Statistische Analyse von K-ras und p53

Für die statistische Auswertung wurden die Daten der 68 Patienten des Kollektivs von insgesamt 99 einbezogen. 31 Patienten waren zuvor aufgrund von drop outs (26 Patienten mit unbekannten bzw. nicht Tumor-assoziierten Todesursachen) oder technischen Fehlern (fünf Patienten) aus der Analyse ausgeschlossen worden.

Zur statistischen Auswertung wurde das Statistik-Programm SPSS benutzt.

Es wurden getrennte Tests für die Prozentsätze an nukleär bzw. zytosolisch gefärbten Zellen durchgeführt. Auf eine Darstellung der Ergebnisse getrennt in nukleär bzw. zytosolisch gefärbter Zellen wurde jedoch aufgrund der geringen Fallzahl zytosolisch gefärbter Zellen verzichtet. Aufgeführt werden daher nur die Ergebnisse der gesamten, d.h. aller nukleär und zytosolisch, gefärbter Zellen. In allen Analysen ergab der Prozentsatz von gefärbten Zellen vergleichbare Ergebnisse zum Färbeindex (STI).

Orientierend wurden Box plots gerechnet und aufgrund der nicht normalen Verteilung der Messdaten, der nicht- parametrische Mann-Whitney-U-Test gerechnet. Dabei wurden die folgenden biologischen und pathologischen Parameter in Beziehung zum p53 Färbeindex (STI = Färbeindex) nukleär bzw. nukleär und zytoplasmatisch gefärbter Zellen und zur p53 Expression nukleär gefärbter Zellen untersucht: T-Stadium (T1/T2 versus T3/T4), N-Stadium (N0 versus N1 versus N2), M-Stadium (M0 versus M1), Grading (G1 versus G2 versus G3), K-ras Mutation, Kodon 12 (Wildtyp (WT) versus Mutation), p53 Mutation (Wildtyp (WT) versus Mutation), UICC-Klassifikation (1/2 versus 3/4), AJCC-Klassifikation (1/2 versus 3/4).

Die Gesamt-Überlebenszeiten, beginnend vom Zeitpunkt der Operation, wurde mittels der Kaplan-Meier Methode geschätzt. Die Überlebenskurven wurden mit dem Log-Rang-Mantel-Cox-Test verglichen. Bekannte Todesursachen wurden entsprechend den Kaplan-Meier-Kriterien als unzensiertes Ereignis definiert, zum Zeitpunkt des Endes des Follow-Ups noch lebende Patienten wurden als zensiert definiert.

Die folgenden biologischen und pathologischen Variablen wurden als kategoriale Variablen für die Kaplan-Meier-Analyse benutzt: T-Stadium (T1/T2 versus T3/T4), N-Stadium (N0 versus N1 versus N2), M-Stadium (M0 versus M1), Grading (G1 versus G2 versus G3), K-ras Mutation, Kodon 12 (Wildtyp versus Mutation), p53 Mutation (Wildtyp versus Mutation), p53 Proteinexpression (≤ versus > 10% nukleär gefärbter Zellen), p53 Färbeindex (≤ versus > 10 nukleär gefärbter Zellen), UICC-Klassifikation (1/2 versus 3/4), AJCC-Klassifikation (1/2 versus 3/4).

Mit der Cox-Hazard-Funktion wurden univariate Faktorenanalysen erstellt. Es wurde das 95% Konfidenzintervall, der p-Wert und das relative Risiko angegeben, früh zu versterben. Die zur Kategorisierung eingesetzten Parametern sind wie folgt: p53 Expression (>10%), p53 Färbeindex (>10), K-ras Mutation, p53 Mutation, UICC-Stadium (3/4), T-Stadium (T3/4), N-Stadium (N1/2), M-Stadium (M1), Grading (G2/3).

Die multivariate Überlebens-Regressionsanalyse wurde (Chi-Quadrat-Test und dem exakten Fischer-Test) durch schrittweise Auswahl von kategorialen Variablen errechnet, basierend auf wahrscheinlichen Assoziationen zwischen klinisch-pathologischen Parametern und zusätzlich mit den Beziehungen zwischen p53 Mutationsstatus, p53 Expression und K-ras Mutationsstatus.

Box Plot Analysen und Mann-Whitney U-Test

Die Box Plot Analyse und Ergebnisse des Mann-Whitney U-Tests zeigen den Vergleich von p53 Index (STI) für nukleär und zytosolisch gefärbte Zellen und den Vergleich dieser Expressionsdaten mit dem TNM-Stadium, Grading, K-ras und p53 Mutationen sowie der UICC- und AJCC-Klassifikation.

Im Ergebnis zeigten sich keine signifikanten Zusammenhänge zwischen p53 Färbeindex (STI) bzw. p53 Expression und den aufgeführten Parametern.

Abb. 5: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus.

a)

Vergleich von p53 Färbeindex (n + z) und T-Stadium. (T1/2 (n = 21), Median 19 [range 0 bis 213]; T3/4 (n = 47), Median 10 [range 0 bis 124]). Mann-Whitney U-Test p = 0,647.

b)

Vergleich von p53 Färbeindex (n + z) und N-Stadium. (N0 (n = 22), Median 23 [range 0 bis 198]; N1 (n = 36), Median 1 [range 0 bis 213]; N2 (n = 10), Median 50,5 [range 0 bis 110]). Mann-Whitney U-Test p0/1 = 0,181 bzw. p1/2 = 0,082.

c)

Vergleich von p53 Färbeindex (n + z) und M-Stadium. (M0 (n = 53), Median 16 [range 0 bis 213]; M1 (n = 15), Median 23 [range 0 bis 110]). Mann-Whitney U-Test p = 0,732.

d)

Vergleich von p53 Färbeindex (n + z) und Grading. (G1 (n = 3), Median 0 [range 0 bis 50]; G1 (n = 28), Median 16,5 [range 0 bis 124]; G3 (n = 35), Median 19 [range 0 bis 213]). Mann-Whitney U-Test p1/2 = 0,445 bzw. p1/3 = 0,628.

Abb. 6: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für den Vergleich von p53 Färbeindex (STI) nukleär und zytosolisch (n + z) gefärbter Zellen für a) K-ras Mutation und b) p53 Mutation.

a)

Vergleich von p53 Färbeindex (n + z) und K-ras Mutation, Kodon 12. (Wildtyp (WT) (n = 65), Median 22 [range 0 bis 213]; Mutation (n = 3), Median 0 [range 0 bis 1]). Mann-Whitney U-Test p = 0,132.

b)

Vergleich von p53 Färbeindex (n + z) und p53 Mutation. (Wildtyp (WT) (n = 61), Median 16 [range 0 bis 213]; Mutation (n = 7), Median 33 [range 0 bis 122]). Mann-Whitney U-Test p = 0,294.

Abb. 7: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für den Vergleich von p53 Färbeindex (STI) nukleär und zytosolisch (n + z) gefärbter Zellen für a) UICC-Klassifikation, b) AJCC-Klassifikation.

a)

Vergleich von p53 Färbeindex (n + z) und UICC-Klassifikation. (1/2 (n = 17), Median 15 [range 0 bis 213]; 3/4 (n = 51), Median 22 [range 0 bis 124]). Mann-Whitney U-Test p = 0,925.

b)

Vergleich von p53 Färbeindex (n + z) und AJCC-Klassifikation. (1/2 (n = 26), Median 15,5 [range 0 bis 213]; 3/4 (n = 42), Median 23,5 [range 0 bis 122]). Mann-Whitney U-Test p = 0,943.

Abb. 8: Box Plot Analyse und Mann-Whitney-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus zeigen den Vergleich von p53 Expression nukleär und zytosolisch (n + z) gefärbter Zellen für a) T-Stadium, b) N-Stadium, c) M-Stadium und d) Grading.

a)

Vergleich von p53 Expression (n + z) und T-Stadium. (T1/2 (n = 21), Median 18 [range 0 bis 71]; T3/4 (n = 47), Median 10 [range 0 bis 70]). Mann-Whitney U-Test p = 0,697.

b)

Vergleich von p53 Expression (n + z) und N-Stadium. (N0 (n = 22), Median 19,5 [range 0 bis 66]; N1 (n = 36), Median 1 [range 0 bis 71]; N2 (n = 10), Median 32,5 [range 0 bis 70]). Mann-Whitney U-Test p_0/1 = 0,276 bzw. p_1/2 = 0,087.

c)

Vergleich von p53 Expression (n + z) und M-Stadium. (M0 (n = 53), Median 15 [range 0 bis 71]; M1 (n = 15), Median 23 [range 0 bis 70]). Mann-Whitney U-Test p = 0,558.

d)

Vergleich von p53 Expression (n + z) und Grading. (G1 (n = 3), Median 0 [range 0 bis 50]; G1 (n = 28), Median 16,5 [range 0 bis 62]; G3 (n = 35), Median 16 [range 0 bis 71]). Mann-Whitney U-Test p_1/2 = 0,652 bzw. p_1/3= 0,608.

Abb. 9: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für den Vergleich von nukleärer und zytosolischer (n + z) p53 Expression für a) K-ras Mutation und b) p53 Mutation.

a)

Vergleich von p53 Expression (n + z) und K-ras Mutation, Kodon 12. (Wildtyp (WT) (n = 65), Median 19 [range 0 bis 71]; Mutation (n = 3), Median 0 [range 0 bis 1]). Mann-Whitney U-Test p = 0,132.

b)

Vergleich von p53 Expression (n + z) und p53 Mutation. (Wildtyp (WT) (n = 61), Median 15 [range 0 bis 71]; Mutation (n = 7), Median 33 [range 0 bis 61]). Mann-Whitney U-Test p = 0,117.

Abb. 10: Box Plot Analyse und Mann-Whitney U-Test für Plattenepithelkarzinome des Ösophagus für den Vergleich von nukleärer und zytosolischer (n + z) p53 Expression für a) UICC-Klassifikation, b) AJCC-Klassifikation.

a)

Vergleich von p53 Expression (n + z) und UICC-Klassifikation. (1/2 (n = 17), Median 15 [range 0 bis 71]; 3/4 (n = 51), Median 19 [range 0 bis 70]). Mann-Whitney U-Test p = 0,994.

b)

Vergleich von p53 Expression (n + z) und AJCC-Klassifikation. (1/2 (n = 26), Median 13 [range 0 bis 71]; 3/4 (n = 42), Median 23,5 [range 0 bis 70]). Mann-Whitney U-Test p = 0,687.

Kaplan-Meier Überlebensanalyse

Mittels Kaplan-Meier Überlebensanalyse und Log-Rang-Test wurde das Gesamtüberleben verglichen mit T-Stadium, N- Stadium, M- Stadium, Grading, K-ras Mutation (Kodon 12), p53 Mutation, p53 Expression, p53 Färbeindex, UICC-Klassifikation, AJCC-Klassifikation.

Im Ergebnis der Überlebensanalyse zeigte sich eine signifikante Beziehung zwischen der Gesamtüberlebenszeit und dem N- Stadium (p = 0,0418), der UICC-Klassifikation (p = 0,0072) sowie der AJCC-Klassifikation (p = 0,0420).

Es zeigte sich hingegen keine prognostische Bedeutung für T- Stadium, M- Stadium, Grading, K-ras Mutation, p53 Mutation, p53 Expression und p53 Färbeindex und der Gesamtüberlebenszeit.

Abb. 11: Kaplan-Meier Überlebensanalyse von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus nach Resektion mit kurativer Absicht für a) T- Stadium, b) N- Stadium, c) M- Stadium, d) Grading.

a)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für T-Stadium. (T1/2 (n = 21) versus T3/4 (n = 47)). Log-Rang-Test p = 0,0831. Mediane Überlebenszeit: T1/2 = 22 Monate, T3/4 = 12 Monate.

b)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für N-Stadium (N0 (n = 22) versus N1 (n = 36) versus N2 (n = 10)). Log-Rang-Test p = 0,0418. Mediane Überlebenszeit: N0 = 21 Monate, N1 = 13 Monate, N2 = 6 Monate.

c)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für M-Stadium (M0 (n = 53) versus M1 (n = 15)). Log-Rang-Test p = 0,0587. Mediane Überlebenszeit: M0 = 16 Monate, M1 = 9 Monate.

d)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für Grading (G1 (n = 3) versus G2 (n = 28) versus G3 (n = 35)). Log-Rang-Test p = 0,4925. Mediane Überlebenszeit: G1 = 13 Monate, G2 = 15 Monate, G3 = 12 Monate.

In den Abbildungen ist zu sehen, dass sich Langzeitüberlebende vor allem unter den Patienten des T1/2-Stadium, des N0-Stadium, des M0-Stadium sowie des G3-Gradings befinden. Das Ergebnis bezüglich des Grading überrascht, ist aber mit großer Wahrscheinlichkeit auf die geringe Anzahl (n = 3) der Patienten im G3-Grading zurückzuführen.

Abb. 12: Kaplan-Meier Überlebensanalyse von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus nach Resektion mit kurativer Absicht für a) K-ras Mutation, b) p53 Mutation.

a)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für K-ras Mutation. (WT (n = 65) versus Mutation (n = 3)). Log-Rang-Test p = 0,4245. Mediane Überlebenszeit: WT = 14 Monate, Mutation = 28 Monate.

b)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für p53 Mutation (WT (n = 61) versus Mutation (n = 7)). Log-Rang-Test p = 0,3651. Mediane Überlebenszeit: WT = 13 Monate, Mutation = 22 Monate.

c)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für p53 Färbeindex (STI) nukleär und zytosolisch (n + z) gefärbter Zellen (<10 n = 35 versus ≥10 n = 33). Log-Rang-Test p = 0,6728. Mediane Überlebenszeit: <10 = 16 Monate, ≥10 = 10 Monate.

d)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für p53 Expression nukleär und zytosolisch (n + z) gefärbter Zellen (<10% n = 31 versus ≥10% n = 37). Log-Rang-Test p = 0,6153. Mediane Überlebenszeit: <10% = 16 Monate, ≥10% = 12 Monate.

In den Abbildungen zeigt sich eine bessere Prognose für die Patienten mit K-ras Mutation und p53 Mutation, jedoch wird keine Signifikanz erreicht. Evtl. sind diese Ergebnisse jedoch auf die geringen Anzahl der Patienten mit Mutationen zurückzuführen.

Abb. 13: Kaplan-Meier Überlebensanalyse von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus nach Resektion mit kurativer Absicht für a) UICC-Klassifikation, b) AJCC-Klassifikation.

a)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für UICC-Klassifikation. (1/2 (n = 17) versus 3/4 (n = 51)). Log-Rang-Test p = 0,0072. Mediane Überlebenszeit: 1/2 = 23 Monate, 3/4 = 12 Monate.

b)

Kaplan-Meier Überlebenskurve für AJCC-Klassifikation (1/2 (n = 26) versus 3/4 (n = 42)). Log-Rang-Test p = 0,0420. Mediane Überlebenszeit: 1/2 = 21 Monate, 3/4 = 12 Monate.

In den Abbildungen ergeben sich auf der Basis der beiden Klassifikationen unterschiedliche Überlebensdaten. Dies könnte auf die unterschiedliche Verteilung der pathologischen Parameter auf die klinischen Stadien, besonders des Lymphknotenstatus, zurück zu führen sein. In der UICC-Klassifikation werden Lymphknotenmetastasen erst in das Stadium III eingruppiert; Patienten im Stadium II könnten daher, trotz fortgeschrittenem Primärtumor, eine wie hier ausgewertete längere mediane Überlebenszeit aufweisen.

Uni- und multivariate Analyse

Mittels Regressionsanalyse nach dem Cox-Proportional-Hazard Model wurde das relative Risiko früher zu versterben und das 95% Konfidenzintervall errechnet für den nukleären und zytoplasmatischen (n + z) p53 Färbeindex (STI) (> 10), K-ras Mutation (Mutation n = 3/68: 4,4%), p53 Mutation (Mutation n = 7/68: 10,3%), UICC-Klassifikation (3/4), T-Stadium (T3/4), N- Stadium (N1/2), M- Stadium (M1) und Grading (G2/3). Die Ergebnisse sind in Tab. 9. zusammengestellt.

Parameter

Relatives Risiko

95% Konfidenzintervall

P-Wert

p53 STI (n + z) (>10%)

1,108

0,679-1,809

0,681

K-ras Mutation (Mutation)

0,631

0,197-2,027

0,440

p53 Mutation (Mutation)

0,702

0,319-1,544

0,379

UICC-Klassifikation (III/IV)

1,036

1,008-1,065

0,011

T-Stadium (T3/4)

1,021

0,996-1,046

0,094

N-Stadium (N1/2)

1,051

1,003-1,100

0,035

M-Stadium (M1)

1,724

0,958-3,101

0,069

Grading (G2/3)

0,972

0,922-1,026

0,307

Tab. 9: Univariate Regressions-Analyse nach dem Cox-Proportional-Hazard Model bei Plattenepithelkarzinom des Ösophagus

Mittels des Chi-Quadrat-Tests und des exakten Fischer-Tests wurden Kreuztabellen erstellt, um eine mögliche beziehung zwischen p53 und K-raas Mutationen zu analysieren. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt. Es zeigten sich keine signifikanten Zusammenhänge zwischen Vorhandensein einer K-ras und einer p53 Mutation (Tab. 10) bzw. der p53 Expression hinsichtlich des Färbeindexes (Tab. 11) oder des Prozentsatzes positiver Zellen (Tab. 12).

Chi-Quadrat nach Pearson = 0,548, Exakter Test nach Fisher = 0,718.

p53

WT

Mutation

Gesamt

K-ras

WT

58

7

65

Mutation

3

3

Gesamt

61

7

68

Tab. 10: Kreuztabelle zu K-ras (WT versus Mutation) und p53 (WT versus Mutation)

Chi-Quadrat nach Pearson = 0,085, Exakter Test nach Fisher = 0,131.

p53 Färbeindex

<10%

≥10%

Gesamt

K-ras

WT

32

33

65

Mutation

3

3

Gesamt

35

33

68

Tab. 11: Kreuztabelle zu K-ras (WT versus Mutation) und p53 STI (<10% versus ≥10%)

Chi-Quadrat nach Pearson = 0,053, Exakter Test nach Fisher = 0,090.

p53 Expression

<10%

≥10%

Gesamt

K-ras

WT

28

37

65

Mutation

3

3

Gesamt

31

37

68

Tab. 12: Kreuztabelle zu K-ras (WT versus Mutation) und p53 Expression (<10% versus ≥10%)