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1.  Einleitung

Mit einem Genom von ca. 230.000 Basenpaaren, die vermutlich für mehr als 227 verschiedene Proteine kodieren [1], ist das Humane Cytomegalievirus (HCMV) der größte Vertreter aus der Gruppe der Herpesviren. Die Komplexität seines Genoms ermöglichte es diesem Virus, im Laufe der Evolution ein umfangreiches Repertoire an Mechanismen zu entwickeln, um sich dem Zugriff des menschlichen Immunsystems effektiv entziehen zu können. Ergebnis dieser sog. Im-munevasionsstrategien ist die Etablierung einer persistierenden Infektion (Latenz): einmal infiziert, kann der Organismus das Virus nie wieder vollständig eliminieren. Die Anforderungen an das Immunsystem, dennoch die Kontrolle über das Virus zu behalten, sind dementsprechend komplex. Die Tatsache, dass die HCMV-Infektion beim Immunkompetenten klinisch völlig in­apparent bleibt, zeigt aber, dass es diesen Anforderungen gerecht wird, auch wenn Reaktivierungen des Virus offensichtlich häufiger vorkommen, als bislang angenommen wurde [2 3]. Anders ist die Situation jedoch, wenn das Immunsystem nicht vollständig ausgebildet oder (zeitweise) in seiner Funktion beeinträchtigt ist. So ist HCMV als nach wie vor häufigste kongenitale Infektion für z.T. schwere embryofetale Missbildungen verantwortlich. Darüber hinaus kann die Reaktivierung von HCMV bei immunsupprimierten Patienten zu einem breiten Spektrum mitunter schwerer Erkrankungsbilder, nicht selten auch zum Tod der Betroffenen, führen. Unter Herztransplantierten beispielsweise stellt HCMV immer noch die wichtigste infektiöse Ursache von Morbidität und Mortalität dar [4].

Welch zentrale Rolle das zelluläre Immunsystem, und v.a. die T-Zellen, bei der Kontrolle der HCMV-Infektion einnehmen, wurde schon Anfang der 80er Jahre bei Knochenmarktransplan-tations-(KMT)-Patienten gezeigt [5 6]. Zunächst am Maus-Modell etabliert [7 8], konnte der adoptive Transfer HCMV-spezifischer CD8+ T-Zellen diese Patienten effektiv vor der Entwicklung einer HCMV-Erkrankung schützen [9 10]. Auch für CD4+ T-Zellen wurde eine essentielle Rolle beim Schutz vor der HCMV-Erkrankung demonstriert [11]. Inzwischen werden Versuche unternommen, durch adoptiven Transfer von antigen-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen Patienten insbesondere in den ersten 90 Tagen nach Transplantation besser zu schützen [12]. Als Hauptziel dieser HCMV-spezifischen T-Zellen galt anfangs das regulatorische immediate early 1 protein (IE-1, UL123) [13 14 15]. Dafür sprach, dass dieses Protein das am stärksten exprimierte Genprodukt der sehr frühen (immediate early) Infektionsphase ist [16] und hohe Frequenzen IE-1-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen im peripheren Blut HCMV-seropositiver gesunder Probanden nachgewiesen werden konnten [13 14], die in der Lage waren, infizierte Fibroblasten [Seite 5↓]noch vor Ablauf des Replikationszyklus in vitro zu zerstören [17]. Dann aber wurde ein weiteres wichtiges T-Zell-Ziel in HCMV identifiziert: das Matrix-Phosphoprotein pp65 [18 19]. Dieses Strukturprotein, das die Hauptmasse des Teguments von HCMV bildet, wird nach der Penetration zusammen mit dem Virion in die Zelle transportiert und T-Zellen bereits vor der viralen Gen­expression präsentiert [19 20]. pp65 ist auch der Hauptbestandteil der sog. "dense bodies“ [21]. Die starke Präsenz von pp65 in infizierten Zellen erklärt, warum dieses Protein einerseits so nützlich als Antigen für die immunzytologische Diagnostik ist und andererseits ein wesentliches Ziel für CD8+ T-Zellen darstellt. Demgemäss wurden hohe Frequenzen von pp65-spezifischen T-Zellen im peripheren Blut gesunder HCMV-seropositiver Probanden beobachtet [22]. Wills und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die CD8+ T-Zell-Antwort einiger dieser Probanden auf wenige oder nur ein einziges Epitop in diesem Protein fokussiert ist [22]. Diese Peptid-spezifischen T-Zell-Populationen bestanden zudem aus nur wenigen oder einem einzigen Klon. Wills und Mitarbeiter folgerten daraus, dass diese Klone in vivo stark expandiert sein mussten [23 24 25]. Ähnliches konnte auch für pp65-spezifische CD4+ T-Zellen demonstriert werden [26].

Dennoch sind die Kenntnisse über die T-Zell-Antwort gegen HCMV lückenhaft. Gleichzeitig wird immer deutlicher, wie komplex diese Antwort ist: mittlerweile ist eine Vielzahl verschiedener Epitope in IE-1 und pp65 beschrieben worden [15 22 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41]. Über die Immundominanz des einen oder des anderen Proteins wird weiterhin kontrovers diskutiert [37]. Zunehmend widmet man sich auch der Identifikation antigener Determinanten in anderen immunogenen HCMV-Proteinen wie gB (UL55), pp150 (UL32) oder pp28 (UL98) [42]. Schliesslich wurde mehrfach die funktionelle Heterogenität HCMV-spezifischer T-Zellen demonstriert, die sich in unterschiedlichen Effektormechanismen und Oberflächen-Phänotypen spiegelt [43 44 45]. Dank der Kenntnis verschiedener pp65-Epitope konnte vor kurzem ein erstes Immunmonitoring auf der Ebene Epitop-spezifischer T-Zellen bei KMT-Patienten durchgeführt und eine starke positive Korrelation zwischen der Rekonstitution dieser Zellen nach Transplantation und dem Schutz vor HCMV-Erkrankung gezeigt werden [46 47].

Trotz allem bleibt weiterhin unklar, warum bei Patienten mit vergleichbarem Ausmass an Immunsuppression es bei manchen zu einer symptomatischen HCMV-Erkrankung kommt, während die Infektion bei anderen auf eine asymptomatische Replikation beschränkt bleibt und klinisch stumm verläuft oder überhaupt keine Replikation beobachtet wird. So bestehen bisher auch keine verlässlichen Möglichkeiten zur Vorhersage, welche Patienten ein besonders hohes Risiko haben, an HCMV zu erkranken.


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1.1.  Die HCMV-Infektion

1.1.1. Pathogenese

HCMV, das humane Herpesvirus Typ 5 (HHV5), gehört zur Familie der Herpesviridae und besitzt die für diese Gruppe typische Struktur: das vollständige Virus besteht aus einer Phospholipidmembran (Envelope) mit membranständigen Glykoproteinen, einer aus verschiedenen Proteinen bestehenden Matrix (Tegument) und dem ikosaedrischen Nukleokapsid (core), das eine mit Polyaminen assoziierte lineare Doppelstrang-DNA (dsDNA) umschliesst (Abb. 1A, S.7). Mit über 200 offenen Leserahmen ("open reading frames“, orfs), die wahrscheinlich für ebenso viele Genprodukte kodieren, besitzt es das grösste Genom aller Herpesviren (Abb. 1B). Diese Genprodukte sind nach ihrer Lokalisation im Genom bezeichnet (z.B. UL83: pp65-Gen; UL123: IE-1-Gen, vgl. Abb. 1). Nach Infektion der Zelle und Proteolyse des Kapsids ("Adsorption, Penetration, Uncoacting“) wird die virale DNA zusammen mit Matrixproteinen in den Zellkern transportiert, wo die Replikation erfolgt (DNA-Replikation, Abb. 1C) [48]. Der ca. 24 h dauernde Replikationszyklus von HCMV [49] gliedert sich in drei zeitlich streng organisierte Abschnitte und beginnt mit der Aktivierung der Transkription sog. immediate early(IE)-Gene durch das im Zellkern vorhandene pp65. Die am stärksten exprimierten Proteine dieser sehr frühen Infektionsphase sind die Phosphoproteine IE-1 und IE-2 (UL122), die in der Regulation der Transkription viraler und zellulärer Gene eine zentrale Rolle spielen. In der E(early)-Phase werden v.a. zur DNA- und Proteinsynthese benötigte Proteine, wie die virale DNA-Polymerase (UL54), hergestellt. Auch die Produktion von pp65 beginnt bereits in der E-Phase. Nach DNA-Synthese und Produktion der Genprodukte der L(late)-Phase, hauptsächlich Strukturproteine, kommt es im Kern zum Viruszusammenbau ("Assembly“). Von der Kern- oder Zellmembran erhält das Virus schließlich seine Hülle ("Budding“), bevor es freigesetzt wird ("Release“). Die Infektion kann dabei sowohl latent als auch lytisch ablaufen. Verläuft sie lytisch, führt die Virusreplikation zu charakteristischen zytopathologischen Veränderungen. Dazu gehören die ausgeprägte Vergrößerung ("Cytomegalie“) der Zelle, die dem Virus seinen Namen verlieh, wie die Bildung intranukleärer Einschlusskörper, die von einem hellen Hof umschlossen sind und zu der Bezeichnung "Eulenaugenzellen“ geführt haben (diese Zellveränderung ist pathognomonisch für HCMV). Im späteren Verlauf der Infektion treten im Zytoplasma auch die sog. "dense bodies“ auf.

Im Allgemeinen ist ein immunkompetenter Wirt jedoch in der Lage, die Infektion rasch einzudämmen [37]. Nach der Primärinfektion persistiert das Virus vor allem in myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark in latenter Form. Das Virusgenom ist dabei nicht in die DNA der


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Wirtszelle integriert; die Expression viraler latenzassoziierter Gene (wie bei EBV, HSV) ist bisher nicht bekannt. Ohne Produktion signifikanter Mengen viraler Genprodukte ist das Immunsystem allerdings auch nicht in der Lage, das Virus zu eliminieren - Ergebnis ist eine persistierende Infektion. Vom Knochenmark aus findet die Verbreitung durch im Blut zirkulierende Monozyten statt. Doch erst die Differenzierung zu Makrophagen unter dem Einfluss von Zytokinen wie IFN-γ in peripheren Geweben ermöglicht dem Virus die Replikation [50]. Weitere Orte der Persistenz sind duktale Epithelien verschiedener Gewebe, u.a. der Speicheldrüsen, Nierentubuli, des Darmes, von Cervix, Hoden und Nebenhoden [50]. Die Primärinfektion erfolgt deshalb v.a. durch Speichel, Urin, Cervix- und Vaginalsekret, Samenflüssigkeit, Muttermilch, Stuhl oder Tränenflüssigkeit, aber auch iatrogen durch Übertragung von Blut, Blutprodukten oder transplantierten Organen HCMV-seropositiver Spender. Die Primärinfektion kann kongenital erfolgen; häufig findet sie aber perinatal bzw. im Kindes- oder jungen Erwachsenenalter statt. Dazu ist eine prolongierte Exposition erforderlich. Auch Ko- bzw. Reinfektionen mit unterschiedlichen Virusstämmen kommen vor. Es gibt nur einen HCMV-Serotyp, aber eine Vielzahl unterschiedlicher Virus-Stämme (Laborstämme wie AD169, Towne, Davis, klinische Isolate wie Toledo usw.), deren Sequenz-Homologie auf ca. 80 % geschätzt wird [51]. Für die Seroprävalenz von HCMV findet man stark variierende Angaben; sie ist abhängig von der untersuchten Population und dem verwendeten diagnostischen Test, wird aber häufig für Europa mit 60 bis 70 % angegeben [52]. Einmal etabliert, bleibt die Infektion lebenslang bestehen. Dies ist v.a. auf das vielfältige Repertoire von Immunevasionsstrategien von HCMV zurückzuführen. Dazu zählen Mechanismen, die mit dem MHC-Klasse-I- und dem MHC-Klasse-II-Präsentationsweg der Wirtszelle und somit dem Zugriff durch T-Zellen interferieren, die Kodierung eines auf der Zellmembran exprimierten MHC-Klasse-I-Homologs (als Schutz vor NK-Zellen), die Interaktion mit Komplementfaktoren, die Produktion von Interleukin-(Il-) und Chemokin-Homologen sowie die Modulation von Signaltransduktion, Transkription u.a. Zellfunktionen [53]. Bemerkenswert in diesem Zusammenhang ist auch, das nach Gilbert und Mitarbeitern [54] pp65 Kinase-Aktivität besitzt und dadurch in der Lage sein könnte, die MHC-Klasse-I-Präsentation von IE-1-Peptiden zu behindern. Dennoch gelingt es dem Immunsystem, die Kontrolle über das Virus zu gewinnen - und zu behalten - sofern nicht Beeinträchtigungen des zellulären Immunsystems, wie z.B. durch Leukämien und Lymphome, Infektion mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) oder im Rahmen einer Organ- oder Knochenmarkstransplantation, dem Virus Gelegenheit zu Reaktivierung und Replikation geben. Dabei bereitet die Immunsuppression der Reaktivierung nicht allein, sondern in Verbindung mit chronischer Antigenstimulation und Aktivierung des Immunsystems [Seite 9↓](z.B. durch hohe Plasmaspiegel an Tumor-Nekrose-Faktor-α, TNF-α, infolge Abstossung, Sepsis, ATG-Gabe usw.), den Boden [55 56]. Eine Organtransplantation erfüllt alle diese Kriterien. Der Einsatz potenter Suppressoren der T-Zell-vermittelten Immunität wie Anti-Thymozyten-Globulin (ATG) oder des monoklonalen anti-CD3-Antikörpers OKT3 ist dabei mit einer besonders hohen Rate an HCMV-Reaktivierungen und Erkrankungen assoziiert.

1.1.2. Klinische Manifestationen

Die Primärinfektion oder Reaktivierung von HCMV können zu einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen führen. Diese sind in Tabelle 2 dargestellt. Die bei Patienten nach Herz- und Lungentransplantation besonders häufigen Manifestationen sind mit (*) gekennzeichnet. Unter Transplantations-Patienten haben HCMV-seronegative Empfänger von Organen seropositiver Spender (D+R-), also Patienten, die im Rahmen ihrer Organtransplantation eine Erstinfektion durchmachen, sowie seropositive Patienten, die ATG zur Behandlung einer akuten Abstoßung benötigen, mit 50-75 % ein besonders hohes Risiko, eine HCMV-Erkrankung zu entwickeln [4].

Direkte und indirekte Effekte der HCMV-Infektion

A. Direkte Effekte der primären HCMV-Infektion oder HCMV-Reaktivierung:

 

Kongenitale HCMV-Infektion: breites Spektrum von klinisch inapparent bis zu schweren Missbildungen

 

Perinatale HCMV-Infektion: selten; interstitielle Pneumonie besonders bei Frühgeborenen

 

HCMV-Mononukleose: v.a. im jungen Erwachsenenalter mononukleoseartige Symptomatik der Erstinfektion

 

HCMV-Infektion bei immunsupprimierten Patienten:

 

- Enzephalitis, Meningitis und akute Myelitis transversa

 

- Fieber*

 

- Gastrointestinale Ulzerationen*

 

- Hepatitis*

 

- Myelosuppression mit Leukopenie und Thrombopenie*

 

- Myokarditis*

 

- Nephritis

 

- Pankreatitis

 

- Pneumonie*

 

- Retinits

 

- Sinusitis

 

- Zystitis

B. Indirekte Effekte:

Transplantatschaden (akuter/chronischer): z.B. Transplantat-Vaskulopathie*

Lymphoproliferative Erkrankung (PTLD)

Globaler immunosuppressiver Effekt, der zu potentiell lebensbedrohlichen opportunistischen Superinfektionen wie z.B. mit Pneumocystis carinii prädisponiert

* häufige Manifestationen bei herz- und/oder lungentransplantierten Patienten, nach [4]


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1.1.3.  Diagnose

Die vielfältigen diagnostischen und prognostischen Marker der HCMV-Infektion sind detailliert in einer kürzlich erschienenen Übersichtsarbeit beschrieben [57]. Hier werden deshalb nur die im Deutschen Herzzentrum Berlin (DHZB) verwendeten und deshalb für diese Arbeit relevanten Verfahren dargestellt.

Grundlage der (Verdachts-)Diagnose sind Anamnese und klinische Untersuchung. Die Symptomatik einer HCMV-Erkrankung ist jedoch sehr diffus und die Diagnose klinisch deshalb oft schwierig zu stellen: Fieber, Müdigkeit, Abgeschlagenheit, Luftnot, Husten, Übelkeit, Erbrechen, Durchfall, Skotome, eine diffuse ZNS-Symptomatik usw. können, je nach Manifestation, auftreten. Paraklinisch wichtige Parameter sind v.a. Leuko- und Thrombozytopenie, Transaminasenerhöhung, HCMV-IgG und -IgM, pp65-Antigenämie und HCMV-DNAämie. Wichtige apparative Untersuchungsmethoden sind die Bronchoskopie, Compupertomographie, Endoskopie, Echokardiographie, die intramyokardiale Elektrographie (IMEG) [58], Lungenfunktions-Diagnostik und Thorax-Röntgen. Der HCMV-Serostatus wird bei allen Patienten schon vor der Transplantation erhoben. Zur serologischen Diagnostik wird der Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) eingesetzt, der die Präsenz HCMV-spezifischer IgG- oder IgM-Antikörper im peripheren Blut nachweist (indirekter Nachweis der Infektion). Die Anwesenheit von IgG-Antikörpern zeigt eine in der Vergangenheit durchgemachte Primärinfektion an (Ausnahme: passiv übertragene HCMV-IgG). IgM-Antikörper werden sowohl im Rahmen der Primärinfektion als auch nach Reaktivierungen gebildet und erlauben somit keine Unterscheidung beider Entitäten. Zudem ist die Serologie bei immunsupprimierten Patienten auch eher insensitiv. IgG- und IgM-ELISA werden im DHZB in der unmittelbaren post-Transplantationsphase zunächst wöchentlich, dann bei Routineuntersuchungen in der ambulanten Nachsorge bestimmt. Gleiches gilt für die pp65-Antigenämie. Dieser Test beruht als ein direktes Nachweisverfahren auf der Detektion von pp65 in infizierten Leukozyten im peripheren Blut mit Hilfe monoklonaler anti-pp65-Antikörper. Das Ergebnis wird in positiven Zellen pro 200.000 Zellen angegeben. Bei Verdacht auf Reaktivierung oder Erkrankung wird die Antigenämie auch in kleineren Abständen bestimmt. Gelegentlich wird zusätzlich eine qualitative DNA-PCR durchgeführt. Die Diagnose von Organmanifestationen beruht auf dem Nachweis von HCMV in entsprechenden histologischen Präparaten und in der bronchoalveolären Lavage.


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1.1.4.  Therapie

Die Therapie der HCMV-Infektion beinhaltet die Prophylaxe, die präemptive Therapie und die Behandlung asymptomatischer und symptomatischer Infektionen. Trotz intensiver Bemühungen um eine Standardisierung gehen die Ansichten über die Effektivität verschiedener Protokolle aber nach wie vor weit auseinander. Bei Patienten einer Hochrisikogruppe (HCMV-seronegative Empfänger eines Organs von einem HCMV-positiven Spender, kurz D+R-; ATG bei Abstoßung) sollte der Primärinfektion durch Prophylaxe vorgebeugt werden. Dazu werden Hyperimmunglobulin (HCMV-Ig) und die Nukleosidanaloga Aciclovir, Valaciclovir, Ganciclovir oder neuerdings Valganciclovir eingesetzt. Eine wirkungsvolle HCMV-Impfung ist derzeit noch nicht verfügbar. Unter den vielen Vakzinierungsstrategien gegen HCMV sind die Versuche von Plotkin und Mitarbeitern mit einer abgeschwächten Lebendvakzine ("Towne-Stamm“) nennenswert [59]. Der Einsatz einer solchen Lebendvakzine ist im Rahmen einer Organtransplantation aber zu riskant. Ein anderer Ansatz ist die Entwicklung einer sog. Peptidvakzine. Die Kenntnis des HLA-A*0201-restringierten Epitops pp65495-503 ( NLVPMVATV 1) ermöglichte Diamond und Mitarbeitern erste Versuche mit einer solchen Peptidvakzine [60]. Da das Allel HLA-A*0201 weltweit stark verbreitet ist und HCMV-seropositive HLA-A*0201-positive Spender zu einem hohen Prozentsatz gegen dieses Peptid mit CD8+ T-Zell-Antworten reagieren, könnte die Immunisierung mit diesem Peptid HLA-A*0201-positiven Patienten einer Risikogruppe effektiven Schutz vor Primärinfektion verleihen. Mit einem relativ kleinen Repertoire weiterer Peptide, die von anderen häufigen HLA-Allelen präsentiert werden, wäre auf dieser Basis auch die Immunisierung eines noch grösseren Bevölkerungsteils denkbar [35].

Die Gabe von Ganciclovir i.v. für 10 bis 14 Tage, gefolgt von einer dreimonatigen oralen Ganciclovir-Gabe, senkt das Risiko einer HCMV-Erkrankung bei Patienten, die ATG zur Behandlung eine akuten Abstossung benötigen, deutlich [4]. In manchen Zentren gilt eine solche präemptive Ganciclovir-Gabe auch bei Anstieg der Virämie (quantitative PCR) als indiziert [4].

Standard der symptomatischen HCMV-Therapie im DHZB ist nach wie vor Ganciclovir i.v. für 10 bis 14 Tage (5mg/kg Körpergewicht, 2 mal täglich), gefolgt von Ganciclovir per os. Foscarnet wird bei Transplantationspatienten wegen seiner hohen Toxizität nur in Fällen eingesetzt, in denen Ganciclovir nicht zu Besserung führt (Infektion mit Ganciclovir-resistenten HCMV-Stämmen) [61]. Gleiches gilt für das relativ neue Cidofovir, ein ebenfalls recht toxisches Medikament. Im DHZB erhalten alle Patienten nach Transplantation eine prophylaktische Gabe von [Seite 12↓]Aciclovir p.o. gegen Herpesvirusinfektionen im Allgemeinen. Die Aktivität von Aciclovir gegen HCMV ist jedoch schwach, weshalb im Falle positiver pp65-Antigenämien auf Ganciclovir per os umgestellt wird. Bei vermuteter oder gesicherter invasiver HCMV-Erkrankung erhalten die Patienten initial Ganciclovir i.v., später per os. Künftig wird sicher das neue oral gut verfügbare Ganciclovir (Valganciclovir) verstärkt eingesetzt werden.

1.2. Die Rolle von T-Zellen in der Kontrolle von HCMV

Die zentrale Funktion des Immunsystems, und damit auch von T-Lymphozyten, ist die Unterscheidung zwischen gefährlich und ungefährlich. T-Zell-Antworten besitzen die beiden wesentlichen Charakteristika der erworbenen Immunität - Antigenspezifität und Gedächtnis. Alle kernhaltigen Körperzellen präsentieren T-Zellen an MHC-Klasse-I gebundene Peptide auf ihrer Zelloberfläche. Sie geben ihnen damit ein "Inventar“ der in ihrem Zytoplasma enthaltenen, von der Zelle synthetisierten, Proteine. Man nennt das den "endogenen Präsentationsweg“. Auch Peptide, die aus viralen Proteinen in virusinfizierten Zellen oder aus mutierten Proteinen in Tumorzellen stammen, können dem Immunsystem auf diese Weise präsentiert werden. Die sog. zytotoxischen CD8+ T-Zellen sind auf die Elimination solcher Zellen spezialisiert. Durch Interaktion ihres T-Zell-Rezeptors (TCR) mit dem Peptid, für das sie spezifisch sind und dem dieses Peptid präsentierendem MHC-Klasse-I-Molekül, wird die CD8+ T-Zelle aktiviert und der Komplex durch Bindung von CD8 an den TCR stabilisiert. Dieses Signal allein würde jedoch zum Tod der T-Zelle führen ("activation induced cell death“, AICD). Um ihre Funktion vermitteln zu können, benötigt die T-Zelle noch ein zweites, kostimulatorisches, Signal ("two-signal hypothesis“), wie z.B. die Interaktion von CD28 auf T-Zellen mit den Oberflächenmolekülen CD80 (B7-1) oder CD86 (B7-2) auf aktivierten Antigen-präsentierenden Zellen (APC). Zytotoxische T-Zellen verfügen über ein breites Repertoire sog. "direkter“ und "indirekter“ Mechanismen, um die als "fremd“ erkannte Zielzelle zu zerstören [62]. Zu den "direkten“ Mechanismen aktivierter CD8+ T-Zellen zählen z.B. die Sekretion von Perforin und Granzymen oder die Wechselwirkung von Fas-Ligand (CD95L) mit Fas (CD95) auf der Oberfläche von Zielzellen. Die "indirekten“ Mechanismen, wie die Sekretion von Chemokinen und Zytokinen wie z.B. TNF-α und IFN-γ, haben keine unmittelbaren zytotoxischen Effekte auf die Zielzelle, sie nehmen Einfluss auf andere Zellen. IFN-γ, das ausserdem noch von CD4+ T-Zellen und NK-Zellen produziert wird, ist ein sog. pleiotropes Zytokin, also ein Zytokin mit einer Vielzahl immunmodulatorischer Funktionen. Zu seinen Wirkungen zählt die gesteigerte Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen auf verschiedenen Zelltypen und von MHC-Klasse-II-Molekülen v.a. auf Makrophagen, die Aktivierung von [Seite 13↓]Endothelzellen, Granulozyten, Makrophagen, T- und NK-Zellen sowie die Differenzierung von T- und B-Zellen. Für IFN-γ wurde auch ein direkter inhibitorischer Effekt auf die Replikation von HCMV beschrieben [39]. Nach Antigenkontakt aktivierte naive CD8+ T-Zellen proliferieren und differenzieren z.T. zu Effektor-T-Zellen, deren Aufgabe die Elimination des Antigens ist, für das sie spezifisch sind. Solche Antigen-spezifischen T-Zell-Populationen können dabei massiv expandieren. Bleibt weiterer Antigenkontakt aus, sterben die entstandenen Zellen aber durch Apoptose wieder ab. Ein Teil antigen-geprimter T-Zellen entwickelt sich jedoch zu den funktionell ruhenden sog. Gedächtniszellen weiter. Bei erneutem Antigenkontakt sind diese Zellen in der Lage, innerhalb weniger Stunden eine starke Immunantwort aufzubauen. Die schnelle Produktion von IFN-γ ist ein (zumindest durchflusszytometrisch) sichtbarer Beleg dafür [63].

Das MHC-Klasse-I-Molekül des Menschen besteht aus einer schweren Kette mit drei Domänen (α1, α2, und α3) sowie dem β2-Mikroglobulin. Die α1 und α2 Domänen formen die sog. Antigenbindungsgrube, die zu beiden Seiten geschlossen ist und daher nur relativ kurze Peptide mit einer Länge von 7 bis 13, typischerweise aber von 9, Aminosäuren aufnehmen kann [64]. Variationen der Aminosäuresequenz insbesondere in dieser Region führen zu Unterschieden in der Form der Antigenbindungsgrube zwischen verschiedenen HLA-Allelen. Spezifität und Länge der Peptide, die von den bisher bekannten 83 HLA-A, 186 HLA-B und 46 HLA-C Allelen gebunden werden, hängen ab von den Aminosäureresten, die die Antigenbindungsgrube aufbauen. Durch Vergleich von Peptiden, die von bestimmten HLA-Allelen gebunden waren, konnte gezeigt werden, dass diese Peptide häufig gleiche Aminosäurereste nahe dem N- und C-Terminus hatten. Der Begriff "Bindungsmotiv“, der für dieses Phänomen geprägt wurde, beinhaltet dabei sowohl die Länge als auch die Präferenz für bestimmte Aminosäurereste in bestimmten Positionen eines am betreffenden MHC-Molekül gebundenen Peptids. Finden sich in diesen Positionen Aminosäuren aus einer Gruppe mit sehr ähnlichen biochemischen Eigenschaften, werden diese Aminosäuren als "Bindungsanker“ bezeichnet. Dabei handelt es sich meistens um den Aminosäurerest in Position 2 sowie den C-terminalen Aminosäurerest. Abbildung 2 (S.14) verdeutlicht das am Beispiel einiger von HLA-A*0201 präsentierter Peptide:

Der häufigste Bindungsanker in Position 2 der Aminosäure-Sequenz ist hier Leucin (L), aber auch andere aliphatische Aminosäuren wie Valin (V), Methionin (M), Isoleucin (I), Alanin (A), und Threonin (T) kommen in dieser Position vor [64]. Als Bindungsanker in Position 9 kommt fast ausschliesslich Valin vor. Andere Aminosäurereste des Peptids ragen aus der Peptidbindungsgrube des MHC-Moleküls heraus, was die Interaktion mit dem T-Zell-Rezeptor ermöglicht.


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Die Kenntnis der Bindungsmotive für viele verschiedene HLA-Allele erlaubt mittlerweile die Vorhersage, von welchem HLA-Allel ein gegebenes Peptid sehr wahrscheinlich präsentiert wird. Dieses Prinzip liegt den Datenbanken "SYFPEITHI“ und "BIMAS“ zugrunde.

Im Gegensatz zu den MHC-Klasse-I-Molekülen ist die Peptidbindungsgrube von Klasse-II-Molekülen zu beiden Seiten offen und kann daher auch grössere Peptide aufnehmen. Typischerweise haben diese Peptide eine Länge von 15 bis 18 Aminosäuren [64], es kommen jedoch auch viel kürzere (< 9) und längere (> 24) Liganden in Frage. Die Präferenz für bestimmte Aminosäurereste in Bindungspositionen ist bei MHC-Klasse-II-Molekülen zudem viel weniger stringent als bei Klasse-I-Molekülen: Aminosäuren, die zu biochemisch sehr unterschiedlichen Gruppen zählen, werden gleichermassen toleriert, was die Definition von Bindungsmotiven stark erschwert. MHC-Klasse-II-Moleküle befinden sich nur auf der Oberfläche von Zellen, die auf die Präsentation von Antigen spezialisiert sind (APC), wie Makrophagen, Langerhans- und dendritische Zellen, aber auch B-Zellen. APC nehmen Antigene durch Endophagozytose aus ihrer Umgebung auf und präsentieren diese den CD4+ T-Helfer-Zellen (sog. "exogener Präsentationsweg“). T-Helfer­zellen sind zentrale "Organisatoren“ der Immunantwort. Durch das Zytokinrepertoire, das sie ausschütten, bestimmen sie die Art der resultierenden Immunantwort.

1.3. Aufgaben und (mögliche) Anwendungen der durchflusszytometrischen T-Zell-Epitop-Kartierung

Die Aufgaben und (möglichen) Anwendungen der durchflusszytometrischen T-Zell-Epitop-Kartierung erstrecken sich auf alle im Abschnitt 1.1 dargestellten Gebiete. Im Vordergrund steht dabei die Erforschung der komplexen Natur der T-Zell-Antwort gegen HCMV und die damit verbundenen pathogenetischen Implikationen. Davon verspricht man sich entscheidenden Einfluss auf die Diagnostik. Vor allem die Entwicklung eines intensivierten Immunmonitorings mit [Seite 15↓]dem Ziel, das Risiko einer HCMV-Erkrankung besser und früher abschätzen zu können, ist damit verbunden. Zudem kann der Einfluss der immunsuppressiven Therapie auf die HCMV-spezifischen T-Zellen direkt untersucht werden. Wie erwähnt, sind bereits Versuche des Immunmonitorings auf Epitop-Ebene bei KMT-Patienten mit Hilfe von sog. "Tetrameren“ durchgeführt worden [46 47]. Dabei handelt es sich um tetramere, über Streptavidin gekoppelte und mit Peptiden beladene MHC-Molekül-Komplexe, die mit Phycoerythrin (PE) markiert sind und so die direkte Darstellung Peptid-spezifischer T-Zellen gestatten. Die Entwicklung von "Tetrameren“ ist aber ohne Kenntnis der immunogenen Peptide und der präsentierenden HLA-Allele nicht möglich. Auch dies ist ein wichtiger Ertrag der T-Zell-Epitop-Kartierung. Darüber hinaus hat die Kenntnis von Epitopen eine entscheidende Bedeutung sowohl für die Entwicklung einer effektiveren Prophylaxe, beispielsweise in Form verbesserter Peptid-Vakzinen, als auch für die Therapie mit Hilfe des adoptiven Transfers HCMV-spezifischer T-Zellen. Vor allem aber könnte die medikamentöse Therapie für Patienten, die in einer bestimmten Phase des klinischen Verlaufes oder auf dem Boden ihrer T-Zell-Antwort ein erhöhtes Risiko für eine HCMV-Erkrankung haben, durch gezielteren Einsatz entscheidend optimiert werden; Patienten, die keiner Prophylaxe oder Therapie bedürfen, blieben unerwünschte Nebenwirkungen dieser Maßnahmen erspart.


Fußnoten und Endnoten

1 (wahrscheinliche) immunogene Sequenzen sind in dieser Arbeit einheitlich fett und unterstrichen dargestellt



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27.05.2004