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Einleitung

1.1 Immunologische Grundlagen

1.1.1 Funktionelle Einteilung des Immunsystems:
Unspezifische und spezifische, zelluläre und humorale Faktoren

Das Immunsystem hat sich im Laufe der Evolution als körpereigene Abwehr gegen Mikroorga­nismen, Fremdstoffe und maligne Zellen entwickelt. Dieser Schutz ist hochspezifisch für die verschiedenen abzuwehrenden Strukturen.

Wichtige Organe des Immunsystems sind die primären lymphatischen Organe Thymus und Knochenmark sowie die sekundären lymphatischen Organe Milz, Lymphknoten und das Mukosa-assoziierte lymphatische Gewebe. Auf zellulärer Ebene wird die Immunantwort vor allem von Leukozyten getragen, die nicht nur in den lymphatischen Organen zirkulieren, sondern fast alle Organe des menschlichen Körpers erreichen. Auf der Zelloberfläche von Leukozyten befinden sich Differenzierungsantigene, die sogenannten „cluster of differentiation“ (CD-Antigene). Mit Hilfe dieser Oberflächenmarker, die durch monoklonale Antikörper identifiziert werden können, lassen sich die verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen differenzieren.

Man unterscheidet das angeborene, unspezifische Immunsystem von der erworbenen, spezifi­schen Abwehr, wobei diese beiden funktionellen Einheiten synergistisch zusammenarbeiten.

Die angeborene Immunantwort wird als unspezifisches Immunsystem bezeichnet, da sie zu­nächst unabhängig vom abzuwehrenden Erreger agiert. Neben physikalischen und chemischen Barrieren wie z.B. dem Säureschutzmantel der Haut, besteht dieses System aus einer humoralen und einer zellulären Komponente. Die humorale Ebene wird vom Komplementsystem und ande­ren löslichen Faktoren wie z.B. Lysozym, Interferonen und Akutphaseproteinen gebildet. Die zelluläre Komponente besteht aus dem Monozyten-Makrophagensystem, Granulozyten und Natürlichen Killerzellen, die zudem ein Bindeglied zwischen unspezifischem und spezifischem Immunsystem darstellen.

Das erworbene Immunsystem zeichnet sich durch die Fähigkeit aus, Antigene bei mehrfachen Kontakten wiederzuerkennen und dadurch schneller und effektiver bekämpfen zu können. [Seite 2↓]T- und B-Lymphozyten bilden die zelluläre Grundlage dieses Systems und können mit ihren Anti­genrezeptoren hochspezifisch bestimmte Strukturen erkennen. Die Basis dieser Vielfalt bildet das sogenannte „Genrearrangement“: Die genetische Information zur Bildung der Antigenrezeptoren ist auf mehrere Genabschnitte verteilt, die jeweils in vielen verschiedenen Varianten vorliegen. Während der Zellreifung wird das Gen dann durch Verknüpfung je einer Variante der verschiedenen Genabschnitte zusam­mengefügt. Nach Antigenkontakt können B- und T-Zellen klonal expandieren und so ein immu­nologisches Gedächtnis ausbilden.

B-Lymphozyten stellen die humorale Komponente dieses spezifischen Immunsystems dar, sie bilden und sezernieren antigenspezifische Immunglobuline (Antikörper) verschiedener Isotypen. Die zelluläre spezifische Immunantwort wird von T-Lymphozyten getragen, deren gemeinsames Merkmal die Expression von Proteinen des CD3-Komplex ist. Dieser beinhaltet unter anderem den Antigenrezeptor, der die Spezifität der T-Zellen ausmacht. T-Zellen erkennen mit Hilfe die­ses T-Zellrezeptors (TCR) Fremdantigene, wenn diese von antigenpräsentierenden Zellen (APC) nach Internalisierung und Prozessierung als Peptidfragmente in Haupthistokompatibilitäts­komplex (MHC)-Molekülen präsentiert werden.

1.1.2 Die Aktivierung von T-Zellen durch Antigene

Man unterscheidet zwei Hauptgruppen von T-Zellen: CD8+-Zellen erkennen Antigenpeptide in Assoziation mit MHC-Klasse-I-Molekülen. Sie bilden in erster Linie eine Abwehr gegen virusin­fizierte und maligne entartete Zellen. Die Abwehr bakterieller Antigene wird hauptsächlich durch CD4+-Zellen (T-Helferzellen) gewährleistet, die Antigenpeptide erkennen, die in MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden.

Die Aktivierung von T-Zellen erfolgt durch Bindung des TCR an ein MHC-Molekül und das darin präsentierte Antigenpeptid. Dieser trimolekulare Komplex allein ist jedoch nicht ausrei­chend, um die T-Zelle zu aktivieren. Neben dem CD4- bzw. CD8-Molekül, das die Bindung ver­stärkt, sind weitere kostimulatorische Signale durch Adhäsions- und akzessorische Moleküle notwendig. Das wichtigste dieser kostimulatorischen Signale ist die Bindung des T-Zelloberflä­chenmoleküls CD28 an die membranständigen Rezeptoren B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86) der professionellen antigenpräsentierenden Zellen Makrophagen, B-Zellen und dendritischen Zellen.

Die Signaltransduktion der T-Zellaktivierung wird durch Enzyme, die mit der intrazellulären Domäne des TCR und anderen Molekülen assoziiert sind, initiiert. Sie führt schließlich zur Genaktivierung und Transkriptionsregulation im Zellkern. Daraus folgt unter anderem die [Seite 3↓]verstärkte Expression von Kernbindungsproteinen, Aktivierungsantigenen und Zytokinen. Die Sekretion des Wachstumsfaktors Interleukin-2 (IL-2) führt daraufhin zur klonalen Expansion antigenspezifischer T-Zellen.

1.1.3 Zwei Untergruppen von T-Helferzellen und deren klinische Relevanz

T-Helferzellen werden anhand der von ihnen sezernierten Zytokine in die funktionellen Unter­gruppen Th1 und Th2 unterteilt. Diese Unterscheidung wurde zunächst an T-Zellklonen im murinen System beschrieben (Mosmann et al., 1986) und später auf humane CD4+-Zellen übertragen (Romagnani, 1991). Th1-Zellen zeichnen sich durch Sekretion des Zytokins Interferon-γ (IFNγ) aus und führen zu ausgeprägten Entzündungsvorgängen. Th2-Zellen sezernieren überwiegend Interleukin-4 (IL4) und regen B-Zellen zur Bildung von Antikörpern an. Einfluß auf die Diffe­renzierung einer gemeinsamen Vorläuferzelle in Richtung Th1 oder Th2 haben verschiedene Faktoren wie das Zytokinmilieu, die Antigenkonzentration und die Art und Weise der Kostimu­lation (Abbas et al., 1996). Die Unterteilung menschlicher T-Helferzellen in die Subpopulationen Th1 und Th2 ist jedoch nicht als strikte Trennung in zwei Populationen zu verstehen. Th1- und Th2-Zellen stellen vielmehr Extremwerte einer Vielzahl von Populationen mit fließenden Übergängen dar (Kelso, 1995; Prussin, 1997).

Bei bestimmten Krankheitsgruppen lassen sich charakteristische Zytokinmuster nachweisen, die Hinweise auf ein Überwiegen einer der beiden Subpopulationen geben (O’Shea, 2002). Wäh­rend ein Ungleichgewicht zu Gunsten der Th2-Zellen bei atopischen Erkrankungen (Maggi et al., 1991) gefunden wurde, wird ein Überwiegen der proinflammatorischen Th1-Antwort für die Pathogenese einiger, überwiegend organspezifischer Autoimmunerkrankungen verantwortlich gemacht (van der Graaff et al., 1998; Singh et al., 1999; Morahan et al., 2001).

1.2 Multiple Sklerose:
eine T-zellvermittelte Autoimmunerkrankung?

1.2.1 Klinische Charakteristika

Die Bezeichnung Multiple Sklerose (MS) und ihr Synonym Encephalomyelitis disseminata be­schreiben die wichtigsten Charakteristika dieser Krankheit: MS ist eine inflammatorische Ent­markungserkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), die mit einer Bindegewebsvermehrung einhergeht. Die Krankheit tritt sowohl zeitlich als auch örtlich disseminiert auf, d.h. sie verläuft in den meisten Fällen schubförmig und manifestiert sich in einer multifokalen Symptomatik.


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Die Markscheiden (Myelinscheiden) der Nervenzellfortsätze (Axone) werden im ZNS von Oligodendrozyten gebildet und gewährleisten eine hohe Leitgeschwindigkeit der elektrischen Potentiale. Die Symptomatik der MS wird bei intaktem Axon vermutlich durch eine herabge­setzte Nervenleitgeschwindigkeit hervorgerufen, die Folge der Entmarkung (Demyelinisierung) ist.

Die Diagnose der MS wird anhand der Anamnese, der klinisch neurologischen Untersuchung, paraklinisch nachgewiesener Läsionen und des Liquorbefundes gestellt. Je nach der Anzahl der räumlich und zeitlich disseminiert nachgewiesenen Entmarkungsherde unterscheidet man die Bezeichnungen „sichere“ und „wahrscheinliche“ MS (Poser et al., 1983; Poser et al., 2001). Neben der am häufigsten vorkommenden schubförmigen Verlaufsform (Rezidivierend Remittierende MS (RRMS)) gibt es chronisch verlaufende MS-Formen. Geht eine RRMS in einen sich chronisch verschlechternden Zustand über, spricht man von Sekundär Progredienter MS (SPMS), während die von Beginn an chronisch verlaufende Form als Primär Progrediente MS (PPMS) bezeichnet wird.

1.2.2 Hinweise aus epidemiologischen Untersuchungen

Das Manifestationsalter der MS liegt meist zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr; Frauen sind ungefähr doppelt so häufig betroffen wie Männer.

MS gehört zu den epidemiologisch meist untersuchtesten Erkrankungen (Weinshenker, 1996). Aus diesen Studien ergeben sich Hinweise auf eine genetische Anfälligkeit für MS. Verwandte von MS-Patienten zeigen ein erhöhtes Risiko, an MS zu erkranken. Zwillingsuntersuchungen haben gezeigt, dass eineiige Zwillinge mit einer Konkordanzrate von ca. 30% eine ungefähr sie­benfach höhere Erkrankungswahrscheinlichkeit haben als zweieiige Zwillinge (Sadovnik et al., 1993). Ebenso weisen verschiedene ethnische Gruppen unterschiedliche Prävalenzen auf (Ebers et al., 1994).

Daneben gibt es Anhaltspunkte für die Beteiligung eines Umweltfaktors. So ist die starke Diffe­renz der Prävalenzen in Abhängigkeit der geographischen Lage auffällig: Um den Äquator beträgt sie 1:100 000, in Nordeuropa und -amerika 50:100 000. Migrationsstudien zeigten, dass das Risiko, an MS zu erkranken, vom Aufenthaltsort bis zum 15. Lebensjahr abhängig ist. Erwach­sene Auswanderer tragen das Erkrankungsrisiko des Ortes, an dem sie bis zur Pubertät [Seite 5↓]aufge­wachsen sind (Alter et al., 1966). Dies spricht für die Existenz eines Umweltfaktors, der schon in der Kindheit Einfluss auf das spätere Erkrankungsrisiko nimmt.

1.2.3 Indizien für eine Autoimmungenese der Multiplen Sklerose

Autoimmunerkrankungen sind Krankheiten, in denen das Immunsystem körpereigene Strukturen nicht als „Selbst“ erkennt und sie daher als „Fremd“ bekämpft.Selektionsmechanismen während der T-Zellreifung im Thymus verhindern normalerweise das Übertreten autoreaktiver T-Zellen in die Peripherie, es entsteht die sogenannte zentrale Toleranz. Auch nach der T-Zellreifung gibt es Mechanismen, die potentielle selbstreaktive Zellen „ausmustern“ – diese Vorgänge bilden die periphere Toleranz.

Es gibt im wesentlichen drei Hinweise, die für eine Autoimmungenese der MS sprechen: erstens die im Tiermodell gezeigte T-zellvermittelte Pathogenese, zweitens die Assoziation der MS mit bestimmten HLA-Typen und schließlich der Erfolg immunmodulatorischer Therapien bei MS.

1.2.3.1 Im Tiermodell lässt sich durch Übertragung autoreaktiver T-Helferzellen ein der MS ähnliches Krankheitsbild induzieren.

In Nagetieren und auch Primaten kann durch Injektion von Hirnhomogenat, gereinigten Myelin­komponenten oder deren immundominanten Peptiden Experimentelle Autoimmunenzephalo­myelitis (EAE), ein der MS ähnliches Krankheitsbild, induziert werden (Wekerle, 1993). Aktivierte T-Zellen eines solchen immunisierten Tieres wiederum können die Erkrankung auf gesunde Tiere übertragen (Ben-Nun et al., 1981; Pettinelli et al., 1981) - ein Hinweis auf die T-Zell-vermittelte Pathogenese dieser Erkrankung.

Keines der EAE-Modelle stellt jedoch alle klinischen und immunologischen Aspekte der Krank­heit MS dar. Daraus ergibt sich die Frage, inwieweit EAE als Modell der humanen Demyelini­sierungserkrankung eingesetzt werden kann. Vielmehr erscheint es angemessen zu fragen, welches der verschiedenen EAE-Modelle als Erklärung für welchen Aspekt der in sich sehr hetero­genen Krankheit MS dienen kann (Wekerle et al., 1994; Petry et al., 2000).

1.2.3.2 Multiple Sklerose ist mit bestimmten HLA-Allelen assoziiert.

Das Humane Leukozyten Antigen (HLA)-System (= Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-System) ist ein komplexes, kodominant vererbtes System von Gewebeantigenen. Es zeichnet sich durch einen ausgeprägten genetischen Polymorphismus aus, d.h. es existiert eine Vielzahl verschiedener HLA-Phänotypen.Bestimmte HLA-Konstellationen gehen mit einer erhöhten Krankheitsempfänglichkeit für gewisse Autoimmunkrankheiten einher. Vom HLA-Phänotyp ist [Seite 6↓]abhängig, welches Peptid eines Proteins von APC präsentiert wird und die dafür spezifischen T-Helferzellen aktiviert. So ist es vorstellbar, dass nur bei einem bestimmten HLA-Typ (bei der MS z.B. HLA-DR2) autoreaktive T-Zellen aktiviert werden, weil sie das präsentierte Peptid erkennen, während bei einem anderen HLA-Typ (hier: HLA-DRx) ein Peptid präsentiert wird, das nicht von eigenen T-Zellen erkannt wird (Abb. 1-1).

Abbildung.1-1: Bedeutung des HLA-Typs für die Peptidpräsentation von Autoantigenen. Individuen unterschiedlichen HLA-Typs präsentieren verschiedene Peptide des Autoantigens. Eine spezifische T-Zelle erkennt in diesem Fall nur das im Kontext von HLA-DR2 präsentierte Peptid, während das von einem anderen HLA-Typ (HLA-DRx) präsentierte Peptid nicht erkannt wird.

MS ist assoziiert mit dem DR2-Allel des HLA-Klasse-II-Antigens. Das Allel findet sich bei 55% der MS-Patienten im Vergleich zu nur 28% bei Gesunden (Sherrit et al., 1992).

1.2.3.3 In der Therapie der Multiplen Sklerose kommen immunmodulatorische Medikamente zum Einsatz.

Der Erfolg immunmodulatorischer Therapien spricht dafür, dass eine pathogene Immunantwort für das Entstehen der MS eine Rolle spielt. Es wurde gezeigt, dass hochdosierte Kortikosteroide in der Therapie des akuten MS-Schubes eine schnellere Remission erreichen (Miller et al., 2000). IFNβ-Therapie bewies dagegen ein Herabsetzten der Schubfrequenz und wird als [Seite 7↓]Langzeittherapie eingesetzt (The IFNβMultiple Sclerosis Study Group, 1993). Das Immun­suppressivum Azathioprin zeigte ebenfalls eine Wirksamkeit in Form einer niedrigeren Schubfrequenz (Yudkin et al., 1991; Palace et al., 1997).

1.2.4 Die Pathogenese der MS ist multifaktoriell –
viele zelluläre und humorale Faktoren sind beteiligt.

Die Pathogenese der MS ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Bisher ist keine spezifische Immun­antwort gegen ein oder mehrere Autoantigene eindeutig als Ursache für die Entstehung dieser Krankheit identifiziert worden. Vielmehr handelt es sich nach dem derzeitigen Stand der Forschung um Pathomechanismen, an denen eine Vielzahl zellulärer und humoraler Faktoren beteiligt sind (Hohlfeld et al., 1995; Martin et al., 1998; Stinissen et al., 1998; Martino et al., 1999). Als Autoantigene werden Myelinkomponenten, aber auch andere Strukturen wie zum Beispiel Hitzeschockproteine diskutiert (Schmidt, 1999).

1.2.4.1 Histologische Charakterisierung der MS-Läsionen im ZNS

Aufschluss über die an der Pathogenese beteiligten Faktoren geben zunächst histopathologische Untersuchungen der ZNS-Entmarkungherde aus Autopsie- und Biopsie-Material. MS-Läsionen zeichnen sich durch drei Merkmale aus: Entzündung, Demyelinisierung und gliale Narben­bildung. Die nähere Untersuchung der Läsionen spricht für eine T-Zell-dominierte Pathogenese der entzündlichen Demyelinisierung mit zusätzlicher Beteiligung von Antikörpern. Neben einer perivaskulären Infiltration von Lymphozyten und Makrophagen finden sich allgemeine Ent­zündungszeichen. So konnte eine erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen (Dore-Duffy et al., 1993), MHC-Molekülen (Traugott, 1987; Dore-Duffy et al., 1993) und proinflammatorischen Zytokinen (Hofman et al., 1989; Woodroofe et al., 1993) gezeigt werden. Anhand der in Makrophagen nachgewiesenen Myelindegradationsprodukte und der von Makrophagen expri­mierten Aktivierungsmarker lassen sich MS-Läsionen in früh-, spät- und inaktive Herde einteilen (Lucchinetti et al., 1996). Es wird allgemein angenommen, dass dieser chronisch entzündliche Prozess für die Zerstörung der Myelinscheiden verantwortlich ist, obwohl dies bisher nicht ein­wandfrei bewiesen werden konnte (Lassmann et al., 1995). Die Heterogenität der Läsionen unterschiedlicher Patienten, nicht jedoch innerhalb eines Patienten geben Hinweise auf eventuell verschiedenartige zugrunde liegende Pathomechanismen (Lucchinetti et al., 2000; Ludwin, 2000).


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1.2.4.2  Charakterisierung der Liquorbefunde von MS-Patienten

Die einfachste Möglichkeit, ZNS-nahes Material von MS-Patienten zu untersuchen, ist die Liquor­punktion, die auch entscheidende diagnostische Bedeutung hat. Im Liquor cerebrospinalis von MS-Patienten findet sich eine mäßig erhöhte Zellzahl bis ca. 50/μl, wobei es sich vor­wiegend um Lymphozyten und Monozyten handelt. Aus dem Liquor von MS-Patienten wurden autoreaktive T-Helferzellen gegen verschiedene Myelinkomponenten isoliert. Es konnten zwar keine Antikörper gegen diese Myelinkomponenten gefunden werden, jedoch antikörperbildende Zellen (Olsson et al.(1), 1990; Sun et al., 1991; Link et al., 1992). Bei den meisten Patienten lässt sich eine intrathekale IgG-Produktion nachweisen, bei 95% sind in der isoelektrischen Fokus­sierung oligoklonale Banden sichtbar (Olsson, 1994). Des weiteren wurden erhöhte TNFα-Spiegel im Liquor von MS-Patienten im Schub und Korrelation der TNFα-Spiegel mit dem Ausmaß der Blut-Hirn-Schrankenstörung gezeigt (Sharief et al., 1992).

1.2.4.3 Charakterisierung der Befunde im peripheren Blut

Aus peripherem Blut von MS-Patienten konnten autoantigenspezifische T-Helferzellen isoliert werden. Diese wurden jedoch auch bei gesunden Probanden gezeigt. Zunächst wurden T-Helfer­zellen nachgewiesen, die die Hauptkomponente des Myelins, das Myelin Basic Protein (MBP) erkennen (Allegretta et al., 1990). Später folgte die Untersuchung von reaktiven Zellen gegen andere Myelinkomponenten (Sun et al., 1991; Zhang et al., 1993; Bernard et al., 1997), sowie Nicht-Myelinantigene wie zum Beispiel Hitzeschockproteine (van Noort et al., 1995).

Nach polyklonaler Stimulation von Makrophagen und T-Zellen aus peripherem Blut konnten einige Autoren bei MS-Patienten eine erhöhte Produktion von Th1-Zytokinen feststellen und die Zytokinproduktion mit Krankheitsaktivität und Therapieerfolg korrelieren (Beck et al., 1988; Comabella et al., 1998; Becher et al., 1999). Andere Studien konnten dies jedoch nicht bestätigen (van Oosten et al., 1998; Durán et al., 2001).

Versuch der Zusammenfassung der pathogenetisch relevanten Ereignisse

Es gibt unterschiedliche Hypothesen, die versuchen, die histo- und immunopathologischen Befunde zu einem einheitlichen Bild zusammenzufügen. Abbildung 1-2 zeigt ein mögliches Modell der Pathogenese der MS: In der Peripherie werden autoreaktive T-Helferzellen aktiviert. Vorstellbare Mechanismen dafür sind die Quervernetzung von T-Zellrezeptoren und MHC-Molekülen durch Superantigene, Kreuzreaktivität mit anderen Antigenen oder ein verändertes Zytokinmilieu. Aktivierte Lymphozyten können dann die Blut-Hirn-Schranke passieren und durch Autoantigene reaktiviert werden. Es wird angenommen, dass die nachfolgende Entzün­[Seite 9↓]dungsreaktion für die Demyelinisierung zentraler Axone und die Axondegeneration verantwort­lich ist.

Abbildung 1-2: Schema der Pathogenese der Multiplen Sklerose. In der Peripherie werden autoreaktive T-Helferzellen durch verschiedene Mechanismen, wie z. B. Superantigene, Kreuzreaktivität oder Veränderungen im Zytokinmilieu, aktiviert. Sie können dann die Blut-Hirn-Schranke passieren und lösen nach Reaktivierung durch Autoantigene im ZNS eine Entzündungsreaktion aus, die schließlich zur Demyelinisierung führt.

1.3 Myelin Basic Protein (MBP) als mögliches Autoantigen -
Stand der Forschung

MBP ist mit ca. 30% des Myelintrockengewichts die Hauptkomponente der Markscheiden im menschlichen ZNS. Neben drei splicing-Varianten sind strukturell verwandte Isoformen bekannt, die auch außerhalb des ZNS, vorwiegend in Thymus und Lymphgewebe, exprimiert werden (Zelenika et al., 1993). MBP ist das am meisten untersuchte potentielle Autoantigen bei MS. [Seite 10↓]Neben der Erforschung der pathogenetischen Relevanz dieses potentiellen Autoantigens gibt es mehrere Ansätze zur therapeutischen Anwendung MBP-verwandter Peptide oder Proteine. Das ursprünglich zur Induktion der EAE entwickelte polymere MBP-Analogon Copolymer I zeigte eine unerwartete protektive Wirkung und wird heute als Rezidivprophylaxe eingesetzt (Gran et al., 2000, Neuhaus et al., 2001). Daneben wurden klinische Studien zur Wirksamkeit von soge­nannten „altered peptide ligands“ durchgeführt (Kappos et al., 2000; Bielekova et al., 2000). Diese synthetisch hergestellten Peptide unterscheiden sich durch wenige Aminosäuresubsti­tutionen von einem als immundominant beschriebenen MBP-Peptid. Es wird diskutiert, dass sie die Aktivierung MBP-spezifischer T-Helferzellen modulieren. Beide Studien wurden jedoch abge­brochen – die eine wegen auftretenden Hypersensibilitätsreaktionen, die andere, weil einige Patienten eine erhöhte Schubfrequenz aufwiesen. Bielekova et al. zeigten bei einem Teil dieser Patienten mit häufigeren Schüben eine Expansion proinflammatorischer T-Helferzellen, die spezifisch für die „altered peptide ligands“ und MBP waren. Dies ist ein Hinweis auf die pathogenetische Relevanz MBP-spezifischer T-Zellen. Daneben zeigen diese Studien, dass die Wirkmechanismen der „altered peptide ligands“ bei weitem nicht vollständig verstanden sind.

Unterscheiden sich MBP-spezifische T-Helferzellen von MS-Patienten und Gesunden?

MBP-spezifische T-Helferzellen sind Bestandteil des T-Zellrepertoires sowohl von MS-Patienten als auch von Gesunden. Es stellt sich also die Frage, inwiefern sich diese Immun­antwort bezüglich der Frequenz, des Phänotyps oder des Aktivierungsstatus unter­scheidet.

Mehrere Studien haben die relativen Häufigkeiten (Frequenzen) MBP-spezifischer T-Helfer­zellen ermittelt. Einige konnten erhöhte Häufigkeiten bei MS-Patienten nachweisen (Chou et al., 1992; Lodge et al., 1996), während sich die Frequenzen in anderen Studien nicht signifikant unterschieden (Zhang et al., 1992; Tejada-Simon et al., 2001). Es weisen mehrere Ergebnisse darauf hin, dass MBP-spezifische T-Helferzellen bei MS-Patienten im Gegensatz zu Gesunden bereits aktiviert wurden und klonal expandiert sind: Allegretta et al. untersuchten 1990 die Mutationshäufigkeit eines Markergens bei MBP-spezifischen T-Zelllinien von MS-Patienten und Gesunden und fanden vermehrt Mutationen bei Linien von Patienten. Geht man davon aus, dass bei häufigerer Zellteilung vermehrt Zufallsmutationen auftreten, ist dies ein Hinweis auf eine klonale Expansion bei MS-Patienten. Die Aktivierung MBP-spezifischer T-Zellen von MS-Patienten scheint weniger abhängig vom kostimultorischen CD28/B7-Signal zu sein als die Aktivierung anderer antigenspezifischer T-Helferzellen (Lovett-Racke et al., 1997; Scholz et al., 1998). Zang et al. zeigten 1999, dass MBP-reaktive, Apoptose-sensitive Zellen bei MS-[Seite 11↓]Patienten persistieren. Dies könnte bedeuten, dass sie der peripheren Toleranz entgehen. Die Frage, ob MBP-spezifische T-Helferzellen im peripheren Blut vorwiegend naive oder Gedächtniszellen sind, wird kontrovers diskutiert: Es gibt Arbeiten, die die Zugehörigkeit dieser Zellen zum Gedächtnispool, d.h. der CD45RO-exprimierenden Zellen, zeigten (Bielekova et al., 1999; Burns et al., 1999), während eine andere Gruppe die Herkunft MBP-spezifischer T-Zelllinien vorwie­gend aus CD45RA+ naiven Zellen zeigte (Muraro et al., 2000).

Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass es Hinweise auf eine Aktivierung MBP-spezifischer T-Helferzellen bei MS-Patienten gibt, was für deren pathogenetische Relevanz spricht. All diese Erkenntnisse wurden jedoch aus Experimenten an MBP-spezifischen T-Zell­linien oder -klonen gewonnen. Durch die lange Kultivierung sind daraus nur eingeschränkt Rückschlüsse auf Verhältnisse möglich. Es bleibt also zu zeigen, inwieweit diese Ergebnisse durch Untersuchungen bestätigt werden können.

Es gibt Hinweise auf ein Überwiegen proinflammatorischer MBP-spezifischer CD4+-Zellen.

Das Zytokinprofil MBP-spezifischer CD4+-Zellen ist heterogen, es zeigt sich jedoch eine Ten­denz in Richtung proinflammatorischer Zytokine (Vandevyver et al., 1998). In einigen Studien konnte auch eine verstärkte Th1-Zytokinsekretion bei MS-Patienten im Vergleich zu Gesunden nachgewiesen werden (Tejada-Simon et al., 2001; Rohowsky-Kochan et al., 2000).

1.4 Die Detektion antigenspezifischer T-Zellen

Die Untersuchung antigenspezifischer T-Zellen ist problematisch, da die Frequenz der T-Zellen, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind, gering ist. Die verwendeten Methoden müssen also eine hohe Sensitivität aufweisen.

Grundsätzlich kann man die Antigenspezifität von T-Zellen entweder strukturell oder funktionell nachweisen. Strukturell bezeichnet den direkten Nachweis des antigenspezifischen T-Zellrezep­tors. Bei einer funktionellen Analyse wird dagegen nach Antigenstimulation die reaktive Aktivierung der T-Zellen, zum Beispiel anhand der Zytokinsekretion oder Proliferation, nach­gewiesen. Die Vor- und Nachteile dieser Methoden liegen auf der Hand: Die strukturelle Analyse weist alle antigenspezifischen T-Zellen nach, sagt aber nichts über deren Funktionalität aus. Bei der funktionellen Analyse werden hingegen nur diejenigen Zellen detektiert, die auf die Antigenstimulation mit eben der nachgewiesenen Reaktion antworten.


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Zur strukturellen Analyse beschrieben Altman et al. 1996 erstmals die Verwendung von MHC-Peptid-Komplexen, mit deren Hilfe antigenspezifische TCR durchflußzytometrisch detektiert werden können. Zum Einsatz dieser Methode bedarf es jedoch zum einen rekombinanter MHC-Moleküle des jeweiligen HLA-Typs und zum anderen definierte Peptide des Antigens. Diese Methode wird für CD8+-Zellen bereits angewandt, während es für die Untersuchung von CD4+-Zellen noch technische Probleme zu überwinden gilt.

Als funktioneller Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen dient seit langer Zeit die Detek­tion reaktiver Proliferation nach Antigenstimulation. Proliferation bzw. DNA-Synthese können durch den Einbau radioaktiv- oder fluoreszenzmarkierter Substanzen detektiert werden. Dafür ist jedoch zumindest eine fünftägige Kultur der Zellen notwendig. Das heißt, eine direkte Detektion spezifischer T-Zellen ist auf diesem Wege nicht möglich.

Eine weitere Möglichkeit des funktionellen Nachweises antigenspezifischer T-Zellen ist die Detektion reaktiv exprimierter Zytokine nach Antigenstimulation. Die Durchflußzytometrie bietet hier die Möglichkeit, Zytokinexpression sowie Koexpression anderer Moleküle auf Einzelzellebene zu untersuchen. Die exprimierten Zytokine werden mit monoklonalen fluoreszenzmarkierten Antikörpern detektiert. Der Nachweis spezifischer T-Zellen durch die Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression mittels intrazellulärer Färbung in fixierten Zellen wurde 1998 etabliert und von der gleichen Arbeitsgruppe hinsichtlich der optimalen Kostimula­tion und Stimulations­zeiten in den folgenden Jahren weiter optimiert (Suni et al., 1998; Waldrop et al., 1998; Nomura et al., 2000). Nach sechsstündiger Antigenstimulation mit Zugabe des Sekretionsinhibitors Bre­feldin A werden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Anschließend können mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern intrazellulär die reaktiv exprimierten Zytokine gefärbt wer­den. Zudem werden auf der Zelloberfläche der T-Helferzellmarker CD4 und der Ak­tivierungsmarker CD69 angefärbt (Abb. 1-3).


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Abbildung 1-3: Prinzip der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression mittels intrazellulärer Zytokin­färbung. Nach sechsstündiger Antigenstimulation werden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen den T-Helferzellmarker CD4 und den Aktivierungsmarker CD69, sowie intrazellulär gegen die Zytokine IFNγ und TNFα gefärbt. In der Auswertung werden zunächst CD4+-Lymphozyten eingegrenzt und diese dann bezüglich der Aktivierung und Zytokinexpression ausgewertet. Die IFNγ+CD69+-Zellen repräsentieren eine antigenspezifische T-Helferzellpopulation.

Ein Nachteil der intrazellulären Zytokinfärbung ist die erforderliche Fixierung und Permeabili­sierung der Zellen. Die Detektion sezernierter Zytokine mit Hilfe einer membrangebundenen Fangmatrix (Manz et al, 1995; Brosterhus et al., 1999) erlaubt dagegen den Zytokinnachweis auf lebenden Zellen. Die Grundlage dieses IFNγ-Sekretionsassays bildet ein bivalenter Antikörper, dessen eine Bindungsstelle für das auf allen Leukozyten exprimierte Oberflächenantigen CD45 spezifisch ist. Die andere Bindungsstelle erkennt ein Epitop des Zytokins IFNγ. Dieser Anti­körper bildet eine Fangmatrix auf der Zelloberfläche, die dann die während der Sekretionsphase [Seite 14↓]von der Zelle sezernierten IFNγ-Moleküle „einfängt“. Mit einem zweiten Antikörper, der ein weiteres Epitop des IFNγ-Moleküls erkennt und mit dem Fluorochrom PE markiert ist, werden die IFNγ-sezernierenden Zellen dann angefärbt (Abb. 1-4).

Abbildung 1-4: Prinzip des IFN γ -Sekretionsassays. Nach sechsstündiger Antigenstimulation werden die Zellen mit einem bivalenten αCD45αIFNγ-Antikörper inkubiert, der eine Fangmatrix für sezerniertes IFNγ bildet. Dieses wird in einer 45minütigen Sekretionsphase eingefangen und mit einem zweiten, fluoreszenzmarkierten αIFNγ-Antikörper angefärbt.

Anschließend können die zytokinexprimierenden Zellen magnetisch angereichert werden (Miltenyi et al., 1990). Dies bringt zwei große Vorteile mit sich: Zum einen ist durch diese Anreicherung eine erhöhte Sensitivität gegenüber der Analyse antigenreaktiver Zytokin­expression in fixierten Zellen zu erwarten. Zum anderen eröffnet die Möglichkeit der Isolierung lebender antigenspezifischer T-Helferzellen Optionen wie zum Beispiel die weitere Charakteri­[Seite 15↓]sierung dieser Zellen oder deren therapeutische Verwendung. So wäre ein therapeutisches Ziel eine Manipulation des Zytokinprofils der proinflammatorischen zu regulatorischen T-Helferzellen, die nach anschließender Reinjektion die Entzündungsvorgänge im ZNS regulieren könnten.


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08.01.2004