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5.  Diskussion

5.1.  

5.1.1. Die T-Zell-Antwort gegen IE-1 und pp65 ist komplex strukturiert

Wie in der Einleitung erwähnt, zeichnet sich zunehmend die Komplexität der T-Zell-Antwort gegen HCMV ab. Sie findet ihren Ausdruck z.B. in unterschiedlichen Effektorfunktionen [44 45] oder Oberflächen-Phänotypen von CD8+ T-Zellen [43]. Im Rahmen der methodischen Versuche zeigte sich, wie unterschiedlich die Dosis-Wirkungsbeziehungen für verschiedene Antigene und zwischen verschiedenen Probanden sein können. In der untersuchten Patientengruppe beobachteten wir zudem grosse intraindividuelle und interindividuelle Unterschiede hinsichtlich des immundominanten Proteins, der gemessenen Peptid-spezifischen T-Zell-Frequenzen, der Anzahl der identifizierten pp65-Epitope, der dominierenden T-Zell-Subpopulation sowie der präsentierenden HLA-Allele. Im folgenden Abschnitt 5.1 werden zunächst die Ergebnisse der methodischen Arbeiten diskutiert. Im Abschnitt 5.2 sollen einzelne Aspekte der komplexen T-Zell-Antwort gegen HCMV eingehender beleuchtet werden, bevor in Abschnitt 5.3 schliesslich deren klinische Implikationen diskutiert werden.

5.2. Schlussfolgerungen aus den Ergebnissen der methodischen Arbeiten

5.2.1. Ein definitives Versuchsprotokoll für die intrazelluläre Zytokinfärbung

1995 wurde von Picker und Mitarbeitern eine Methode vorgestellt, die es ermöglichte, Antigen-spezifische T-Zellen nach Kurzzeitstimulation ex vivo (6 bis 8 h) durch die Färbung intrazellulär zurückgehaltener Zytokine durchflusszytometrisch zu charakterisieren und direkt zu quantifizieren [63]. Die Färbung von IFN-1 als wichtigem und rasch induzierbaren Effektorzytokin war dazu besonders geeignet. Dieses Verfahren erwies sich als wertvolle Innovation. Von der Einführung eines Vollblut-Protokolls bald darauf versprach man sich eine entscheidende Vereinfachung dieser Methode [72]. Dadurch entfiel nicht nur die aufwendige und zudem schwierig zu standardisierende Präparation von PBMC. Im direkten Vergleich wurden im Vollblut sogar leicht höhere T-Zell-Frequenzen auf Stimulation mit viralem Lysat und Staphylokokken Enterotoxin B (SEB) bei gleicher Antigenkonzentration gemessen als in PBMC. Dies wurde damit erklärt, dass Vollblut ein "physiologischeres Milieu“ für die Kurzzeitstimulation darstellt als PBMC [72]. Nomura und Mitarbeiter bemühten sich dann um "Optimierung“ dieses Protokolls; u.a. gaben sie als effektivste Antigenkonzentration für HCMV-Lysat 5 µg/ml an [73]. Die Präparation von PBMC [Seite 67↓]stellt unzweifelhaft einen Arbeitsaufwand dar, der durch die Verwendung von Vollblut entfällt. Fragwürdig war für uns dagegen, ob Vollblut wirklich das "physiologischere“ Milieu darstellt. Die Präsentation von Antigenen und deren Erkennung durch T-Zellen erfolgen in sekundären lymphatischen Organen und peripheren Geweben - nicht im Vollblut. Tatsächlich könnte gerade die Anwesenheit bestimmter Plasmafaktoren im Vollblut (Proteasen und andere Proteine), die weder in peripheren Geweben noch in PBMC-Suspensionen vorhanden sind, mit der Aufnahme und Präsentation von Antigenen interferieren. Solche Plasmafaktoren sind noch viel weniger zu standardisieren als die PBMC-Präparation. Hinzu kommt, dass gerade mit PBMC exakte - standardisierte - Zellkonzentrationen eingestellt werden können, was bei Vollblut-Proben schwierig ist. Von diesem Standpunkt aus betrachtet spricht also eher wenig für die Verwendung von Vollblut.

Wir entschieden uns deshalb, mit Hilfe von Dosis-Wirkungskurven für Antigene, die häufig im Rahmen dieser Methode verwendet werden (Nona- und Pentadecapeptide sowie virales Lysat), Vollblut- und PBMC-Versuchsaufbau nochmals systematisch zu vergleichen. Vorrangiges Ziel war, festzustellen, ob Vollblut als Milieu tatsächlich besser geeignet ist. Die signifikanten Unterschiede, die sich in allen vergleichenden Experimenten ergaben (einschliesslich der im Antikoagulanzienvergleich beobachteten Differenzen), sprachen dabei jedoch eindeutig für die Verwendung von PBMC. Neben den deutlich höheren maximalen T-Zell-Frequenzen waren diese v.a. schon bei sehr viel kleineren Antigenkonzentrationen durchflusszytometrisch detektierbar als im Vollblut. Beides war von Bedeutung für die Sensitivität der Methode. Ausserdem hatte die Wahl des Antikoagulanzes offensichtlich keinen wesentlichen Einfluss auf den PBMC-Versuchsaufbau. Aus der Summe dieser Betrachtungen heraus entschieden wir uns, für alle weiteren Versuche mit ex vivo Kurzeit-Stimulation und anschliessender intrazellulärer Zytokinfärbung PBMC zu verwenden.

Die Dosis-Wirkungskurven zeigten aber noch etwas anderes: die nach Stimulation mit einzelnen Peptiden gemessenen T-Zell-Antworten wiesen grosse interindividuelle Unterschiede auf, so gross, dass die Festlegung einer einheitlichen, als "optimal“ zu bezeichnenden Peptidkonzentration im Prinzip nicht möglich war. Die ausgeprägte - und zudem sehr individuelle - Abhängigkeit der T-Zell-Frequenz von der eingesetzten Antigenkonzentration hatte noch eine weitere Implikation: solange nicht die konkrete Dosis-Wirkungsbeziehung des jeweiligen Antigens bei einem bestimmten Patienten oder Probanden bekannt ist und nicht bekannt ist, ob diese über die Zeit stabil ist, bleibt ungewiss, ob sich dessen T-Zell-Antwort bei einer gegebenen Antigenkonzentration nahe ihres Maximums befindet oder weit davon entfernt. Dieser Faktor sollte beim Ver[Seite 68↓]gleich von T-Zell-Frequenzen zwischen verschiedenen Patienten oder Probanden Berücksichtigung finden. Weiter ist zu beachten, dass die intrazelluläre Zytokinfärbung im Unterschied zur Tetramer-Technik nur die Quantifizierung funktioneller, innerhalb relativ kurzer Zeit mit einer Zytokin-Produktion reagierender, Antigen-spezifischer T-Zellen erlaubt. Da eine grosse Menge Peptide für die nachfolgenden Untersuchungen eingesetzt werden sollte, musste ein sinnvoller Kompromiss zwischen Aufwand und Effektivität gefunden werden. Die T-Zell-Antworten mussten dabei nicht notwendigerweise im Bereich ihres Maximums liegen (denn die Epitop-Kartierung hat v.a. qualitativen Charakter), sollten von ihrer Grössenordnung her mit dieser Konzentration aber zumindest deutlich in messbaren Bereichen sein. Eine Dosis von 1 µg/ml erschien dafür auf der Basis der Dosis-Wirkungs-Kurven geeignet. Der Zusatz exogener Kostimulation hätte die Sensitivität der Methode zudem möglicherweise noch erhöhen können. Die Verwendung kostimulatorischer monoklonaler Antikörper gegen CD28 und CD49d ist in zahlreichen Arbeitsgruppen integraler Bestandteil des Versuchsaufbaus [66 72 73]. Die Ergebnisse unserer Versuche zeigten jedoch nur einen sehr geringen Effekt auf die Kurzzeitstimulation mit einzelnen Pentadecapeptiden bei transplantierten Patienten. Weil die Verwendung solcher Antikörper einen zusätzlichen Aufwand an Zeit, Arbeit und Kosten bedeutet, ausserdem eine weitere artifizielle Komponente in den Versuchsaufbau einführt und vereinzelt sogar stärkere T-Zell-Antworten ohne Kostimulation beobachtet wurden als mit, entschieden wir uns, auf den Zusatz von anti-CD28 und anti-CD49d zu verzichten. Desweiteren hatten sich Isotyp-Kontrollen im vorangegangenen Projekt als für diesen Versuchsaufbau unnötig herausgestellt. Da auch Positiv-Kontrollen mit PMA/Ionomycin aus den im Ergebnissteil dargelegten Gründen keinen nennenswerten Informationsgewinn erbringen, wurde auf die Durchführung dieser Kontrollen ebenfalls verzichtet. Für methodische Untersuchungen, insbesondere solche, in denen T-Zell-Frequenzen direkt miteinander verglichen werden sollen, ist die Durchführung von Dreifachansätzen ratsam. Für die T-Zell-Epitopkartierung waren aber aufgrund des begrenzten Patienten-Materials Doppel- oder gar Dreifachbestimmungen nicht machbar. Wir entschieden uns deshalb für die T-Zell-Epitop-Kartierung und alle anderen Versuche mit intrazellulärer Zytokinfärbung für folgendes Versuchsprotokoll: aus Citratblut isolierte PBMC wurden über Nacht im Brutschrank vorinkubiert, bevor sie am darauffolgenden Tag in Einzelansätzen mit Pentadecapeptiden in einer Endkonzentration von je 1 µg/ml für 6 h ohne Zusatz exogener Kostimulation stimuliert wurden. Als Kontrolle diente dabei ausschliesslich eine mit 4 µl DMSO stimulierte (entsprechend der DMSO-Menge in den zugegeben Peptid-Lösungen) und mit anti-IFN-1-FITC gefärbte Probe. Zudem wurde immer auch eine "Gesamtmischung“ des entsprechenden Proteins mitgeführt.


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5.2.2.  T-Zell-Epitop-Kartierung mit dem neuem Peptidpool-Design

Das dreidimensionale Peptidpool-Design wurde entworfen, um die Anzahl der für eine T-Zell-Epitop-Kartierung benötigten Proben so weit zu reduzieren, dass auch die Untersuchung von Patienten möglich wurde. Die Effektivität dieses neuen Verfahrens hing wesentlich von zwei Faktoren ab: (1) der Anzahl an PBMC, die pro Untersuchungstermin insgesamt zur Verfügung standen und (2) der Anzahl der Peptide, die nachgetestet werden mussten. Bei einem Protein wie IE-1, in dem bei Patienten oder Probanden nur selten mehr als zwei Epitope identifiziert wurden, erwies sich die neue Methode als deutlich effektiver als die bisher eingesetzte. Mit steigender Anzahl an Peptiden, die zu IFN-1-Produktion führten, nahm die Effizienz allerdings ab. Bei 1 5 Epitopen beispielsweise (wie bei Pt-9, vgl. Abb. 10, S.47), erwies sich die Identifizierung der Epitope nicht nur als eine Herausforderung. Weil in jedem Pool deutlich mehr Peptide enthalten waren als beim zweidimensionalen Pool-Design (bis zu 30 anstatt 12), blieben auch entsprechend mehr Peptide als potentielle Kandidaten zur Nachtestung übrig. Diese wurden in solchen Fällen wieder entsprechend einer zweidimensionalen Matrix kombiniert, um die Anzahl der Tests zu reduzieren. Bei Pt-9 war die Anzahl benötigter Proben für die Epitop-Kartierung inkl. Nachtestung am Ende dennoch identisch mit der, die mit dem zweidimensionalen Peptidpool-Design benötigt worden wäre. Dieser Fall blieb jedoch die Ausnahme; fünf Epitope wurden nur bei diesem Patienten beobachtet. Bei nicht lymphopenischen Patienten konnte die komplette Epitop-Kartierung in einem Grossteil der Fälle zu einem einzigen Zeitpunkt aus den ca. 16 ml Vollblut erfolgen, die vom DHZB bei jedem Ambulanztermin eines Patienten zur Verfügung gestellt wurden. Damit war der Langzeitverlauf der T-Zell-Antwort auf Epitop-Ebene nach initialer Epitop-Kartierung auf der Basis dieser Technik möglich geworden und wurde im Anschluss an dieses Projekt bereits an weiteren herz- und lungentransplantierten Patienten umgesetzt. Im Vergleich zu der schon erwähnten Arbeit von Hebart und Mitarbeitern [47] hat dieser Ansatz v.a. den Vorteil, dass wahrscheinlich die gesamte T-Zell-Antwort gegen ein Protein und nicht nur eine ausgewählte antigene Determinante verfolgt wird. Warum nur "wahrscheinlich“ die gesamte T-Zell-Antwort? Weil die untere Nachweisgrenze der Methode bei Frequenzen von 1 bis 2 IFN-1-positiven Zellen pro 10.000 (0.01 % bis 0.02 %) der entsprechenden T-Zellsubpopulation liegt, vorausgesetzt, der Background (Hintergrundrauschen) in den Proben ist sehr niedrig (< 0.02 %). Es ist deshalb nicht ausgeschlossen, dass ein Patient über Epitop-spezifische T-Zellen verfügt, die (zeitweise) unter der durchflusszytometrischen Nachweisgrenze liegen. Tatsächlich konnten wir solche nur zeitweise detektierbaren Reaktionen beobachten (s.u.). Das neue Peptidpool-Design könnte auch als ein Modell für die Identifizierung von T-Zell-Epitopen in anderen immu[Seite 70↓]nogenen Proteinen von HCMV, beispielsweise pp150 oder pp28, wie auch in anderen Pathogenen (HIV, HBV und HCV, Tuberkulose usw.) dienen.

5.2.3. Weitere methodische Arbeiten

Zunächst testeten wir den IFN-1-Sekretions-Assay mit nachfolgender magnetischer Zellseparation nach Stimulation mit einzelnen IE-1 und pp65-Pentadecapeptiden mit PBMC gesunder Probanden. Die Klonalität einer auf diese Weise gereinigten Peptid-spezifischen T-Zell-Population von Pr-6 wurde dann mit der TCR-11/2-PCR untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass durch magnetische Zellseparation allein eine ausreichende Reinheit der Probe für eine sichere Beurteilung der Klonalität nicht gewährleistet werden konnte; die Probe enthielt noch zuviele (T-)Zellen, die nicht der Peptid-spezifischen Population angehörten (vgl. Abb. 14, S.62). Deshalb entschieden wir uns, nach der magnetischen Zellseparation eine durchflusszytometrische Feinsortierung der CD8pos/CD69high/IFNpos T-Zellen anzuschliessen, um so sicherzustellen, dass die Probe ausschliesslich Peptid-spezifische T-Zellen enthielt. Die damit gewonnenen Zell-Populationen waren zwar sehr rein, bestanden aber nur noch aus wenigen Zellen. Der hohen Sensitivität der TCR-11/2-PCR war es zu verdanken, dass die Klonalitätsanalyse dennoch in sechs von sieben Fällen erfolgreich verlief. Die Untersuchung der T-Zell-Rezeptorklonalität durch die in dieser Arbeit vorgestellte Methode bietet im Vergleich zu den bisher angewendeten Verfahren [23 24 25 26] einige Vorteile: (1) die T-Zell-Antwort auf jedes beliebige immunogene Peptid kann, unabhängig von der Kenntnis des präsentierenden HLA-Allels, untersucht werden. (2) CD4+ und CD8+ T-Zell-Reaktionen können analysiert und Peptid-spezifische T-Zell-Frequenzen direkt ermittelt werden. (3) Der Versuchsaufbau ist vergleichsweise einfach und nimmt nur einen einzigen Tag in Anspruch. (4) Der methodische Fehler wird dadurch, v.a. aber durch Vermeidung langer in vitro Zell-Kulturen sowie durch die direkte Isolierung der T-Zell-Population aus Material des Patienten oder Probanden, minimiert. Man untersucht so gewissermassen den "Wildtyp“ der Reaktion. (5) Für die Untersuchung werden nur sehr kleine Mengen Vollblut benötigt (in unseren Versuchen reichten etwa 10 ml aus). Damit können diese Versuche mit Patienten-Material erfolgen, wenn gewünscht auch im Langzeitverlauf. Umgekehrt können auch sehr schwache T-Zell-Reaktionen untersucht werden; die Menge des zur Verfügung stehenden Materials muss dafür entsprechend erhöht werden. Die Bestimmung der V9-Familien der reagierenden T-Zellen erachten wir dagegen als wenig sinnvoll. Das Repertoire der zur Verfügung stehenden anti-V9-mAk ist derzeit noch zu unvollständig, um eine umfassende und detaillierte Analyse gewährleisten zu können.


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5.3.  Schlussfolgerungen aus den Ergebnissen von T-Zell-Epitop-Kartierung und Untersuchungen zur T-Zell-Klonalität

5.3.1. Bedeutung Peptid-spezifischer T-Zell-Frequenzen

Die Spannweite der beobachteten T-Zell-Frequenzen war ausserordentlich gross. Wir konnten T-Zell-Reaktionen beobachten, die zeitweise unter, zeitweise knapp über der durchflusszytometrischen Nachweisgrenze lagen. Ein Beispiel dafür sind die Peptide pp65281-295 und pp65285-299 (Peptide 71 und 72), auf die Pt-7 sehr schwache CD4+ T-Zell-Reaktionen zeigte. Ebenso schwach war seine CD8+ T-Zell-Antwort auf pp65489-503 (Peptid 123); erst bei mehrfacher Nachtestung konnte eine Reaktion von 0.03 % der CD8+ T-Zellen auf dieses Peptid festgestellt werden. Das war insofern erstaunlich, weil das angrenzende pp65493-507 (Peptid 124) die stärkste pp65-spezifische T-Zell-Antwort bei Pt-7 induzierte. Beide Peptide enthielten das von HLA-A2 präsentierte Nonamer NLVPMVATV . Pt-7 hatte mit zuletzt 27 % der CD8+ T-Zellen auf IE-1305-319 (Peptid 77) auch die größte in der gesamten Gruppe gemessene T-Zell-Antwort (vgl. Tabelle 10, S.50).

Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war, mit sehr wenig Material die T-Zell-Antwort auf ein Ziel-Protein, repräsentiert in Form der jeweiligen "Gesamtmischung“, in ihre einzelnen Epitope aufschlüsseln zu können, um die Weiterverfolgung dieser Antwort auf Ebene der einzelnen CD4+ und CD8+ Epitope möglich zu machen. Im Zusammenhang mit den Dosis-Wirkungskurven wurde schon angedeutet, dass dabei unbekannt ist, ob die auf ein bestimmtes Peptid gemessene T-Zell-Antwort mit der eingesetzten Konzentration von 1 µg/ml sich nahe ihres Maximums befindet oder weit davon entfernt. Hinzu kommt, dass sich über den Zeitverlauf z.T. extreme Schwankungen der T-Zell-Frequenzen beobachten lassen.

Abbildung 5-1 (Abb. 16, S.72) illustriert das anhand von drei zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessenen CD8+ T-Zell-Reaktionen auf die bei Pt-7 dominanten Peptide in IE-1 und pp65. Theoretisch ist auch nicht sicher auszuschliessen, das sich die Dosis-Wirkungsbeziehung für ein Peptid im Zeitverlauf ändert. Schliesslich muß noch berücksichtigt werden, dass lediglich die Frequenzen Antigen-spezifischer T-Zellen im Blut bestimmt werden, nicht aber in sekundären lymphatischen Geweben oder in peripheren Geweben, in den Kompartimenten also, in denen die Immun- Antwort eigentlich stattfindet. Die Quantifizierung HCMV-spezifischer T-Zellen ist essentieller Bestandteil des angestrebten Monitorings der antiviralen T-Zell-Antwort. Die dargelegten Faktoren komplizieren die schwierige Interpretation der klinischen Bedeutung der gemessenen T- Zell-Frequenzen aber noch zusätzlich.


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5.3.2. Bedeutung des immundominanten Proteins

In der untersuchten Gruppe gab es Patienten, die ausschliesslich eine T-Zell-Antwort auf pp65 zeigten und solche, die auf beide Proteine reagierten; dabei stand, zumindest gemessen an der Frequenz Antigen-spezifischer T-Zellen, zumeist ein Protein deutlich im Vordergrund (vgl. Tab. 9, S.48). Pt-39 beispielsweise hatte eine starke IE-1-spezifische T-Zell-Antwort; die Reaktion auf pp65 war kaum messbar. Bei anderen Patienten, wie z.B. bei Pt-15, war die IE-1-Antwort sehr schwach ausgeprägt; hier schien pp65 deutlich stärker zu stimulieren. Nur wenige Patienten hatten in etwa vergleichbar starke T-Zell-Antworten auf beide Proteine. Von beiden Proteinen wird angenommen, dass sie bedeutende, wenn nicht die beiden wichtigsten, Zielstrukturen in HCMV sind [37]. Warum so deutliche "Präferenzen“ für das eine oder das andere Protein beobachtet werden, ist unklar. Über das Ausmass der Immunogenität beider Proteine wird zudem kontrovers diskutiert. Einen Überblick zu diesem Thema gibt eine Übersichtsarbeit von Reddehase [37]. Träfe es tatsächlich zu, dass pp65 die proteasomale Prozessierung von IE-1 zu verhindern vermag, würden IE-1-Peptide nur bei nicht vorhandener UL83-Genexpression, also z.B. in der IE-Phase der Reaktivierung aus der Latenz, auf der Zell-Oberfläche präsentiert. Welche klinische Bedeutung das haben könnte, wird in Abschnitt 5.3 diskutiert.

5.3.3. Anzahl der identifizierten Epitope und Subpopulationen der Epitop-spezifischen T-Zellen

Auch in diesen beiden Aspekten zeigte die T-Zell-Antwort grosse Unterschiede zwischen verschiedenen Patienten. Bei einigen war die pp65-Antwort fokussiert auf ein einziges CD8+ Epitop. Pt-24 beispielsweise reagierte nicht auf IE-1 und hatte nur eine relativ schwache CD8+ T-[Seite 73↓]Zell-Antwort gegen pp65185-199 (Peptid 47). Diese Ergebnisse decken sich mit Beobachtungen von Wills und Mitarbeitern, die als erste die starke Fokussierung der T-Zell-Antwort gegen HCMV auf wenige oder nur ein einzelnes pp65-Epitop beschrieben [22]. Zudem ergab die Untersuchung der Klonalität ausgewählter starker CD8+ T-Zell-Reaktionen eine deutliche Fokussierung der Antwort auf einen oder wenige T-Zell-Klone, wie sie zuvor schon von Weekes und Mitarbeitern beobachtet worden war [23]. Ein gutes Beispiel dafür ist die T-Zell-Reaktion von Pt-30 auf IE-1245-259 (Peptid 62), die aus einem einzigen Klon bestand (vgl. Abb. 15, S.63). Bei keinem der untersuchten Patienten wies die T-Zell-Antwort eine polyklonale Struktur auf. Weekes und Mitarbeiter führten das unter anderem auf die wiederholte Auseinandersetzung mit viralen Antigenen im Rahmen von Reaktivierungen von HCMV zurück, die mit der Zeit einerseits zur Selektion von T-Zellen mit hochaffinen T-Zell-Rezeptoren und andererseits zu hohen Frequenzen dieser Antigen-spezifischen T-Zellen führe [23], ein Phänomen, das auch schon für andere persistierende Virusinfektionen wie EBV, HIV-1 und HTLV-1 beschrieben worden war [76 77 78]. Dass bei anderen Patienten hingegen Reaktionen gegen eine Reihe verschiedener Epitope beobachtet wird, war ebenfalls schon von Wills und Mitarbeitern beschrieben worden [22]. Bei Pt-9 beispielsweise führten fünf Epitope zu z.T. starken Reaktionen in der CD8+ und in der CD4+ T-Zell-Subpopulation, im Falle der Peptide 123 und 124 sogar in beiden Subpopulationen, ein Phänomen, das bisher noch nicht beschrieben worden war (vgl. Abb. 10, S.47). Die in der Stichprobe identifizierten CD4+ T-Zell-Epitope konnten dabei in einem, zwei oder drei Pentadecapeptiden enthalten sein, was auf sehr unterschiedliche Bindungsmotive schliessen lässt. Die IE-1-spezifische T-Zell-Antwort war demgegenüber in der hier untersuchten Gruppe deutlich stärker fokussiert. Im Median erkannten die Patienten nur ein Epitop in IE-1.

5.3.4. Bedeutung des HLA-Typs für die Reaktivität

Determiniert der HLA-Typ des Patienten seine HCMV-spezifische Reaktivität? Die hier vorgestellten Ergebnisse lassen diesen Schluss nicht zu und bestätigen damit die von Betts und Mitarbeitern gemachten Beobachtungen [79]. Eine Reihe von Patienten zeigte nicht die auf der Grundlage ihres HLA-Typs zu erwartenden Reaktionen auf bestimmte Peptide, eine Tatsache, für die es mehrere Erklärungen gibt. So war Pt-32 beispielsweise der einzige von neun untersuchten HLA-A2-positiven Patienten, der keine T-Zell-Reaktion auf die pp65-Peptide 123 und 124 zeigte. Das HLA-A2-Allel umfasst mindestens 25 molekularbiologisch unterscheidbare Subspezifitäten [80]. Möglicherweise verfügte Pt-32 nicht über die Subspezifität HLA-A*0201, sondern z.B. über HLA-A*0224. Diese Frage könnte leicht durch eine molekularbiologische Typisierung der HLA-[Seite 74↓]Typen beantwortet werden. Doch auch HLA-A*0201-positive Probanden reagieren nicht immer auf NLVPMVATV - in einer Arbeit von Longmate und Mitarbeitern hatten aber immerhin 28 von 30 HLA-A*0201-positiven Probanden (93 %) messbare T-Zell-Reaktionen auf dieses Peptid ("Chromium release assay“) [35]. Dieser Prozentsatz ähnelt dem in dieser Arbeit beobachteten von 88 %. Natürlich spielt die Sensitivität der Messmethode ebenfalls eine Rolle. Möglicherweise lag die Frequenz der für NLVPMVATV spezifischen T-Zellen von Pt-32 zum Zeitpunkt der Epitop-Kartierung einfach unterhalb der durchflusszytometrischen Nachweisgrenze, wie es z.B. bei Pt-7 beobachtet worden war. Zwei weitere Erklärungen für fehlende Reaktivitäten sind im Gegensatz dazu nur schwer zu untersuchen: das T-Zell-Rezeptor-Repertoire, über das ein Patient verfügt sowie der oder die HCMV-Stämme, mit denen er (ko-)infiziert ist. So wäre eine plausible Erklärung dafür, dass Pt-32 nicht auf die pp65-Peptide 123 und 124 reagierte, dass er über keinen passenden T-Zell-Rezeptor verfügte, um NLVPMVATV zu erkennen. Eine weitere Einschränkung der hier erzielten Ergebnisse besteht darin, dass den Versuchen die Aminosäure-Sequenz von IE-1 bzw. pp65 des Laborstamms AD169 zugrunde liegt. Klinische Isolate können von dieser Sequenz mehr oder weniger stark abweichen [51]. Es ist also durchaus denkbar, dass ein Patient T-Zell-Antworten in vivo gegen Peptid-Sequenzen hatte, die in unserem in vitro-System gar nicht vorkamen und deshalb auch nicht gemessen werden konnten. Es gibt Arbeiten, die sich mit der klinischen Relevanz der Infektion mit verschiedenen Virusstämmen auseinandersetzen. Andere Arbeiten konzentrieren sich auf die Identifizierung von Epitopen in Regionen immunogener Proteine, die hochkonserviert zwischen unterschiedlichen HCMV-Stämmen sind, wie z.B. das Exon4 von IE-1 (Aminosäurereste 86-491) [42].

5.3.5. Bedeutung von IE-1 und pp65

Desweiteren ist es wichtig zu beachten, dass die T-Zell-Antworten gegen lediglich zwei immundominante HCMV-Proteine gemessen wurden. Zwar wird mit einiger Berechtigung angenommen, dass es sich bei diesen Proteinen um wichtige Zielstrukturen in HCMV handelt. Ihr Stellenwert kann allerdings erst richtig abgeschätzt werden, wenn andere potentiell immunogene HCMV-Proteine wie pp150, pp28 oder gB in ähnlicher Weise - idealerweise vergleichend in einem größeren Patientenkollektiv - untersucht werden.

5.3.6. Verwendung von Vorhersagen

Für den Grossteil der hier als immunogen identifizierten Peptide konnte eine Vorhersage der präsentierenden HLA-Allele durchgeführt werden. Diese Analyse beruhte v.a. auf der Übereinstimmung von HLA-Allelen bei Patienten bzw. Probanden, die auf die gleichen Peptide reagier[Seite 75↓]ten, unterstützt von den Ergebnissen der Bindungsmotiv-Analyse durch die online-Datenbanken "SYFPEITHI“ und "BIMAS“. Eine solche Analyse allein auf der Grundlage dieser Datenbanken erscheint uns zur Zeit wenig ratsam. Für das bekannte HLA-B7-restringierte Epitop CRVLCCYVL etwa, das in den IE-1-Peptiden 77 und 78 enthalten ist, wurde von beiden Datenbanken HLA-B*2705 mit hoher Wahrscheinlichkeit als präsentierendes Allel angegeben. HLA-B7 erhielt dagegen sehr schlechte Ergebnisse. Die vorhergesagten immunogenen Nonamere unterschieden sich zudem bei beiden Datenbanken.Komplex war v.a. das Bild, das sich nach dieser Identifikation ergab. Für eine Vielzahl von Peptiden konnte gezeigt werden, dass sie von mehreren HLA-Allelen präsentiert wurden. Dies ist wahrscheinlich auf unterschiedliche immunogene Nonamere zurückzuführen, die gleichzeitig in einem Pentadecapeptid enthalten sein können. In einem Teil der Fälle könnte es sich aber auch um gleiche Nonamere gehandelt haben. Verschiedene Arbeitsgruppen haben sich mit der Zusammenfassung von MHC-Klasse-I-Allelen zu sog. Supertypen auf der Basis struktureller Ähnlichkeiten in der Antigen-Bindungsgrube, gemeinsamer Peptid-Bindungsmotive und Bindungsanker sowie der Identifikation von Peptiden, die mit einigen dieser Allele kreuzreagieren können, befasst. So sind z.B. ein HLA-A2-, A3-, B7- oder B44-Supertyp beschrieben worden [81 82 83 84 85]. Manche der von Sette und Mitarbeitern für diese Versuche hergestellten synthetischen Peptide konnten dabei von bis zu fünf verschiedenen HLA-Allelen gebunden werden [85]. Für einen Teil der Peptide, die wir als von mehreren HLA-Allelen präsentiert beschrieben haben, könnte dies ebenso zutreffen; die Peptide IE-1193-207 und IE-1197-211 (Peptide 49 und 50) kämen dafür z.B. in Frage. Die "Restriktionsanalyse“ legte für diese Peptide nahe, dass das gleiche immunogene Nonamer sowohl von HLA-B8 als auch von HLA-B18 präsentiert werden könnte. Eine Möglichkeit herauszufinden, welches jeweils die tatsächlichen immunogenen Nonamer-Sequenzen sind, besteht in der Fein-Kartierung mit sich um jeweils eine Aminosäure überlappenden Nonameren, wie von Kern und Mitarbeitern publiziert [30]. Für einen Teil der in dieser Arbeit identifizierten Peptide wurde diese Fein-Kartierung im Anschlussprojekt bereits durchgeführt. Ist das Nonamer identifiziert, kann das präsentierende HLA-Allel durch einen Vergleich reagierender Probanden, durch einen Zytotoxassay oder direkt durch die Generierung von Tetrameren verifiziert werden. Die beiden letztgenannten Verfahren sind aber relativ aufwendig.

Die Untersuchung der Häufigkeitsverteilung der HLA-Allele in der Stichprobe ergab, das sich diese nur für wenige Allele signifikant von der der mitteleuropäischen Durchschnittsbevölkerung unterschied. Die in der Stichprobe gemachten Ergebnisse sollten also der Situation in der Gesamtbevölkerung entsprechen oder zumindest relativ ähnlich sein. Der statistisch valide Nach[Seite 76↓]weis, dass Patienten und gesunde Probanden der gleichen Grundgesamtheit entstammen (sich also hinsichtlich der Struktur ihrer T-Zell-Antworten gegen IE-1 und pp65 nicht unterscheiden), konnte aufgrund der zu unterschiedlichen Altersstruktur in Patienten- und Probandengruppe hier aber nicht erbracht werden.

5.4. Schlussfolgerungen aus der Korrelation der experimentellen Ergebnisse mit HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung

Einleitend muss nochmals betont werden, dass eine Reihe der oben aufgeworfenen Fragen wie die Korrelation der HCMV-Reaktivierung mit Haupt-T-Zell-Zielstruktur, Anzahl der IE-1 bzw. -pp65-Epitope, dominanter T-Zell-Subpopulation usw. in der Patientengruppe zwar untersucht wurden, sich aber für keine davon statistisch signifikante Zusammenhänge ergaben. Wir führten dies v.a. auf die komplexen, recht vielschichtigen Ergebnisse in Kombination mit kleinen Fallzahlen zurück. Die nachfolgenden Überlegungen haben deshalb hypothetischen Charakter. Mit den hier vorgestellten Techniken sollen aber verschiedene Hypothesen in Folgestudien an einer größeren Patientenzahl verifiziert werden.

5.4.1. Klinische Implikationen der gemachten Beobachtungen

Bei Pt-7 zeigte sich, dass sich seine T-Zell-Antwort gegen pp65 aus sehr schwachen und sehr starken Reaktionen zusammensetzte. Welche Rolle solch schwachen T-Zell-Antworten gegen einzelne Epitope in der Kontrolle der Infektion zukommt, bleibt unklar. Prinzipiell stellt sich diese Frage aber für jede T-Zell-Antwort, unabhängig davon, welche Frequenzen zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessen werden. Eine einfache Beziehung nach der Art: "je grösser die Frequenz HCMV-spezifischer T-Zellen desto besser der Schutz vor einer HCMV-Erkrankung“ scheint es in dieser Weise nicht zu geben. Pt-15 hatte beispielsweise in dem Zeitraum, als bei ihm eine HCMV-Gastritis diagnostiziert wurde (um die 5. Woche nach Transplantation), pp65-spezifische T-Zell-Frequenzen um 0.5 %; seine T-Zell-Antwort richtete sich dabei gegen drei CD8+ Epitope und ein CD4+ Epitop in pp65. Die meisten anderen Patienten erkrankten nicht, auch wenn bei ihnen zu vergleichbaren Zeitpunkten z.T. deutlich kleinere Frequenzen HCMV-spezifischer T-Zellen gemessen wurden. Die Definition "protektiver T-Zell-Frequenzen“ ist also mit grossen Schwierigkeiten verbunden. Sie wird, wie oben angedeutet, durch die zu beobachtenden grossen Unterschiede in den Dosis-Wirkungsbeziehungen sowohl zwischen verschiedenen Peptiden als auch verschiedenen Patienten noch zusätzlich erschwert. Gleichwohl ist die Abhängigkeit des Schutzes vor HCMV-Reaktivierung bzw. -Erkrankung von der Frequenz Anti[Seite 77↓]gen-spezifischer T-Zellen evident. Sie wird nicht zuletzt durch ein hohes Risiko für HCMV-Erkrankungen (v.a. Retinitis und interstitielle Pneumonie) bei HIV-infizierten Patienten belegt, deren CD4+ T-Zell-Frequenzen 100/µl unterschreiten [11].

Eine weitere wichtige Frage ist, welche klinischen Implikationen die Immundominanz von IE-1 bzw. pp65 hat. Patienten, bei denen die IE-1-Antworten dominierten (8 von 20 Patienten), schienen besser vor HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung geschützt zu sein, als Patienten, die stärkere T-Zell-Reaktionen gegen pp65 hatten. Bei einem Grossteil dieser Patienten (5 von 8) wurde keinerlei Reaktivierung beobachtet. Drei von acht Patienten hatten lediglich Episoden symptomloser Reaktivierung. Obwohl dies bei der kleinen Fallzahl statistisch nicht signifikant war, erschien uns die Tendenz bemerkenswert. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung wäre, dass IE-1 als immediate-early-Genprodukt in der sehr frühen Phase des Replikationszyklus exprimiert ist. Da die Halbwertszeit eines peptidbeladenen MHC-Klasse-I-Moleküls auf der Zelloberfläche ca. 6 h beträgt, müssten IE-1-spezifische T-Zellen ihre Zielzellen v.a. in der IE- und E-Phase des Replikationszyklus (der beim HCMV ca. 24 h dauert) erkennen und zerstören, also lange bevor infektiöses Virus produziert werden kann. Das Early-Phasen-Genprodukt pp65 ist durch seine starke Präsenz in der Zelle (als häufigstes Tegument-Protein und Hauptbestandteil der "dense bodies“) möglicherweise tatsächlich immunogener als IE-1. Ob pp65 die Immunogenität von IE-1 durch Phosphorylierung zu reduzieren vermag, ist vermutet, aber nie bestätigt worden [54]. Wenn T-Zellen pp65-Peptide erkennen, kommen sie aber möglicherweise "zu spät“ - infektiöses Virus ist schon gebildet oder sogar freigesetzt worden. Von diesem Standpunkt aus betrachtet erschiene die verschieden starke Immunogenität der Proteine durchaus plausibel: das Virus könnte sich eine hohe Immunogenität von pp65 gewissermassen leisten, würde sich aber "bemühen“, IE-1 dem Zugriff der T-Zellen möglichst effektiv zu entziehen. Dazu würde die Beobachtung passen, dass die T-Zellen der Patienten im Median deutlich weniger IE-1-Epitope erkannten, als dies bei pp65 der Fall war (in der untersuchten Patientengruppe betrug der Median der T-Zell-Epitope eines in IE-1 gegenüber drei in pp65). Die Anzahl der Epitope, die bisher insgesamt in IE-1 identifiziert worden sind, ist ebenfalls deutlich kleiner als bei pp65, obwohl die Primärstruktur von IE-1 nur um 15 % kürzer ist (vgl. Abb. 11 und 12, S.53-54 ). Hinzu kommt die Beobachtung, dass HCMV-seropositive Patienten, die nicht gegen pp65 mit einer T-Zell-Antwort reagieren, seltener sind als dies für IE-1 der Fall ist (in der hier untersuchten Patientengruppe 0 % gegenüber 25 %). Wenn die Beobachtung tatsächlich zutrifft, dass Patienten mit ausgeprägten T-Zell-Antworten gegen IE-1 einen besseren Schutz vor HCMV-Erkrankung geniessen, gäbe es also einige Erklärungsansätze dafür.


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Einige Patienten hatten weitaus stärkere CD4+ als CD8+ T-Zell-Antworten gegen pp65 (Pt-10, Pt-43). Welches Gewicht letztlich den beiden T-Zell-Subpopulationen jeweils bei der Kontrolle des Virus zukommt, ist beim Menschen bisher nicht ausreichend untersucht. Polic und Mitarbeiter haben diese Frage aber detailliert im MCMV-Modell studiert [86]. Sie konnten demonstrieren, dass die immunologischen Funktionen MCMV-spezifischer CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie von NK-Zellen hierarchisch und redundant organisiert sind. Eine MCMV-Reaktivierung war selten, wenn nur eine dieser Subpopulationen in den Versuchstieren depletiert wurde. Wurden NK-Zellen und eine weitere Subpopulation depletiert, erwiesen sich die CD8+ T-Zellen als weitaus effektiver in der Kontrolle des Virus als CD4+ T-Zellen. Auch wenn die CD4+ T-Zellen in der Lage waren, die Vermehrung einzuschränken, war in 100 % der Mäuse eine Virusreplikation nachweisbar. Bei CD4+ und NK-Zell-depletierten Tieren konnte dagegen nur in 25 % der Mäuse eine Reaktivierung beobachtet werden. Es ist wahrscheinlich, dass auch im Menschen den CD8+ T-Zellen die massgebliche Rolle in der Kontrolle der HCMV-Infektion zukommt, unterstützt von NK-Zellen und CD4+ T-Zellen. Komanduri und Mitarbeiter konnten eine Korrelation zwischen HCMV-Erkrankung und dem Verlust HCMV-spezifischer CD4+ T-Zellen im Zuge progressiver HIV-Infektion zeigen [11]. In zwei Anfang 2002 veröffentlichen Arbeiten wurde ein Immunmonitoring von HCMV-spezifischen CD8+ T-Zellen bei KMT-Patienten vorgestellt [46 47]. Beide Arbeiten zeigten eine starke Korrelation zwischen der Rekonstitution HCMV-spezifischer CD8+ T-Zellen und dem Schutz vor HCMV-Erkrankung. Dieses Ergebnis ist nicht allzu überraschend, wurde doch zuvor schon in verschiedenen Arbeiten gezeigt, dass die Erholung der CD8+ T-Zellen insgesamt gut mit dem Schutz vor HCMV korreliert [5 6]. Als wesentlicher Kritikpunkt an diesem Ansatz ist aber anzuführen, dass lediglich einzelne antigene Determinanten isoliert beobachtet wurden, nicht die gesamte T-Zell-Antwort.

5.4.2. Resümé

Zwei der drei in dieser Arbeit verfolgten Ziele wurden erreicht: die Schaffung der technischen Voraussetzungen, um aus einem Minimum an Material die T-Zell-Antwort gegen immundominante Proteine in Antworten gegen einzelne antigene Determinanten, und, wenn gewünscht, auch in Antworten einzelner Klone, aufzugliedern, sowie die Anwendung dieser Techniken bei immunsupprimierten Patienten mit dem Ziel, die T-Zell-Antwort gegen die beiden vielleicht wichtigsten T-Zell-Zielstrukturen in HCMV, IE-1 und pp65, zu untersuchen. Zusammenfassend lassen die Ergebnisse die Aussage zu, dass die T-Zell-Antwort gegen diese Zielstrukturen von überaus komplexer Natur ist. Das dritte Ziel, die Unterschiede zwischen den Patienten hinsichtlich [Seite 79↓]HCMV-Reaktivierung und -Erkrankung auf die beobachteten grossen Unterschiede in der T-Zell-Antwort zurückzuführen, wurde nicht erreicht. Obwohl die Beobachtung eines möglichen Zusammenhanges zwischen einer T-Zell-Antwort gegen IE-1 und Schutz vor HCMV-Reaktivierung interessant ist, wirft die unerwartet grosse Komplexität der gemachten Beobachtungen eine Reihe neuer Fragen auf, deren Beantwortung derzeit schwierig erscheint.


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27.05.2004