3  Materialien und Methoden

Es werden hier die häufig benutzten Lösungen und Geräte eingeführt, die als Grundlage für alle später beschriebenen Methoden dienten. Materialien, die nur für eine bestimmte Methode gebraucht wurden, werden dort aufgeführt.

Periphervenöses Blut von gesunden Probanden und MS-Patienten wurde in natriumheparini­sierten Röhrchen des Vacutainer-Systems (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, USA) bzw. ammoniumheparinisierten Monovetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) abgenommen und bei Raumtemperatur nicht länger als sechs Stunden aufbewahrt.

Periphere mononukleäre Zellen können aufgrund ihrer Dichte von den anderen Bestandteilen des Blutes getrennt werden. Hierzu wird verdünntes Vollblut auf eine Schicht Ficoll-Hypaque mit der Dichte 1,077 g/ml gebracht. Nach Zentrifugation flottieren die mononukleären Zellen auf­grund ihrer geringeren Dichte als sogenannte „Interphase“ über der Ficoll-Schicht, während sich Zellen höherer Dichte am Boden des Röhrchens befinden. Als Puffer für die PBMC-Isolierung wurde PBS verwendet, um jegliche unspezifische Stimulation durch Fremdproteine zu vermei­den.

Heparinisiertes Vollblut wurde 1:1 mit PBS verdünnt und anschließend auf raumtemperierten Ficoll Paque (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) geschichtet. Nach 20 Minuten Zentrifugation bei 800xg ohne Bremse wurde die Interphase abgenommen, mit PBS aufgefüllt und bei 250xg zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet in PBS resuspendiert und abschließend 15 Minuten bei 200xg zentrifugiert. Danach wurden die Zellen in einer definierten Menge Medium oder PBS aufgenommen und gezählt.

Je 10 ml Liquor wurde nach Lumbalpunktion in konische Polypropylen-Röhrchen abgenommen, auf Eis transportiert und direkt verarbeitet. Nach Zentrifugation bei 250xg wurden die Zellen zweimal mit PBS-BSA gewaschen und anschließend in Kulturmedium aufgenommen.

Mikroskopische Kammerzählung

Eine Möglichkeit der Zellzählung ist das mikroskopische Auszählen mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer. Zur Ausgrenzung toter Zellen wurde die Zellsuspension mit 0,4%iger Trypan Blau Lösung (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) gemischt, welche durch die Zellmembran toter Zellen diffundiert, lebende Zellen jedoch nicht anfärbt.

Die Zellsuspension wurde unter das Deckblatt der Zählkammer pipettiert. Ausgezählt wurden die vier großen Eckquadrate der Neubauer-Kammer mit dem 40er Objektiv des Mikroskops Axiovert (Carl Zeiss, Deutschland). Jedes Eckquadrat hat eine Fläche von 1 mm. Damit wurden bei einer Kammertiefe von 0,1 mm insgesamt ein Volumen von 0,4 μl ausgezählt. Die gesuchte Zellzahl pro ml ergibt sich also aus der Multiplikation der Zahl der in allen vier Quadraten ge­zählten Zellen mit dem Faktor 2500.

Während unter dem Mikroskop nur morphologische Charakteristika zur Unterscheidung ver­schiedener Zelltypen berücksichtigt werden können, können bei der Durchflußzytometrie fluoreszenzgefärbte Oberflächenmarker auf Zellen detektiert werden und somit Aussagen über bestimmte Zellpopulationen gemacht werden, die mikroskopisch nicht zu unterscheiden sind. Im Durchflußzytometer werden jedoch nur Frequenzen von Zellen gemessen, ohne das Volumen der Zellsuspension zu berücksichtigen. Um absolute Zellzahlen zu ermitteln, wurden der zu messen­den Probe eine kalibrierte Anzahl an fluoreszierenden Mikropartikeln (TruCount Tubes, Becton Dickinson, San Jose, USA) zugesetzt. Diese Partikel können aufgrund ihrer geringen Größe und starken Fluoreszenz von Zellen unterschieden werden. Aus dem Verhältnis der gemessenen zu den ursprünglich zugegebenen Mikropartikeln kann dann die Gesamtzahl der Zellen in der Probe berechnet werden.

Fluoreszenz bezeichnet das Leuchten eines Stoffes nach Anregung durch zugeführte Energie (Absorption). Dieses Leuchten entspricht Lichtquanten, die von angeregten Atomen bei der Rückkehr der Elektronen auf ihr ursprüngliches Energieniveau freigesetzt werden (Emission). Durch die Kopplung von Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorochrome) an Proteine können diese op­tisch nachweisbar gemacht werden.

Fluoreszenzfarbstoffe zeichnen sich jeweils durch ein charakteristisches Absorptions- und Emissionsspektrum aus. Tabelle 3-1 zeigt die in dieser Arbeit eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe.

Tabelle 3-3.1: In dieser Arbeit verwendete Fluorochrome.

1: verwendet als gekauftes Antikörperkonjugat
2: verwendet als selbstgekoppeltes Antikörperkonjugat

Es sei hier exemplarisch die Kopplung von FITC an Proteine beschrieben. Das Protein wurde in Boratpuffer (0,1 M Borsäure, 0,025 M Natriumtetraborat, 0,075 M Natriumchlorid, mit Natron­lauge auf pH 9,5 eingestellt) überführt und auf eine Konzentration von 1 mg/ml gebracht. FITC wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, in 50-molarem Überschuss zur Proteinlösung gege­[Seite 21↓]ben und eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde das Konjugat mittels einer PD-10-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in PBS-BSA-Azid über­führt. Die Proteinkonzentration und das Kopplungsverhältnis wurden anhand der photometrisch bestimmten optischen Dichte (OD) bei 280 nm und bei 495 nm (Absorptionsmaximum von FITC) bestimmt.

Formeln für Kopplung von IgG (Molekulargewicht 150 000):

Proteinkonzentration [mg/ml] = (OD280 – 0,35 x OD₄₉₅) / 1,4

Kopplungsverhältnis (Fluorochrom/Protein) = 2,9 x OD₄₉₅ / (OD₂₈₀ – 0,35 x OD₄₉₅)

Die Immunfluoreszenz nutzt fluoreszenzmarkierte Antikörper, um bestimmte Antigene oder Antikörper nachzuweisen. Die Fluoreszenzmessung kann dann in einem Fluoreszenzmikroskop oder in einem Durchflußzytometer erfolgen.

Für diese Arbeit wurde nur die direkte Immunfluoreszenz verwendet, bei der Antikörper mit einer Spezifität für das nachzuweisende Antigen direkt an fluoreszente Farbstoffe gekoppelt sind. Davon unterscheidet man die indirekte Immunfluoreszenz, bei der der antigenspezifische Antikörper durch einen zweiten, fluoreszenzmarkierten Antikörper nachgewiesen wird.

Mit Antikörpern gegen verschiedene Oberflächenmarker humaner Zellen können diese Marker sowohl auf lebenden als auch auf fixierten Zellen nachgewiesen werden. Intrazelluläre Antigene, wie z.B. von der Zelle exprimierte Zytokine, können dagegen nur nach Fixierung und Permeabi­lisierung der Zellmembran angefärbt werden. Die verwendeten monoklonalen Antikörper gegen Oberflächenmarker bzw. humane Zytokine sind in Tabelle 3-2 bzw. 3-3 aufgezählt.

Tabelle 3-3.2: Verwendete monoklonale Antikörper gegen humane Oberflächenmarker.

Tabelle 3-3.3: Verwendete monoklonale Antikörper gegen humane Zytokine.

Alle -Stimulationen wurden für sechs Stunden bei 37°C und 5% CO in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre im Brutschrank durchgeführt.

Die Stimulation von Vollblut erfolgte mit je einem Milliliter heparinisiertem Vollblut pro Ansatz in Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden (Greiner, Frickenhausen, Deutschland). Die Röhr­chen wurden im Brutschrank mit 5-10° Neigung zur Horizontalen inkubiert, um eine größtmögliche Kontaktfläche zwischen der Vollblutprobe und der Oberfläche des Stimulations­röhrchens herzustellen.

Die Stimulation von PBMC wurde in RPMI-Kulturmedium mit den oben (Kap.3.1.1) aufge­führten Zusätzen durchgeführt. Für den IFNγ-Sekretionsassay betrug die Zellkonzentration 1x10⁷ PBMC/ml; die Zellen wurden in Gewebekulturschalen (Greiner, Frickenhausen, Deutschland) stimuliert. Die Stimulationsansätze für die Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen (Restimulation der T-Zelllinie bzw. Stimulation von Liquorzellen) wurden in verschließbaren Polystyrol-Röhrchen (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, USA) mit einer Zelldichte von 2x10⁶ PBMC/ml durchgeführt. Diese Stimulationsröhrchen wurden, wie bei der Vollblutstimulation beschrieben, im Brutschrank schräg gestellt.

An der Aktivierung von T-Zellen durch antigenpräsentierende Zellen sind neben der Interaktion der MHC-Klasse-II-Moleküle mit dem CD3-Komplex noch mehrere andere Moleküle beteiligt. [Seite 23↓]Eines dieser kostimulatorischen Moleküle ist das Antigen CD28, das von T-Zellen exprimiert wird und an CD80 und CD86, beides Oberflächenmoleküle von antigenpräsentierenden Zellen, bindet. In allen Stimulationsansätzen dieser Arbeit wurden Antikörper gegen CD28 (Klon CD28.2, BD Pharmingen, San Diego, USA) in einer Endkonzentration von 1μg/ml zugegeben.

Es wurden verschiedene Antigene zur Stimulation eingesetzt (Tab. 3-4):

Tabelle 3-3.4: In dieser Arbeit verwendete Antigene.

Neben den verschiedenen Antigenstimulationen wurde jeweils eine Probe als Negativkontrolle mitgeführt, die ohne Antigen, aber mit αCD28 inkubiert wurde. Alle weiteren Schritte wurden bei der Negativkontrolle parallel zu den antigenstimulierten Ansätzen durchgeführt.

Die Stimulation einer T-Zelllinie bzw. Liquorzellen unterscheidet sich von der Stimulation von Vollblut oder PBMC vor allem durch zwei Besonderheiten: Zum einen besitzen die zu stimulie­renden Zellen keine Fähigkeit zur Antigenaufnahme, -prozession und -präsentation. Zum anderen ist die Anzahl der Zellen zu gering für die Durchführung einer Stimulation. Um diese beiden praktischen Probleme zu lösen, wurden autologe PBMC mit Carboxyfluorescein Diacetat-Succinimidyl Ester (CFDA-SE) markiert und zu den Versuchsansätzen zugegeben. CFDA-SE ist ein nicht-fluoreszierendes, sehr gut membrangängiges Molekül. Es wird von intra­zellulären Esterasen durch Abspaltung zweier Azetatgruppen in das fluoreszente Carboxyfluorescein-Succinimidyl Ester (CFSE) umgewandelt, das weniger membrangängig ist. Der Succinimidyl Ester-Anteil des Moleküls wiederum ist sehr reaktiv und kann den Carboxyfluorescein-Anteil durch Reaktion an Aminogruppen kovalent an Zellproteine binden. Dadurch werden Zellen fluoreszenzmarkiert und optisch detektierbar. Die Stimulations­bedingungen unterschieden sich nicht von der PBMC-Stimulation bei anderen Versuchen.

Brefeldin A (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) ist ein Metabolit des Pilzes und inhibiert den zellulären Sekretionsapparat. Es wurde in einer Endkonzentration von 10 μg/ml eingesetzt und jeweils für die letzten vier Stunden der sechs­stündigen Stimulationszeit zugegeben. Es wurde Wert darauf gelegt, dass die Stimulationsröhrchen nach Zugabe von Brefeldin A in der gleichen Lage in den Brutschrank gelegt wurden wie in den ersten zwei Stunden der Stimulationszeit, um Zellinteraktionen so wenig wie möglich zu stören.

Nach der Stimulation wurden die Zellen zunächst mit EDTA von der Oberfläche der Stimula­tionsröhrchen gelöst. EDTA wurde in einer Endkonzentration von 2 mM zugegeben, anschließend wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die anschließende Fixierung unterschied sich bei Vollblut und PBMC, da bei den Vollblutproben zunächst die Erythrozyten lysiert wurden.

Zur Lysierung wurden je 9 ml 1+9 mit destilliertem Wasser verdünnte FACS Lysing Solution (Becton Dickinson, San Jose, USA) zu jeder Vollblutprobe gegeben, diese kräftig geschüttelt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand dekantiert und das Zellpellet in je 500 μl 1+9 mit destilliertem Wasser verdünnter FACS Permeabilizing Solution (Becton Dickinson, San Jose, USA) resuspendiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 10 ml PBS-BSA-Azid zugegeben, die Proben zentrifugiert und nach dem Dekantieren des Überstandes das Zellpellet in PBS-BSA-Azid aufge­nommen.

PBMC wurden nach der EDTA-Zugabe zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in 2%iges Formaldehyd (verdünnt in PBS) aufgenommen und 20 Minuten inkubiert. Formaldehyd fixiert Zellen durch Vernetzung von Proteinen und DNA. Die fixierten Zellen wurden in FACS Permeabilizing Solution aufgenommen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 10 ml PBS-BSA-Azid, Zentrifugation und Dekantieren des Überstandes wurde das Zellpellet in PBS-BSA-Azid aufgenommen.

Die Färbeprozedur ist für Vollblut- und PBMC-Proben die gleiche, die Färbung von Oberflä­chenmarkern und die intrazelluläre Färbung wurden gleichzeitig durchgeführt. Es wurde eine Färbelösung angesetzt, in der alle benutzten Antikörper in der vorher austitrierten optimalen Konzentration vorlagen. Zur Verhinderung einer unspezifischen Bindung der fluoreszenz­markierten Antikörper an Fc-Rezeptoren von Monozyten wurde der Färbelösung humanes Immunglobulin (Beriglobin, Centeon, Marburg, Deutschland) in einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zugegeben. Die zu färbenden Zellen wurden in 100 μl Färbelösung aufgenommen und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden sie mit PBS-BSA-Azid gewaschen und in PBS-BSA-Azid aufgenommen.

Neben der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen ist der IFNγ-Sekre­tionsassay eine weitere Methode des Nachweises antigenspezifischer T-Helferzellen anhand exprimierter Zytokine. Der Unterschied besteht darin, dass die Zellen nicht fixiert werden müssen und damit in einem weiteren Schritt angereichert bzw. lebend isoliert werden können. Die Grundlage des Zytokin-Sekretionsassays bildet ein bivalenter Antikörper, dessen eine Bindungsstelle für das auf allen Leukozyten exprimierte Oberflächenantigen CD45 spezifisch ist. Die andere Bindungsstelle erkennt ein Epitop des Zytokins IFNγ. Dieser Antikörper wird Catch Reagent genannt, weil er eine Fangmatrix auf der Zelloberfläche bildet, die dann die während der Sekretionsphase von der Zelle sezernierten IFNγ-Moleküle „einfängt“. Mit einem zweiten Antikörper, der ein weiteres Epitop des IFNγ-Moleküls erkennt und mit dem Fluorochrom PE markiert ist, werden die IFNγ-sezernierenden Zellen dann angefärbt. Dieser Antikörper wird Detection Antibody genannt (siehe Abb. 1-4).

Es wurden pro Ansatz mindestens 1x10⁷ PBMC stimuliert, anschließend mit einem Zellschaber (Sarstedt, Newton, USA) aus der Gewebekulturschale herausgelöst und dann mit 1:5 verdünntem IFNγ Catch Reagent (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland) sieben Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend folgte die Sekretionsphase: Die Zellsuspension wurde in warmem Medium auf eine Zelldichte kleiner als 10⁶/ml verdünnt und 40 Minuten im Brutschrank bei 37°C auf einem Rotationsgerät (Ingenieurbüro CAT, Staufen, Deutschland) inkubiert. Danach wurden die Zellen mit PBS-BSA-EDTA gewaschen und in 500 μl Färbelösung zehn Minuten auf Eis extrazellulär gefärbt. Die Färbelösung enthielt PE-markierten IFNγ Detection Antibody (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland), αCD4-Cy5, αCD69-FITC, αCD14-PerCP und humanes Immunglobulin. Anschließend wurden die Zellen mit PBS-BSA-EDTA gewaschen und dann in PBS-BSA-EDTA resuspendiert.

Die magnetische Zellsortierung (MACS) basiert auf der Markierung von Zellen mit Hilfe von superparamagnetischen Mikropartikeln mit einem Durchmesser von etwa 100 nm, die an Anti­körper gekoppelt werden. Im magnetischen Feld können dann die markierten Zellen von den nicht markierten Zellen getrennt werden: Die Zellsuspension wird über eine Säule aus Stahlwolle gegeben, die sich in einem magnetischen Feld befindet. Das Eluat dieser Säule im magnetischen [Seite 27↓]Feld enthält die nicht markierten Zellen. Eluiert man dann die Säule außerhalb des Magnetfeldes, erhält man die magnetisch markierten Zellen (Abb. 3-1).

	Abbildung 3-1: Prinzip der magnetischen Zellseparation. Zellen werden mit an Antikörpern gebundenen superparamagnetischen Mikropartikeln markiert und anschließend über eine Säule aus Stahlwolle gegeben, die sich in einem magnetischen Feld befindet. Die markierten Zellen erhält man anschließend durch Eluieren der Säule außerhalb des Magnetfeldes.

Dieses System wurde für die Anreicherung IFNγ-sezernierender Zellen genutzt. Die nach dem IFNγ-Sekretionsassay mit dem Fluoreszenzfarbstoff PE markierten Zellen wurden mit Anti-PE-Microbeads (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland) magnetisch markiert und dann angereichert. Nach der Oberflächenfärbung des IFNγ-Sekretionsassays wurden die Zellen mit Anti-PE-Microbeads 15 Minuten bei 4-8°C inkubiert, dann mit PBS-BSA-EDTA gewaschen und in PBS-BSA-EDTA resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurde 1/20 Aliquot abgenommen und nach PI-Zugabe durchflußzytometrisch analysiert. VS⁺ Säulen (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland) wurden im magnetischen Feld des MACS-Separationsgerätes aufgestellt und mit zweimal 1 ml entgastem PBS-BSA-EDTA gespült. Anschließend wurde die Zellsuspen­sion über einen Zellfilter (pre separation filter, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Deutschland) auf die Säulen gegeben. Die Säule wurde in drei Schritten mit 2 ml, 2 ml und 3 ml Puffer gespült und das Eluat als Negativfraktion aufgefangen und durchflußzytometrisch analy­siert. Daraufhin wurde die Säule aus dem Magnetfeld genommen und die magnetisch markierten Zellen mit 3 ml PBS-BSA-EDTA eluiert. Es folgte ein weiterer Anreicherungsschritt, analog dem ersten, um die Reinheit der magnetisch markierten Zellen zu erhöhen. Die zweite positive [Seite 28↓]Fraktion, das Eluat aus der zweiten Säule, wurde zentrifugiert, die Zellen in 300 μl Puffer aufge­nommen und die ganze Probe im Durchflußzytometer analysiert, nachdem PI zugegeben worden war.

Mit Hilfe der Durchflußzytometrie können Zellsuspensionen auf Einzelzellniveau untersucht werden (Radbruch, 2000). Die Zellen werden zunächst durch hydrodynamische Fokussierung in Einzellzellsuspension gebracht. Die Zellsuspension wird im Probenstrom aus dem Proben­reservoir angesaugt. Um diesen herum fließt der Mantelstrom, der eine schnellere Fließgeschwindigkeit aufweist und damit die Zellsuspension in Einzelzelltröpfchen aufteilt (Abb. 3-2).

	Abbildung 3-2: Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung. Die Fließgeschwindigkeit des Mantelstroms ist höher als die des Probenstroms und vereinzelt so die Zellen zu einer Einzelzellsuspension.

Die einzelnen Zellen passieren dann einen Laserstrahl, d.h. monochromatische, annähernd parallele Lichtstrahlung. Dadurch entsteht zum einen Streulicht, anhand dessen Aussagen über die Größe und die Granularität gemacht werden können. Zum anderen können Fluorochrome zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt werden.

Das in einem geringen Winkel reflektierte Licht (2-20°) wird als Vorwärtsstreulicht (engl. forward scatter, FSC) bezeichnet. Es korreliert mit der Zellgröße und dem Brechungsindex, während das im rechten Winkel gestreute „Seitwärtsstreulicht“ (engl. side scatter, SSC) mit der Granularität der Zellen korreliert.

Das entstehende Fluoreszenzlicht wird durch dichrote Teilerspiegel und Bandpassfilter in verschiedene Fluoreszenzspektren aufgetrennt. Nach einer Verstärkung durch Photomultiplierröhren wird das optische Signal zunächst in elektrische Ströme und schließlich in [Seite 29↓]ein digitales Signal umgewandelt. Die Verstärkung kann linear oder logarithmisch erfolgen (Abb. 3-3).

	Abbildung 3 -3: Prinzip des Durchflußzytometers. Einzelne Zellen werden durch monochromatisches Licht angeregt. Das emittierte Licht verschiedener Wellenlängen wird anschließend durch dichrote Teilerspiegel und Bandpassfilter aufgetrennt und nach Verstärkung durch Photomultiplierröhren gemessen.

Alle für diese Arbeit durchgeführten Messungen wurden am FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, USA) durchgeführt. Im FACS Calibur werden die Zellen von zwei Lasern mit unter­schiedlichen Wellenlängen angeregt. Der erste Laser, ein Argonionenlaser, generiert Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm, der zweite, ein roter Diodenlaser, Licht der Wellenlänge 635 nm. Das heißt, es können Fluorochrome verwendet werden, deren Absorptionsmaximum in einem dieser Bereiche liegt.Das Fluoreszenzlicht wird in vier verschiedene Spektren aufgeteilt, so dass vier verschiedene Fluoreszenzkanäle (FL) zur Verfügung stehen. Tabelle 3-5 zeigt die Charakte­ristika dieser Fluoreszenzkanäle.

Tabelle 3-3.5: Charakteristika der vier zur Verfügung stehenden Fluoreszenzkanäle des FACS Calibur.

Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm CELL Quest (Becton Dickinson, San Jose, USA). Dieses Programm ermöglicht es, Regionen von Zellpopulationen zu definieren und spätere Darstellungen auf diese Populationen zu beschränken. Es wurden Punktdiagramme aus jeweils zwei der sechs gemessenen Parameter erstellt.

Die statistische Auswertung wurde mit dem Statistikprogramm Statistical Package for Social Sciences (SPSS) von Microsoft durchgeführt.

Um zu vergleichen, bei prozentual wie vielen Gesunden bzw. MS-Patienten antigenreaktive CD4⁺-Zellen gegen die verschiedenen Antigene nachgewiesen werden konnten, wurde der Chi-Quadrat-Test angewendet. Zum Vergleich der Frequenzen zytokinexprimierender CD4⁺-Zellen bei Gesunden und MS-Patienten bzw. deren Untergruppen wurde der Mann-Whitney-Test angewandt. P-Werte kleiner als 0,05 wurden als Tendenzen, p-Werte kleiner 0,01 als statistische Signifikan­zen angesehen.