3.  Patienten, Material und Methoden

3.1.  Patienten-Kollektiv der Plattenepithelkarzinome des Ösophagus

Es wurden 68 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus analysiert. Das Material wurde von der Chirurgischen Abteilung des Universitäts-Klinikums Benjamin-Franklin der Charité-Universitätsmedizin, Berlin bereitgestellt. Die Patienten wurden dort in den Jahren 1982 bis 1993 nach Resektion mit kurativer Absicht behandelt und nachuntersucht. Tab. 7 zeigt die klinisch-pathologischen Parameter des Patienten-Kollektivs.

Tab. 7: Klinisch-pathologische Parameter des Patienten-Kollektivs

3.2.  Allgemeine Darstellung der, zur Mutationsanalyse verwendeten Methoden

Zur Mutationsanalyse von Tumorgeweben an Hand von operativ reseziertem oder biopsiertem Material werden Schnitte mittels eines Mikrotoms angefertigt. Diese Handhabung beinhaltet u.a. zwei Nachteile, die Kontamination der Schnittfläche, beim Einsatz an unterschiedlichen, nacheinander bearbeiteten Blöcken, sowie eine mögliche mangelhafte Gewebe-Repräsentation. Letztere ist dann nicht eindeutig, wenn verschiedene Komponenten des Gewebes, wie z.B. epitheliales und interstitielles, oder unterschiedliche Arten von Läsionen, wie Tumore und um-/anliegendes normales Gewebe, im Schnitt enthalten sind. Für qualitativ wie quantitativ gute Ergebnisse der PCR wird daher eine manuelle Bearbeitung des Materials durch das Ablösen abgeschabter Stücke anstelle der konventionellen Schnitte empfohlen. Durch Gebrauch einer chirurgischen Klinge bzw. eines Skalpels können mit visueller Kontrolle, normales Gewebe und Wachs vom Zielgewebe bzw. verschiedene Arten an Tumoren getrennt werden. Der Anteil relativ reiner Tumor-DNA ist höher, falsch-positive Reaktionen der PCR werden reduziert oder verhindert. Die Menge an extrahierter DNA ist vergleichbar.

Der Prozess der Fixierung der Proben und die Einbettung in Paraffin haben einen bedeutenden Effekt auf die molekulare Anordnung der Nukleinsäuren im Gewebe und können in unterschiedlichem Ausmaß in der Degradation der DNA resultieren. Wichtige Einflussfaktoren auf die Qualität reiner DNA sind das zeitliche Intervall der Gewebe-Hypoxie zwischen Operation und Fixierung, der Grad der Gewebe-Autolyse und Nekrose, die Größe der Proben und deren Permeabilität gegenüber dem Fixativ, die chemische Zusammensetzung des Fixativs, die Dauer der Fixierung und der Aufbewahrung in Paraffinblöcken. Als Hauptmechanismus der DNA-Degradation während der Fixierung wird v.a. das sogenannte cross-linking von Proteinen der DNA beschrieben. Der erste Schritt der Reaktion mit Formaldehyd führt zu schneller, reversibler Hydroxymethylierung der Amino- und Imino-Gruppen der Nukleinsäurebasen, der zweite zu einer langsamen Methylene-Brückenbildung zwischen den Basen. Eigene Erfahrungen zeigen aber, dass die DNA solcher Genteste in kurze Fragmente degeneriert ist und hierdurch die PCR Amplifikation genomischer Segmente erschwert ist.

Beide Schritte werden durch die Reaktions-Temperatur und die Konzentrationen der Reagentien moduliert. Bei einem Anstieg von 37°C auf 65°C beginnen Wasserstoffbindungen zwischen den Basenpaaren der Doppelstrang-DNA zu brechen, bei >90°C liegen Einzelstränge vor und die DNA ist denaturiert. Durch die genannte Hydroxymethylierung von Formaldehyd mit denaturierter DNA kann die Reaktions-Temperatur gesenkt und das Re-Annealing gehemmt werden. Jedoch auch bei 37°C oder Raumtemperatur reagiert Formaldehyd direkt oder indirekt mit DNA. Eine direkte Wirkung ist die Bildung freier, exozyklischer Aminogruppen, exponiert in der Doppelstrang-DNS, und endozyklischer Amino-und Imino-Gruppen. Indirekt wird eine Bindung der Amino-Gruppen von Histonen und deren Verbindungen zur DNA ausgelöst. Beide Effekte vermehren sich quantitativ bei Verlängerung der Fixierung.

Das cross-linking von Proteinen der DNA und die Anwesenheit von Formalin-induzierten Proteinkomplexen erklärt u.a. die Notwendigkeit einer verlängerten Digestionszeit mit Proteinase K für einige Tage, sowie die höhere Qualität der Extraktion bei kürzerer Fixationszeit. Gegenüber anderen Proteinasen bearbeitet die Proteinase K das fixierte Material schneller und führt zu einem höheren DNA-Gehalt. Sie ist relativ stabil bei einer mittleren Temperatur von 50-60°C, was kürzerer Digestionszeiten ermöglicht. Die Menge reiner DNA ist, je nach dem Grad der Degradation, aus fixiertem Gewebe in der Regel geringer als aus frischem oder gefrorenem Material. Hierdurch sind der PCR technische Grenzen gesetzt (62).

3.2.1.  Polymerase-Ketten-Reaktion (Polymerase-Chain-Reaction (PCR))

Die von Kary Mullis 1985 vorgestellte Polymerase-Ketten-Reaktion, erfuhr seitdem durch Entwicklung und Erweiterung zunehmend an Bedeutung. Die zuerst verfügbaren, hitzelabilen Enzyme, wie das Klenow-Fragment der E.coli-DNA-Ploymerase I, wurden durch hitzestabile Polymerasen ersetzt. Eine der heute genutzten Polymerasen ist die DNA-Polymerase des Organismus Thermus aquaticus, Taq-Polymerase, welche initial aus heißen Quellen des Yellowstone Nationalparks isoliert wurde. Die Amplifikation unbegrenzter Gensegmente und die zunehmend einfachere Bedienung von Thermocyclern ermöglichte in der Folge die klinische Anwendung einer solchen Mutationsanalyse.

Die PCR ermöglicht hierbei eine gezielte Vervielfältigung kurzer DNA-Abschnitte. Die notwendige Starthilfe bieten Oligonukleotidprimer, kurze, einzelsträngige DNA-Moleküle, die den Enden der definierten Ziel-Sequenz der DNA-Matrize komplementär sind. Die DNA-Polymerase verlängert dann, in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten (dNTPs), die Primer entlang der einzelsträngigen, denaturiert vorliegenden DNA-Matrize in 5´ - 3´Richtung, mit ca. 35-100 Nukleotiden pro Sekunde und synthetisiert so neue, der Matrize komplementäre, DNA-Moleküle. Zur erneuten Synthese wird die doppelsträngige DNA wiederholt durch Hitze aufgeschmolzen durch die thermostabile Polymerase repliziert, separiert in Einzelstränge und nach Abkühlung wieder von den Primern gebunden. Unter optimalen Reaktionsbedingungen steigt damit bei jedem neuen Zyklus die Konzentration der zu vervielfältigenden Ziel-Sequenz an. Bereits ab dem dritten Zyklus entstehen Produkte der gesuchten Länge. Kurze Ziel-Sequenzen, die durch die Primer eingeschlossen sind, vermehren sich ab dem vierten Zyklus exponentiell, lange Produkte, mit einem Ende ohne Primer, werden hingegen linear vervielfältigt. Bei 100prozentiger Ausbeute in jedem Zyklus hat sich nach 20 Zyklen die DNA 2 hoch 20-fach vermehrt. Alle Kopien der DNA-Moleküle liegen zum Abschluss der Reaktion in Form von Doppelsträngen vor; ihre Anzahl lässt sich anhand folgender Formel bestimmen : (2ⁿ – 2n) , wobei n die Anzahl der Vermehrungszyklen ist, 2n die Produkte des ersten und zweiten Zyklus, deren Länge nicht definiert ist (63).

Besondere Möglichkeiten bietet die PCR durch hohe Spezifität und Sensitivität. Mit Einsatz geringster Mengen an Ziel-DNA aus komplexen Mischungen genomischer Sequenzen einzelner Zellen oder einzelner Kopien von Genen mit einer Größe von 50-10000bp ist es möglich, in praktisch unlimitierter Menge DNA-Fragmente zu amplifizieren. Für weitere Anwendungen konnte daher an Material(Schnitte) bzw. DNA gespart werden.

Die Sensitivität der Methode stellt nicht nur die Kraft, sondern auch die Schwäche der PCR dar. Sowohl falsch-negative bzw. falsch-positive Resultate durch Kontamination und die Vollständigkeit der Zielsequenz, in Abhängigkeit von der Degradation, müssen ausgeschlossen werden. Ferner nimmt die Vermehrung der Amplifikationsprodukte in der Praxis nicht beliebig lange in exponentieller Weise zu, da im Verlaufe jedes Zyklus mehrere Faktoren eine 100%ige Ausbeute verhindern, ein Effekt, der sich in späteren Zyklen noch verstärkt. Auch ist die Ausbeute durch die Menge und Aktivität des Enzyms, der Polymerase, begrenzt, nicht zuletzt da Hitze das Enzym im Laufe der Reaktionen denaturiert. Die zunehmende Konzentration der gebildeten Stränge vermindert u.a. durch deren Hybridisierung untereinander, die Effektivität der PCR Amplifilation durch Konkurrenz bei der Anlagerung der Primer. Weiterhin bewirken lange Fixationszeiten des verwendeten Materials eine weniger effiziente PCR.

Für die Wirksamkeit von Hemmstoffen und Beschleunigern der PCR gibt es bis jetzt wenig garantierte Nachweise. Viele unbekannte Hemmstoffe befinden sich in biologischen Material. Die Proteinase K z.B., welche bei der Extraktion der DNA eingesetzt wird, baut denaturierte Proteine ab. Da die Taq-Polymerase gegen solche Proteasen empfindlich ist, muss die Proteinase K durch Denaturierung bei 95°C aus dem PCR Ansatz entfernt werden.

Erfahrungsgemäß können durch die unten beschriebene Optimierung (siehe Ergebnisse), nötige Modifikationen der PCR vorgenommen werden und Störfaktoren reduziert werden (62).

Die Methode der SSCP-Elektrophorese bei bekannter DNA-Sequenz ist zum Routinescreening geeignet und stellt ein praktisches Verfahren zum Screening möglicher Mutationen dar. Die Anwendung zeigt sich besonders nützlich beim Vergleich unbekannten Patientenmaterials mit bekanntem Standard-Wildtyp als positive Kontrolle. Vorteile liegen in der Schnelligkeit, der einfachen Handhabung und der Möglichkeit, mehrere Proben zur gleichen Zeit untersuchen zu können.

Die Methode der SSCP basiert auf der Beobachtung, dass die Mobilität des DNA-Einzelstranges in nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen sehr sensitiv gegenüber der primären Struktur bzw. Sequenz reagiert. Während doppelsträngige DNA im elektrischen Feld v.a. in Abhängigkeit ihrer Größe (in bp) wandert, bilden Einzelstränge aufgrund der Basensequenz unterschiedliche räumliche Anordnungen, die Konformation, welche für ein charakteristisches Bandenmuster verantwortlich ist. Mit hoher Wahrscheinlichkeit haben daher selbst leichte Änderungen der DNA-Sequenz große Auswirkung auf die Konformation der Einzelstränge. Diese Beobachtungen sind empirischer Natur, eine eindeutige Theorie für die Beweglichkeit, basierend auf der Konformation oder deren Änderung gibt es bisher nicht.

Da die Einzelstrang-Konformation unter nicht-denaturierenden Bedingungen nur von der Zusammensetzung der Sequenz abhängig ist, ergeben sich unterschiedliche oder abweichende Konformationen bei nur einem einzigen Basenaustausch. Die meisten Konformations-Veränderungen scheinen die physikalische Konfiguration oder die Größe ausreichend zu beeinflussen, dass, trotz gleicher Ladung der varianten Sequenz, das Verhältnis der Konfiguration–zur-Ladung bzw. der Größe-zur-Ladung in genügendem Maße unterschiedlich ist, um als Mobilitäts-Differenz in der Elektrophorese durch eine verzögernde Matrix, wie der des Polyacrylamidgels, sichtbar werden zu lassen.

Mit der SSCP Analyse kann der größte Teil an Variationen von Einzelsträngen identifiziert werden. Typischerweise liegt die Länge der eingesetzten Einzelstränge zwischen 150 und 250 Nukleotiden, wodurch 70-90% an Basensubstitutionen entdeckt werden. Längere Stränge entwickeln in geringerem Ausmaß Konformationsänderungen durch einzelne Basenaustausche, während kürzere weniger komplexe Konformationen annehmen. In beiden Fälle besteht die Gefahr, dass Veränderungen nicht sichtbar werden. Heteroduplexe Banden werden als Nebenprodukte gefunden und können in die Analyse miteinbezogen werden. Eine zusätzliche Sequenzierung der DNA kann nach diesem Suchtest in der Folge durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob abweichenden Bandenmustern Mutationen oder andere Veränderungen, wie z.B. Polymorphismen zu Grunde liegen.

Limitationen der SSCP-Methode bestehen u.a. in der Bewertung der Laufgeschwindigkeiten der Einzelstränge. Diese geben lediglich Auskunft über den Quotienten aus Ladung und Molekulargröße der DNA-Fragmente und variieren durch deren räumliche Anordnung. Unterschiedliche DNA-Fragmente mit verschiedenen Sequenzen und Längen können u.U. in einer nativen Elektrophorese gleiche Laufgeschwindigkeiten aufweisen. Aus diesem Grund läßt sich aus der Laufgeschwindigkeit keine direkten Sequenzinformation ableiten, was eine Sequenzierung wünschenswert macht. Daher sollte zuvor mittels sequenzdefinierter Mutanten, sowie des Wildtyps geklärt werden, ob sich alle Mutationen darstellen lassen und welches Bandenmuster sie haben.

Um Struktur, Organisation, Entwicklung und Differenzierung von tumorösem Gewebe darzustellen, kann die Verteilung von Antigenen in situ bestimmt werden. Mit immunhistochemischen Techniken lassen sich spezifische Interaktionen von Antikörpern mit Antigenen, die Verteilung von Antigenen in Zellen bzw. Geweben lokalisieren.

Die hier verwendete Avidin-Biotin-Methode gehört zu den Immunperoxidase-Färbemethoden. Sie basiert auf der Fähigkeit des Eiweißglykoproteins Avidin, vier Moleküle des Vitamins Biotin physikalisch zu binden. Hierzu werden drei Reagenzien benötigt: 1) ein Primärantikörper, spezifisch für das zu bestimmende Antigen, 2) ein Sekundärantkörper, welcher mit Biotin konjugiert ist und den ersten bindet, 3) ein Peroxidase-konjugierter Avidin-Biotin-Komplex. Das Enzym Peroxidase wird mit Chromogenen sichtbar gemacht; aufgrund der hohen Affinität von Avidin zu Biotin erhält man eine hochspezifische Verstärkung der Färbung und gute Ergebnissen aus fixiertem und in Paraffin eingebettetem Material.

Da Antigen-Antikörper-Reaktionen eine hohe Spezifität aufweisen, sind immunhistochemische Techniken präziser als gewöhnliche histochemische. Die Reaktion führt zu Immunkomplexen, die als Präzipitate dargestellt werden können. Antikörper, die bei immunhistochemischen Färbungen eingesetzt werden, sind vorwiegend vom IgG Typ, mit schweren Ketten vom Typ γ, und zwei leichten Ketten vom Typ Kappa κ oder Lambda λ.; das von Leicht- und Schwerketten gebildete Fab-Fragment trägt die Antigenerkennungsregion und ist für die spezifische Antigenbindung verantwortlich.

Antikörper werden mit einem Fluoreszenz- oder Enzym-Marker konjugiert, deren intensives Signal bei der Auswertung der Schnitte unter dem Mikroskop eine Visualisierung ermöglicht. Ein Vorteil von Enzym-Markierungen der sekundären Antikörper, z.B. Meerettich-Peroxidase (Horseradish-HRP) ist, dass gewöhnliche Durchlicht-Mikroskope gebraucht werden können und chemische Gegenfärbungen, wie der Zellkerne mit Haematoxylin, die Darstellung der Morphologie unterstützen können. Vorteilhaft ist auch die kleine Größe der Peroxidase, so dass die Bindung vom Antikörper an benachbarte Stellen nicht behindert wird. Sie ist in hochgereinigter Form erhältlich, was die Kontaminationsgefahr und unspezifische Farbreaktionen verringert. Sie ist stabil und bleibt während Herstellung, Aufbewahrung und Anwendung weitgehend unverändert. Dazu gibt es eine Vielzahl von Chromogenen, die mit der Peroxidase Farbprodukte bilden, welche dann an der Stelle des zu lokalisierenden Antigens präzipitieren und es hierdurch visualisieren.

Bei allen immunhistochemischen Verfahren sind positive und negative Kontroll-Antikörper zum Vergleich mit dem Test-Antikörper erforderlich. Werden unbekannte Proben mit Primärantikörpern angefärbt, werden folgende Kontrollen angewendet: Positiv-Kontrolle ist eine bekannte, identisch vorbehandelte Probe, die das gesuchte Antigen enthält und v.a. im unteren positiven Bereich die Sensitivität der Methode zeigt. Negativ-Kontrolle ist eine bekannte, identisch vorbehandelte Probe, die das gesuchte Antigen nicht enthält. Eine unbekannte Probe, die nur mit Verdünnungspuffer bearbeitet wird bzw. mit nichtbindenden, Isotyp-gleichen Kontrollantikörpern bzw. nur mit dem Sekundärantikörper gefärbt wurde, dient als Leerpräparat, um positive Ergebnisse von unspezifischen Proteinbindungen, endogenen Peroxidaseaktivitäten oder anderen unerwünschten Epiphänomenen zu unterscheiden.

In der immunhistochemischen Auswertung werden der Vergleich unspezifischer und spezifischer Reaktionen sowie Färbeintensitäten unbekannter Proben und Kontrollen interpretiert. Färbeeigenschaften werden nach der Menge des präzipitierten Chromogens, welches zur Menge des Antigens proportional ist, sowie nach zytoplasmatischer und nukleärer Markierung charakterisiert. Da nicht alle Zellen gleiche Mengen an Antigenen enthalten, ergeben sich unterschiedliche Intensitäten innerhalb einer Probe. Fehlende Unterscheide in der Intensität können daher auf unspezifische Färbungen hinweisen. Spezifische Färbungen sind auf die Zellen beschränkt, unspezifische finden sich z.B. häufig in Collagen und Bindegewebsmatrix.

Interpretationsfehler lassen sich in vier Kategorien einteilen. Unspezifische Farbstoff-Präzipitate können mit einer positiver Anfärbung des Antigens verwechselt werden, sind aber im Gegensatz zu diesen nicht auf Zellen beschränkt. Es handelt sich dabei um nicht reagierende Chromogenpartikel oder auch Pigmente der Gegenfärbung. Ferner gibt es Gewebsartefakte, welche beim Schneiden der Schnitte entstehen, und Zellartefakte, welche positive Anfärbungen von nekrotischen, zerquetschten, autolytischen Zellen und hämorrhagischem Gewebe darstellen. Zuletzt können (spezifische) Hintergrundfärbungen, z.B. bei blutigem, ungewaschenem Gewebe mit viel Serum im interstitiellen Gewebe, auftreten. Das gesuchte Antigen liegt dabei in hoher Konzentration im Serum vor und stellt als intensive Hintergrundfärbung eine spezifische, jedoch unerwünschte Färbung des Antigen im Serum dar. Diese kann das in Zellen gesuchte Antigen verdecken.

Ursächlich für mangelnden oder fehlenden Nachweis von anzufärbenden Proteinen können Nonsense-Mutationen, Spleiß-Varianten oder Stop-Kodons sowie unterschiedliche Antikörper und nicht zuletzt auch differierende Interpretationskriterien sein (3).

3.3.  Spezielle Darstellung der Methoden-Protokolle

3.3.1.  Deparaffinierung der Tumorproben

Aus 30 μm in Paraffin eingebetteten Schnitten wurde DNA entsprechend standardisierter Techniken vor Extraktion durch zweimalige Deparaffinierung gesäubert: durch Zugabe von 1ml Octan und, nach Zentrifugation in einer Tischzentrifuge und Resuspension in 0.5ml 96% Ethanol, wird das Paraffin aus der Gewebeprobe herausgelöst.

DNA wurde mit dem Invisorb Spin Tissue Mini Kit (Firma Invitek GmbH, Berlin-Buch, Deutschland) wie folgt extrahiert. Das Ausgangsmaterial wurde in 400 µl Lyse-Puffer und 40 µl Proteinase K-Lösung bei einer Inkubationstemperatur von 52°C unter kontinuierlichem Schütteln (Thermomixer 5436, Eppendorf, Hamburg) über Nacht lysiert, unlysierte Bestandteile mittels Zentrifugation (Tischzentrifuge, Centrifuge 5415C, Eppendorf, Hamburg) entfernt. Nach Zugabe von 200 µl Bindungs-Puffer (Invitek, Berlin) wurde die DNA an einer Minisäule gebunden, nach Zentrifugation und Waschen mit 500 µl Wasch-Puffer mit 100 µl, auf 52°C erwärmten, Elutions-Puffer (Invitek, Berlin) verdünnt und anschließend in 10 mM Tris HCL/0, 1 mM EDTA Puffer pH 8.0 bei –20°C zur DNA-Analyse aufbewahrt.

Die Mutationsanalyse wurde mit dem K-ras-Genotyping System (Invitek, Berlin) für Punktmutationen im Kodon 12 und 13 des Onkogens K-ras durchgeführt. Nach der ersten PCR im Thermocycler (Gene Amp, PCR System 9700, PE Applied Biosystems) wurden die gewonnenen Produkte einer Restriktionsreaktion unterzogen, um Wildtyp ras zu zerstören und in der folgenden zweiten PCR selektiv amplifiziert. Die Amplifikate wurden einem Hybridisierungs-Test im Mikrotiter-96-Lochplatten Format zugeführt, in welchem im PCR Amplifikat durch Nachweis mittels biotinylierter, für mutiertes ras Sequenz-spezifischer Oligonukleotide gefolgt von Streptovidin-Peroxidase-Komplexen und Farbreaktion mittels standardisierter Absorbtionsmessung Mutationen aufgedeckt wurden. Die im Test ermittelten Extinktionen wurden mit der Spezialsoftware DiGeM für Codon 12 bzw. 13- Mutationen analysiert.

Die Probenamplifikation mittels der 1. PCR erfolgte in einem standardisierten Ansatz mit den Komponenten Buffermix I, Primermix I, Solution, Taq Polymerase (10 units/µl) und ddH₂0. Der Thermocycler wurde wie folgt programmiert: Initialdenaturierung bei 94 °C für 5 min., 25 Zyklen bei 94 °C für 30 sec., 54 °C für 30 sec., 72 °C für 20 sec. und Extension bei 72 °C für 1 min. Der Ansatz für die Restriktionsreaktion enthielt die Komponenten Restriction Buffer, Restriction Enzyme und ddH₂0. Die selektive Amplifikation mittels der 2. PCR erfolgte mit den Komponenten Buffermix II, Primermix II, Solution, Taq Polymerase (10 units/µl) und ddH₂0. Der Thermocycler wurde wie folgt programmiert: Initialdenaturierung bei 94 °C für 5 min., 25 Zyklen bei 94 °C für 30 sec., 54 °C für 30 sec., 72 °C für 20 sec. und Extension bei 72 °C für 1 min. Es erfolgte eine Kontrolle der Amplifikation auf Agarosegel.

Für den Hybridisierungs-Test wurden die Amplifikate aus der 2. PCR durch Zugabe von Dilution Solution verdünnt. Eine Mikrotitertestplatte wurde mit externen Standardproben sowie der Proben- und Kontroll-Amplifikate beladen. Durch Zugabe von Denaturations Puffer wurde denaturiert und anschließend mit Verdünnungslösung gewaschen. Für die Hybridisierungsreaktion wurden die auf 42°C vorgewärmten Hybridisierungsonden zugegeben. Dann wurde mit Waschpuffer gewaschen, mit Equilibrations Puffer äqulibriert und für die Nachweisreaktion die Verdünnungslösung zugegeben. Nach erneutem Waschen wurde die Farbreaktion durch Zugabe von Substrat eingeleitet und dann abgestoppt. Die Absorbtionsmessung wurde in einem Mikrotiterplatten-Photometer (SLT-Systems, Salzburg) bei einer Wellenlänge von 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 620 nm durchgeführt.

Die Interpretation der Messdaten erfolgte in zwei Schritten. Erstens wurden die Ergebnisse der externen und internen Kontrollproben begutachtet und zweitens die Resultate der Untersuchungsproben geprüft. Als externe Kontrolle diente eine Standardkurve mit mutiertem Ras-Amplifikat, deren Ergebnisse den Erfolg des DNA-Hybridisierungs-Assays anzeigen. Anhand der internen Kontrollprobe wurde geprüft, ob die Schritte der Probenamplifikation und der Restriktionsreaktion fehlerfrei verlaufen waren. Sie enthielt DNA aus einem Zellgemisch des homozygoten Wildtyps mit der heterozygoten Mutante im Verhältnis 2000/1. Die Negativkontrollen gaben Auskunft über Probenverschleppung während der Nukleinsäurepräparation oder der Amplifikationsreaktionen. Mögliche Fehlerquellen wurden beachtet, wie eine ungültige Eichkurve bei falschen zur Messung verwendeten Wellenlängen, eine ungültige Standardkurve bei falsch aufgetragenen Standardverdünnungen, auffallend viele Mutationen durch Probenverschleppung während der DNA-Präparation oder der PCR, auffallend wenige Mutationen bei mangelnder Mutationsanreicherung.

Exon 5 bis 8 des p53 Gens wurden mittels der Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert.

Die Exon 5 – 8 betragen (in bp) : Exon 5 = 184, Exon 6 = 113, Exon 7 = 109, Exon 8 = 137.

Das Exon 5 von p53 wurde aufgrund seiner Gesamtlänge von 184 bp in zwei Anteile, 5a und 5b, geteilt und getrennt amplifiziert.

Die Amplifikationsprodukte der Exons 5 – 8 umfassen (in bp) : Exon 5a = 139, Exon 5b = 191, Exon 6 = 163, Exon 7 = 190, Exon 8 = 199.

Die Sequenzen der Oligonukleotidprimer für die PCR-Amplifikation sind wie folgt unten aufgelistet (sense und antisense):

Exon 5a : CCA GTT GCT TTA TCT GTT CA und TGT GGA ATC AAC CCA CAG ;

Exon 5b : CAA CTG GCC AAG ACC TGC und AAC CAG CCC TGT CGT CTC T ;

Exon 6 : CTC TGA TTC CTC ACT GAT TGC und GAG ACC CCA GTT GCA AAC CA ;

Exon 7 : TTG CCA CAG GTC TCC CCA A und AGG GTG GCA AGT GGC TCC ;

Exon 8 : CCT TAC TGC CTC TTG CTT C und CGC TTC TTG TCC TGC TTG C;

Der Reaktionsansatz enthält:

2-4 µl DNA;

0,5 µl je sense und antisense Primer (50 pmol/µl);

12,5 mmol je dNTP, verdünnt mit Aqua dest. in einem Gesamtvolumen von 100 µl : eingesetzt wurden 0,4 µl für Exon 5a, 5b, 6 und 7; 0,8 µl für Exon 8;

1 µl MgCl₂ (50 mM) für Exon 6 und 7, 2µl MgCl₂ für Exon 5a, 5b und 8;

5 µl Reaktion-Puffer ((NH₄ ) 2SO₄) (16 mM);

1,5 U der Taq-Polymerase, entspricht 0,5 µl (InViTAQ, InViTek);

Die Komponenten wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl mit Aqua dest. verdünnt;

Für die PCR Reaktion wurde ein Thermocycler (Gene Amp, PCR System 9700, PE Applied Biosystems) anhand des folgenden Protokolls programmiert:

Erhitzen auf 94 °C für 4 min, gefolgt von 35 Zyklen bei 94 °C für 1 min, Annealing-Temperatur (siehe unten) der jeweiligen Primer für 30 sec, 72 °C für 1 min; 72 °C für 7 min; Abkühlung auf 12 °C;

Die Annealing-Temperaturen für Exon 5 – 8 betragen: Exon 5a = 52 °C, Exon 5b = 65 °C, Exon 6 = 58 °C, Exon 7 = 58 °C, Exon 8 = 58 °C;

Nach der PCR wurde ein Nachweis der amplifizierten DNA unter Prüfung negativer und positiver Kontrollen mittels Agarosegelen durchgeführt.

Je 10 µl der DNA-Produkte wurde unter Zugabe von 2 µl Sigma-Ladungspuffer (6×) in 12%igen TAE-Agarosegelen (Agarose (SeaKem) 1×TAE Tri-Acetat-EDTA)-Puffer : 50×TAE verdünnt mit A. bidest : 242 g Tris-Base (Aminomethan), 57.1 ml Eisessig, 100 ml 0.5M EDTA (pH 8.0), 1000 ml A. bidest) aufgetragen und bei 120V elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Visualisierung der DNA-Fragmente wurde 1 µl Ethidiumbromid (Roth), welches nach Interkalierung die DNA der PCR Produkte unter UV-Beleuchtung sichtbar werden lässt.

SSCP-Analysen wurden bei dem Patienten-Kollektiv der Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für das p53 Gen durchgeführt.

5-12 µl der PCR-Produkte wurde in 6 µl DNA Ladungspuffer verdünnt (82% Formamid, 10 mmol/l NaOH, 50 mmol/ EDTA, Bromphenol Blau, Xylen Xyanol Farbtest).

Die Proben wurden bei 95 °C für 5 min denaturiert, dann im Eisbad für 3 min abgekühlt, um eine erneute Zusammenlagerung der Einzelstränge zu verhindern. Im Anschluss wurden die Proben auf ein 10%iges nicht-danaturierendes Polyacryamid-Gel (11 ml A. bidest, 4 ml 5×TBE (1×TBE (Tris-Borat-EDTA)-Puffer : 5×TBE verdünnt 1: 5 mit 1000 ml A. bidest : 54 g Tris-Base, 27.5 g Borsäure, 20 ml 0.5M EDTA (pH 8.0), 1000 ml A. bidest), 5 ml 40%-iges Acrylamid-Bisacrylamid (29:1)-Stammlösung, 125µl APS 10%-ig (Ammoniumpersulfat), 25 µl TEMED) aufgetragen und anschließend bei 300 V für 30 min, 900 V für 10-100 min und 50 mA bei 22 °C in einer Multiphor-Elektrophorese-Kammer (Pharmacia, Freiburg) in SSCP-Ladungspuffer (9 ml Formamid, 20 µl 5 NaOH (pH 8.0), 200 µl 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1 ml Farbstofflösung (0.5% Bromphenolblau, 0.5% Xylen Xyanol Farbtest) elektrophoriert.

DNA der Zelllinie LoVo diente als Wildtyp Kontrolle für p53 Mutationen. Je eine Wildtyp Probe wurde wie die untersuchten Proben denaturiert, eine zweite Wildtyp Probe diente der Kontrolle doppelsträngiger DNA.

Die Exons 5 - 8 des p53 Gens wurden bei einer Lauftemperatur von 22 °C aufgetrennt.

Zur Visualisierung der DNA-Banden wurde eine Silberfärbung der Gele mit dem DNA Silberfärbe-Kit (Parmacia Biotech) durchgeführt.

Alle Schritte der Färbung wurden ohne Unterbrechung durchgeführt und ein Austrocknen der Schnitte vermieden. Nach Entparaffinierung mit Xylol für mind. 20 min und Alkoholbad in absteigender Alkoholreihe wurden die Schnitte in Aqua bidest. und 1× TBS (Tris buffered saline: 10 Χ TBS 1:10 verdünnt mit A. bidest : 9 g Tris-Base (Aminomethan), 68,5 g Tris-HCL, 87,8 g NaCl, 1000 ml A. bidest, pH 7,4-7,6) rehydriert. Dann wurden sie in 1× Citratpuffer (pH 6), 9 ml einer Stammlösung A, 0.1 M Zitronensäure (21.01 g C₆H₈O₇ * H₂O in 1000 ml A. bidest), 41 ml einer Stammlösung B, 0.1 M Natriumcitrat (29.41 g C₆H₅Na₃ * 2 H₂O in 1000 ml A. bidest) und 450 ml A. bidest) gekocht und in Aqua bidest. und 1× TBS vor und zwischen den anschließenden Inkubations-Intervallen gewaschen.

Die Inkubation wurde wie folgt durchgeführt: 1) die Schnitte wurden mit dem, in TBS verdünntem, primären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert; zur Immunlokalisation des p53 Protein wurde der monoklonale primäre Antikörper Anti-human p53 (Klon DO-7, kappa, (Verdünnung 1:75) Dako A/S, Glostrup, Denmark) verwendet; anschließend erfolgte ein Waschschritt von 3×2 min mit TBS; 2) Inkubation mit biotinyliertem sekundärem Ziege-anti-Maus-Antikörper (Dianova) verdünnt im Verhältnis 1:250 in TBS, für 30 min. bei Raumtemperatur; anschließender Waschschritt von 3×2 min mit TBS; 3) Streptavidin-Peroxidase (Dianova, Hamburg) verdünnt im Verhältnis 1:500 in TBS, für 30 min. bei Raumtemperatur; anschließender Waschschritt von 3×2min mit TBS. Darauf folgte eine Färbung mit DAB (Pierce), für 5-10 min, und Hämatoxylin nach Meyer (1 g Hämatoxylin (Merck, Darmstadt), 0.2 g Kaliumjodat (Merck), 50 g Kalialaun (Aluminiumkaliumsulfat-Dodecahydrat, Merck), 1000 ml A. bidest, 50 g Chloralhydrat (Merck), 1 g krist. Zitronensäure (Merck) für 15 sec sowie eine aufsteigende Alkoholreihe mit Paraclear (Quartett, USA) und das Eindecken in ClariOn (Natutec, Frankfurt/Main).

Die Interpretation der immunhistochemisch gefärbten Schnitte zum Nachweis der p53 Proteinexpression wurde blind von zwei Untersuchern ohne Kenntnis der klinisch-pathologischen Daten durchgeführt. In vier hoch aufgelösten Feldern (× 400) wurde der Prozentsatz positiv gefärbter Tumorzellen (0 % bis 100 %) und die Färbeintensität (0 bis 3-fach positiv) unter dem Mikroskop evaluiert. Für die weiter Analyse wurde der Prozentsatz positiver Tumorzellen und der sogenannte p53 Färbe-Index benutzt, welcher als das Produkt an positive gefärbten Zellen und der Färbeintensität berechnet wurde. Eine Positiv-Kontrolle (Kolonkarzinom-Tumorprobe) zeigte eine angemessene Immunreaktivität für p53. Die Negativ-Kontrolle (Kolonkarzinom-Tumorprobe) zeigte hingegen keine Immunofärbung.

Für die statistische Auswertung der immunhistochemischen Färbung von p53 Protein wurde ein Grenzwert bei 10% positiver Zellen in Analogie zu früheren Untersuchungen an anderen Tumorkollektiven definiert (90). D.h. Karzinome mit >10% gefärbten Zellen wurden mit „hoher Expression“ bzw. „positiv“ bezeichnet und Karzinome mit ≤10% gefärbten Zellen mit „niedriger Expression“ bzw. „negativ“ bezeichnet.