4.  Ergebnisse

Der durchflusszytometrische Nachweis Antigen-spezifischer T-Zellen nach Kurzzeit-Stimulation mittels intrazellulärer Zytokinfärbung kann sowohl in Vollblut wie auch unter Verwendung von PBMC durchgeführt werden [63 66 72 73]. Für beide Methoden waren bereits Versuchsprotokolle im Institut etabliert. Ein systematischer Vergleich beider Verfahren hatte aber bisher nicht stattgefunden. Ein erster Teil methodischer Arbeiten diente daher der Etablierung eines möglichst effektiven Protokolls für alle weiteren Versuche mit intrazellulärer Zytokinfärbung (Abschnitt 4.1). Vor allem sollte mit den parallel in Vollblut und PBMC durchgeführten Dosis-Wirkungskurven untersucht werden, welcher Ansatz sich besser für die Stimulation und die anschliessende intrazelluläre Zytokinfärbung eignet und welche Konzentration der verwendeten Antigene optimale Ergebnisse erbringt. Zusätzlich wurden der Einfluss verschiedener Antikoagulanzien und die Verwendung kostimulatorischer monoklonaler Antikörper auf die Methode untersucht. In einem zweiten Teil methodischer Versuche wurden Versuchsprotokolle für die Anreicherung Peptid-spezifischer T-Zell-Populationen und deren Analyse durch TCR-γ1/2-PCR und Fragment-Analyse fluoreszenzmarkierter PCR-Amplifikate (FFA) etabliert. IFN-γ-Sekretions-Assay, magnetische Zellseparation (MACS) und nachfolgende durchflusszytometrische Feinsortierung sowie die Vβ-Typisierung HCMV-spezifischer T-Zell-Reaktionen (v.a. die zeitgleich mit der Stimulation erfolgende Oberflächenfärbung der Vβ-Ketten) wurden mit PBMC von gesunden Probanden getestet, bevor sie für die Untersuchung der Patienten angewendet wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche sind hier nicht dargestellt. Unter Abschnitt 4.2 sind die Ergebnisse von Epitop-Kartierung und der Klonalitätsanalyse beschrieben. Abschnitt 4.3 fasst die Korrelation der experimentellen Ergebnisse mit den klinischen Daten der Patienten zusammen.

Der Effekt gebräuchlicher Antikoagulanzien auf den Vollblut- und PBMC-Versuchsaufbau wurde bei drei Probanden mit bekannten T-Zell-Reaktivitäten auf einzelne IE-1- und pp65-Pentadecapeptide verglichen. Dazu wurde den Probanden venöses Vollblut in Natrium-Heparin-, Lithium-Heparin- und Citrat-Monovetten abgenommen; aus einem Teil des Materials wurden PBMC präpariert, welche dann zeitgleich mit den Vollblutansätzen mit je 10 µg/ml der entsprechenden Pentadecapeptide für 6 h stimuliert wurden. Wie Abbildung 6 (S.40) zeigt, hatte die

Wahl des gerinnungshemmenden Zusatzes im PBMC-Versuchsaufbau keinen erheblichen Einfluss auf die gemessenen T-Zell-Frequenzen. Im Vollblut-Versuchsaufbau wurden dagegen die höchsten Frequenzen in Lithium-heparinisierten Blut gemessen. Wie erwartet zeigte Citrat einen deutlich inhibitorischen Effekt; dieses Salz bindet in den Proben Ca²⁺, das damit nicht mehr für die Aktivierung der T-Zellen zur Verfügung steht. Auf die Stimulation von PBMC zeigte Citrat jedoch keinen nennenswerten Einfluss, was vermutlich auf die Auswaschung von Citrat bei der PBMC-Präparation und die Verwendung von 1640-RPMI-Medium zurückzuführen ist, das Ca²⁺ enthält. Die relativ grossen Unterschiede in den gemessenen Frequenzen, die bei Proband 3 beobachtet wurden, lassen sich v.a. auf die schwachen T-Zell-Antworten zurückführen; auf kleine Reaktionen hatte die Methode naturgemäss grösseren Einfluss, als auf starke T-Zell-Antworten, was sich in grösseren Schwankungen der gemessenen Werte niederschlagen konnte.

Für die Erstellung der Dosis-Wirkungskurven wurde Lithium-heparinisiertes Vollblut von sechs HCMV-seropositiven Probanden abgenommen, die bekannte CD8+ T-Zell-Reaktionen auf einzelne Nona- und Pentadecapeptide aus IE-1 bzw. pp65 sowie CD4+ T-Zell-Antworten gegen HCMV-Lysat hatten. (Bei Proband 2 wurde ein 10-mer verwendet, weil dieses zu wesentlich stärkeren Reaktionen als das entsprechende Nonamer führte). Um ein möglichst realistisches Modell zu erhalten, wurden gesunde Probanden mit grossen Unterschieden in der Reaktionsstärke ausgewählt. Aus einem Teil des Vollblutes wurden zunächst PBMC präpariert, bevor die Proben zeitgleich mit 0.1, 1, 10 und 40 µg/ml der entsprechenden Peptide bzw. 0.1, 1, 10 und 20 µg/ml viralem Lysat stimuliert wurden. Aus Kostengründen war eine Verwendung von 40 µg/ml HCMV-Lysat nicht möglich. Die beobachteten T-Zell-Antworten fielen dabei weitaus unterschiedlicher aus, als erwartet (Abb. 7, S.42). Bei manchen Probanden erreichten die T-Zell-Frequenzen sowohl in Vollblut als auch bei PBMC bei einer Antigenkonzentration von 10 µg/ml ein Plateau und konnten auch mit höheren Konzentrationen nicht weiter gesteigert werden (Pr-1, Pr-2, Pr-5). Bei anderen Probanden wurden die höchsten T-Zell-Frequenzen schon bei relativ niedrigen Antigen-Konzentrationen gemessen (Pr-2, Pr-7, Pr-8); höhere Konzentrationen hatten offensichtlich einen inhibitorischen Effekt. Dies war besonders bei den mit HCMV-Lysat stimulierten Proben der Fall, ein Ergebniss, das sich mit Beobachtungen von Meacker und Mitarbeitern [73] deckte, die dieses Phänomen auf die in HCMV-Lysat befindlichen immunmodulatorischen Moleküle zurückführten. Die Unterschiede zwischen den jeweils in Vollblut und PBMC gemessenen T-Zell-Frequenzen waren jedoch bei allen hier untersuchten Probanden konsistent.

Die maximalen unter Verwendung von PBMC gemessenen T-Zell-Frequenzen waren im Vergleich zu Vollblut insgesamt deutlich höher und/oder wurden schon bei kleineren Antigenkonzentrationen erreicht. Mögliche Erklärungen für dieses Phänomen sind die Anwesenheit von Plasmaproteasen mit degradierendem Einfluss auf die verwendeten Antigene oder die unspezifische Bindung der Antigene an im Vollblut befindliche Plasmaproteine bzw. Erythrozyten.

Waldrop und Mitarbeiter hatten gezeigt, dass die mit intrazellulärer Zytokinfärbung gemessenen CD4+ T-Zell-Frequenzen durch Zugabe monoklonaler Antikörper gegen CD28 und CD49d um das bis zu 2.75-fache gesteigert werden können [74]. Da dies insbesondere für die Analyse schwacher T-Zell-Antworten bei der Epitop-Kartierung sehr vorteilhaft hätte sein können, sollte der Effekt dieser exogenen Kostimulation - gerade auch für CD8+ T-Zell-Antworten - untersucht werden. Dazu wurden 20 CD8+ und 8 CD4+ T-Zellreaktionen immunsupprimierter Patienten auf einzelne IE-1- und pp65-Pentadecapeptide mit und ohne Zusatz kostimulatorischer Antikörper verglichen. Aufgrund der begrenzten Menge an Material konnten nur Einzelansätze durchgeführt werden. Die Versuchsanordnung gewährleistete jedoch gleiche Antigenkonzentrationen in beiden Proben (vgl. Abschnitt 3.3.4, S.28). Die CD8+ T-Zell-Frequenzen konnten durch Zugabe kostimulatorischer Antikörper tatsächlich ein wenig gesteigert werden (Wilcoxon-Rangtest; asymptotische 2-seitige Signifikanz: p = 0.002). Im Median waren die gemessenen Frequenzen um 12.02 % grösser als bei Proben ohne Kostimulation (Abb. 8A, S.44). Ähnliches galt für CD4+ T-Zell-Antworten (jedoch mit p = 0.067 nicht signifikant). Im Median verstärkte die exogene Kostimulation die CD4+ T-Zell-Antworten um 20.71 % (Abb. 8B). Bei einer Reihe von Proben waren die gemessenen T-Zell-Frequenzen allerdings ohne die exogene Kostimulation grösser als mit. Zudem war der beobachtete Effekt insgesamt nicht besonders ausgeprägt, weshalb auf die Zugabe von anti-CD28 und anti-CD49d in allen weiteren Versuchen verzichtet wurde.

Bis dato war die Durchführung von Isotyp-Kontrollen und Positiv-Kontrollen mit PMA/Ionomycin integraler Versuchsbestandteil. Mit Isotypen soll das Ausmaß der unspezifischen Bindung eines gegen das intrazellulär zurückgehaltene Zytokin gerichteten Antikörpers bestimmt werden. Im vorangegangenen Projekt wurden die T-Zell-Frequenzen nach Stimulation mit IE-1- und pp65-"Gesamtmischungen“ in PBMC der ebenfalls in dieser Studie untersuchten Patienten unter Verwendung eines identischen Versuchsprotokolls über ein halbes Jahr nach Transplantation verfolgt. Im Rahmen dieser Versuche wurden insgesamt mehr als 1.000 Isotyp-

Kontrollen für stimulierte wie unstimulierte Proben gemessen. In keinem Fall konnte eine Bindung des murinen IgG2b Antikörpers beobachtet werden, die größer als der unspezifische "Background“ der Negativ-Kontrolle war (unstimulierte, mit anti-IFN-γ-FITC gefärbte Probe). Aus diesem Grund wurde auf die Durchführung von Isotyp-Kontrollen verzichtet, ebenso wie auf die Durchführung von Positiv-Kontrollen mit PMA/Ionomycin. Der Informationsgehalt dieser Proben wurde als zu gering erachtet, um Patientenmaterial dafür aufzuwenden. Da die Stimulation mit immunogenen Pentadecapeptiden eine TCR-vermittelte Aktivierung von T-Zellen darstellt, eignet sich PMA/Ionomycin als TCR-unabhängige Stimulation nicht als Positiv-Kontrolle für diese Versuchsanordnung.

Die neue Technik der T-Zell-Epitop-Kartierung erwies sich als ebenso zuverlässig wie das früher von unserer Arbeitsgruppe eingeführte Verfahren, bei dem die Pentadecapeptide in Pools ent[Seite 45↓]sprechend einer zweidimensionalen Matrix arrangiert waren [31 32]. Die Anzahl der benötigten Proben für die vollständige Kartierung eines Proteins konnte dadurch für IE-1 von 24 auf 17 und für pp65 von 26 auf 18 reduziert werden (jeweils inkl. einer Negativ-Kontrolle und der entsprechenden "Gesamtmischung“). Zusätzlich wurde, wenn nötig, die Zellkonzentration auf bis zu 1.0 x 10⁶ pro Ansatz reduziert, um das vorhandene Patientenmaterial optimal zu nutzen. Diese Zellkonzentration war in einem Grossteil der Fälle immer noch ausreichend, um die pro Ansatz angestrebte Zahl von 250.000 Zellen messen zu können und damit eine sorgfältige Analyse auch sehr kleiner Reaktionen (< 0.05 %) zu gewährleisten. Da die Patienten zudem i.A. zu den Untersuchungszeitpunkten nicht mehr oder nur geringgradig lymphopenisch waren, konnte so in den meisten Fällen die vollständige Epitop-Kartierung eines Proteins aus den vom DHZB bei jedem Ambulanztermin eines Patienten zur Verfügung gestellten ca. 16 ml Vollblut durchgeführt werden. Die Abbildungen 9 (S.46) und 10 (S.47) zeigen jeweils ein Beispiel für eine T-Zell-Epitop-Kartierung von IE-1 bzw. pp65 mit dem neuen dreidimensionalen Peptidpool-Design. Die IE-1-Epitop-Kartierung in Abbildung 9 erfolgte - inkl. der Nachtestung der beiden identifizierten Peptide - aus ca. 16 ml Vollblut. Für das Beispiel in Abbildung 10 wurden zwei Termine benötigt.

In der untersuchten Patientengruppe hatten 15 Patienten (75 %) messbare T-Zell-Antworten gegen IE-1 und 20 (100 %) gegen pp65. Diese T-Zell-Reaktionen waren, wie weiter oben schon erwähnt, für 6 Monate nach Transplantation nachverfolgt worden. Zunächst wurde das Protein, das die stärkere T-Zell-Antwort hervorrief, hinsichtlich der Einzelepitope analysiert. Vier Patienten kamen während des Untersuchungszeitraums oft genug in die Transplantationsambulanz, um die T-Zell-Antworten gegen beide Proteine untersuchen zu können. Insgesamt wurden 24 T-Zell-Epitop-Kartierungen durchgeführt, 8 von IE-1- und 16 von pp65-Reaktionen (Tab. 9, S.48). Nach der initialen Kartierung wurden alle in Frage kommenden Peptide einzeln nachgetestet. Peptide, die auf diese Weise als für die IFN-γ-Produktion verantwortlich identifiziert werden konnten, wurden einer "Restriktionsanalyse“ unterzogen. Dazu wurden zunächst die HLA-Typen

¹dargestellt sind die letzten vor Beginn der T-Zell-Epitopkartierung gemessenen T-Zell-Frequenzen auf die "Gesamtmischungen“ von IE-1 bzw. pp65; die jeweils dominierende Antwort ist fett gedruckt

von Patienten und gesunden Probanden verglichen, die auf die gleichen Peptide reagierten. Zusätzlich wurde für jedes Peptid eine Vorhersage der am wahrscheinlichsten präsentierenden HLA-Allele - im Falle von CD8-Reaktionen auch der wahrscheinlichsten immunogenen Nonamer-Sequenzen in diesen Peptiden - mittels der online-Datenbanken "SYFPEITHI“ und "BIMAS“ durchgeführt (vgl. Abschnitt 3.3.10, S. 34). Dieses Verfahren sei am Beispiel des ersten in Tabelle 10 (S.50) aufgeführten Peptids erklärt:

Das Peptid IE-1_181-195 (Peptid 46, AANKLGGALQAKARA) führte bei Patient 34 (Pt-34) und bei drei gesunden Probanden zu einer CD8+ T-Zell-Reaktion. Alle Spender hatten das Allel HLA-A3 gemein. Zusätzlich gaben beide Datenbanken HLA-A3 in Übereinstimmung als das wahrscheinlichste präsentierende HLA-Allel und KLGGALQAK als die wahrscheinlichste immunogene Nonamer-Sequenz an. Das war damit zu erklären, dass sich in Position 2 und 9 dieser Sequenz mit L bzw. K die idealen Bindungsanker für Allel HLA-A3 befanden [64]. Ausserdem wurde eine IFN-γ-Produktion bei der Epitop-Kartierung in nur genau drei Peptidpools festgestellt, was darauf hinwies, dass das Epitop in nur einem Pentadecapeptid enthalten war (ein Epitop, das in zwei Pentadecapeptiden enthalten war, erschien mindestens in vier Pools, vgl. Abb. 9, S.46). [Seite 49↓]Durch die Überlappung von 11 Aminosäuren zwischen aufeinanderfolgenden Pentadecapeptiden war nur jeweils eine einzige Nonamer-Sequenz ausschliesslich in einem Pentadecapeptid enthalten. Dabei handelte es sich um die Aminosäure-Sequenz, die sich genau in der Mitte des Pentadecapeptids befand und auf beiden Seiten von je drei Aminosäuren flankiert war. In IE-1_181-195 (Peptid 46) lautete diese Sequenz AAN KLGGALQAK ARA. Die Summe dieser Beobachtungen machte es damit sehr wahrscheinlich, dass dieses Peptid ein HLA-A3-restringiertes Nonamer-Epitop enthielt, dessen Aminosäure-Sequenz KLGGALQAK lautete. Als "beweisend“ können diese Resultate jedoch nicht angesehen werden.

Die Ergebnisse aller Peptid-Nachtestungen und der "Restriktionsanalyse“ sind in den Tabellen 10 und 11 (S.50-52) zusammengefasst. Alle bei Patienten und/oder gesunden Probanden als immunogen identifizierten IE-1- und pp65-Peptide sind zusätzlich in den Abbildungen 11 und 12 (S.53-54) dargestellt. Um diese "Epitop-Karten“ möglichst vollständig zu machen und dadurch einen Überblick über die bisher identifizierten Epitope in beiden Proteinen zu geben, sind alle weiteren bisher in der Literatur beschriebenen immunogenen Peptide ebenfalls eingezeichnet.¹

T-Zell-Epitop-Kartierungen von IE-1 wurden bei 7 herz- und 1 lungentransplantierten Patienten durchgeführt. Bei 7 Patienten wurde jeweils 1 Epitop identifiziert, bei einem Patienten 2 Epitope (Median: 1). Die Frequenzen Peptid-spezifischer T-Zellen lagen zwischen 1.07 % und 14.42 % der CD8+ T-Zellen (T-Zell-Frequenzen bei der Einzelpeptid-Nachtestung; Median: 1.49 %). Insgesamt wurden sechs verschiedene CD8+ T-Zell-Epitope in IE-1 identifiziert. CD4+ T-Zell-Antworten wurden nicht beobachtet. In IE-1_245-259 (Peptid 62, EIMAYAQKIFKILDE) war ein CD8+ T-Zell-Epitop enthalten, das zuvor noch nicht beschrieben wurde (Tab. 13, S.56). Zwei Patienten (Pt-30 und Pt-39) zeigten T-Zell-Reaktionen auf dieses einzelne Peptid, nicht aber auf die angrenzenden Peptide 61 oder 63. Diese Patienten hatten zwei HLA-Allele gemein, HLA-A24(9) und HLA-B15. Die Vorhersage ergab für HLA-A24(9) eine höhere Wahrscheinlichkeit, das präsentierende Allel zu sein. Das entsprechende Nonamer hatte zudem die Sequenz AYAQKIFKI , die Nonamer-Sequenz, die ausschliesslich in Peptid 62 enthalten war.

Für eine Reihe von IE-1-Peptiden wurde deutlich, dass sie von mehr als einem HLA-Allel präsentiert sein mussten (Tabelle 14, S.58). Der Abschnitt IE-1_193-211 (Peptide 49 und 50, ARAKKDELRRKMMYM und KDELRRKMMYMCYRN) enthielt beispielsweise das bereits als HLA-

[Seite 51↓]

¹ Nonamer-Sequenz, die ausschließlich in diesem Pentadecapeptid enthalten war
² Peptid wurde von mehreren HLA-Allelen präsentiert (vgl.Tab. 14, S. 58)
³ Neu identifiziertes Epitop
*Experimentell gesicherte immunogene Sequenz
ND: nicht durchgeführt

² Peptid wurde von mehreren HLA-Allelen präsentiert (vgl.Tab. 14, S. 58)
³ Neu identifiziertes Epitop
⁴ Kein anderer Patient oder gesunder Proband hat auf dieses Peptid reagiert. Eine Vorhersage des präsentierenden HLA- Allels war deshalb nicht
mit ausreichender Sicherheit zu treffen.
ND: nicht durchgeführt

B18-restringiert beschriebene Epitop ELRRKMMYM [38]. Diese Peptide führten auch bei einem HLA-B18-positiven Patienten (Pt-2) zu T-Zell-Reaktionen. Vier HLA-B18-negative gesunde Probanden hatten allerdings ebenfalls T-Zell-Antworten gegen beide Peptide. Diesen Probanden war das Allel HLA-B8 gemein. HLA-B8 wurde auch von beiden Datenbanken mit hoher Wahrscheinlichkeit als präsentierendes Allel und ELRRKMMYM als immunogenes Nonamer vorhergesagt. Zudem war ein von unserer Arbeitsgruppe generiertes, mit dem Peptid ELRRKMMYM beladenes HLA-B8-Tetramer in der Lage, T-Zellen gesunder Probanden zu färben (F. Kern, unpublizierte Daten). Das IE-1-Epitop, das in den Peptiden 49 und 50 enthalten war, wurde also von verschiedenen Allelen, von HLA-B8 und HLA-B18, präsentiert.

Schliesslich zeichneten sich Gebiete starker "Epitop-Häufung“ innerhalb der Primärstruktur von IE-1 ab. IE-1_305-319 (Peptid 77, LSEFCRVLCCYVLEE) enthielt beispielsweise das bekannte HLA-B7-restringiertes Epitop CRVLCCYVL [22 30]. Dieses Epitop war auch in dem angrenzenden Peptid IE-1_309-323 (Peptid 78, CRVLCCYVLEETSVM) enthalten. Eine Reihe von Patienten und Probanden reagierte auf diese beiden Peptide, alle hatten das Allel HLA-B7 gemein. Bei zwei gesunden Spendern führten die Peptide 78 und IE-1_313-327 (Peptid 79, CCYVLEETSVMLAKR) zu T-Zell-Antworten, nicht aber Peptid 77. Diese Probanden waren HLA-B7-negativ, hatten aber beide das Allel HLA-A2. Die Vorhersage ergab die Sequenz VLCCYVLEE als von HLA-A2 präsentiertes Nonamer. Ebenso führten bei Patient 34 (Pt-34) IE-1_309-323 und IE-1_313-327 (Peptide 78 und 79) zu einer T-Zell-Antwort. Dieser Patient hatte jedoch keines von beiden Allelen, weder HLA-A2 noch HLA-B7; die Vorhersage ergab hier HLA-A3 als wahrscheinlich präsentierendes Allel und YVLEETSVM als zugehörige immunogene Nonamer-Sequenz. Das bedeutete, dass in dem Pentadecapeptid IE-1_309-323 (Peptid 78) drei verschiedene immunogene Nonamer-Sequenzen enthalten waren, die von mindestens drei verschiedenen HLA-Allelen präsentiert wurden (HLA-A2, -B7, und -A3). Schliesslich führte bei zwei weiteren gesunden Probanden nur IE-1_313-327 (Peptid 79) zur IFN-γ-Produktion. Für diese Probanden ergab die Vorhersage IE-1_315-323 ( VLEETSVML ) als immunogenes Nonamer, präsentiert von HLA-A2. Diese Sequenz war wiederum die ausschliesslich in Peptid 79 enthaltene, was gut mit der Tatsache übereinstimmte, dass beide Probanden ausschliesslich auf dieses eine Peptid Reaktionen zeigten. Ausserdem war diese Sequenz bereits als HLA-A2-restringiertes Epitop beschrieben worden [41]. Alles in allem zeigte sich damit, dass in der kurzen Sequenz IE-1_305-327 (23 Aminosäuren) nicht weniger als vier verschiedene CD8+ T-Zell-Epitope enthalten waren (vgl. Abbildung 11, S.53). Bei einem gesunden Probanden führte IE-1_305-319 (Peptid 77) ausserdem noch zu einer CD4+ T-Zell-Antwort.

T-Zell-Epitop-Kartierungen von pp65 wurden bei 13 herz- und 3 lungentransplantierten Patienten durchgeführt. Dabei wurden 9 verschiedene CD4+ Epitope und 13 verschiedene CD8+ Epitope identifiziert. Darunter waren insgesamt 9 Epitope, die zuvor noch nicht beschrieben worden waren (Tabelle 13, S.56). Die Gesamtanzahl von pp65-Epitopen reichte bei den Patienten von 1 bis 5 (Median: 3), die Anzahl der CD4+ Epitope von 0 bis 3 (Median: 1), ebenso wie die Zahl der CD8+ Epitope (Median: 2). Die Peptid-spezifischen T-Zell-Frequenzen betrugen 0.02 % bis 5.83 % der CD4+ T-Zellen (Median: 0.25 %) bzw. 0.02 % bis 10.01 % der CD8+ T-Zellen (Median: 0.80 %). Die dominierende T-Zell-Subpopulation war bei 5 Patienten (31 %) CD4+, bei 11 Patienten (69 %) CD8+. Die Anzahl der CD4+ und CD8+ T-Zell-Epitope sowie die Peptid-spezifischen T-Zell-Frequenzen wiesen grosse Unterschiede zwischen den Patienten auf. Tatsächlich hatte jeder der untersuchten Patienten eine individuelle T-Zell-Antwort gegen pp65. Die präsentierenden HLA-Allele und wahrscheinlichen immunogenen Nonamere konnten für die meisten Peptide bestimmt werden. Sie sind den Tabellen 11 und 12 (S.50-52) zu entnehmen.

Wie für IE-1 zeigte sich auch für eine Reihe von pp65-Peptiden, dass sie von mehr als einem HLA-Allel präsentiert sein mussten. pp65_361-375 (Peptid 91, PQYSEHPTFSQYRI) beispielsweise führte bei fünf Patienten zu IFN-γ-Produktion. Dieses Peptid enthielt nach [38] ein von HLA-A1 präsentiertes Epitop. In der Patientengruppe, für die pp65-Epitop-Kartierungen durchgeführt [Seite 57↓]wurden, war HLA-A1 jedoch nur insgesamt vier mal vertreten. Folglich musste dieses Peptid ebenfalls von mehreren HLA-Allelen präsentiert worden sein. Bei zwei HLA-A1-positiven Patienten führte nur pp65_361-375 (Peptid 91) zu IFN-γ-Produktion. Bei drei weiteren Patienten induzierte Peptid 91 dagegen zusammen mit pp65_365-379 (Peptid 92, EHPTFSQYRIQGKL) T-Zell-Antworten. Diese drei Patienten waren alle HLA-A1-negativ, hatten dafür aber HLA-B35 gemein. Dies legte den Schluss nahe, dass pp65_361-375 (Peptid 91) ein HLA-A1-restringiertes immunogenes Nonamer ( SEHPTFSQY ), vielleicht auch ein Decamer, enthielt, eine Sequenz jedenfalls, die ausschliesslich in diesem Peptid vorkam, während bei den übrigen Patienten ein HLA-B35-restringiertes Nonamer zu T-Zell-Antworten führte, das in beiden Peptiden, 91 und 92, enthalten war ( EHPTFSQYR ). Ausserdem ist in der Literatur ein von HLA*B3801 präsentiertes immunogenes Peptid mit der Sequenz PTFTSQYRIQGKL beschrieben [35]. Die wahrscheinliche Präsentation mehrerer in einem Pentadecapeptid enthaltener Epitope durch verschiedene HLA-Allele war kein Ausnahmefall; sie wurde für insgesamt 17 Peptide beobachtet (Tabelle 14, S.58). Ähnlich wie für IE-1 zeichneten sich auch in der Primärstruktur von pp65 Gebiete mit auffallender "Epitop-Häufung“ ab. Dies traf besonders für die Aminosäure-Sequenz 485-535 zu (vgl. Abb. 12, S.54). Sechs pp65-Peptide waren ausserdem in der Lage, sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zell-Antworten zu induzieren. Bei drei HLA-A2- und HLA-DR11(5;52)-positiven Patienten (Pt-9, Pt-11, und Pt-43) führte pp65_489-503 (Peptid 123, AGILRNLVPMVATV) z.B. bei CD4+ und CD8+ T-Zellen zu Reaktionen (ein Beispiel dafür ist in Abbildung 10, S.47 wiedergegeben).

Neben der grossen Heterogenität zwischen den Patienten fielen jedoch auch bestimmte konservierte Muster ins Auge. In einer Gruppe von drei Patienten und zwei gesunden Probanden wurden jeweils gemeinsam die drei CD8+ Epitope pp65_261-279 (Peptide 66/67), pp65_413-431 (Peptide 104/105) und pp65_489-507 (Peptid 124, z.T. mit Peptid 123) identifiziert. Diese Patienten bzw. gesunden Probanden hatten alle die Allele HLA-A2 und HLA-B7 gemein. Ein zweites Beispiel sind die Peptide pp65_117-135 (Peptide 30/31) und pp65_361-379 (Peptide 91/92), die bei zwei Patienten CD8+ T-Zell-Antworten auslösten. Für diese Peptide war jeweils HLA-B35 als präsentierendes Allel bestimmt worden. Es war dennoch keineswegs möglich, das Reaktionsmuster auf der Basis des (serologisch bestimmten) HLA-Typs vorherzusagen. So hatten von neun untersuchten HLA-A2-positiven Patienten nur acht T-Zell-Antworten gegen pp65_489-507, und sogar nur drei der sieben untersuchten HLA-DR11(5;52)-positiven Patienten reagierten auf pp65_361-383.

Einzelne Peptide führten zur Stimulation von bis zu 10 % der CD8+ T-Zellen und mehr. Die Klonalität solch starker CD8+ T-Zell-Reaktionen auf einzelne IE-1 und pp65-Peptide wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen untersucht: zum einen wurden die Vβ-Familie(n) der reagierenden T-Zell-Population identifiziert (Vβ-Typisierung). Zusätzlich wurde die T-Zell-Rezeptor- Klonalität von hoch gereinigten, Peptid-spezifischen T-Zell-Populationen mit Hilfe einer TCR-γ1/2-PCR analysiert. Das Repertoire verfügbarer anti-Vβ-mAk umfasst derzeit 24 Vβ-Familien [Seite 59↓]und Subfamilien. Um die Anzahl der für die Vβ-Typisierung benötigten Proben zu reduzieren, wurden jeweils ein FITC-konjugierter und ein PE-konjugierter anti-Vβ-mAk in einem Ansatz kombiniert (z.B. anti-Vβ1-PE und anti-Vβ2-FITC). Zusammen mit einer unstimulierten und einer stimulierten, mit anti-Panα/β-mAk gefärbten, Probe konnte die Anzahl benötigter Tests von 26 auf 14 gesenkt werden. Dies entsprach ca. 14 x 10⁶ Zellen, die für diesen Versuch benötigt wurden. Da die T-Zell-Aktivierung häufig eine deutliche Herabregulierung des CD3/TCR-Komplexes zur Folge hat (vgl. Abb. 4, S.30), wurden die Vβ-Ketten zeitgleich mit der Zugabe des jeweiligen Peptids gefärbt, entsprechend einem Protokoll, welches zur Färbung mit Tetrameren etabliert worden war. Die Ergebnisse dieser Versuche waren jedoch unbefriedigend. Nur bei einem einzigen von sechs Patienten konnten die Vβ-Familien der Peptid-spezifischen T-Zellen direkt bestimmt werden, und in diesem Fall leider auch nur unvollständig (Abb. 13, S.61). Bei diesem Patienten deckten die anti-Vβ-mAk lediglich 43.14 % des gesamten TCR-Vβ-Repertoires ab, (ersichtlich aus dem Vergleich der Summe aller Vβ-positiven T-Zellen mit der gesamten Panα/β-T-Zell-Population) und die Vβ-Familien von lediglich 66 % der Peptid-spezifischen T-Zell-Population konnten direkt bestimmt werden. Die Reaktion war auf insgesamt 8 verschiedene Vβ-Familien verteilt; ca. 50 % der T-Zell-Antwort erschien dabei in den beiden Vβ-Familien Vβ3 und Vβ14. Die Vβ-Familien der übrigen 34 % der Reaktion konnten mit den verfügbaren anti-Vβ-mAk offensichtlich nicht erfasst werden. Dies war wahrscheinlich bei den übrigen Patienten, bei denen die Typisierung der T-Zell-Antwort nicht gelang, ebenfalls der Fall.

Im Gegensatz dazu bewies die TCR-γ1/2-PCR eine ausgesprochen hohe Sensitivität. Die TCR-γ1/2-PCR mit anschliessender Analyse fluoreszenzmarkierter PCR-Amplifikate (FFA) wird als ein relativ unkompliziertes Verfahren z.B. bei der Diagnose kutaner T-Zell-Lymphome eingesetzt. Die Methode basiert auf der Detektion klonal expandierter rearrangierter γ-T-Zell-Rezeptoren und kann ebenso für die Untersuchung fixierter Hautbiopsate wie für aus peripherem Blut isolierte PBMC angewendet werden [71]. Wichtig ist aber v.a., dass mit dieser Methode für den Nachweis klonal expandierter T-Zell-Populationen nur eine kleine Zellzahl benötigt wird. Da durch die durchflusszytometrische Nachsortierung die genaue Zellzahl der gereinigten T-Zell-Populationen bekannt war, konnte das Minimum benötigter Zellen für eine erfolgreiche PCR-Analyse im hier vorgestellten Versuchsaufbau mit etwa 1.0 x 10³ bestimmt werden. Ein Beispiel für die Isolierung einer Peptid-spezifischen T-Zell-Population ist in Abbildung 14 (S.62) wiedergegeben. Die Ergebnisse der TCR-γ1- und -γ2-PCR sind in Abbildung 15 (S.63) dargestellt. Übereinstimmend mit den Beobachtungen von Weekes und Mitarbeitern [23] zeigte sich auch in [Seite 60↓]den hier untersuchten Reaktionen die Fokussierung der CD8+ T-Zell-Antwort auf einige wenige oder nur einen einzigen Klon; keine der untersuchten Reaktionen war polyklonal.

Im letzten Teil der Studie sollte ein erster Versuch unternommen werden, die komplexen Unterschiede in den beobachteten T-Zell-Antworten mit den unterschiedlichen klinischen Verläufen in Beziehung zu setzen. Nach Erhebung der relevanten klinischen Daten wurde dafür zunächst eine Gruppeneinteilung der Patienten nach Ausmaß der HCMV-Reaktivierung in vier Schweregrade vorgenommen (keine, asymptomatische und symptomatische Reaktivierung, invasive HCMV-Erkrankung). Diese Einteilung orientierte sich an den Definitionen der 5. internationalen HCMV-Konferenz, Stockholm, 1995 [75]. Im Verlauf nach Transplantation hatten danach fünf Patienten (25 %) eine manifeste HCMV-Erkrankung (Gruppe 4). In zwei Fällen war die Diagnose bioptisch gesichert worden; es handelte sich in beiden Fällen um eine HCMV-Gastritis. Weitere wesentliche Charakteristika der Patientengruppe sind in Tabelle 3 (S.19) aufgeführt. Obwohl die Patientengruppe relativ klein war, wich die Verteilung der HLA-Allele nur in wenigen Fällen um mehr als 5 % von der der Durchschnittsbevölkerung ab (Abb. 3, S.20).

Anschliessend wurden die wesentlichen Prozessvariablen "Anzahl der Epitope“ und "T-Zell-Frequenzen“ mittels Vergleich von Mittelwert und Median, Schiefe der Verteilung, Shapiro-Wilks-Test und Q-Q-Diagramm auf ihre Verteilung untersucht. Diese Analyse ließ den Schluss nicht zu, dass die Variablen normalverteilt waren. Für alle weiteren Untersuchungen wurden demgemäss nicht-parametrische Testverfahren eingesetzt, insbesondere der Spearman’sche Rangkorrelationskoeffizient und der zweiseitige Mann-Whithney-U-Test.

Zu den bearbeiteten Fragestellungen gehörte in erster Linie die Korrelation des Ausmasses an HCMV-Reaktivierung und der Anzahl der HCMV-Reaktivierungen mit einer Reihe unterschiedlicher Parameter wie der Anzahl der CD4+ bzw. CD8+ T-Zell-Epitope in IE-1 und pp65, der dominanten T-Zell-Subpopulation, der Haupt-T-Zell-Zielstruktur (IE-1 oder pp65), dem Lebensalter der Patienten usw. (Tabelle 16). Die durchgeführten Analysen ergaben jedoch für keine der bearbeiteten Fragestellung eine signifikante Korrelation, weshalb die Ergebnisse hier im einzelnen nicht dargestellt sind. Lediglich auf eine interessante Tendenz sei hingewiesen: in der Patienten-Gruppe, in der die IE-1-Antworten dominierten (8 von 20 Patienten), hatte keiner der Patienten eine symptomatische HCMV-Reaktivierung oder erkrankte an HCMV. Der Grossteil der Patienten (5 von 8) befand sich in Gruppe 1; bei ihnen wurde also gar keine Reaktivierung beobachtet. Drei von acht Patienten hatten lediglich Episoden symptomloser Reaktivierung.

Fußnoten und Endnoten

¹ Auch nach ausgiebiger Literaturrecherche kann dabei aber nicht ausgeschlossen werden, dass Arbeiten übersehen wurden.