3.  Materialien und Methoden

In einem vorangegangenen Projekt wurden die T-Zell-Antworten auf IE-1 und pp65 von 43 herz- und lungentransplantierten Patienten von einem anderen Untersucher über 6 Monate nach Transplantation verfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurden alle HCMV-IgG-seropositven Patienten (kurz: Patienten; Pt-2, Pt-7, Pt-9¹ usw.) aus dieser Gruppe untersucht, die messbare T-Zell-Reaktionen auf eines oder beide Proteine hatten. Die wichtigsten Charakteristika dieser insgesamt 17 herz- und 3 lungentransplantierten Patienten, die alle bereits vor Transplantation HCMV-IgG-seropositiv waren, sind in Tabelle 3 (S.19) zusammengefasst. Die Verteilung der HLA-Allele in der Patientengruppe zeigt Abbildung 3 (S.20). Mit der Epitop-Kartierung wurde zwischen dem 150. und 450. Tag nach Transplantation begonnen. Dazu wurde den Patienten zu Routineuntersuchungszeitpunkten in der Transplantationsambulanz oder während stationärer Klinikaufenthalte im DHZB 16.2 ml venöses Blut (sechs 2.7 ml Cirtat-Monovetten) abgenommen. Aus diesem Blut wurden am gleichen Tag PBMC präpariert.

Zur Untersuchung der HCMV-IgG-seropositiven gesunden Probanden (kurz: gesunde Probanden; Pr-1, Pr-2, usw.) wurde für methodische Untersuchungen venöses Vollblut in verschiedenen Serien und unter Verwendung von Citrat oder Heparin abgenommen.

* 4 Patienten hatten sowohl frühe als auch späte Reaktivierungen

• Zellkulturmedium: 1640 RPMI-Medium + 10 % (v/v) FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 I.E. Penicillin/Streptomycin
• Permeabilisierungslösung: 400 ml Aqua dest., 100 ml FACS-Lyse-Reagenz, 250 µl
  Tween 20
• EDTA-Lösung: PBS + 2 mM EDTA
• PFA-Fixationslösung: PBS + 1 % (w/v) PFA
• Wasch-Puffer: PBS + 0.5 % (w/v) BSA, 0.1 % (w/v) NaN₃
• MACS-Puffer: PBS + 0.5 % (w/v) BSA, 2 mM EDTA

Die verwendeten Peptide von 9, 10 und 15 Aminosäuren Länge wurden in der Abteilung für Peptid- und Proteinchemie des Instituts für Medizinische Immunologie der Charité und der Firma NMI (Reutlingen) nach Standard-Fmoc-Verfahren [65] synthetisiert und anschließend gefriergetrocknet. Die Sequenzen der Peptide sind den Tabellen 5 (S.24) und 6 (S.25) zu entnehmen. Je[Seite 23↓]des Peptid wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 80 mg/ml gelöst (Stammlösung). Aus diesen Stammlösungen wurden je nach Bedarf Arbeitslösungen durch Verdünnung mit DMSO hergestellt. Für methodische Arbeiten benötigte Einzelpeptide wurden direkt vor der Zugabe mit PBS auf die benötigten Konzentrationen eingestellt. Zur Herstellung der Peptidpools wurden die Einzelpeptide bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre mit DMSO auf eine Konzentration von 0.25 mg/ml gebracht, wie benötigt zusammenpipettiert, und in Aliquots von 4 µl eingefroren. Zwei Peptidpools (die "Gesamtmischungen“) enthielten jeweils alle Pentadecapeptide des entsprechenden Proteins. Die Konzentration der Peptide in diesen Pools betrug ebenfalls 1 µg/ml. Auch diese Pools wurden in Aliquots zu 4 µl eingefroren. Einzelpeptide zur Nachtestung wurden mit DMSO auf 1 mg/ml, gereinigtes und zuvor im Ulltraschallbad homogenisiertes HCMV-Lysat (ABI, Columbia, USA) mit PBS auf eine Konzentration von 0.25 mg/ml gebracht. Alle Antigene wurden bei -70° C aufbewahrt.

PBMC wurden aus Vollblut durch Dichtegradienten-Zentrifugation mittels Ficoll-Paque (Dichte: 1.078 g/ml bei 20°C) isoliert. Die Präparation folgte bei allen Versuchen i.W. dem gleichen Protokoll (auf Unterschiede ist hingewiesen):

• 14 ml Polyethylen-Röhrchen wurden mit 3 ml Ficoll beschickt, welches vorsichtig mit 8 ml von mindestens 1:2 mit sterilem PBS verdünntem Vollblut überschichtet wurde. Anschließend erfolgte die Zentrifugation bei 1000 g für 20 min.
• Die zwischen Plasma und Ficoll befindliche Zellschicht (PBMC) wurde vorsichtig abgehoben und dreimal mit sterilem PBS gewaschen (1. Waschschritt 210 g/10 min., 2. Waschschritt 174 g/10 min., 3. Waschschritt 164 g/12 min.).
• Die Zellen wurden anschließend in einem 50 ml-Polypropylen-Röhrchen mit Zellkulturmedium auf eine Zellkonzentration von 2.0 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt und über Nacht in einem Brutschrank bei 37°C und 5 % CO₂-Atmosphäre vorinkubiert. Bei der Präparation von PBMC aus Patientenmaterial wurde auf den 2. Waschschritt verzichtet, um den Zellverlust zu reduzieren. Ausserdem wurde die Zellkonzentration bei Bedarf bis auf ein Minimum von 1.0 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt, um das vorhandene Material optimal auszunutzen.

• Venöses Vollblut von Probanden wurde in verschiedenen Monovetten (Citrat-, Lithium- und Natrium-Heparin-Monovetten) abgenommen.
• Alle Ansätze wurden als Dreifachansatz durchgeführt. Jeweils 1 ml Vollblut wurde dazu in 14 ml-"Cellstar“-Polypropylen-Röhrchen pipettiert, diese mit dem zugehörigen Deckel verschlossen und die Proben bei Raumtemperatur während der Präparation von PBMC (ca. 120 min.) stehend gelagert.
• Peptide und virales Lysat wurden anschließend zeitgleich mit der Stimulation von PBMC in Volumina von 1, 10, 20 und 40 µl (Arbeitskonzentrationen von 0.1 und 1 mg/ml) zugegeben. Die Endkonzentration der Antigene betrug je nach Versuchsansatz für Peptide 0.1, 1, 10 und 40 µg/ml (exakt: 0.1, 1.0, 9.90 und 38.46 µg/ml) und für virales Lysat 0.1, 1, 10 und 20 µg/ml (exakt: 0.1, 1.0, 9.90 und 19.60 µg/ml). Als Negativkontrolle diente ein Dreifachansatz, dem je 4 µl DMSO zugegeben wurden. Durch Verwendung von PBS als Lösungsmittel [Seite 27↓]für die Antigene wurde die DMSO-Konzentration in allen Proben unter 0.1 % (vol/vol) gehalten.
• Die Proben wurden anschließend in 5° Schräglage von der Horizontalen bei 37°C und 5 % CO₂-Atmosphäre im Brutschrank inkubiert, bevor nach 2 Stunden 2 µl einer in DMSO gelösten Stammlösung von 5 mg/ml des Sekretionshemmers Brefeldin A (BFA) zugegeben wurden. Die Endkonzentration von BFA betrug somit 10 µg/ml in allen Proben.
• Nach weiteren 4 Stunden Inkubationszeit wurde die Zytokinproduktion durch Zugabe von 10 ml eiskaltem PBS gestoppt. Die Ansätze wurden dann für 8 min. bei 430 g und 4°C zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Zellpellet gründlich resuspendiert.
• Anschließend wurden 10 ml FACS-Lyse-Lösung für 10 min. bei Raumtemperatur zugegeben, um die Erythrozyten zu lysieren.
• Nachdem die Zellen herunterzentrifugiert, durch Zugabe von 4 ml Waschpuffer (bei 430 g und 4°C für 8 min.) gewaschen, dekantiert und resuspendiert wurden, erfolgte die Permeabilisierung der Zellmembranen. Dazu wurde 1 ml Permeabilisierungs-Lösung zugegeben und die Proben für 10 min. bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert.
• Nach einem weiteren Waschschritt erfolgten die intrazelluläre Färbung und die Oberflächenfärbung mit sättigenden Mengen monoklonaler Antikörperkonjugate (anti-CD3-PerCP, anti-CD4-PE, anti-CD8-APC und anti-IFN-γ-FITC) für 30 min. bei Dunkelheit auf schmelzendem Eis. Auf Isotyp-Kontrollen wurde verzichtet, da diese sich in vorangegangenen Versuchen nicht als nützlich erwiesen hatten (siehe Abschnitt 4.1). Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen durch 5-minütige Zugabe von 1 % PFA-Lösung refixiert, nochmals gewaschen und am folgenden Tag gemessen.

• Für den Vergleich von Vollblut und PBMC sowie verschiedener Antikoagulanzien wurde HCMV-seropositiven gesunden Spendern venöses Vollblut in verschiedenen Monovetten (Citrat-, Lithium- und Natrium-Heparin) abgenommen; daraus wurden, wie unter Abschnitt 3.3.1 beschrieben, PBMC isoliert. Alle Proben wurden als Dreifachansatz durchgeführt. Peptide und virales Lysat wurden zeitgleich mit der Stimulation von Vollblut in Volumina von 1, 10, 20 und 40 µl (Arbeitslösungen 0.1 und 1 mg/ml) zugegeben. Die Endkonzentrationen der Stimulantien betrug je nach Versuchsansatz für Peptide 0.1, 1, 10 und 40 µg/ml (exakt: 0.1, 1.0, 9.90 und 38.46 µg/ml) und für virales Lysat 0.1, 1, 10 und 20 µg/ml (exakt: 0.1, 1.0, 9.90 und 19.60 µg/ml). Als Negativkontrolle diente ein Dreifachansatz, dem je 4 µl DMSO [Seite 28↓]zugegeben wurden. Durch Verwendung von PBS als Lösungsmittel lag die DMSO-Konzentration in allen Proben unter 0.1 % (vol/vol).
• PBMC von Patienten wurden zunächst präpariert (vgl. Abschnitt 3.3.1), mit Zellkulturmedium auf eine Zell-Konzentration von 1.0 bis 2.0 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt und über Nacht im Brutschrank vorinkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden Einzelansätzen jeweils 4 µl der vorbereiteten Pools oder Einzelpeptide bzw. DMSO für die Negativkontrolle zugegeben.
• Für die Stimulation von PBMC wurden zunächst 100 ml Kulturmedium in 2052-Falcon-Röhrchen pipettiert, das jeweilige Stimulanz darin aufgenommen und anschließend 400 µl der Zellsuspension zugegeben.
• Die Proben wurden darauf in 5° Schräglage von der Horizontalen bei 37°C und 5 % CO₂-Atmosphäre im Brutschrank inkubiert.
• Nach 2 Stunden wurden pro Ansatz 2 µl BFA (der o.g. Stammlösung) in 500 µl warmen Kulturmedium aufgenommen und den Proben vorsichtig zugegeben. Die Endkonzentration von BFA betrug so in allen Proben 10 µg/ml.
• Nach weiteren 4 Stunden Inkubationszeit wurde die Zytokinproduktion durch Zugabe von 3 ml eiskaltem PBS abgestoppt, die Proben für 8 min. bei 430 g und 4°C herunterzentrifugiert und das Zellpellet resuspendiert.
• Danach wurden 3 ml einer 2 mM EDTA-Lösung zugegeben und die Proben für 10 min. bei 37°C im Wasserbad inkubiert. (EDTA entzieht den Zellen Ca²⁺. Sie sollen dadurch die Fähigkeit zur Adhäsion an der Röhrchenwand verlieren).
• Nachdem die Ansätze herunterzentrifugiert, gründlich resuspendiert und durch Zugabe von 4 ml Waschpuffer (bei 430 g und 4°C für 8 min.) gewaschen wurden, erfolgte die Permeabilisierung, Antikörperfärbung, und Fixierung wie für Vollblut beschrieben.
• Für die Identifizierung der für die IFN-γ-Produktion verantwortlichen Peptide wurde für Vollblut- und PBMC-Proben eine Kombination von 10 µl anti-CD3-PerCP, 10 µl anti-CD4-PE, 0.5 µl anti-CD8-APC und 10 µl anti-IFN-γ-FITC pro Ansatz verwendet. Die Anfärbung CD4+ und CD8+ T-Zellen erlaubte die direkte Analyse der in diesen Subpopulationen auftretenden Reaktionen, was bei Reaktionen in beiden Subpopulationen von Vorteil sein konnte. Für die Nachtestung identifizierter Peptide nach der Epitop-Kartierung wurde eine Kombination von 10 µl anti-CD3-PerCP, 0.5 µl anti-CD8-APC, 10 µl anti-CD69-PE und 10 µl anti-IFN-γ-FITC pro Ansatz gewählt. Die Färbung des frühen Aktivierungsparameters CD69 ermöglichte eine genauere Analyse der T-Zell-Antwort [66].

Um den Einfluss kostimulatorischer Antikörper auf die T-Zell-Antwort im oben beschriebenen Versuchsaufbau zu untersuchen, wurden jeweils 200 µl Kulturmedium in ein 2052-Falcon-Röhrchen pipettiert, 2 µl eines 1 mg/ml konzentrierten Einzelpeptids zugegeben und vorsichtig resuspendiert. 101 µl dieses Ansatzes wurden in ein zweites 2052-Falcon-Röhrchen überführt und diesem Ansatz je 1 µl anti-CD28 und anti-CD49d (Endkonzentration: 1 µg/ml) zugegeben. Diese Verfahrensweise gewährleistete gleiche Peptidkonzentrationen in beiden Ansätzen. Zwei mit 4 µl DMSO versetzte Negativkontrollen, die eine ohne, die andere mit 1 µg/ml anti-CD28 und anti-CD49d, wurden ebenfalls mitgeführt. Anschließend wurden PBMC eines Patienten zugeben, bei dem Stimulation mit dem jeweiligen Peptid zu CD4+ und/oder CD8+ T-Zell-Antworten führte. Die Zellen wurden nun wie unter Abschnitt 3.3.3 dargestellt weiterverarbeitet.

Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Charakterisierung von Antigenen auf und in einer Zelle mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Die Zellen werden dazu zunächst in einem Flüssigkeitsmantel als einzelne Partikel in laminare Strömung gebracht, bevor sie in die Messkammer eintreten. Dort trifft (monochromatisches) Laserlicht auf die einzelne Zelle - und damit auf die an Antikörper gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe. Durch das Laserlicht angeregt, emittieren diese ihrerseits Licht eines definierten Wellenlängenspektrums, das von Sensoren in der Messkammer als Impuls aufgenommen, verstärkt, und anschließend rechnergestützt aufbereitet wird. Gleichzeitig wird das Laserlicht je nach Beschaffenheit der getroffenen Zelle charakteristisch gestreut. Aus der Interpretation von Vorwärtsstreulicht (FSC = forward scatter; ein globales Maß für die Grösse) und Seitswärtsstreulicht (SSC = sideward scatter; ein globales Maß für die Granularität) sind Rückschlüsse auf Größe und Granularität der Zelle möglich. Bei einem Vier-Farben-Durchflusszytometer wie dem FACSCalibur können durch die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen mit ähnlichen Absorptions-, aber unterschiedlichen Emissionsmaxima bis zu sechs Parameter (vier Antigene sowie Grösse und Granularität) gleichzeitig untersucht werden. Als Farbstoffe wurden in dieser Arbeit Fluoreszein Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Perdinin Chlorophyll-Protein (PerCP) und Allophycocyanin (APC) verwendet. Die Interpretation der gemessenen Proben ist in Abbildung 4 (S.30) und in [67] dargestellt.

Die Prinzipien der durchflusszytometrischen T-Zell-Epitop-Kartierung sind mehrfach detailliert dargestellt worden [30 31 32 68 69]. Dazu wurden die HCMV-Proteine IE-1 und pp65 (Aminosäure-Sequenzen des HCMV-Laborstamms AD169) in Form von Pentadecapeptiden (15-mere) synthetisiert, die sich um jeweils 11 Aminosäuren überlappten. Für IE-1 waren dazu 120, für pp65 138 solcher Pentadecapeptide erforderlich (Tabelle 5 und 6, S.24 und 25). Dieser Ansatz hatte zwei wesentliche Charakteristika: einerseits war jedes denkbare CD8+ Epitop von 8 bis 11 Aminosäuren Länge in mindestens einem dieser 15-mere enthalten. Andererseits konnten die Pentadecapeptide auch CD4+ T-Zell-Antworten induzieren. Um die CD4+ und CD8+ T-Zell-Epitope identifizieren zu können, mussten jedoch nicht notwendigerweise 120 bzw. 138 einzelne Tests durchgeführt werden. Vielmehr war es möglich, durch Zusammenfassung einzelner Peptide zu Peptidpools, die Anzahl benötigter Tests deutlich zu reduzieren. In dieser Arbeit kamen dazu zwei Verfahren zum Einsatz. Bei Patienten mit komplexen Reaktionen gegen pp65 mussten bis zu 30 Peptide und mehr nachgetestet werden. Um die Anzahl der dazu erforderlichen Proben möglichst klein zu halten, wurden die sehr wahrscheinlichen "Kandidaten“ einzeln nachgetestet, während weniger wahrscheinliche "Kandidaten“ zu Pools entsprechend einer zweidimensionalen Matrix zusammengefasst wurden. Die T-Zell-Epitop-Kartierung selber wurde aus dem gleichem Grund erstmals mit einem System durchgeführt, das noch effizienter arbeitete. Hierzu wurden die 120 IE-1- und die 138 pp65-Pentadecapeptide entsprechend einer dreidimensionalen Matrix zusammengefasst (illustriert am Beispiel von IE-1 in Abb. 5, S.32).

Die Vβ-Typisierung Peptid-spezifischer T-Zell-Populationen wurde wie folgt durchgeführt: PBMC wurden, wie unter Abschnitt 3.3.1 dargestellt, präpariert, mit Zellkulturmedium auf 1.0 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt und über Nacht vorinkubiert. Am nächsten Tag wurden 2052-Falcon-Röhrchen mit 100 µl Zellkulturmedium und 1 µg eines zuvor als immunogen identifizierten einzelnen Peptids beschickt und je ein mit FITC und ein mit PE markierter anti-Vβ-mAk zugegeben (z.B. anti-Vβ1-PE und anti-Vβ2-FITC). Zusätzlich wurden eine mit anti-Panαβ-PE gefärbte Probe sowie eine unstimulierte Kontrolle mitgeführt. Schließlich wurden 400 µl der Zellsuspension zugegeben und die Zellen wie oben (Abschnitt 3.3.3) weiterverarbeitet. Die intrazelluläre Färbung erfolgte nach 6-stündiger Stimulation mit anti-IFN-γ-APC, parallel zur Färbung mit anti-CD8-PerCP. Bei der anschliessenden Analyse wurden CD8^high Zellen ausgewählt ("gating“)

und die Vβ-Familien der CD8^high/IFN-γ+ T-Zell-Populationen bestimmt. Ein Beispiel dafür ist in Abbildung 13 (S.61) wiedergegeben.

Zur Separation Peptid-spezifischer T-Zellpopulationen wurde nach Stimulation mit dem jeweiligen Peptid ein Sekretions-Assay mit anschließender magnetischer Zellseparation und durchflusszytometrischer Feinsortierung durchgeführt. Die PBMC-Präparation erfolgte wie unter Abschnitt 3.3.1 erläutert.

• Die Zellen wurden dann mit Zellkulturmedium auf 2.0 x 10⁶ Zellen/ml eingestellt und in einem 50 ml 2070-Falcon-Röhrchen über Nacht vorinkubiert.
• Nach Entnahme der für die Vβ-Typisierung benötigten Zellen wurden die verbleibenden Zellen mit 5 µg/10⁶ Zellen des jeweiligen Peptids stimuliert (um maximale T-Zell-Frequenzen zu erreichen; in einem Falle wurden 2 µg/10⁶ Zellen verwendet).
• Nach 6 h Inkubation im Brutschrank (bei 37°C und 5 % CO₂-Atmosphäre) wurde das Röhrchen mit eiskaltem PBS aufgefüllt und bei 4°C mit 250 g für 10 min. zentrifugiert.
• Nach Absaugen des Überstandes wurde das Zellpellet resuspendiert und in 80 µl kaltem Zellkulturmedium aufgenommen.
• Daraufhin wurden 20 µl eines anti-CD45- und anti-IFN-γ-spezifischen mAk zugegeben ("catch reagent“) und die Zellen für 7 min. auf Eis inkubiert.
• Die Probe wurde in mehrere Aliquots von jeweils 5.0 x 10⁶ Zellen geteilt, die Zellen wurden mit je 50 ml 37°C warmen Zellkulturmedium verdünnt (die Zellkonzentration in jedem 50 ml-Röhrchen betrug so 1.0 x 10⁵ Zellen/ml) und im Brutschrank für 45 min. unter intermittierender Rotation inkubiert.
• Nach der Sekretionsphase wurden die Zellen zentrifugiert, das Medium abgesaugt und mit PBS/BSA/EDTA (MACS-Puffer) gewaschen (250 g, 10 min., 4°C).
• Anschließend wurden die Zellen wieder gepoolt, in 80 µl kaltem MACS-Puffer aufgenommen und 20 µl anti-IFN-γ-PE (detection antibody) zugegeben. Gleichzeitig erfolgte die Oberflächenfärbung mit anti-CD69-FITC, anti-CD14-PerCP und anti-CD8-APC. Ausserdem wurden 4 µl einer humanen Immunglobulin-Lösung (Octagam^®) zugesetzt, um Fc-Rezeptoren abzusättigen. Die Probe wurden dann für 10 min. auf Eis inkubiert.
• Danach wurden die Zellen erneut gewaschen und in 80 µl kalten MACS-Puffer resuspendiert, bevor 20 µl anti-PE-Microbeads zugegeben wurden und die Probe für 15 min. bei 6°C inkubiert wurde.[Seite 34↓]
• Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen in 1 ml entgastem, kaltem MACS-Puffer aufgenommen und durch ein Filter auf eine LS Separationssäule (Miltenyi Biotec) gegeben, die sich in einem MidiMACS Magneten (Miltenyi Biotec) befand. Die Säule wurde dreimal mit entgastem MACS-Puffer gespült, bevor die zurückgehaltenen Zellen ausserhalb des Magnetfeldes über einer zweiten LS Säule ausgewaschen wurden. Der Separationsvorgang wurde dann noch einmal wiederholt.
• Die gereinigte CD8+/CD69+/IFN-γ+ Zellpopulation wurde schließlich auf Eis gelagert und unmittelbar darauf im Deutschen Rheumaforschungszentrum mit Hilfe eines FACSVantage- oder FACSDiva-Cell-Sorters nachsortiert, um einen maximalen Reinheitsgrad zu erreichen.
• Die sortierten Zellen wurden schließlich in PBS aufgenommen und bei -20°C für die PCR-Analyse aufbewahrt. Ein Beispiel für die Separation einer Peptid-spezifischen CD8+ T-Zell-Reaktion ist in Abbildung 14 (S.62) gezeigt.

Im Thymus erhält jede T-Zelle durch Rekombination spezifischer V-J- oder V-D-J-Segmente sowie Veränderungen im Bereich der Verknüpfungsstellen der Segmente (N-Region) eine individuelle TCR-DNA-Sequenz, die an die Tochterzellen weitergegeben wird. Bei Vorkommen klonaler Expansionen in einem Zellgemisch findet man daher zahlreiche T-Zellen mit gleichen TCR-Sequenzen (sog. monoklonale Zellen). Dieses Rearrangement umfaßt dabei alle Gensegmente: auch wenn die Zelle später einen αβ-T-Zell-Rezeptor exprimiert, werden die γ- und δ-Segmente ebenfalls rearrangiert. Die PCR ermöglicht eine schnelle Analyse dieser rearrangierten TCR-Gene, eine Methode, die z.B. Anwendung in der Dermatologie zur Diagnose kutaner T-Zell-Lymphome findet. Dabei werden überwiegend Rearrangements der TCR-γ-Gene untersucht, die im Vergleich zu den anderen TCR eine einfachere Struktur haben. Diese Untersuchungen wurden im Rahmen einer Kooperation mit der Abteilung für Dermatologie und Venerologie der Charité unter der Leitung von Dr. Lukowsky durchgeführt. Die Methode inklusive des Primer-Designs ist detailliert in [70] und [71] dargestellt.

• Zunächst wurde die DNA aus den frisch aufgetauten, gereinigten T-Zell-Populationen durch Behandlung mit Proteinase K isoliert.
• Anschließend wurden zwei TCR-γ-PCRs durchgeführt: die PCR-1 unter Verwendung der Konsensus-Primer VG1 und JG1/2, die Rearrangements der Gensegmente Vγ1-8 und Jγ1/2 amplifizierten, sowie die PCR-2 mit Primern für die Segmente Vγ9, Vγ10, Vγ11 und Jγ1/2 [Seite 35↓](VG9, VG10/11, JG1/2). Die PCR-Produkte wurden auf mit 2 % Ethidiumbromid gefärbtem Agarosegel auf erfolgreiche Amplifikation untersucht.
• Die am 5´-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5-Carboxy-fluorescein markierten Primer VG1 oder JG1/2 wurden anschließend der DNA-Fragmentanalyse durch ein ABI 310 PRISM DNA-Sequenzierungsgerät unterzogen.
• Die Trennungen wurden dann mittels "GeneScan 372“ Software analysiert. Die Klonalität einer T-Zell-Population wurde angenommen, wenn ein Peak die Profile der Fluoreszenzintensität mit einer "peak-height-ratio“ von mindestens Zwei dominierten [71].

Für jedes Pentadecapeptid, das zu CD8+ T-Zell-Antworten führte, wurde mit Hilfe der über das Internet frei zugänglichen Datenbanken "SYFPEITHI“ (www.syfpeithi.bmi-heidelberg.com) und "BIMAS“ (www.bimas.cit.nih.gov) eine Vorhersage der jeweils wahrscheinlichsten präsentierenden HLA-Allele und in den 15-meren enthaltenen immunogenen Nonamer-Sequenzen durchgeführt. Zusätzlich wurden die HLA-Typen von Patienten und gesunden Probanden, die zuvor im Rahmen anderer Arbeiten von anderen Untersuchern kartiert worden waren und auf die gleichen Peptide reagierten, verglichen. Die Reaktivitäten dieser Probanden zeigen die Tabellen 7 und 8. Für Peptide, die zu CD4+ T-Zell-Reaktionen führten, waren die Möglichkeiten zur Vorhersage der präsentierenden HLA-Klasse-II-Allele begrenzter: da "BIMAS“ ausschließlich die Präsentation an Klasse-I-Allelen vorhersagt und das Repertoire von "SYFPEITHI“ nur vier DR-Allele umfaßt (DRB1*0101, 0301, 0401, and 1101), beruhte die Vorhersage hauptsächlich auf der HLA-Konformität von Patienten und gesunden Spendern, die auf gleiche Peptide CD4+ T-Zellreaktionen zeigten.

[Seite 36↓]

[Seite 37↓]

[Seite 38↓]

Fußnoten und Endnoten

¹ Um Verwirrungen in der Gesamtdokumentation des Labors zu vermeiden, wurde die ursprügliche Numerierung der Patienten aus der Vorstudie beibehalten; die Numerierung der Patienten in dieser Arbeit ist daher nicht kontinuierlich.