2.  Einleitung

Apoptose, der programmierte Zelltod, ist ein Prozess der unter Betätigung einer Vielzahl biologischer Systeme und Signalwege reguliert wird. Die beteiligten Apoptosegene, sowie deren Aktivierung bzw. Hemmung spielen eine wesentliche Rolle in der malignen Transformation von Tumoren.

Die Fragestellung der vorliegenden retrospektiven Arbeit war die Analyse von molekularen Veränderungen von p53 und K-ras und die Suche nach prognostisch relevanten Faktoren als Basis für die zukünftige Entwicklung individueller therapeutischer Strategien in Bezug auf diese beiden Proteine. Schwerpunkt dieser Arbeit war die Fortsetzung einer vorausgegangenen retrospektiven Studie zu den Apoptosegenen p53, Bax, und p16^ink4a/CDKN2 bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus (1).

Resistenz gegenüber Zytostatika und Bestrahlung ist der wesentliche Grund für das Versagen von Tumortherapien in der Onkologie. Studien zur Pathogenese der Therapieresistenz ergaben Hinweise auf eine Regulation der zelluläre Antwort auf Zytostatika und Bestrahlung über das Tumorsupressorgen p53. Untersuchungen zum Tumorsupressorgen p53 in der ösophagealen Tumorgenese zeigten zudem molekulargenetische Veränderungen in späten Stadien der Tumorentwicklung und ergaben somit einen Hinweis, dass p53 Mutationen an der Tumorprogression beteiligt sein könnten.

Studien zur Ras-Onkogen-Familie zeigten dagegen das Auftreten aktivierender Mutationen in frühen Stadien in Tumoren des gastrointestinalen und respiratorischen Traktes (2). Prognostische und therapeutische Bedeutung kann K-ras u.a. erlangen infolge der Aktivierung anti-apoptotischer Signalkaskaden, z.B. über PI3- und Akt-Kinase, sowie durch den klinischen Einsatz von Inhibitoren der Farnesyl-Protein-Transferase (FTPase), eines für die Signaltransduktion und Aktivität von K-ras wichtigen Enzyms. Daten ösophagealer Tumore im Rattenmodell zeigten Aktivierung von K-ras und Genamplifikation des K-ras Onkogens sowie eine Überexpression von H-ras RNA und in niedriger Frequenz auch K-ras Mutation.

Aufgrund dieser Befunde und Vorarbeiten zum p53 Signalweg wurden Mutations- und Protein-Epressions-Analysen des Tumorsuppressorgens p53 und des zellulären Onkogens K-ras in einem Kollektiv von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus durchgeführt und deren Zusammenhang untersucht.

Für die Analyse von p53 und K-ras wurden Tumorproben von 68 Patienten mit primären Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus mittels der Polymerase-Chain-Reaction – Single-Strand-Conformational-Polymorphism – Methode (PCR-SSCP) auf p53 Mutationen untersucht. Mittels immunhistochemischer Methoden (IHC) wurde das Expressionsniveau des p53-Protein bestimmt und mittels genomischer PCR gefolgt von einem Oligonukleotid basierten Hybridisierungstest wurden aktivierende Punktmutationen von K-ras im Codon 12 nachgewiesen.

2.1.  Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus

2.1.1.  Modelle zur Tumorgenese ösophagealer Plattenepithelkarzinome

Folgende Mechanismen können bei der Entwicklung von Plattenepithelkarzinomen von Bedeutung sein.

Genetische Instabilität spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und auch bei der Progression maligner Tumoren. Mutationen in Kontrollgenen verleihen dabei tumorösen Zellen einen selektiven Wachstumsvorteil, mit dem Resultat eines klonalen Wachstums. Eine Form der Instabilität kann durch Inaktivierung sogenannter DNA mismatch repair (MMR) Gene entstehen. Wichtige MMR Gene sind z.B. MSH2 oder MLH1. Ihre Inaktivierung ist an über das Genom verstreuten, kleinen DNA Repeats erkennbar, die bei MMR-Instabilität charakteristisch verlängert oder verkürzt sind. Man spricht dann von Mikrosatelliten Instabilität (MIN).

Eine weitere Form der Instabilität basiert in den Chromosomen in Sinne von Aneuploidie, welche durch genetische Veränderung in mitotischen Genen entstehen kann, die in Ungleichverteilungen von Chromosomen nach mitotischer Zellteilung resultiert. Bei diesen chromosomalen Instabilitäts (CIN)-Veränderungen könnte es sich um Nebeneffekte maligner Transformation handeln, wie sie durch Veränderungen von ras, myc oder p53 ausgelöst werden. Für die Initiierung des CIN-Typs scheinen die genannten Gene jedoch nicht verantwortlich, da MIN Tumore, obgleich sie nicht aneuploid sind, gleiche Mutationen, z.B. in p53 oder ras, wie CIN Tumore, sowie gleiche Charakteristika der Stadien und Progression aufweisen. Es kommt infolge CIN oder MIN zu klonalem Wachstum, durch Aktivierung von Onkogenen, Inaktivierung von Tumorsupressorgene oder durch Veränderung von Reparaturgenen, wie der BLM-Helikase oder der MMR Gene, MLH1 und MSH2, welche physiologischerweise die genetische Stabilität sichern. Eine zu hohe Anzahl an Mutationen führt jedoch zum Zelltod. Das Wachstum der Zellpopulation ist demnach gekennzeichnet durch die Balance zwischen Mutations-Effekten, welche Selektion bzw. Wachstumsvorteile fördern, und solchen, welche zum Zusammenbruch der Zellpopulation führen. Selektionsbarrieren sind u.a. abnorme Bedingungen im zellulären Milieu, Perioden von Hypoxie, Malnutrition, hormonelle Einflüsse und potentielle Angriffe des Immunsystems (4).

Hypothesen zur genetischen Instabilität der kolorektalen Tumorentstehung, welche auch im Rahmen der ösophagealen Karzinogenese diskutiert werden, besagen, dass multiple genetische Veränderungen bzw. Mutationen zur Entwicklung maligner Tumore notwenig sind. Nach Darstellungen kolorektaler Tumormodelle sind mindestens sieben voneinander unabhängige Ereignisse für eine genetische Instabilisierung von Allelen der Tumorsupressorgene verantwortlich (5). Dabei gibt es bevorzugte Sequenzen für Mutations-Ereignisse, deren Akkumulation bestimmender für den biologischen Phänotyp ist, als deren Reihenfolge.

Das Model der monoklonalen Theorie besagt, dass der Grund für die Entstehung multipler Foci in der Streuung von Zellen liegt, die einer einzigen neoplastischen Zelle entstammen. Die Theorie der „field cancerization“ hingegen diskutiert, dass Karzinogene ihre Wirkung kontinuierlich auf ein Organ oder einen Gewebebereich ausüben, welcher genetisch instabil wird und in Folge für die Tumorentwicklung prädisponiert ist. Dies führt zu multiplen, unabhängig von einander auftretenden Foci von Läsionen (6).

Studien zur Morphologie von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus und systematische Charakterisierungen des kanzerösen Feldes zeigen, basierend auf der Akkumulation von p53, dass diese wahrscheinlich in frühen Stadien an multifokalen Regionen des Gewebes entstehen, die zu Gruppen transformierter Zellen fusionieren können und nicht durch Streuung ausgelöst sind (7). Die hohe Frequenz p53-positiver, dem Tumor benachbarten Epithelien bei p53-negativen Karzinomen, sowie das Vorkommen unterschiedlicher p53 Mutationen unterstützen diese Theorie der „field-cancerization“ der Kanzerogenese. Dieses Phänomen könnte ein Grund für das Entstehen von Rezidivien nach Entfernung des Primärtumors sein (6).

Das Modell der Adenom-Karzinom-Sequenz besagt, dass sich Tumore des Gastrointestinaltraktes wie die Ösophaguskarzinome in Stadien histopathologischer Veränderungen innerhalb des Epithels entwickeln. Diese Stadien gehen von normalem Epithel über zu Atrophie mit verlängerten Papillen und zu Hyperplasie des Epithels mit über 15% an proliferierenden, basalen Zellen (basal cell hyperplasia (BCH)). In höheren Stadien kommt es zu leichter bzw. schwerer Dysplasie (DYS) mit veränderten Krypten, Kernatypien, Verlust der normalen Zellpolarität und dem Auftreten abnormer Gewebeausreifung. Schreitet die Entwicklung zu sogenannten Früh-Adenomen fort, gelten u.a. K-ras Mutationen als Progressionsfaktor für Spät-Adenome. Die Aktivierung des Onkogens K-ras erfordert nur ein genetisches Ereignis, im Gegensatz zu Tumorsuppressorgenen, welche zu ihrer Inaktivierung zwei, in jedem Allel eines, benötigen (5).

Das nächste Stadium, u.a. gefördert durch das Tumorsuppressorgen p53 ist das Carcinoma in situ (CIS), mit vollständiger Durchsetzung des Epithels mit dysplastischen Zellen, jedoch noch intakter Basalmembran. Das CIS kann über Jahre asymptomatisch bleiben, bevor es zur Invasion und Überschreitung der Basalmembran und somit zum manifesten ösophagealen Plattenepithelkarzinom fortschreitet (6). Morphologische Veränderungen im Bereich von Plattenepithelkarzinomen sind abgeplattete, erodierte Mukosaanteile als Zeichen von DYS und CIS, sowie eine Verdickung der longitudinalen und transversalen Mukosafalten (7). Zur Klassifizierung gut- bzw. schlecht-differenzierter Karzinome können keratinisierte Zellen genutzt werden (8).

	Abb. 1 : Adenom-Karzinom-Sequenz

Die Auslösung von Karzinomen im menschlichen Organismus ist in der Regel nicht auf eine einzige Ursache zurückzuführen. Dies schließt konsequenterweise die Schwierigkeiten mit ein, die sich bei der Bewertung von chemischen Stoffen, Umweltfaktoren und anderen Risikoparametern ergeben.

Kanzerogene bzw. Mutagene können mit der DNA reagieren und deren Struktur verändern. Voraussetzung ist u.a. die Umwandlung inaktiver Vorstufen in aktive Formen. Innerhalb des Lebermetabolismus findet z.B. eine direkte Aktivierung karzinogener Vorläufer als Substrate des Cytochrom p450-Systems statt. Genetische Varianten solcher metabolischer Enzyme, wie z.B. die Glutathion-S-Transferase-M1 (GSTM1), mit geringerer Kapazität, Karzinogene, zu entgiften, stellen ein erhöhtes Erkrankungsrisiko dar (9, 10).

Alkohol- und Tabak-Konsum gelten als die Hauptrisikofaktoren für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus in Nordamerika und Europa. Epidemiologische Daten zeigen eine signifikante Beziehung zwischen chronischem Alkohol-Konsum und erhöhtem Tumorrisiko im oberen Atem- und Verdauungstrakt (Kopf-Hals-Tumore). Die biologischen Wirkungsmechanismen des Ethanols, bzw. seines Metaboliten, Acetaldehyd, sind bislang ungeklärt, wobei unter anderem Proliferationshemmung, Apoptose, Induktion einer verzögerten G1-Phase, Aktivierung der Proteinkinasen und Protoonkogenen, Inhibition der DNA Reparatur und Erzeugung freier Radikale diskutiert werden (11). Ein weit größerer Teil an Tumoren des oberen Atem- und Verdauungstraktes ist positiv korreliert mit dem Tabak-Konsum. Teerprodukte enthalten u.a. die für eine karzinogene Wirkung verantwortlichen polyzyklischen, aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK). PAK entstehen beim Erhitzen von organischem Material unter Sauerstoffmangel (u.a. in Luftverunreinigungen, Zigarettenrauch). Aktive Verbindungen, wie Benzo(a)anthracen oder Benz(a)pyren, mit selbst schwacher karzinogener Aktivität, können über Substitutionen von Methylgruppen potente Karzinogene produzieren, wie z.B. 7,12-Dimethyl- und 7,8,12-Trimethylbez(a)anthracene. Die Aktivierung der chemisch reaktionsträgen polyzyklischen Aromaten wird durch Monooxygenase (MO) und Epoxidhydrolase (EH) katalysiert (10). Die so entstandenen Epoxide, als enzymatische Endprodukte von PAK, stellen mutagene Verbindungen dar, die irreversibel an DNA sowie RNA binden und damit wohl die Tumorentstehung induzieren (12). Im Vergleich der Erkrankungsrisiken bei gleichzeitigem Alkohol- und Tabak-Konsum zeigt sich, dass das Risiko an einem Ösophaguskarzinom zu erkranken, z.B. bei 0-9 g Tabak und 0-40 g Alkohol pro Tag gleich 1.0 ist, während es bei ≥ 30 g Tabak und ≥ 121 g Alkohol pro Tag auf 149,3 ansteigt. Wenn eines zum anderen kommt, erhöht sich das Risiko eines Rauchers, einem Ösophaguskarzinom zu erkranken beträchtlich, je mehr Alkohol er trinkt. Dies ist ein Hinweis auf die synergistische Wirkung, die begünstigende Faktoren – auch wenn sie alleine keinen Tumor auslösen können – für die Tumorgenese haben können (12).

Infektionen mit DNA-Viren der Humanen Papillomavirus-Gruppe (HPV), Typ 16 und 18, sind assoziiert mit anogenitalen Tumoren und Plattenepithelkarzinomen. Sie vermehren sich bevorzugt in Plattenepithelien und induzieren warzenartige Veränderungen und chronische Entzündungsreaktionen, die Basis tumoröser Entwicklungen sein können. HPV-DNA Nachweise in Plattenepithelkarzinomen von 0-72% variieren in verscheidenen geographischen Regionen (13). Wesentlich hierfür sind die HPV Proteine E6 und E7, die das Rb bzw. das p53 Protein inaktivieren und hierdurch Proliferations- und Apoptosekontrollmechanismen aufheben.

Prädisponierende Grunderkrankungen für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus sind u.a. chronische Ösophagitiden, die in Hoch-Risiko Gebieten schon bei jungen Menschen beobachtet werden (14), die Tylosis, eine autosomal vererbte Erkrankung, welche durch Hyperkeratose der Handflächen, Fußsohlen und der Papillen des Ösophagus charakterisiert ist, sowie die Achalasie, bei der das Gewebe in häufigen Kontakt mit Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen von zurückgehaltenen Speisen oder Getränken kommt. Ferner können Verletzungen, Verätzungen, ösophageale Divertikel oder das Plummer-Vinson Syndrom, eine aus einer Eisenmangelanämie entstehende Schleimhautatrophie in Mund, Rachen und Ösophagus, zu Plattenepithelkarzinomen führen.

Ursächlich für die unten dargestellten Unterschiede in der geographischen Verteilung ösophagealer Plattenepithelkarzinome sind möglicherweise auch Einflüsse spezifischer Umweltfaktoren und Ernährungsgewohnheiten. In Süd-Afrika, im Iran und in China findet man z.B. Assoziationen zu auf Mais oder Mehl basierten Speisen, bestimmten eingelegten Gemüsen und dem Konsum kochend heißer Speisen (15). Ferner werden Kontamination von Speisen mit Pilzen, wie z.B. Fusarium moniliforme, oder Mykotoxinen, sowie Defizite an Vitaminen, wie z.B. Vit A, C, E, Niacin, Riboflavin, Zink- oder Spurenelementdefizite, Mangel an Anti-Oxidantien oder die Bildung von Stickstoffmonoxid diskutiert (16).

Antioxidantien, wie Vitamin C, Betakarotine oder alpha-Tocoferol, können DNA-schädigende freie Radikale, wie sie z.B. bei Tabak-Konsum oder Reflux entstehen, neutralisieren (18).

Stickstoffmonoxid (NO), welches endogene N-Nitrosamine bzw. N-Nitroso-Verbindungen bildet, wird durch Überexpression der induzierbaren Stickstoffmonoxid–Synthase (nitric oxid synthase (NOS)) in mehreren Zelltypen, wie z.B. Makrophagen, Endothelzellen und einigen Karzinomzellen in großen Mengen produziert. NO ist ein wichtiger second messenger und wird generell in allen Zellen gebildet. Die Beteiligung von NO in der menschlichen Karzinogenese ist jedoch noch unklar. Studien zeigten, dass NO den Übergang von Kolonadenomen zum Carcinoma in situ fördert, DNA-Schäden und Angiogenese induzieren kann, jedoch auch das Wachstum epithelialer Tumorzellen inhibiert. NO induziert u.a. eine Akkumulation von p53 (19). Das Reaktionsprodukt von NO und Superoxid (O2-), Peroxynitrit (ONOO-), ist ein potentes nitrierendes und oxidierendes Agens, das mit Tyrosin reagiert, um Nitrotyrosin zu bilden. Das endogene Nitrotyrosin ist damit ein Marker für die Bildung von Peroxynitrit, welches in gesundem Gewebe nicht nachweisbar ist.

Kanzerogenität von N-Nitrosomethylbenzylamine (NMBA), die in Zink-defizienten Ratten beobachtet wird, wirkt möglicherweise durch erhöhten ösophagealen mikrosomalen Matabolismus von NMBA, Bildung von O6-Methylguanin, Hemmung ösophagealer Reparaturenzyme, sowie eine erhöhte ösophageale Zellproliferation. Das Rattenmodel zeigt, dass ein Zink-Defizit die Inzidenz ösophagealer Karzinome steigert, wodurch im allgemeinen nicht-tumorinduzierende Dosen von NMBA zu hoch tumor-induzierenden werden können (20).

Ösophaguskarzinome gehören weltweit zu den häufigen malignen Tumoren mit hoher Mortalität. Die geographische Verteilung ösophagealer Plattenepithelkarzinome weist zeitliche und örtliche Unterscheide mit bis zu 17-fachen Differenzen der Inzidenz- und Mortalitätsraten auf. Studien und Daten zu Mortalitätsraten der WHO beschreiben u.a. Hoch-Risiko Gebiete in Nord-China (Provinzen Linxian, Henan Provinz, Shanxi, Sichuan (6)), Puerto Rico, Singapur, Iran, Frankreich, Schweiz, Norditalien und in Süd-Thailand.

In der dunkelhäutigen und asiatischen Bevölkerung dominieren Plattenepithelkarzinome, während in der weißen Bevölkerung in Nord-Amerika und Europa Adenokarzinome überwiegen (21).

Während in den USA unter männlichen Weißen in den Jahren 1974 – 1994 die jährliche Inzidenzrate der Plattenepithelkarzinome von 3.4 auf 2.2 pro 100 000/Einwohner sank, stieg sie für Adenokarzinome von 0.7 auf 3.2. Unter männlichen Schwarzen ließ sich in der gleichen Zeit ebenfalls ein Anstieg der Adenokarzinome von 0.4 auf 0.6 beobachten, während die Inzidenz von Plattenepithelkarzinomen konstant bei 13.2 lag. Innerhalb der weiblichen Bevölkerung sind die Inzidenzraten beider Typen proportional niedriger (9).

Trotz Verbesserungen in der Behandlung bleibt die Prognose ösophagealer Tumore schlecht. Die durchschnittliche Überlebenszeit ösophagealer Karzinome liegt bei 11 Monaten nach Diagnosestellung, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 5-44 % in unterschiedlichen geographischen Regionen (21, 22, 23, 24).

Die UICC (Union Internationale Contre le Cancer) erstellt Datenbanken der WHO mit Statistiken zu altersangepasste Mortalitätsraten maligner Tumore von aus weltweit 33 Ländern. Die aus Standard-Populationen ermittelten Raten pro 100 000/Einwohner der Jahre 1988-1992 zeigen hohe Werte von 11 in Frankreich, 7.8 in England und 7.7 in Chile, für Männer, bzw. 3.7 in Irland, 3.4 in Chile und 3.2 in England, für Frauen. Für Deutschland liegen die Werte innerhalb dieses Zeitintervalls, getrennt nach Geschlechtern, bei 5.2 bzw. 0.9. Die niedrigsten Werte sind 2.0 in Mexiko, 1.7 in Israel und 1.5 in Griechenland, für Männer, bzw. 0.5 in der ehemalige Tschechoslowakei, 0.5 in Griechenland und 0.5 in Österreich, für Frauen.

1999 publizierte Mortalitätsraten zeigen einen Anstieg und eine geographische Umverteilung, mit Höchstwerten für Männer bzw. Frauen, von 19.2 bzw. 7.1 in Süd-Afrika und 15.8 bzw. 7.9 in China (je pro 100 000/Einwohner) und niedrige Werte von 1.0 bzw. 0.1 in Mittel-Afrika und 0.9 bzw. 0.5 in West-Afrika (25).

Trotz Fortschritten in der diagnostischen Technik werden Ösophaguskarzinome wie auch andere Tumore des gastrointestinalen Traktes selten in frühen Stadien diagnostiziert. Das Alter der Patienten liegt bei Erstdiagnose in der Regel zwischen 55 – 65 Jahre. Initiale Symptome sind Dysphagie (80-96%), ab einem Durchmesser von mehr als 13mm, Gewichtsverlust (42-46%), retrosternale oder epigastrische Schmerzen (6-20%), Kachexie (6%), Husten (3-4%) sowie Aspirationspneumonien; in fortgeschritteneren Stadien kann es zu Hämatesis, Hämoptysis, Melaena, Nervenläsionen, wie z.B. Horner-Syndrom, zu Vena subclavia Syndromen, zur Erosion der Aorta, zu Pleuraergüssen, Ascites, paraneoplastischen Syndromen, wie z.B. eine Hyperkalziämie kommen (14).

Lokalisiert sind ca. 15% der Tumore im oberen Drittel, 50% im mittleren und 35% im unteren Drittel des Ösophagus. Je größer die Ausdehnung des Tumors in einem bzw. mehreren Dritteln, desto höher ist der Anteil betroffener anliegender Strukturen.

In 65% haben Karzinome einen Durchmesser von ≤ 5cm mit einer Metastasierungswahrscheinlichkeit von 35%, in 25% sind die Karzinome > 5cm mit einer Metastasierungswahrscheinlichkeit von 75%. Das dichte Lymphgefäßsystem in der ösophagealen Mucosa und Submucosa kommuniziert mit extraösophagealen Lymphgefäßen, was die Streuung von Metastasen innerhalb des Ösophagus, als auch in thorakale, suprazervikale und zervikale Lymphknoten-Regionen erleichtert.

Auf internationaler Ebene bestehen z.T. Unterschiede in der pathologischen Diagnostik von Dysplasien versus Karzinomen. Diagnostische Kriterien sind einerseits die Invasion des Tumors in die Lamina propria der Mucosa, andererseits nukleäre und strukturelle Merkmale, wie Hyperchromasie, Variabilität und Vergrößerung der Nukleoli. Kriterien, welche auf geringsten Veränderungen basieren, können zu unangemessenen Diagnosen und Behandlungen mit unnötig hohen Komplikationsraten führen. Andererseits können zu hoch angesetzte Schwellenkriterien in einer verspäteten Behandlung resultieren. Es sollte daher eine eindeutige Nomenklatur der Stadien bzw. der histologischen Kriterien angestrebt werden (21).

Das klinische Staging und Grading von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus nach dem TNM-System ist international etabliert und beeinhaltet die folgenden Kriterien. Die sieben T-Kriterien für primäre Tumore, umfassen T0, kein Primär-Tumornachweis, Tis, präinvasives Carcinoma in situ (CIS), T1, Invasion bis an die Grenze der Submucosa, T2, an die Grenze der Muscularis propria, T3, Invasion der Adventitia sowie T4, Invasion angrenzender Strukturen. TX bedeutet fehlende bzw. mangelhafte Bewertbarkeit des Tumors. Eine Invasion der Lymphgefäße kann auftreten, wenn der Tumor die Muscularis mucosae überschreitet. Der Status der regionalen Lymphknoten wird mit den drei N-Kriterien, N0, kein Nachweis bzw. N1, Nachweis einer Metastasierung in regionale Lymphknoten, beschrieben. NX bedeutet fehlende oder mangelhafte Einschätzbarkeit des Lymphgewebes. Die M-Kriterien für Fernmetastasen sind M0, kein Nachweis bzw. M1, Nachweis von Fernmetastasen. MX bedeutet fehlende oder mangelhafte Einschätzbarkeit von Fernmetastasen.

Aus dieser TNM Klassifikation leiten sich klinisch strukturierte Klassifikationssysteme für die Gruppierung der Stadien ösophagealer Karzinome. Nach der AJCC (American Joint Committee on Cancer) Klassifikation liegt das Stadium 0 bei den Kriterien Tis-N0-M0 vor, Stadium I bei T1-N0-M0. Stadium II umfasst T2-N0-M0, T1-N1-M0 und T2-N1-M0 und Stadium III umfasst T3-N0-M0, T3-N1-M0 und T4-N1-M0. Bei jedem Nachweis von Fernmetastasen (M1) wird von Stadium IV gesprochen (14).

Die Einteilung der Tumoren erfolgt einerseits anhand des Bezuges zum Tracheobronchialsystem (infrabifurkale, suprabifurkale und rein zervikale) und andererseits nach der TNM-Klassifikation der UICC (Union International Contre le Cancer) und der AJCC (American Joint Commission for Classification of Cancer).

Tab. 1 : Tumor-Nodus-Metastase (TNM)-Stadieneinteilung des Ösophaguskarzinoms nach UICC*

Tab. 2 : Klinische Stadieneinteilung der Ösophaguskarzinome nach AJCC*

Tab. 3: Klinische Stadieneinteilung der Ösophaguskarzinome nach UICC

Klinisch-pathologische Merkmale, wie das Alter, die Histologie, die Tiefe der Tumorinvasion, das Ausmaß der lymphatischen und venösen Invasion, Fernmetastasen und das Stadium sind nur bedingt prognostisch zuverlässig (26).

Erkenntnisse über die molekulargetischen Mechanismen der Tumorentstehung könnten die Erstellung von zuverlässigen Diagnose- und Prognosekriterien ermöglichen und werden durch Entwicklung geeigneter Nachweis-Methoden erleichtert (27). Einzelne oder kombinierte diagnostische molekulare Marker werden durch Techniken mit hoher Spezifität und Sensitivität, wie der PCR-SSCP, der RT-PCR oder der Immunhistochemie können nun konventionelles Staging und Grading, wie z.B. durch die Identifizierung von Mikrometastasen, ergänzen (9). Durch die Entwicklung monoklonaler Antikörper wurden die Untersuchung von Zellzyklus-, Apoptose-, oder Therapieresistenz-assoziierten Proteinen, z.B. mittels Immunhistologie oder Durchflußzytometrie, und deren Einsatz zum Screening von Tumormaterial ermöglicht (27). Auf Grund der unterschiedlichen genetischen Veränderungen von Ösophaguskarzinomen erscheint die Entwicklung einzelner spezifischer Marker schwer, eine ganze Gruppe von Markern, sogenannter Risikoprofile, hingegen eine bessere Strategie zu sein.

Tab. 4: Diagnostik und Staging bei Patienten mit Ösophaguskarzinom (87)

Tab. 5: Präoperative Untersuchungsmethoden zur Risikoabschätzung (87)

In der Behandlung von Karzinomen des Ösophagus wird bei kurativer Intention die multimodale Therapie mit Einsatz von Chemo- und Radiotherapie, Operation sowie der externen Bestrahlungstherapie eingesetzt. Eine frühe Entdeckung von Ösophaguskarzinomen ist die beste, oft einzige Chance, die Prognose zu verbessern, unter der Vorraussetzung einer kompletten Entfernung, weshalb das präoperative Staging eine entscheidende Rolle in der therapeutischen Entscheidung spielt.

Von Goldie und Coldman wurde zudem das Auftreten mutierter Klone mit einem mathematischen Modell beschrieben, und hieraus wurden wesentliche Rückschlüsse für die klinischen Therapiestrategien abgeleitet. Die Goldie-Coldman-Hypothese besagt, dass während der Größenzunahme eines Tumors die Zahl der zur Therapieresistenz führenden mutierten Zellklone zunimmt. Mit anderen Worten: Es besteht eine enge Beziehung zwischen Tumorgröße und der Wahrscheinlichkeit, dass der Tumor resistente Zellen enthält. Mit zunehmender Tumorgröße reduziert sich daher die Wahrscheinlichkeit einer Heilung durch Chemotherapie. Eine wesentliche Schlussfolgerung aus der Goldie-Coldman-Hypothese ist die Notwendigkeit, bei chemosensiblen Tumoren so früh wie möglich mit einer zytostatischen Kombinationstherapie unter Verwendung nicht kreuzresistenter Zytostatika zu beginnen (28).

Zytostatika wirken meist nur auf proliferierende Zellen. In der G0- oder Ruhephase sind gesunde als auch Tumorzellen daher weitgehend unempfindlich. Die G0-Phase ist die prädominante Zellzyklus-Phase von Dauergewebes. Im Gegensatz hierzu treten Tumorzellen gehäuft aus der Ruhephase in den Zellzyklus ein. Die erste Phase des Zyklus ist die präsynthetische G1-Phase, gefolgt von der DNA-Synthese-Phase (S-Phase), der prämitotischen G2-Phase und der mitotischen M-Phase. Nahezu alle Zytostatika haben ihre größte Wirkung auf Zellen, die sich im Zellzyklus befinden. Vergleicht man Tumore mit unterschiedlichen Wachstumsgeschwindigkeiten, so wird klar, dass schnellwachsende Tumore durch Chemotherapie am besten zu beeinflussen sind. Es besteht eine Beziehung zwischen der therapeutischen Sensibilität und der Wachstumsgeschwindigkeit. Die meisten klinisch eingesetzten Chemotherapeutika sind bei langsam wachsenden Tumoren, wie dem Ösophaguskarzinom ohne Basistherapie und Operation, daher oft nur palliativ einsetzbar (28).

Behandlungsresultate von Tumoren durch Chemotherapie zeigen, dass bei Ösophaguskarzinomen durch eine palliative Therapie eine Tumorverkleinerung erreichbar ist, ohne dass damit in der Regel eine Lebensverlängerung verbunden ist. Der Profit der Chemotherapie ist dabei vor allem für frühe Stadien der Erkrankung etabliert. Eingesetzt werden meistens 5-Fluorouracil (5-FU) und Cisplatin (28). 5-Fluorouracil hat als S-Phasen-spezifisches Zytostatikum seinen zellzyklusspezifischen Angriffspunkt an der DNA-Synthese. Folinsäure kann hierbei den Abbau von 5-FU durch Hemmung der Thymidilatsynthase (TS) verlangsamen. Cisplatin bildet DNA-Addukte und induziert hierdurch Zelltod. Die drei Wirkstoff-Kombination ergibt gute Resultate in frühen Stadien (29), steigert die Rate resezierbarer Tumore, verbessert die lokale Tumorkontrolle und verlängert das rezidivfreie Intervall. Der Effekt der systemischen Chemotherapie auf lokal fortgeschrittene und metastasierte Karzinomen ist jedoch gering. Aufgrund organtoxischer Wirkungen von Fluorouracil, wie z.B. auf das Knochenmark, mit Leuko-, Thrombozytopenie und Anämie, und auf den Magen-Darm-Trakt, sowie hoher postoperativer Morbidität und Mortalität sind weitere Verbesserungen notwenig (30).

Gen- und immuntherapeutische Ansätze haben bisher keinen Einzug in die Klinik solider Tumore des Ösophagus gefunden.

Primäre oder erworbene Resistenzen können Ursache für das Versagen von zytostatischen Tumortherapien sein. Der Versuch der Induktion von Apoptose, welcher in vitro durch eine Reihe chemotherapeutischer Wirkstoffe gelingt, wird daher in Studien auch in vivo bei ösophagealen Plattenepithelkarzinomen angestrebt Der Versuch der Induktion von Apoptose, welcher in vitro durch eine Reihe chemotherapeutischer Wirkstoffe gelingt, wird daher in Studien auch in vivo bei ösophagealen Plattenepithelkarzinomen angestrebt (32). So ist z.B. die Rekonstitution von Zellzyklus-Arrest und Apoptose-fördernden Genen bereits Ziel gentherapeutischer Strategien und für p53, den "Wächter des Genoms" (33), konnte gezeigt werden, dass lokaler p53-Gentransfer die Tumorregression bei Bronchialkarzinomen begünstigt., konnte gezeigt werden, dass lokaler p53-Gentransfer die Tumorregression bei Bronchialkarzinomen begünstigt.

Vor der kurativen Tumorresektion wird der kombinierte und simultane Einsatz einer präoperativen Radiotherapie additiv zur Chemotherapie durchgeführt (27). Die Strahlentherapie kann perkutan und/oder als intraluminale Brachytherapie durchgeführt werden.Die Strahlentherapie kann perkutan und/oder als intraluminale Brachytherapie durchgeführt werden.

Unter den operativen Verfahren wird die Anwendung von EMR (endoscopicmucosal resection) als minimal invasive Behandlung zur frühen Entdeckung und gleichzeitigen Entfernung oberflächlicher Tumoren diskutiert. Die Indikationen für EMR sind auf Tumore der epithelialen Schicht und der Mukosa propria beschränkt (34).Tiefere liegende Karzinome erfordern eine radikale Resektion mit Thorakotomie bzw. Laparatomie (8).

Zur weiteren Einschätzung der Operabilität sollten die präoperativen Stagingverfahren die Lage des Tumors zu angrenzenden Strukturen (Lokalisation), die Tiefe der Tumorinvasion bestimmen (T-Status), regionale Lymphknotenmetastasen evaluieren (N1), Fernmetastasen ausschließen (M1) und das histopathologische Gradung bewertet werden. Bildgebende Techniken mit geeigneter Sensitivität die Endosonographie, die Computertomographie, Röntgenaufnahmen, Ultraschall und die Laparoskopie (35).Wichtig ist es, Patienten herauszufiltern, die von einer Operation profitieren, sowie Patienten mit z.B. Nachweis von Fernmetastasen von evtl. unnötig risikoreichen Operationen mit prä- und postoperatievn Komplikationen auszuschließen.

Tab. 6: Therapie des Plattenepithelkarzinoms des Ösophagus (88)

2.2.1.  Apoptose und Nekrose

Apoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine zentrale Rolle in biologischen Systemen, wie der Embryogenese, der physiologischen Morphogenese und Zellerneuerung, dem Nerven- und Immunsystem, der Homöostase eines Organismus und bei der Zellantwort auf äußere Stimuli, wie dem durch Zytostatika oder Bestrahlung induzierten Zelltod (36). Studien in Modellorganismen bestätigen, dass die grundlegenden Apoptoseprozesse im Laufe der Evolution konserviert wurden (83) und aus einer Einleitungs- und einer Ausführungsphase, mit verschiedenen Effektoren, Inhibitoren und Initiatoren bestehen. Während dieser Phasen finden morphologische und biochemische Veränderungen statt (38).

Im Vergleich zu nekrotischen Prozessen ist Apoptose genetisch programmiert und erlaubt die geregelte Elimination einzelner Zellen. Die Atmungskette, als Energielieferant der Apoptose, bleibt nach Induktion noch lange aktiv und damit auch die Membran, im Gegensatz zur Nekrose, initial erhalten. Jedoch ändert sich die Membranzusammensetzung, was ein „Iss-mich“ Phagozyten-Signal auslöst. Der Einstrom zytosolischer Ionen und H₂0 durch Permeabilitätsveränderungen führt dann in späteren Phasen zum Zusammenbrechen des mitochondrialen Membranpotentials und der Atmungskette. Apoptotische Zellen werden durch Phagozytose aus dem Gewebeverbund entfernt, ohne inflammatorische Reaktionen oder Schäden an angrenzenden Zellen zu verursachen.

Die für die Apoptose charakteristischen, morphologischen Veränderungen, sind jedoch aufgrund der kurzen Dauer schwer in histologischen Schnitten darzustellen (39). Sie bestehen u.a. in folgenden Merkmalen: beobachtet wird eine zytoplasmatische Schrumpfung und ein Membran-Blebbing. Diese sichtbaren Transformationen sind begleitet von biochemischen Veränderungen. An der Zelloberfläche wird u.a. die Externalisierung von Phosphatidylserin ausgelöst, die die Erkennung durch Phagozyten fördert. Intrazellulär zeigt sich eine Chromatin-Kondensation und Fragmentierung der DNA in von Membranen umschlossenen Vesikeln, sowie die Spaltung spezifischer zellulärer Polypeptide durch aktivierte Caspasen (84).

Neben einer Verlängerung der Zellüberlebenszeit und Bildung hyperplastischen Gewebes kann die Hemmung von Apoptose direkt an der malignen Transformation beteiligt und verantwortlich sein. Die Akkumulation genetischer Veränderungen erleichtert hierbei einen selektiven Wachstumsvorteil und den Verlust der Proliferationskontrolle.

Die Aktivierung zellulärer Apoptoseprogramme wird u.a. ausgelöst durch exogene oder endogene Schädigungen, wie Hypoxie, (UV-) Strahlung, Medikamente, wie Zytostatika, die zu DNA-Schäden, Störungen der Mitochondrienfunktion, der Gewebehomöostase oder der die Zellteilung regulierenden Mechanismen, die zelluläre Stressprogramme aktivieren, führen. Ein Teil der Zelltodsignalwege wird über die Todes-Rezeptoren der TNF-Familie vermittelt, welche u.a. die folgenden Rezeptoren und Liganden einschließen: den p55 und p75 TNF-Rezeptor (TNF-R1 und R2) des Tumor Nekrose Faktors alpha (TNF-α), der CD95/Fas-Rezeptor mit dem Fas-Liganden, zwei TRAIL-Rezeptoren (DR4 und DR5) und deren TNF-related apoptosis inducing factors (TRAIL) sowie DR6. Extrazellulär besitzen die Rezeptoren Cystein-reiche Domänen, welche deren Trimerisierung vermitteln. Intrazellulär befinden sich Todes-Domänen (Death-Domain (DD)), die an der Bindung von Adaptorproteinen und der Bildung des DISC (death inducing signaling complex) beteiligt sind. Die Liganden induzieren die Trimerisierung und die lokale Konzentration der Rezeptoren und stimulieren die Rekrutierung der Adaptorproteine FADD zur Todesdomäne (DD). Das apoptotische Programm läuft weiter über die Initiator-Caspasen 8 und 10, die sich vermutlich autokatalytisch aktivieren (84).

Dieser Zelltodsignalweg wird auch als extrinsischer Signalweg bezeichnet, da er über extrazelluläre Signale aktiviert wird. Im Gegensatz hierzu aktivieren intrazelluläre Stress-Signale den intrinsischen Signalweg, der über die Aktivierung des mitochondrialen Zelltodsignalweges exekutiert wird. Beteiligt sind u.a. die antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-xL, sowie die proapoptotischen Proteine Bax, Bak und Bok, welche direkt die Mitochondrien aktivieren. Die Konformationsänderung im N-Terminus von Bax löst dessen Translokation bzw. Insertion vom Zytoplasma in die äußere Mitochondrienmembran aus. Dieser Vorgang öffnet Ionenkanäle und setzt ATP und Cytochrom c frei. Freigesetztes ATP und Cytochrom c binden an das zytosolische Apaf-1 Protein, führen zur Konformationsänderung von Apaf-1 und damit zur Rekrutierung von Pro-Caspase 9 (84). Dieser Komplex wird als Apoptosom bezeichnet und führt zur Aktivierung von Procaspase-9 zur aktiven Caspase-9.

	Abb. 2 : Apoptose-Signalwege

Das Proto-Onkogen K (Kirsten)-ras, ein Protein mit einem Molekulargewicht von 21 kDa, zählt zu einer Familie von GTPasen mit weiteren Vertretern wie H (Harvey)-ras und N (Neuroblastom)- ras (40), welche Sequenzhomologie auf Aminosäuren auf ca. 85% haben (41). Ras wird als inaktives Verläufermolekül synthetisiert, das posttranslational modifiziert werden muss, um aktiv zu wirken. Der wichtigste Mechanismus ist hierbei die Prenylierung durch das Enzym Farnesyltransferase. Mutierte und hierdurch konstitutiv aktive Ras-Proteine liegen in der farnesylisierten Form vor. Dieses aktivierte Ras rekrutiert Adapterproteine und aktiviert nachgeschaltete Kinasesignalwege (81). Diese induzieren Kaskaden Mitogen-aktivierter Proteinkinasen (MAP-Kinasen), stimulieren Transkripitionsfaktoren und steuern zelluläre Antworten auf exogene Reize, wie Wachstumssignale oder UV-Strahlung. Die dabei stattfindende GTP-Bindung ist in gesunden Zellen durch ein Wechselspiel von Rezeptor-Tyrosinkinasen mit intrazellulären Proteinen kontrolliert (43). Onkogene und konstitutions aktive Formen von K-ras haben dauerhaft GTP gebunden. Ursache dafür sind u.a. Mutationen in den Bindungsstellen der Proteine, wodurch die Hydrolyse von GTP zur GDP verhindert wird (46). Dabei erfordert die Aktivierung von K-ras, im Gegensatz zur Inaktivierung der zwei Allele von Tumorsuppressorgenen, nur ein, nicht zwei, genetische Ereignisse (5).

Ras-Gene zählen zu den am häufigsten deregulierten zellulären Onkogene in menschlichen Tumoren (48) und zeigen eine frühe Aktivierung in verschiedenen Rattenmodellen für maligne Transformation.

Mutationen sind v.a. nachweisbar in humanen Tumoren des gastro-intestinalen und respiratorischen Traktes, sowie in ösophagealen Rattenmodellen (49). Frühere Studien zur Frequez von K-ras Mutationen in humanen ösophagealen Tumoren sprechen von ca. 5% (48).

Die Expressionsprodukte zweier ras-regulierter Gene, Osteopontin und Cathepsin L, welche mit Tumorinvasion und Metastasierung korrelieren, konnten in hoher Frequenz in Ösophaguskarzinomen nachgewiesen werden, scheinen jedoch beim größten Teil der Karzinome durch ras-unabhängige Mechanismen vermittelt zu sein (2).

Der Zellzyklus besteht aus den aufeinander folgenden Phasen der Interphase und der Mitose in proliferierenden Geweben. Die Interphase umfasst die G1 (gap1-), die S- (Synthese-), die G2- (gap2-) Phase. Nicht proliferierende Zellen befinden sich zumeist in der G0-Phase. Die sich anschließende Mitose durchläuft die Pro-, Prometa-, Meta-, Ana- und die Telophase. Die Dauer des Zellzyklus ist variabel, z.B. in Lymphozyten ca. 24 Stunden.

Ist ein durch DNA-Schädigung entstandene Schaden innerhalb des Zellzykluses irreparabel, wird das Tumorsuppressorgen aktiviert. P53 induziert dann Apoptose, um genetisch irreversibel geschädigte Zellen zu eliminieren. Dies erfolgt unter anderem durch transkriptionelle Aktivierung der Expression des proapoptotischen Bax Proteins und Hemmung der Expression des antiapoptotischen Bcl-2 Proteins. Bax und Bcl-2 sind homologe Proteine, welche intrazelluläre Heterodimere bilden, wobei die Wechselwirkung von Bcl-2 mit Bax für die Hemmung des Zelltod durch Bcl-2 wichtig zu sein scheint. Ferner reguliert P53 die Sensitivität gegenüber Apoptose, dass deren Triggerung erleichtert wird, z.B. durch Bestrahlung oder zytotoxische Wirkstoffe.

Das Tumorsuppressorgen p53 liegt auf dem kurzen Arm von Chromosom 17, umfasst in elf Exons von 16-20 kb zelluläre DNA und kodiert ein Phosphoprotein von 393 Aminosäuren. P53 Wildtyp ist ein Schlüsselgen der Zellzyklusregulation, des Zellwachstum und der Tumorsuppression. Wichtige Elemente sind dabei die Erhaltung der genetischen Integrität durch Regulation des G1 - S-Phaseüberganges, des Zellzyklusarrestes und der DNA-Reparatur vor der Induktion von Apoptose.

Die Aktivität von p53 selbst und die Höhe der Expression des p53 Protein werden durch transkriptionelle und posttranskriptionelle sowie durch posttranslationale Mechanismen reguliert. Seine Funktion, als transkriptioneller Regulator zelluläre Gene zu aktivieren bzw. zu reprimieren erfordert DNA-Bindungsregionen, um durch Sequenz-spezifische Wechselwirkungen an Zielgene zu binden. Promotoren solcher Zielgene enthalten Sequenzen mit Homologie zur Konsensus-Bindungsstelle von p53 (51).

	Abb. 3 : Aktivierung und Funktion von p53

Einige Elemente des Zellzyklus werden durch Cyclin-abhängige-Protein-Kinasen (Cdks) reguliert, deren Aktivität durch Cycline induziert und durch Cyclin-Kinase-Inhibitoren (CKIs) gehemmt wird. Zwei Familien an CKIs sind identifiziert. Die Mitglieder der ersten (INK4) sind p16INK4a, p15INK4b, p14INK4d, p18 und p19, welche Spezifität für Cdk4 und Cdk6 besitzen. Die zweite der Familien (CIP/KIP) enthält p21/WAF1/CIP1, p27KIP1 und p57KIP2 mit Spezifität für Cyclin/Cdk-Komplexen (52).

Nach DNA-Schädigung wird p21 durch p53 hochreguliert, welches in Folge durch die Hemmung von Cyclin D1–Cdk4 und Cyclin E–Cdk2 Komplexen zur Hemmung der Cdk-abhängigen Phosphorylierung von Rb führt. Dies wiederum hemmt die Transkription von Genen, die den Übergang von der G1- zur S-Phase ermöglichen. Die Folge ist Zellzyklusarrest in der G1-Phase und damit Suppression von Wachstum, u.a. von Tumorwachstum (52). Dieser Arrest erlaubt die Reparatur geschädigter DNA vor der sich anschließenden DNA-Replikation und verhindert eine unkontrollierte Proliferation. Gelingt der Zelle die Reparatur, dann wird der G1-Block aufgehoben und die Proliferation fortgesetzt. Dieser Vorgang der Zellzyklusarrest-Funktion von p53 über den nachgeschalteten Effektor p21 scheint nur durch den Wildtyp von p53 induziert zu werden. Mutiertes p53 jedoch verliert im Allgemeinen seine Fähigkeit, die Transkription der Zielgene, wie p21, zu induzieren. So zeigt sich z.B. in Tumoren mit p53-Überexpression, welche durch p53 Mutationen mit entsprechender Protein-Akkumulation ausgelöst sein kann, häufig eine niedrige bzw. keine p21 Expression (23). Neben der Induktion von p21 über p53 existiert ein p53–unabhängiger Weg, welcher z.B. über Wachstumsfaktorentzug ausgelöst werden kann (26).

2.3.1.  Allgemeine Kategorien genetischer Veränderungen in Tumoren

In tumorösen Zellen werden häufig genetische Veränderungen identifiziert, welche das Wachstum kontrollierende Gene beeinflussen. Drei Kategorien stehen dabei im Vordergrund.

Genom-Mutationen sind Änderungen in der Chromosomenanzahl, Aneuploidie genannt, durch Verlust oder Vervielfachung ganzer Chromosomen oder Anteile von Chromosomen.

Chromosomen-Mutationen sind Veränderungen der Form bzw. Struktur von Chromosomen, wie z.B. die Translokation. Dabei handelt es sich um Fusionen von verschiedenen Chromosomen oder von Segmenten einzelner Chromosomen. Beim zusammengesetzten, im Gegensatz zum einfachen Typ, können dabei während der Rekombination Deletionen oder Insertionen von Anteilen chromosomaler Arme auftreten, was zu Verlusten oder Zugewinnen an chromosomalem Material, und hierdurch bedingt zur Produktion neuer Gene, sogenannter Fusionsgene, führen kann.

Nukleotidsequenz-Austausch ist charakterisiert durch intragenetische Gen- bzw. Punkt-Mutationen und umfasst Basen-Substitutionen, Deletionen oder Insertionen einzelner oder mehrerer Nukleotide. Hierzu zählen ebenfalls Polymorphismen, z.B. SNPs (single nucleotide polymorphisms). In Abhängigkeit von der Art und Lage der dadurch ausgetauschten Aminosäure im Protein, führt nicht jeder Nukleotid-Austausch zu einer Veränderung des Gen-Produktes. Wird die genetische Information jedoch verändert, entstehen u.a. Missense- oder Nonsense-Mutationen, Stop-Kodons oder Leseraster-Mutationen, bei welchen infolge Insertion oder Deletion der Triplet-Code eine andere Bedeutung bekommt und ein sogenannter Frame-Shift, eine Verschiebung des Leserasters, auftritt. Geringe Veränderungen verursachen z.B. Austausche gleich geladenen Seitenketten bzw. Aminosäuren; ein Austausch z.B. im aktiven Zentrum eines Enzyms kann zudem zu dessen Funktionsverlust führen. Substitution eines Pyrimidin- bzw. Purin-Nukleotids gegen ein anderes Pyrimidin- bzw. Purin-Nukleotid wird Transition, Substitution eines Pyrimidin- gegen ein Purin-Nukleotid Transversion genannt.

Spontane oder durch Chemikalien ausgelöste Mutationen treten an ca. 10 000 Stellen pro Zelle und Tag auf. Mutationsereignisse sind dabei nicht gleichmäßig über die Sequenz eines Gens verteilt. Es gibt Stellen, an welchen Mutationen selten oder nicht auftreten, während an anderen mehrere unabhängige Mutationsereignisse auftreten können. Letztere Stellen nennt man „hot-spots“.

Die ras-Proteine zählen zu den wichtigsten bekannten Onkogene. Es wird geschätzt, daß ihre Mutation an der Entstehung von bis zu 10 % aller bösartigen Erkrankungen Anteil hat (45). Onkogene Varianten von K-ras sind mutierte, konstitutiv aktive Proteine, die dauerhaft GTP gebunden haben. Ursache dafür können Mutationen in den Nukleotid-Bindungsstellen des Proteins sein, was die Hydrolyse von GTP zur GDP verhindert (46).Diese Mutationen sind hauptsächlich in den Kodons 12, 13 und 61 zu finden (54).

Daten aus dem Jahre 1991 berichten von über 400 humanen Tumoren, in welchen K-ras Punktmutationen charakterisiert wurden. K-ras scheint u.a. an der Entstehung epithelialer Tumore beteiligt zu sein, mit besonders hohen Prozentangaben für Adenokarzinome des Pankreas (75%), Adenome und Karzinome des Kolon und Rektum (40%), Karzinome der Gallengänge sowie Lungen-, Leber- und Nierenkarzinome. Differenzen in gastrointestinalen und respiratorischen Tumoren beruhen möglicherweise auf unterschiedlicher Exposition gegenüber genotoxischen Wirkstoffen (55).

In ösophagealen Karzinomen wurde über eine Gen-Amplifikation von K-ras berichtet, Mutationen konnten bislang jedoch kaum nachgewiesen werden. Die geringe Frequenz der K-ras Mutationen steht dabei häufig im Gegensatz zur hohen Frequenz der p53 Mutationen in ein und denselben Karzinomen (2).

Im Rahmen der Diagnostik gehört das Onkogen K-ras, z.B. bei Pankreas- und Dickdarmkarzinomen zu den bislang am besten geeignetsten molekularbiologischen Markern, da sie schon in frühen Stadien der Kanzerogenese auftreten und damit für eine Tumorfrüherkennung möglicherweise geeignet sind. Da die Mutationen im wesentlichen an definierten Positionen in Kodon 12 und 13 auftreten, können sie durch Hybridisierung mit wenigen Oligonukleotid-Sonden identifiziert werden und durch Vervielfältigung der mutierten DNA selbst bei einem Anteil von weniger als 1% des Probenmaterial erkannt werden (56).

Der Verlust von p53 kann durch die fehlende Hemmung der Replikation geschädigter DNA und gesteigerter Proliferation veränderter Zellen zu genomischer Instabilität führen. Normalerweise bewirkt das Vorhandensein eines intakten p53 eine gute Sensitivität von Zellen gegenüber zytotoxischen Wirkstoffen bzw. Bestrahlung. Zellen mit defektem p53 zeigen daher eine verminderte Zytostatika-induzierte Apoptose bzw. Zellzyklusarrest. Unklarheiten bestehen jedoch in der Frage, wie der Verlust von p53 zur Resistenz führt. Ursächlich hierfür könnte eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen dem proapoptotischen Bax und dem antiapoptotischen Bcl-2 sein, da p53 ein transkriptioneller Aktivator des bax-Promotors ist und die Expression von Bcl-2 reduziert.

P53 Mutationen sind häufig in humanen Tumoren zu finden, u.a. bis zu 50% in ösophagealen Plattenepithelkarzinomen (23). Dabei wird diskutiert, ob sie schon in frühen Stadien leichter basaler Hyperplasie (basal cell hyperplasia (BCH)) entstehen oder ein spätes Ereignis darstellen.

Nicht alle Mutationen haben Einfluss auf die Struktur oder Funktion des p53 Proteins. Sie können im Intron gelegen sein, sich als stille Mutationen erweisen und damit nicht den nötigen Wachstumsvorteil hervorrufen, um Tumore zu fördern (58).

Charakterisiert sind die Mutationen v.a. durch Punktmutationen (35-80%), kleine Deletionen oder Insertionen, mit Frameshift oder Aminosäure-Austäuschen. Lokalisiert sind sie häufig nahe an GC-reichen Regionen (85) und mit über 90% in den phylogenetisch konservierten Domänen der Exons 5 - 8. Hotspots sind im Exon 5 die Kodons 126-187(175), im Exon 6, Kodon 188-224(213), im Exon 7, Kodon 225-261(245/248/249) und im Exon 8 die Kodons 262-290(273/282). Dies sind DNA-Sequenzen, welche für Aminosäuren der DNA-Bindungsdomäne kodieren und deren wichtigste Rolle die Sequenz-spezifische Transkription von Zielgenen, wie des Cyclin-abhängigen Kinase-Imhibitors (CDK) p21^WAF/CIP1 oder des proapoptotischen Bcl-2 Homologs Bax, ist. Diese Mutationen betreffen häufig die für Arginin kodierenden Segmente, welche eine entscheidende Rolle in der DNA-Bindung durch Wasserstoffbindungen spielen.

Der Verlust der Heterozygotie, d.h. der Verlust eines Allels des Chromosoms 17p auf dem das p53 Gen lokalisiert ist, wird im Zusammenhang mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus beobachtet. Die Befunde deuten auf einen hohen Grad genetischer Instabilität des Chromosoms 17p hin. Besonders betroffen sind drei schmale Regionen, welche auch den Lokus für das p53 Gen enthalten (17p13.2-p13.1) (15). Trotz z.T. hohen Frequenzen in geographischen Regionen mit den weltweit höchsten Inzidenzraten und der Beobachtung einer familiären Häufung, konnte allerdings keine signifikante Korrelation zwischen Verlusten von 17p und p53 Mutationen des zweiten p53 Allels nachgewiesen werden.

Zum Vergleich von p53 Mutationen eignet sich insbesondere die IARC TP53 Mutations Datenbank (International Agency for Research on Cancer (IARC) als Teil der WHO, abrufbar unter: http://www.iarc.fr/), welche derzeit insgesamt 17689 Fälle der weltweit charakterisierten Mutationen umfasst. Die Prozentsätze für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus liegen bei 17% - 71% in den untersuchten Populationen.

Da Ösophaguskarzinome in den meisten Fällen erst in fortgeschrittenen Stadien entdeckt werden, ist die Identifikation von nicht-invasiven, serologischen Marker zur Frühentdeckung und zuverlässigeren prognostischen Bewertung von besonderer Bedeutung. Klinische Studien haben daher das Ziel, neben dem Zusammenhang von p53 Mutationen und intra-tumoraler p53 Protein-Akkumulation, eine humorale Immunantwort mit Produktion von p53 Antikörpern gegen Plattenepithelkarzinome nachzuweisen. Ziel dieser Studien ist, die Relevanz von p53 Antikörpern als Biomarker zu begründen. In gesundem Gewebe sind Antikörper gegen p53 nicht nachweisbar. In 9-26% humaner Tumore konnten jedoch p53 Antikörper als potentielle Antwort auf die Tumorentwicklung in frühen Stadien entdeckt werden. Dabei erscheinen bestimmte Mutationen immunogener zu sein als andere. Bei Fehlen immundominanter Epitope, wie z.B. bei Frameshift-Mutationen mit Produktion trunkierter p53-Proteine, werden geringere oder gar keine Immunantworten hervorgerufen (19). Ferner muss noch geklärt werden, wie zuverlässig die Bewertung der Serokonversion der p53 Antikörpern, nach Behandlung der Erkrankung, ist, um die Therapiekontrolle zu erleichtern (60). Die hohe Prävalenz zirkulierender p53 Antikörper sowie die signifikante Korrelation der humoralen Immunantwort mit p53 Antikörpern und einer intratumoralen p53 Protein-Akkumulation (61) würde die Anwendung von serologischen p53 Antikörpern als nicht-invasive Marker zur Früherkennung rechtfertigen. Besonders Patienten in Hoch-Risiko Gebieten könnten profitieren, zudem ist sie einfacher anzuwenden, als immunhistochemische Methoden oder Mutationsanalysen (19).