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3.  Materialien und Methoden

3.1. Materialien

3.1.1. Patienten- und Probandenmaterial

In einem vorangegangenen Projekt wurden die T-Zell-Antworten auf IE-1 und pp65 von 43 herz- und lungentransplantierten Patienten von einem anderen Untersucher über 6 Monate nach Transplantation verfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurden alle HCMV-IgG-seropositven Patienten (kurz: Patienten; Pt-2, Pt-7, Pt-91 usw.) aus dieser Gruppe untersucht, die messbare T-Zell-Reaktionen auf eines oder beide Proteine hatten. Die wichtigsten Charakteristika dieser insgesamt 17 herz- und 3 lungentransplantierten Patienten, die alle bereits vor Transplantation HCMV-IgG-seropositiv waren, sind in Tabelle 3 (S.19) zusammengefasst. Die Verteilung der HLA-Allele in der Patientengruppe zeigt Abbildung 3 (S.20). Mit der Epitop-Kartierung wurde zwischen dem 150. und 450. Tag nach Transplantation begonnen. Dazu wurde den Patienten zu Routineuntersuchungszeitpunkten in der Transplantationsambulanz oder während stationärer Klinikaufenthalte im DHZB 16.2 ml venöses Blut (sechs 2.7 ml Cirtat-Monovetten) abgenommen. Aus diesem Blut wurden am gleichen Tag PBMC präpariert.

Zur Untersuchung der HCMV-IgG-seropositiven gesunden Probanden (kurz: gesunde Probanden; Pr-1, Pr-2, usw.) wurde für methodische Untersuchungen venöses Vollblut in verschiedenen Serien und unter Verwendung von Citrat oder Heparin abgenommen.

3.1.2. Verbrauchsmaterialien

2.7 und 10 ml Citrat-Monovetten

Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

5.5 ml Lithium-Heparin-Monovetten

Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

10 ml Monovetten mit 150 I.E. Liquemin

Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

0.5, 1.5 und 2.0 ml Eppendorfgefässe

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

2052-Falcon-Röhrchen (5 ml; Polypropylen)

Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

14 ml "Cellstar“-Polypropylen-Röhrchen

Greiner, Frickenhausen, Deutschland

14 ml Polyethylen-Röhrchen mit Deckel

Greiner, Frickenhausen, Deutschland

2070-Falcon-Röhrchen (50 ml; Polypropylen)

Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

Pipettenspitzen zu 10, 100 und 1000 µl

Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

sterile Transferpipetten (3.5 ml)

Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

sterile Pipettenspitzen (5 und 10 ml)

Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA

LS Zellseparationssäulen

Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland

Parameter

Wert

Alter bei Transplantation in Lebensjahren: Median (Spannweite)

50 (31-66)

  

Geschlecht: w/m

5/15

  

Diagnose:

 

Dilatative Kardiomyopathie (dKMP)

12 (60 %)

Restriktive Kardiomyopathie (rKMP)

1 (5 %)

Koronare Herzerkrankung (KHK)

3 (15 %)

Herzinsuffizienz bei hochgradiger Aorten- und Mitralinsuffizienz

1 (5 %)

Lungenemphysem bei α-1-Antitrypsinmangel

2 (10 %)

Primäre Pulmonale Hypertonie (PPH)

1 (5 %)

  

Transplantiertes Organ: Herz/Doppel-Lunge

17/3

  

Spender-/Empfänger-HCMV-Serostatus:

 

D-R+

11 (55 %)

D+R+

9 (45 %)

  

Immunsuppressive Therapie (Beginn/Ende des Beobachtungszeitraums):

 

Cyclosporin A

20/20

Prednisolon

20/20

Azathioprin

14/8

Mycofenolat Mofetil

6/10

Rapamycin

1/1

  

Abstoßungen: Nein/Ja

6/14

  

HCMV-Reaktivierung:

 

1 = HCMV-seropositiv, keine DNA-/Antigenämie

6 (30 %)

2 = DNA-/Antigenämie, keine klinischen Symptome

7 (35 %)

3 = DNA-/Antigenämie, Fieber und/oder Leukopenie

2 (10 %)

4 = DNA-/Antigenämie, invasive HCMV-Erkrankung

5 (25 %)

  

Anzahl der dokumentierten Reaktivierungen je Patient im Beobachtungszeitraum: Median (Spannweite)

1 (0-5)

  

Frühe ( ≤ 90 Tage) und späte ( > 90 Tage) HCMV-Reaktivierungen

(4 Patienten hat sowohl frühe wie späte Reaktivierungen)

18/6

  

Antigenämie: Median (Spannweite): positive/200.000 Zellen

3 (0-39)

* 4 Patienten hatten sowohl frühe als auch späte Reaktivierungen


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3.1.3.  Chemikalien, Medium, Lösungen, Puffer

Bovines Serum Albumin (BSA)

Serva, Heidelberg, Deutschland

Brefeldin A (BFA)

Sigma, München, Deutschland

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Pierce, Rockford, USA

Ethyldiamin tetra-Essigsäure (EDTA)

Sigma, Steinheim, Deutschland

Fetales Kälberserum (FCS)

Biochrom, Berlin, Deutschland

L-Glutamin

Biochrom, Berlin, Deutschland

Natrium Azid (NaN3)

Serva, Heidelberg, Deutschland

Paraformaldehyd (PFA)

Merck, Darmstadt, Deutschland

Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonolaureat (Tween 20)

Sigma, Steinheim, Deutschland

Aqua dest.

Braun, Melsungen, Deutschland

FACS-Lyse-Reagenz

BD, San Jose, USA

Ficoll-Paque

Pharmacia, Uppsala, Schweden

Na-Heparin (Liquemin®)

Roche, Eppstein, Deutschland

Penicillin/Streptomycin

Biochrom, Berlin, Deutschland

Humane Immmunglobulin-Lösung (Octagam®)

Octapharma, Langenfeld, Deutschland

Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Dulbeccos, Gibco, Grossbritannien

Unsterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Hausapotheke der Charité

1640 RPMI-Medium

Biochrom, Berlin, Deutschland


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3.1.4.  Monoklonale Maus-anti-Human-Antikörper und -Antikörperkonjugate

Antikörper

Hersteller

Antikörper

Hersteller

anti-CD28

BD, San Jose, USA

anti-Vβ7-FITC

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-CD49d

BD, San Jose, USA

anti-Vβ8.1/8.2-FITC

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-CD3-PerCP

BD, San Jose, USA

anti-Vβ9-PE

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-CD4-PE

BD, San Jose, USA

anti-Vβ11-FITC

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-CD8-PerCP

BD, San Jose, USA

anti-Vβ12-FITC

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-CD8-APC

BD, San Jose, USA

anti-Vβ13.1-PE

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-CD14-PerCP

BD, San Jose, USA

anti-Vβ13.6-FITC

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-CD69-FITC

BD, San Jose, USA

anti-Vβ14-PE

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-CD69-PE

BD, San Jose, USA

anti-Vβ17-PE

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-IFN-γ-FITC

BD, San Jose, USA

anti-Vβ18-PE

Immunotech, Marseille, Frank-

   

reich

anti-IFN-γ-APC

IQ Products, Groningen,

anti-Vβ20-FITC

Immunotech, Marseille, Frank-

 

Niederlande

 

reich

anti-Vβ1-PE

Immunotech, Marseille,

anti-Vβ21.3-FITC

Immunotech, Marseille, Frank-

 

Frankreich

 

reich

anti-Vβ2-FITC

Immunotech, Marseille,

anti-Vβ22-FITC

Immunotech, Marseille, Frank-

 

Frankreich

 

reich

anti-Vβ3-PE

Immunotech, Marseille,

anti-Vβ23-PE

Immunotech, Marseille, Frank-

 

Frankreich

 

reich

anti-Vβ5.1-PE

Immunotech, Marseille,

anti-Panα/β-PE

Immunotech, Marseille, Frank-

 

Frankreich

 

reich

anti-Vβ5.2-PE

Immunotech, Marseille,

anti-CD45-anti-IFN-γ

Miltenyi Biotec, Bergisch-

 

Frankreich

(Catch Reagent)

Gladbach, Deutschland

anti-Vβ5.3-PE

Immunotech, Marseille,

anti-IFN-γ-PE (Detec-

Miltenyi Biotec, Bergisch-

 

Frankreich

tion Antibody)

Gladbach, Deutschland

anti-Vβ6.7-FITC

Serotech, Düsseldorf,

anti-PE-Microbeads

Miltenyi Biotec, Bergisch-

 

Deutschland

 

Gladbach, Deutschland

3.1.5. Antigene: Einzelpeptide, Peptidpools, virales Lysat

Die verwendeten Peptide von 9, 10 und 15 Aminosäuren Länge wurden in der Abteilung für Peptid- und Proteinchemie des Instituts für Medizinische Immunologie der Charité und der Firma NMI (Reutlingen) nach Standard-Fmoc-Verfahren [65] synthetisiert und anschließend gefriergetrocknet. Die Sequenzen der Peptide sind den Tabellen 5 (S.24) und 6 (S.25) zu entnehmen. Je[Seite 23↓]des Peptid wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 80 mg/ml gelöst (Stammlösung). Aus diesen Stammlösungen wurden je nach Bedarf Arbeitslösungen durch Verdünnung mit DMSO hergestellt. Für methodische Arbeiten benötigte Einzelpeptide wurden direkt vor der Zugabe mit PBS auf die benötigten Konzentrationen eingestellt. Zur Herstellung der Peptidpools wurden die Einzelpeptide bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre mit DMSO auf eine Konzentration von 0.25 mg/ml gebracht, wie benötigt zusammenpipettiert, und in Aliquots von 4 µl eingefroren. Zwei Peptidpools (die "Gesamtmischungen“) enthielten jeweils alle Pentadecapeptide des entsprechenden Proteins. Die Konzentration der Peptide in diesen Pools betrug ebenfalls 1 µg/ml. Auch diese Pools wurden in Aliquots zu 4 µl eingefroren. Einzelpeptide zur Nachtestung wurden mit DMSO auf 1 mg/ml, gereinigtes und zuvor im Ulltraschallbad homogenisiertes HCMV-Lysat (ABI, Columbia, USA) mit PBS auf eine Konzentration von 0.25 mg/ml gebracht. Alle Antigene wurden bei -70° C aufbewahrt.

3.2. Verwendete Geräte und Software

3.2.1. Verwendete Geräte

Absaugpumpe Laboport

Neuberger, Freiburg, Deutschland

Brutschrank EG 110 R

Jouan, Saint Nazaire, Frankreich

FACSCalibur-Durchflusszytometer

Becton Dickinsion, San Jose, USA

FACSVantage-Durchflusszytometer

Becton Dickinsion, San Jose, USA

FACSDiva-Durchflusszytometer

Becton Dickinsion, San Jose, USA

Laminar-Flow-Box

Kendro, Hanau, Deutschland

Lichtmikroskop

Olympus, Tokio, Japan

MidiMACS-Separationsständer und -magnet

Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland

Neubauer Zählkammer

Brand, Wertheim, Deutschland

Pipettierhilfe Pipettus standard

Hirschmann, Eberstadt, Deutschland

Wasserbad

Grant, Camebridge, Grossbritannien

Zentrifuge Centrifuge 5810

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Kühlzentrifuge CR422

Jouan, Saint Nazaire, Frankreich

3.2.2. Verwendete Software

Cell QuestPro

Becton Dickinsion, San Jose, USA

Paint-A-GatePro

Becton Dickinsion, San Jose, USA

Word 97/2000

Microsoft Corp., Redmont, USA

Excel 7.0

Microsoft Corp., Redmont, USA

Power Point

Microsoft Corp., Redmont, USA

FreeHand 9

Macromedia, San Francisco, USA

SPSS für Windows

SPSS Inc., Chicago, USA

Peptid

Aminosäure-Sequenz

Peptid

Aminosäure-Sequenz

Peptid

Aminosäure-Sequenz

1

MESSAKRKMDPDNPD

41

EDKREMWMACIKELH

81

SVMLAKRPLITKPEV

2

AKRKMDPDNPDEGPS

42

EMWMACIKELHDVSK

82

AKRPLITKPEVISVM

3

MDPDNPDEGPSSKVP

43

ACIKELHDVSKGAAN

83

LITKPEVISVMKRRI

4

NPDEGPSSKVPRPET

44

ELHDVSKGAANKLGG

84

PEVISVMKRRIEEIC

5

GPSSKVPRPETPVTK

45

VSKGAANKLGGALQA

85

SVMKRRIEEICMKVF

6

KVPRPETPVTKATTF

46

AANKLGGALQAKARA

86

RRIEEICMKVFAQYI

7

PETPVTKATTFLQTM

47

LGGALQAKARAKKDE

87

EICMKVFAQYILGAD

8

VTKATTFLQTMLRKE

48

LQAKARAKKDELRRK

88

KVFAQYILGADPLRV

9

TTFLQTMLRKEVNSQ

49

ARAKKDELRRKMMYM

89

QYILGADPLRVCSPS

10

QTMLRKEVNSQLSLG

50

KDELRRKMMYMCYRN

90

GADPLRVCSPSVDDL

11

RKEVNSQLSLGDPLF

51

RRKMMYMCYRNIEFF

91

LRVCSPSVDDLRAIA

12

NSQLSLGDPLFPELA

52

MYMCYRNIEFFTKNS

92

SPSVDDLRAIAEESD

13

SLGDPLFPELAEESL

53

YRNIEFFTKNSAFPK

93

DDLRAIAEESDEEEA

14

PLFPELAEESLKTFE

54

EFFTKNSAFPKTTNG

94

AIAEESDEEEAIVAY

15

ELAEESLKTFEQVTE

55

KNSAFPKTTNGCSQA

95

ESDEEEAIVAYTLAT

16

ESLKTFEQVTEDCNE

56

FPKTTNGCSQAMAAL

96

EEAIVAYTLATAGVS

17

TFEQVTEDCNENPEK

57

TNGCSQAMAALQNLP

97

VAYTLATAGVSSSDS

18

VTEDCNENPEKDVLA

58

SQAMAALQNLPQCSP

98

LATAGVSSSDSLVSP

19

CNENPEKDVLAELVK

59

AALQNLPQCSPDEIM

99

GVSSSDSLVSPPESP

20

PEKDVLAELVKQIKV

60

NLPQCSPDEIMAYAQ

100

SDSLVSPPESPVPAT

21

VLAELVKQIKVRVDM

61

CSPDEIMAYAQKIFK

101

VSPPESPVPATIPLS

22

LVKQIKVRVDMVRHR

62

EIMAYAQKIFKILDE

102

ESPVPATIPLSSVIV

23

IKVRVDMVRHRIKEH

63

YAQKIFKILDEERDK

103

PATIPLSSVIVAENS

24

VDMVRHRIKEHMLKK

64

IFKILDEERDKVLTH

104

PLSSVIVAENSDQEE

25

RHRIKEHMLKKYTQT

65

LDEERDKVLTHIDHI

105

VIVAENSDQEESEQS

26

KEHMLKKYTQTEEKF

66

RDKVLTHIDHIFMDI

106

ENSDQEESEQSDEEE

27

LKKYTQTEEKFTGAF

67

LTHIDHIFMDILTTC

107

QEESEQSDEEEEEGA

28

TQTEEKFTGAFNMMG

68

DHIFMDILTTCVETM

108

EQSDEEEEEGAQEER

29

EKFTGAFNMMGGCLQ

69

MDILTTCVETMCNEY

109

EEEEEGAQEEREDTV

30

GAFNMMGGCLQNALD

70

TTCVETMCNEYKVTS

110

EGAQEEREDTVSVKS

31

MMGGCLQNALDILDK

71

ETMCNEYKVTSDACM

111

EEREDTVSVKSEPVS

32

CLQNALDILDKVHEP

72

NEYKVTSDACMMTMY

112

DTVSVKSEPVSEIEE

33

ALDILDKVHEPFEEM

73

VTSDACMMTMYGGIS

113

VKSEPVSEIEEVAPE

34

LDKVHEPFEEMKCIG

74

ACMMTMYGGISLLSE

114

PVSEIEEVAPEEEED

35

HEPFEEMKCIGLTMQ

75

TMYGGISLLSEFCRV

115

IEEVAPEEEEDGAEE

36

EEMKCIGLTMQSMYE

76

GISLLSEFCRVLCCY

116

APEEEEDGAEEPTAS

37

CIGLTMQSMYENYIV

77

LSEFCRVLCCYVLEE

117

EEDGAEEPTASGGKS

38

TMQSMYENYIVPEDK

78

CRVLCCYVLEETSVM

118

AEEPTASGGKSTHPM

39

MYENYIVPEDKREMW

79

CCYVLEETSVMLAKR

119

TASGGKSTHPMVTRS

40

YIVPEDKREMWMACI

80

LEETSVMLAKRPLIT

120

GKSTHPMVTRSKADQ

Peptid

Aminosäure-Sequenz

Peptid

Aminosäure-Sequenz

Peptid

Aminosäure-Sequenz

1

MESRGRRCPEMISVL

47

AFVFPTKDVALRHVV

93

FTSQYRIQGKLEYRH

2

GRRCPEMISVLGPIS

48

PTKDVALRHVVCAHE

94

YRIQGKLEYRHTWDR

3

PEMISVLGPISGHVL

49

VALRHVVCAHELVCS

95

GKLEYRHTWDRHDEG

4

SVLGPISGHVLKAVF

50

HVVCAHELVCSMENT

96

YRHTWDRHDEGAAQG

5

PISGHVLKAVFSRGD

51

AHELVCSMENTRATK

97

WDRHDEGAAQGDDDV

6

HVLKAVFSRGDTPVL

52

VCSMENTRATKMQVI

98

DEGAAQGDDDVWTSG

7

AVFSRGDTPVLPHET

53

ENTRATKMQVIGDQY

99

AQGDDDVWTSGSDSD

8

RGDTPVLPHETRLLQ

54

ATKMQVIGDQYVKVY

100

DDVWTSGSDSDEELV

9

PVLPHETRLLQTGIH

55

QVIGDQYVKVYLESF

101

TSGSDSDEELVTTER

10

HETRLLQTGIHVRVS

56

DQYVKVYLESFCEDV

102

DSDEELVTTERKTPR

11

LLQTGIHVRVSQPSL

57

KVYLESFCEDVPSGK

103

ELVTTERKTPRVTGG

12

GIHVRVSQPSLILVS

58

ESFCEDVPSGKLFMH

104

TERKTPRVTGGGAMA

13

RVSQPSLILVSQYTP

59

EDVPSGKLFMHVTLG

105

TPRVTGGGAMAGAST

14

PSLILVSQYTPDSTP

60

SGKLFMHVTLGSDVE

106

TGGGAMAGASTSAGR

15

LVSQYTPDSTPCHRG

61

FMHVTLGSDVEEDLT

107

AMAGASTSAGRKRKS

16

YTPDSTPCHRGDNQL

62

TLGSDVEEDLTMTRN

108

ASTSAGRKRKSASSA

17

STPCHRGDNQLQVQH

63

DVEEDLTMTRNPQPF

109

AGRKRKSASSATACT

18

HRGDNQLQVQHTYFT

64

DLTMTRNPQPFMRPH

110

RKSASSATACTSGVM

19

NQLQVQHTYFTGSEV

65

TRNPQPFMRPHERNG

111

SSATACTSGVMTRGR

20

VQHTYFTGSEVENVS

66

QPFMRPHERNGFTVL

112

ACTSGVMTRGRLKAE

21

YFTGSEVENVSVNVH

67

RPHERNGFTVLCPKN

113

GVMTRGRLKAESTVA

22

SEVENVSVNVHNPTG

68

RNGFTVLCPKNMIIK

114

RGRLKAESTVAPEED

23

NVSVNVHNPTGRSIC

69

TVLCPKNMIIKPGKI

115

KAESTVAPEEDTDED

24

NVHNPTGRSICPSQE

70

PKNMIIKPGKISHIM

116

TVAPEEDTDEDSDNE

25

PTGRSICPSQEPMSI

71

IIKPGKISHIMLDVA

117

EEDTDEDSDNEIHNP

26

SICPSQEPMSIYVYA

72

GKISHIMLDVAFTSH

118

DEDSDNEIHNPAVFT

27

SQEPMSIYVYALPLK

73

HIMLDVAFTSHEHFG

119

DNEIHNPAVFTWPPW

28

MSIYVYALPLKMLNI

74

DVAFTSHEHFGLLCP

120

HNPAVFTWPPWQAGI

29

VYALPLKMLNIPSIN

75

TSHEHFGLLCPKSIP

121

VFTWPPWQAGILARN

30

PLKMLNIPSINVHHY

76

HFGLLCPKSIPGLSI

122

PPWQAGILARNLVPM

31

LNIPSINVHHYPSAA

77

LCPKSIPGLSISGNL

123

AGILARNLVPMVATV

32

SINVHHYPSAAERKH

78

SIPGLSISGNLLMNG

124

ARNLVPMVATVQGQN

33

HHYPSAAERKHRHLP

79

LSISGNLLMNGQQIF

125

VPMVATVQGQNLKYQ

34

SAAERKHRHLPVADA

80

GNLLMNGQQIFLEVQ

126

ATVQGQNLKYQEFFW

35

RKHRHLPVADAVIHA

81

MNGQQIFLEVQAIRE

127

GQNLKYQEFFWDAND

36

HLPVADAVIHASGKQ

82

QIFLEVQAIRETVEL

128

KYQEFFWDANDIYRI

37

ADAVIHASGKQMWQA

83

EVQAIRETVELRQYD

129

FFWDANDIYRIFAEL

38

IHASGKQMWQARLTV

84

IRETVELRQYDPVAA

130

ANDIYRIFAELEGVW

39

GKQMWQARLTVSGLA

85

VELRQYDPVAALFFF

131

YRIFAELEGVWQPAA

40

WQARLTVSGLAWTRQ

86

QYDPVAALFFFDIDL

132

AELEGVWQPAAQPKR

41

LTVSGLAWTRQQNQW

87

VAALFFFDIDLLLQR

133

GVWQPAAQPKRRRHR

42

GLAWTRQQNQWKEPD

88

FFFDIDLLLQRGPQY

134

PAAQPKRRRHRQDAL

43

TRQQNQWKEPDVYYT

89

IDLLLQRGPQYSEHP

135

PKRRRHRQDALPGPC

44

NQWKEPDVYYTSAFV

90

LQRGPQYSEHPTFTS

136

RHRQDALPGPCIAST

45

EPDVYYTSAFVFPTK

91

PQYSEHPTFTSQYRI

137

DALPGPCIASTPKKH

46

YYTSAFVFPTKDVAL

92

EHPTFTSQYRIQGKL

138

GPCIASTPKKHRG


[Seite 26↓]

3.3.  Methoden

3.3.1. Zellpräparation

PBMC wurden aus Vollblut durch Dichtegradienten-Zentrifugation mittels Ficoll-Paque (Dichte: 1.078 g/ml bei 20°C) isoliert. Die Präparation folgte bei allen Versuchen i.W. dem gleichen Protokoll (auf Unterschiede ist hingewiesen):

3.3.2. Antigen-Stimulation und intrazelluläre Zytokinfärbung unter Verwendung von Vollblut

3.3.3. Antigen-Stimulation und intrazelluläre Zytokinfärbung unter Verwendung von PBMC


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3.3.4.  Nachtestung einzelner Peptide mit und ohne Zusatz kostimulatorischer Antikörper

Um den Einfluss kostimulatorischer Antikörper auf die T-Zell-Antwort im oben beschriebenen Versuchsaufbau zu untersuchen, wurden jeweils 200 µl Kulturmedium in ein 2052-Falcon-Röhrchen pipettiert, 2 µl eines 1 mg/ml konzentrierten Einzelpeptids zugegeben und vorsichtig resuspendiert. 101 µl dieses Ansatzes wurden in ein zweites 2052-Falcon-Röhrchen überführt und diesem Ansatz je 1 µl anti-CD28 und anti-CD49d (Endkonzentration: 1 µg/ml) zugegeben. Diese Verfahrensweise gewährleistete gleiche Peptidkonzentrationen in beiden Ansätzen. Zwei mit 4 µl DMSO versetzte Negativkontrollen, die eine ohne, die andere mit 1 µg/ml anti-CD28 und anti-CD49d, wurden ebenfalls mitgeführt. Anschließend wurden PBMC eines Patienten zugeben, bei dem Stimulation mit dem jeweiligen Peptid zu CD4+ und/oder CD8+ T-Zell-Antworten führte. Die Zellen wurden nun wie unter Abschnitt 3.3.3 dargestellt weiterverarbeitet.

3.3.5. Durchflusszytometrische Analyse

Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Charakterisierung von Antigenen auf und in einer Zelle mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Die Zellen werden dazu zunächst in einem Flüssigkeitsmantel als einzelne Partikel in laminare Strömung gebracht, bevor sie in die Messkammer eintreten. Dort trifft (monochromatisches) Laserlicht auf die einzelne Zelle - und damit auf die an Antikörper gebundenen Fluoreszenzfarbstoffe. Durch das Laserlicht angeregt, emittieren diese ihrerseits Licht eines definierten Wellenlängenspektrums, das von Sensoren in der Messkammer als Impuls aufgenommen, verstärkt, und anschließend rechnergestützt aufbereitet wird. Gleichzeitig wird das Laserlicht je nach Beschaffenheit der getroffenen Zelle charakteristisch gestreut. Aus der Interpretation von Vorwärtsstreulicht (FSC = forward scatter; ein globales Maß für die Grösse) und Seitswärtsstreulicht (SSC = sideward scatter; ein globales Maß für die Granularität) sind Rückschlüsse auf Größe und Granularität der Zelle möglich. Bei einem Vier-Farben-Durchflusszytometer wie dem FACSCalibur können durch die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen mit ähnlichen Absorptions-, aber unterschiedlichen Emissionsmaxima bis zu sechs Parameter (vier Antigene sowie Grösse und Granularität) gleichzeitig untersucht werden. Als Farbstoffe wurden in dieser Arbeit Fluoreszein Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Perdinin Chlorophyll-Protein (PerCP) und Allophycocyanin (APC) verwendet. Die Interpretation der gemessenen Proben ist in Abbildung 4 (S.30) und in [67] dargestellt.


[Seite 30↓]


[Seite 31↓]

3.3.6.  Methoden der T-Zell-Epitop-Kartierung

Die Prinzipien der durchflusszytometrischen T-Zell-Epitop-Kartierung sind mehrfach detailliert dargestellt worden [30 31 32 68 69]. Dazu wurden die HCMV-Proteine IE-1 und pp65 (Aminosäure-Sequenzen des HCMV-Laborstamms AD169) in Form von Pentadecapeptiden (15-mere) synthetisiert, die sich um jeweils 11 Aminosäuren überlappten. Für IE-1 waren dazu 120, für pp65 138 solcher Pentadecapeptide erforderlich (Tabelle 5 und 6, S.24 und 25). Dieser Ansatz hatte zwei wesentliche Charakteristika: einerseits war jedes denkbare CD8+ Epitop von 8 bis 11 Aminosäuren Länge in mindestens einem dieser 15-mere enthalten. Andererseits konnten die Pentadecapeptide auch CD4+ T-Zell-Antworten induzieren. Um die CD4+ und CD8+ T-Zell-Epitope identifizieren zu können, mussten jedoch nicht notwendigerweise 120 bzw. 138 einzelne Tests durchgeführt werden. Vielmehr war es möglich, durch Zusammenfassung einzelner Peptide zu Peptidpools, die Anzahl benötigter Tests deutlich zu reduzieren. In dieser Arbeit kamen dazu zwei Verfahren zum Einsatz. Bei Patienten mit komplexen Reaktionen gegen pp65 mussten bis zu 30 Peptide und mehr nachgetestet werden. Um die Anzahl der dazu erforderlichen Proben möglichst klein zu halten, wurden die sehr wahrscheinlichen "Kandidaten“ einzeln nachgetestet, während weniger wahrscheinliche "Kandidaten“ zu Pools entsprechend einer zweidimensionalen Matrix zusammengefasst wurden. Die T-Zell-Epitop-Kartierung selber wurde aus dem gleichem Grund erstmals mit einem System durchgeführt, das noch effizienter arbeitete. Hierzu wurden die 120 IE-1- und die 138 pp65-Pentadecapeptide entsprechend einer dreidimensionalen Matrix zusammengefasst (illustriert am Beispiel von IE-1 in Abb. 5, S.32).

3.3.7. Vβ-Typisierung Peptid-spezifischer T-Zell-Reaktionen

Die Vβ-Typisierung Peptid-spezifischer T-Zell-Populationen wurde wie folgt durchgeführt: PBMC wurden, wie unter Abschnitt 3.3.1 dargestellt, präpariert, mit Zellkulturmedium auf 1.0 x 106 Zellen/ml eingestellt und über Nacht vorinkubiert. Am nächsten Tag wurden 2052-Falcon-Röhrchen mit 100 µl Zellkulturmedium und 1 µg eines zuvor als immunogen identifizierten einzelnen Peptids beschickt und je ein mit FITC und ein mit PE markierter anti-Vβ-mAk zugegeben (z.B. anti-Vβ1-PE und anti-Vβ2-FITC). Zusätzlich wurden eine mit anti-Panαβ-PE gefärbte Probe sowie eine unstimulierte Kontrolle mitgeführt. Schließlich wurden 400 µl der Zellsuspension zugegeben und die Zellen wie oben (Abschnitt 3.3.3) weiterverarbeitet. Die intrazelluläre Färbung erfolgte nach 6-stündiger Stimulation mit anti-IFN-γ-APC, parallel zur Färbung mit anti-CD8-PerCP. Bei der anschliessenden Analyse wurden CD8high Zellen ausgewählt ("gating“)


[Seite 32↓]


[Seite 33↓]

und die Vβ-Familien der CD8high/IFN-γ+ T-Zell-Populationen bestimmt. Ein Beispiel dafür ist in Abbildung 13 (S.61) wiedergegeben.

3.3.8. IFN-γ-Sekretions-Assay, MACS und durchflusszytometrische Feinsortierung

Zur Separation Peptid-spezifischer T-Zellpopulationen wurde nach Stimulation mit dem jeweiligen Peptid ein Sekretions-Assay mit anschließender magnetischer Zellseparation und durchflusszytometrischer Feinsortierung durchgeführt. Die PBMC-Präparation erfolgte wie unter Abschnitt 3.3.1 erläutert.

3.3.9. TCR-γ1/2-PCR und FFA

Im Thymus erhält jede T-Zelle durch Rekombination spezifischer V-J- oder V-D-J-Segmente sowie Veränderungen im Bereich der Verknüpfungsstellen der Segmente (N-Region) eine individuelle TCR-DNA-Sequenz, die an die Tochterzellen weitergegeben wird. Bei Vorkommen klonaler Expansionen in einem Zellgemisch findet man daher zahlreiche T-Zellen mit gleichen TCR-Sequenzen (sog. monoklonale Zellen). Dieses Rearrangement umfaßt dabei alle Gensegmente: auch wenn die Zelle später einen αβ-T-Zell-Rezeptor exprimiert, werden die γ- und δ-Segmente ebenfalls rearrangiert. Die PCR ermöglicht eine schnelle Analyse dieser rearrangierten TCR-Gene, eine Methode, die z.B. Anwendung in der Dermatologie zur Diagnose kutaner T-Zell-Lymphome findet. Dabei werden überwiegend Rearrangements der TCR-γ-Gene untersucht, die im Vergleich zu den anderen TCR eine einfachere Struktur haben. Diese Untersuchungen wurden im Rahmen einer Kooperation mit der Abteilung für Dermatologie und Venerologie der Charité unter der Leitung von Dr. Lukowsky durchgeführt. Die Methode inklusive des Primer-Designs ist detailliert in [70] und [71] dargestellt.

3.3.10. Vorhersage der jeweils wahrscheinlichsten präsentierenden HLA-Allele und immunogenen Nonamer-Sequenzen stimulierender Peptide

Für jedes Pentadecapeptid, das zu CD8+ T-Zell-Antworten führte, wurde mit Hilfe der über das Internet frei zugänglichen Datenbanken "SYFPEITHI“ (www.syfpeithi.bmi-heidelberg.com) und "BIMAS“ (www.bimas.cit.nih.gov) eine Vorhersage der jeweils wahrscheinlichsten präsentierenden HLA-Allele und in den 15-meren enthaltenen immunogenen Nonamer-Sequenzen durchgeführt. Zusätzlich wurden die HLA-Typen von Patienten und gesunden Probanden, die zuvor im Rahmen anderer Arbeiten von anderen Untersuchern kartiert worden waren und auf die gleichen Peptide reagierten, verglichen. Die Reaktivitäten dieser Probanden zeigen die Tabellen 7 und 8. Für Peptide, die zu CD4+ T-Zell-Reaktionen führten, waren die Möglichkeiten zur Vorhersage der präsentierenden HLA-Klasse-II-Allele begrenzter: da "BIMAS“ ausschließlich die Präsentation an Klasse-I-Allelen vorhersagt und das Repertoire von "SYFPEITHI“ nur vier DR-Allele umfaßt (DRB1*0101, 0301, 0401, and 1101), beruhte die Vorhersage hauptsächlich auf der HLA-Konformität von Patienten und gesunden Spendern, die auf gleiche Peptide CD4+ T-Zellreaktionen zeigten.

Peptid

AS-

Amino-Säure-

Pro

HLA-Typ

% CD4+

% CD8+

 

Position

Sequenz

band

 

T-Zellen

T-Zellen

46

IE-1181-195

AANKLGGALQAKARA

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.33

   

Pr-18

A3 A24(9) B8 B35 DR1(51) DR17(3; 52) DQ2 DQ5(1)

-

1.01

   

Pr-24

A3 A24(9) B37 B62(15); Klasse-II nicht typisiert

-

0.59

       

49

IE-1193-207

ARAKKDELRRKMMYM

Pr-17

A1 A2 B8 B60(40) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

-

0.15

   

Pr-18

A3 A24(9) B8 B35 DR1(51) DR17(3; 52) DQ2 DQ5(1)

-

1.25

   

Pr-26

A1 A3 B7 B8 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

0.13

   

Pr-32

A2 B8 B50(21) DR3(52) DR4(53) DQ2 DQ3

-

0.19

   

Pr-34

A1 A24(9) B8 B18 DR3(52) DR7(53) DQ2 DQ3

-

4.82


[Seite 36↓]

Peptid

AS-

Amino-Säure-

Pro

HLA-Typ

% CD4+

% CD8+

 

Position

Sequenz

band

 

T-Zellen

T-Zellen

50

IE-1197-211

KDELRRKMMYMCYRN

Pr-17

A1 A2 B8 B60(40) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

-

0.16

   

Pr-18

A3 A24(9) B8 B35 DR1(51) DR17(3; 52) DQ2 DQ5(1)

-

0.60

   

Pr-32

A2 B8 B50(21) DR3(52) DR4(53) DQ2 DQ3

-

0.25

   

Pr-34

A1 A24(9) B8 B18 DR3(52) DR7(53) DQ2 DQ3

-

4.05

       

62

IE-1245-259

EIMAYAQKIFKILDE

Pr-28

A2 A23(9) B7 B13 DR7(53) DQ2 DQ3

-

0.71

       

73

IE-1289-311

VTSDACMMTMYGGIS

Pr-11

A1 A3 B37 DR4(53) DR8(51) DQ4 DQ8(3)

-

3.34

       

77

IE-1305-319

LSEFCRVLCCYVLEE

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

0.02

0.59

   

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.78

   

Pr-27

A2 A24(9) B7 B13 DR7(53) DR15(2; 51) DQ2 DQ6(1)

-

1.11

   

Pr-28

A2 A23(9) B7 B13 DR7(53) DQ2 DQ3

-

2.48

   

Pr-29

A2 A11 B18 B39 DR8(51) DR13(6; 52) DQ4 DQ6(1)

-

0.02

       

78

IE-1309-323

CRVLCCYVLEETSVM

Pr-3

A3 A26(10) B7 B38(16) DR/(53) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

-

0.13

   

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.22

   

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.28

   

Pr-22

A2 A66(10) B7 B41 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)DQ7(3)

-

0.67

   

Pr-26

A1 A3 B7 B8 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

0.08

   

Pr-27

A2 A24(9) B7 B13 DR7(53) DR15(2; 51) DQ2 DQ6(1)

-

0.47

   

Pr-28

A2 A23(9) B7 B13 DR7(53) DQ2 DQ3

-

2.19

   

Pr-29

A2 A11 B18 B39 DR8(51) DR13(6; 52) DQ4 DQ6(1)

-

0.01

   

Pr-33

A2 A26(10) B27 B44(12) DR1(51) DR4(53) DQ3 DQ5(1)

-

2.98

       

79

IE-1313-327

CCYVLEETSVMLAKR

Pr-8

A2 B35 B37 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1)

-

0.13

   

Pr-29

A2 A11 B18 B39 DR8(51) DR13(6; 52) DQ4 DQ6(1)

-

0.02

   

Pr-32

A2 B8 B50(21) DR3(52) DR4(53) DQ2 DQ3

-

0.11

   

Pr-33

A2 A26(10) B27 B44(12) DR1(51) DR4(53) DQ3 DQ5(1)

-

1.08


[Seite 37↓]

Peptid

AS-

Amino-Säure-

Pro

HLA-Typ

% CD4+

% CD8+

 

Position

Sequenz

band

 

T-Zellen

T-Zellen

10

pp6537-51

HETRLLQTGIHVRVS

Pr-35

A2 A74(19) B51(5) B53 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

0.60

       

11

pp6541-55

LLQTGIHVRVSQPSL

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

0.05

-

   

Pr-26

A1 A3 B7 B8 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

0.24

-

   

Pr-27

A2 A24(9) B7 B13 DR7(53) DR15(2; 51) DQ2 DQ6(1)

0.01

-

       

28

pp65109-123

MSIYVYALPLKMLNI

Pr-13

A30(19) A32(19) B49(21) B51(5) DR13(6; 52) DQ 6(1)

-

0.55

       

29

pp65113-127

VYALPLKMLNIPSIN

Pr-23

A2 A33(19) B51(5) B58(17) DR3(52) DR12(5; 52) DQ2 DQ7(3)

0.10

-

       

30

pp65117-131

PLKMLNIPSINVHHY

Pr-18

A3 A24(9) B8 B35 DR1(51) DR17(3; 52) DQ2 DQ5(1)

-

0.42

   

Pr-23

A2 A33(19) B51(5) B58(17) DR3(52) DR12(5; 52) DQ2 DQ7(3)

0.15

-

       

31

pp65121-135

LNIPSINVHHYPSAA

Pr-18

A3 A24(9) B8 B35 DR1(51) DR17(3; 52) DQ2 DQ5(1)

-

0.39

   

Pr-36

A32 A68(28) B35DR1(51) DR16(2; 51)DQ5(1)

-

0.02

       

47

pp65185-199

AFVFPTKDVALRHVV

Pr-36

A32 A68(28) B35DR1(51) DR16(2; 51)DQ5(1)

-

0.43

       

52

pp65205-219

VCSMENTRATKMQVI

Pr-2

A30(19) A32(19) B13 B27 DR9(53) DR16(2; 51) DQ3 DQ5

-

1.92

   

Pr-15

A2 A28 B27 B37 DR4(53) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ8(3)

-

2.05

   

Pr-19

A1 A2 B44(12) B57(17) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

-

0.50

Peptid

AS-

Amino-Säure-

Pro

HLA-Typ

% CD4+

% CD8+

 

Position

Sequenz

band

 

T-Zellen

T-Zellen

56

pp65221-235

DQYVKVYLESFCEDV

Pr-35

A2 A74(19) B51(5) B53 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

3.37

-

       

66

pp65261-275

QPFMRPHERNGFTVL

Pr-3

A3 A26(10) B7 B38(16) DR7(53) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

-

0.22

   

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

0.05

0.08

   

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.20

   

Pr-22

A2 A66(10) B7 B41 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

-

0.51

   

Pr-26

A1 A3 B7 B8 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

0.07

   

Pr-27

A2 A24(9) B7 B13 DR7(53) DR15(2; 51) DQ2 DQ6(1)

-

0.81

   

Pr-28

A2 A23(9) B7 B13 DR7(53) DQ2 DQ3

-

0.05

   

Pr-29

A2 A11 B18 B39 DR8(51) DR13(6; 52) DQ4 DQ6(1)

0.02

0.08

       

67

pp65265-279

RPHERNGFTVLCPKN

Pr-3

A3 A26(10) B7 B38(16) DR/(53) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

-

0.02

   

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.03

   

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.15

   

Pr-22

A2 A66(10) B7 B41 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

-

0.65

   

Pr-26

A1 A3 B7 B8 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

0.06

   

Pr-27

A2 A24(9) B7 B13 DR7(53) DR15(2; 51) DQ2 DQ6(1)

-

0.33

   

Pr-28

A2 A23(9) B7 B13 DR7(53) DQ2 DQ3

-

0.03

   

Pr-29

A2 A11 B18 B39 DR8(51) DR13(6; 52) DQ4 DQ6(1)

-

0.03

       

71

pp65281-295

IIKPGKISHIMLDVA

Pr-2

A30(19) A32(19) B13 B27 DR9(53) DR16(2; 51) DQ3 DQ5

0.16

-

   

Pr-33

A2 A26(10) B27 B44(12) DR1(51) DR4(53) DQ3 DQ5(1)

0.05

-

       

72

pp65285-299

GKISHIMLDVAFTSH

Pr-2

A30(19) A32(19) B13 B27 DR9(53) DR16(2; 51) DQ3 DQ5

0.16

-

   

Pr-33

A2 A26(10) B27 B44(12) DR1(51) DR4(53) DQ3 DQ5(1)

0.08

-

       

82

pp65325-339

QIFLEVQAIRETVEL

Pr-36

A32 A68(28) B35DR1(51) DR16(2; 51)DQ5(1)

-

0.13

       

91

pp65361-375

PQYSEHPTFTSQYRI

Pr-1

A1 A2 B52(5) B61(40) DR11(5; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

0.01

-

   

Pr-3

A3 A26(10) B7 B38(16) DR/(53) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

1.06

-

   

Pr-10

A2 A31(19) B8 DR3(52) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

1.46

-

   

Pr-17

A1 A2 B8 B60(40) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

0.16

-

   

Pr-30

A3 A30(19) B7 B51(5) DR13(6; 52) DQ6(1)

0.03

-

       

92

pp65361-375

PQYSEHPTFTSQYRI

Pr-1

A1 A2 B52(5) B61(40) DR11(5; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

0.69

-

   

Pr-3

A3 A26(10) B7 B38(16) DR/(53) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

1.26

-

   

Pr-10

A2 A31(19) B8 DR3(52) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

2.49

-

   

Pr-12

A24(9) A32(19) B14 B44(12); Klasse-II nicht typisiert

0.36

-

   

Pr-17

A1 A2 B8 B60(40) DR11(5; 52)DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

0.58

-

   

Pr-30

A3 A30(19) B7 B51(5) DR13(6; 52) DQ6(1)

0.03

-

   

Pr-31

A11 A31(19) B15 B44(12) DR11(5; 52) DQ3

0.06

0.03

       

93

pp65369-383

FTSQYRIQGKLEYRH

Pr-1

A1 A2 B52(5) B61(40) DR11(5; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

0.40

-

   

Pr-3

A3 A26(10) B7 B38(16) DR/(53) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

1.13

-

   

Pr-12

A24(9) A32(19) B14 B44(12); Klasse-II nicht typisiert

0,35

-

   

Pr-17

A1 A2 B8 B60(40) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

0.37

-

   

Pr-30

A3 A30(19) B7 B51(5) DR13(6; 52) DQ6(1)

0.03

0.06

   

Pr-31

A11 A31(19) B15 B44(12) DR11(5; 52) DQ3

0.02

-

       

104

pp65413-427

TERKTPRVTGGGAMA

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.68

   

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.31

   

Pr-22

A2 A66(10) B7 B41 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

-

0.54

   

Pr-28

A2 A23(9) B7 B13 DR7(53) DQ2 DQ3

-

0.08


[Seite 38↓]

Peptid

AS-

Amino-Säure-

Pro

HLA-Typ

% CD4+

% CD8+

 

Position

Sequenz

band

 

T-Zellen

T-Zellen

105

pp65417-431

TPRVTGGGAMAGAST

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.74

   

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.63

   

Pr-22

A2 A66(10) B7 B41 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

-

0.96

   

Pr-26

A1 A3 B7 B8 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

0.27

   

Pr-28

A2 A23(9) B7 B13 DR7(53) DQ2 DQ3

-

0.10

       

122

pp65485-499

PPWQAGILARNLVPM

Pr-1

A1 A2 B52(5) B61(40) DR11(5; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

0.07

0.01

       

123

pp65489-503

AGILARNLVPMVATV

Pr-1

A1 A2 B52(5) B61(40) DR11(5; 52) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ7(3)

0.19

0.18

   

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.06

   

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.18

   

Pr-8

A2 B35 B37 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1)

-

2.57

   

Pr-9

A2 A23(9) B35 B62(15) DR4(53) DR13(6; 52)DQ6(1) DQ8(3)

-

1,68

   

Pr-10

A2 A31(19) B8 DR3(52) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

-

1.38

   

Pr-15

A2 A28 B27 B37 DR4(53) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ8(3)

-

0.06

   

Pr-17

A1 A2 B8 B60(40) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

-

0.49

   

Pr-19

A1 A2 B44(12) B57(17) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

-

0.18

   

Pr-20

A2 A26(10) B56(22) B60(40) DR4(53) DR16(51) DQ5(1) DQ7(3)

-

3.65

   

Pr-21

A2 B44(12) B50(21); Klasse-II nicht typisiert

-

0.50

   

Pr-23

A2 A33(19) B51(5) B58(17) DR3(52) DR12(5; 52) DQ2 DQ7(3)

-

1.74

   

Pr-27

A2 A24(9) B7 B13 DR7(53) DR15(2; 51) DQ2 DQ6(1)

-

0.26

   

Pr-29

A2 A11 B18 B39 DR8(51) DR13(6; 52) DQ4 DQ6(1)

-

0.13

   

Pr-32

A2 B8 B50(21) DR3(52) DR4(53) DQ2 DQ3

-

0.92

   

Pr-33

A2 A26(10) B27 B44(12) DR1(51) DR4(53) DQ3 DQ5(1)

-

1.06

   

Pr-35

A2 A74(19) B51(5) B53 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

1.83

       

124

pp65493-507

ARNLVPMVATVQGQN

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.86

   

Pr-5

A2 B7 B60(40) DR15(2; 51) DQ6(1)

-

0.35

   

Pr-8

A2 B35 B37 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1)

-

2.34

   

Pr-9

A2 A23(9) B35 B62(15) DR4(53) DR13(6; 52)DQ6(1) DQ8(3)

-

0.74

   

Pr-10

A2 A31(19) B8 DR3(52) DR11(5; 52) DQ2 DQ3

-

1.14

   

Pr-15

A2 A28 B27 B37 DR4(53) DR15(2; 51) DQ6(1) DQ8(3)

-

0.08

   

Pr-17

A1 A2 B8 B60(40) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

-

0.37

   

Pr-19

A1 A2 B44(12) B57(17) DR11(5; 52) DR17(3; 52) DQ2 DQ7(3)

-

0.19

   

Pr-20

A2 A26(10) B56(22) B60(40) DR4(53) DR16(51) DQ5(1) DQ7(3)

-

3.04

   

Pr-21

A2 B44(12) B50(21); Klasse-II nicht typisiert

-

0.49

   

Pr-23

A2 A33(19) B51(5) B58(17) DR3(52) DR12(5; 52) DQ2 DQ7(3)

-

1.34

   

Pr-27

A2 A24(9) B7 B13 DR7(53) DR15(2; 51) DQ2 DQ6(1)

-

0.72

   

Pr-29

A2 A11 B18 B39 DR8(51) DR13(6; 52) DQ4 DQ6(1)

-

0.06

   

Pr-32

A2 B8 B50(21) DR3(52) DR4(53) DQ2 DQ3

-

0.63

   

Pr-35

A2 A74(19) B51(5) B53 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

1.49

       

127

pp65505-519

GQNLKYQEFFWDAND

Pr-2

A30(19) A32(19) B13 B27 DR9(53) DR16(2; 51) DQ3 DQ5

0.16

-

   

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

0.04

0.35

   

Pr-33

A2 A26(10) B27 B44(12) DR1(51) DR4(53) DQ3 DQ5(1)

0.26

-

       

128

pp65509-523

KYQEFFWDANDIYRI

Pr-2

A30(19) A32(19) B13 B27 DR9(53) DR16(2; 51) DQ3 DQ5

0.12

-

   

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

0.20

0.35

   

Pr-29

A2 A11 B18 B39 DR8(51) DR13(6; 52) DQ4 DQ6(1)

0.02

-

   

Pr-32

A2 B8 B50(21) DR3(52) DR4(53) DQ2 DQ3

0.02

-

   

Pr-33

A2 A26(10) B27 B44(12) DR1(51) DR4(53) DQ3 DQ5(1)

0.31

-

       

129

pp65513-527

FFWDANDIYRIFAEL

Pr-4

A2 A3 B7 DR13(6; 52) DR15(2; 51) DQ6(1)

0.18

-

       

131

pp65521-535

YRIFAELEGVWQPAA

Pr-35

A2 A74(19) B51(5) B53 DR1(51) DR15(2; 51) DQ5(1) DQ6(1)

-

0.20


Fußnoten und Endnoten

1 Um Verwirrungen in der Gesamtdokumentation des Labors zu vermeiden, wurde die ursprügliche Numerierung der Patienten aus der Vorstudie beibehalten; die Numerierung der Patienten in dieser Arbeit ist daher nicht kontinuierlich.



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HTML-Version erstellt am:
27.05.2004