4.  Ergebnisse der Analyse des Patienten-Kollektivs mit Plattenepithelkarzinom des Ösophagus

4.1.  Patientenkollektiv und Follow-up

Es wurden 68 Patienten analysiert, die mit kurativ intendierter Resektion von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus behandelt wurden. Daten zu Alter, Geschlecht, Stadium und Grading sind in Tab.8 aufgeführt.

Das Kollektiv umfasst 52 (76,5%) Männer und 16 (23,5%) Frauen, im Alter von 37 - 84 Jahren (Mittelwert 56,82 ± 9,01) zum Zeitpunkt der Diagnosestellung. Nach der UICC-Klassifikation waren zwei (2,9%) Karzinome in Stadium I, 15 (22,1%) in Stadium II, 35 (51,5%) in Stadium III und 16 (23,5%) in Szadium IV. Nach der AJCC-Klassifikation waren drei (4,4%) Karzinome in Stadium I, 23 (33,8%) in Stadium II, 27 (39,7%) in Stadium III und 15 (22,1%) in Stadium IV. Nach dem TNM-Stadium wurden sechs (8,8%) Karzinome dem T-Stadium T1, 15 (22,1%) T2, 37 (54,4%) T3 und 10 (14,7%) T4 zugeordnet. Der Lymphknotenstatus war bei 21 (30,9%) Karzinomen N0, bei 36 (52,9%) N1 und bei 10 (14,7%) N2. In einem (1,5%) Fall fehlte das N-Stadium. Fernmetastasen wurden bei 53 (77,9%) Karzinomen nicht nachgewiesen, die somit im M0 Stadium klassifiziert werden. Bei 15 (22,1%) wurde das Stadium M1 bewertet. Das Grading war bei zwei (2,9%) Karzinomen G1, bei 28 (41,2%) G2 und bei 35 (51,5%) G3. In drei (4,4%) Fällen fehlten Angaben zum Grading. Am Ende der follow-up Periode von maximal 201 Monaten (16,75 Jahren) waren noch drei (3/68: 4,4%) der Patienten am Leben.Die mediane Gesamt-Überlebenszeit war 14 Monate für das gesamte Kollektiv (Spannweite 1 – 201 Monate, Mittelwert 23,76 ± 32,39). Die 1-, 2- bzw. 5- Jahres Überlebensraten waren 72,1%, 19,1%, bzw. 8,8%. Todesfälle mit unbekannter bzw. nicht Tumor-assoziierter Todesursache wurden zensiert (26 Patienten). Daten zur Technik und Art des operativen Verfahrens standen nicht zur Verfügung. Die Schnitte und histopathologischen Berichte der Patienten-Proben wurden geprüft, um das klinisch-pathologische Grading und Staging zu bestätigen.

Tab. 8 : Klinisch-pathologische Parameter des Patienten-Kollektivs

Reine DNA konnte aus allen Tumor-Proben mittels Invisorb Spin Tissue Mini Kit (Invitek, Germany) in ausreichender Menge für die Mutationsanalysen von K-ras und p53 extrahiert werden. Die Mutationsanalyse von K-ras erfolgte mittels PCR (Polymerase-chain-reaction) und Festphasen-Hybridisierung mit Mutations-spezifischen Oligonukleotiden. Im Ergebnis zeigte sich bei allen 68 untersuchten Tumor-Proben eine zufriedenstellende Amplifikation, die durch anschließende Restriktion und Reamplifikation mutierter Allele auf mutierte K-ras Sequenzen fokussiert wurden. Die Auswertung erfolgte mit standardisierter Software der Firma Invitek, Berlin, Germany.

Im Rahmen dieser Studie wurden im Kollektiv der Plattenepithelkarzinome des Ösophagus drei Mutationen (3/68: 4,4%) der Aspartat-kodierenden Sequenzen des Kodons 12 nachgewiesen. Es wurden keine Mutationen im Kodon 13 nachgewiesen.

P53 Mutationen wurden in den Exons 5, 7 und 8 entdeckt. Es wurden keine Mutationen in Exon 6 nachgewiesen. Die Gesamtanzahl der im Tumor-Kollektiv detektierten p53 Mutationen war sieben (7/68: 10,3%). Im Einzelnen war die Verteilung in den Exons wie folgt: drei Mutationen in Exon 5 (3/68: 4.41%), drei Mutationen in Exon 7 (3/68: 4.41%), eine Mutation in Exon 8 (1/68: 1.48%). Tumore mit Mutationen in zwei oder mehr Exons wurden nicht beobachtet. Durch Auftragen der DNA-Produkte auf Agarosegele und Vergleich mit der Wildtyp (WT) Kontrolle LoVo wurde eine erfolgreiche PCR-Amplifikation nachgewiesen.

	Abb. 4 : SSCP-PCR von p53-Mutationen a) Exon 5, b) Exon 7, c) Exon 8 (Wildtyp (WT) versus Mutation)

Bei der immunhistochemischen Auswertung von p53 Protein zeigte sich sowohl zytoplasmatisches als auch nukleäres Expressionsmuster. In 37 (37/68: 54,4%) Karzinomen wurde dabei eine p53 Proteinexpression mit zytoplasmatischem und nukleärem Färbemuster nachgewiesen. 35 (35/68: 51,4%) von diesen waren ausschließlich nukleär, zwei (2/68: 3%) ausschließlich zytoplasmatisch gefärbt. Fünf Karzinome (5/68: 7,4%) zeigten eine p53 Expression in ≤10% der Zellen und wurden als negativ klassifiziert. In 26 Karzinomen (26/68: 38,2%) zeigte sich keine Expression von p53.

Der mittlere Prozentsatz der zytoplasmatisch und nukleär p53-exprimierenden Zellen war 35,1% ± 19.36% (range 1% bis 71%), der ausschließlich nukleären 33,85% ± 18,85% (range 1% bis 71%) und der ausschließlich zytoplasmatischen 60% ± 14,14% (50% und 70%).

Unter Einbeziehung der Färbeintensitäten ergab die Auswertung ein vergleichbares Ergebnis zum p53 Färbeindex (STI). 35 Karzinomen (35/68: 51,5%) hatten einen positiven STI, davon waren 33 (33/68: 48,5%) ausschließlich nukleär, zwei (2/68: 3%) ausschließlich zytoplasmatisch positiv. 33 Karzinome (33/68: 48,5%) hatten einen negativen STI.

Für die statistische Auswertung wurden die Daten der 68 Patienten des Kollektivs von insgesamt 99 einbezogen. 31 Patienten waren zuvor aufgrund von drop outs (26 Patienten mit unbekannten bzw. nicht Tumor-assoziierten Todesursachen) oder technischen Fehlern (fünf Patienten) aus der Analyse ausgeschlossen worden.

Zur statistischen Auswertung wurde das Statistik-Programm SPSS benutzt.

Es wurden getrennte Tests für die Prozentsätze an nukleär bzw. zytosolisch gefärbten Zellen durchgeführt. Auf eine Darstellung der Ergebnisse getrennt in nukleär bzw. zytosolisch gefärbter Zellen wurde jedoch aufgrund der geringen Fallzahl zytosolisch gefärbter Zellen verzichtet. Aufgeführt werden daher nur die Ergebnisse der gesamten, d.h. aller nukleär und zytosolisch, gefärbter Zellen. In allen Analysen ergab der Prozentsatz von gefärbten Zellen vergleichbare Ergebnisse zum Färbeindex (STI).

Orientierend wurden Box plots gerechnet und aufgrund der nicht normalen Verteilung der Messdaten, der nicht- parametrische Mann-Whitney-U-Test gerechnet. Dabei wurden die folgenden biologischen und pathologischen Parameter in Beziehung zum p53 Färbeindex (STI = Färbeindex) nukleär bzw. nukleär und zytoplasmatisch gefärbter Zellen und zur p53 Expression nukleär gefärbter Zellen untersucht: T-Stadium (T1/T2 versus T3/T4), N-Stadium (N0 versus N1 versus N2), M-Stadium (M0 versus M1), Grading (G1 versus G2 versus G3), K-ras Mutation, Kodon 12 (Wildtyp (WT) versus Mutation), p53 Mutation (Wildtyp (WT) versus Mutation), UICC-Klassifikation (1/2 versus 3/4), AJCC-Klassifikation (1/2 versus 3/4).

Die Gesamt-Überlebenszeiten, beginnend vom Zeitpunkt der Operation, wurde mittels der Kaplan-Meier Methode geschätzt. Die Überlebenskurven wurden mit dem Log-Rang-Mantel-Cox-Test verglichen. Bekannte Todesursachen wurden entsprechend den Kaplan-Meier-Kriterien als unzensiertes Ereignis definiert, zum Zeitpunkt des Endes des Follow-Ups noch lebende Patienten wurden als zensiert definiert.

Die folgenden biologischen und pathologischen Variablen wurden als kategoriale Variablen für die Kaplan-Meier-Analyse benutzt: T-Stadium (T1/T2 versus T3/T4), N-Stadium (N0 versus N1 versus N2), M-Stadium (M0 versus M1), Grading (G1 versus G2 versus G3), K-ras Mutation, Kodon 12 (Wildtyp versus Mutation), p53 Mutation (Wildtyp versus Mutation), p53 Proteinexpression (≤ versus > 10% nukleär gefärbter Zellen), p53 Färbeindex (≤ versus > 10 nukleär gefärbter Zellen), UICC-Klassifikation (1/2 versus 3/4), AJCC-Klassifikation (1/2 versus 3/4).

Mit der Cox-Hazard-Funktion wurden univariate Faktorenanalysen erstellt. Es wurde das 95% Konfidenzintervall, der p-Wert und das relative Risiko angegeben, früh zu versterben. Die zur Kategorisierung eingesetzten Parametern sind wie folgt: p53 Expression (>10%), p53 Färbeindex (>10), K-ras Mutation, p53 Mutation, UICC-Stadium (3/4), T-Stadium (T3/4), N-Stadium (N1/2), M-Stadium (M1), Grading (G2/3).

Die multivariate Überlebens-Regressionsanalyse wurde (Chi-Quadrat-Test und dem exakten Fischer-Test) durch schrittweise Auswahl von kategorialen Variablen errechnet, basierend auf wahrscheinlichen Assoziationen zwischen klinisch-pathologischen Parametern und zusätzlich mit den Beziehungen zwischen p53 Mutationsstatus, p53 Expression und K-ras Mutationsstatus.

4.5.1.  Box Plot Analysen und Mann-Whitney U-Test

Die Box Plot Analyse und Ergebnisse des Mann-Whitney U-Tests zeigen den Vergleich von p53 Index (STI) für nukleär und zytosolisch gefärbte Zellen und den Vergleich dieser Expressionsdaten mit dem TNM-Stadium, Grading, K-ras und p53 Mutationen sowie der UICC- und AJCC-Klassifikation.

Im Ergebnis zeigten sich keine signifikanten Zusammenhänge zwischen p53 Färbeindex (STI) bzw. p53 Expression und den aufgeführten Parametern.

	Abb. 5: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus.

	Abb. 6: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für den Vergleich von p53 Färbeindex (STI) nukleär und zytosolisch (n + z) gefärbter Zellen für a) K-ras Mutation und b) p53 Mutation.

	Abb. 7: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für den Vergleich von p53 Färbeindex (STI) nukleär und zytosolisch (n + z) gefärbter Zellen für a) UICC-Klassifikation, b) AJCC-Klassifikation.

	Abb. 8: Box Plot Analyse und Mann-Whitney-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus zeigen den Vergleich von p53 Expression nukleär und zytosolisch (n + z) gefärbter Zellen für a) T-Stadium, b) N-Stadium, c) M-Stadium und d) Grading.

	Abb. 9: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für den Vergleich von nukleärer und zytosolischer (n + z) p53 Expression für a) K-ras Mutation und b) p53 Mutation.

	Abb. 10: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für den Vergleich von nukleärer und zytosolischer (n + z) p53 Expression für a) UICC-Klassifikation, b) AJCC-Klassifikation.

Mittels Kaplan-Meier Überlebensanalyse und Log-Rang-Test wurde das Gesamtüberleben verglichen mit T-Stadium, N- Stadium, M- Stadium, Grading, K-ras Mutation (Kodon 12), p53 Mutation, p53 Expression, p53 Färbeindex, UICC-Klassifikation, AJCC-Klassifikation.

Im Ergebnis der Überlebensanalyse zeigte sich eine signifikante Beziehung zwischen der Gesamtüberlebenszeit und dem N- Stadium (p = 0,0418), der UICC-Klassifikation (p = 0,0072) sowie der AJCC-Klassifikation (p = 0,0420).

Es zeigte sich hingegen keine prognostische Bedeutung für T- Stadium, M- Stadium, Grading, K-ras Mutation, p53 Mutation, p53 Expression und p53 Färbeindex und der Gesamtüberlebenszeit.

	Abb. 11: Kaplan-Meier Überlebensanalyse von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus nach Resektion mit kurativer Absicht für a) T- Stadium, b) N- Stadium, c) M- Stadium, d) Grading.

In den Abbildungen ist zu sehen, dass sich Langzeitüberlebende vor allem unter den Patienten des T1/2-Stadium, des N0-Stadium, des M0-Stadium sowie des G3-Gradings befinden. Das Ergebnis bezüglich des Grading überrascht, ist aber mit großer Wahrscheinlichkeit auf die geringe Anzahl (n = 3) der Patienten im G3-Grading zurückzuführen.

	Abb. 12: Kaplan-Meier Überlebensanalyse von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus nach Resektion mit kurativer Absicht für a) K-ras Mutation, b) p53 Mutation.

In den Abbildungen zeigt sich eine bessere Prognose für die Patienten mit K-ras Mutation und p53 Mutation, jedoch wird keine Signifikanz erreicht. Evtl. sind diese Ergebnisse jedoch auf die geringen Anzahl der Patienten mit Mutationen zurückzuführen.

	Abb. 13: Kaplan-Meier Überlebensanalyse von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus nach Resektion mit kurativer Absicht für a) UICC-Klassifikation, b) AJCC-Klassifikation.

In den Abbildungen ergeben sich auf der Basis der beiden Klassifikationen unterschiedliche Überlebensdaten. Dies könnte auf die unterschiedliche Verteilung der pathologischen Parameter auf die klinischen Stadien, besonders des Lymphknotenstatus, zurück zu führen sein. In der UICC-Klassifikation werden Lymphknotenmetastasen erst in das Stadium III eingruppiert; Patienten im Stadium II könnten daher, trotz fortgeschrittenem Primärtumor, eine wie hier ausgewertete längere mediane Überlebenszeit aufweisen.

Mittels Regressionsanalyse nach dem Cox-Proportional-Hazard Model wurde das relative Risiko früher zu versterben und das 95% Konfidenzintervall errechnet für den nukleären und zytoplasmatischen (n + z) p53 Färbeindex (STI) (> 10), K-ras Mutation (Mutation n = 3/68: 4,4%), p53 Mutation (Mutation n = 7/68: 10,3%), UICC-Klassifikation (3/4), T-Stadium (T3/4), N- Stadium (N1/2), M- Stadium (M1) und Grading (G2/3). Die Ergebnisse sind in Tab. 9. zusammengestellt.

Tab. 9: Univariate Regressions-Analyse nach dem Cox-Proportional-Hazard Model bei Plattenepithelkarzinom des Ösophagus

Mittels des Chi-Quadrat-Tests und des exakten Fischer-Tests wurden Kreuztabellen erstellt, um eine mögliche beziehung zwischen p53 und K-raas Mutationen zu analysieren. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt. Es zeigten sich keine signifikanten Zusammenhänge zwischen Vorhandensein einer K-ras und einer p53 Mutation (Tab. 10) bzw. der p53 Expression hinsichtlich des Färbeindexes (Tab. 11) oder des Prozentsatzes positiver Zellen (Tab. 12).

Tab. 10: Kreuztabelle zu K-ras (WT versus Mutation) und p53 (WT versus Mutation)

Chi-Quadrat nach Pearson = 0,548, Exakter Test nach Fisher = 0,718.

Tab. 11: Kreuztabelle zu K-ras (WT versus Mutation) und p53 STI (<10% versus ≥10%)

Chi-Quadrat nach Pearson = 0,085, Exakter Test nach Fisher = 0,131.

Tab. 12: Kreuztabelle zu K-ras (WT versus Mutation) und p53 Expression (<10% versus ≥10%)

Chi-Quadrat nach Pearson = 0,053, Exakter Test nach Fisher = 0,090.