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Ergebnisse

4.1 Etablierung der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen mittels intrazellulärer Färbung

Eine Möglichkeit des Nachweises antigenspezifischer T-Helferzellen ist die Detektion der von T-Helferzellen nach Antigenstimulation reaktiv gebildeten Zytokine mit Hilfe der intrazellulären Färbung. Dazu werden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) oder Vollblut eines Probanden stimuliert, fixiert, permeabilisiert und anschließend die exprimierten Zytokine intrazellulär mit monoklonalen fluoreszenten Antikörpern gefärbt. Durchflußzytometrisch lassen sich dann die relativen Häufigkeiten von T-Helferzellen identifizieren, die durch Inkubation mit dem Anti­gen aktiviert wurden.

4.1.1 Vergleich der Vollblutstimulation mit der Stimulation von PBMC

Zur antigenspezifischen Stimulation können sowohl PBMC als auch Vollblut verwendet werden. Ein Vergleich dieser beiden Möglichkeiten bezüglich der Frequenz zytokinexprimierender Zellen nach Stimulation bzw. ohne Stimulation ist also nötig. Ein Teil heparinisierten Blutes eines gesunden Probanden wurde hierzu direkt mit Cytomegalie Virus Antigen (CMV) stimuliert, während aus dem anderen Teil mononukleäre Zellen (PBMC) isoliert und stimuliert wurden. Nach sechsstündiger Stimulation mit Zugabe des Sekretionsinhibitors Brefeldin A nach zwei Stunden wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Anschließend wurden mit fluoreszenz­markierten Antikörpern intrazellulär verschiedene Zytokine, sowie auf der Zelloberfläche der T-Helferzellmarker CD4 und der frühe Aktivierungsmarker CD69 angefärbt. Die Auswertung wurde auf CD4+-Lymphozyten beschränkt; ausgewertet wurden die jeweiligen relativen Häufig­keiten (Frequenzen) aktivierter zytokinexprimierender Zellen in CD4+-Zellen. Nach Stimulation von Vollblut mit CMV exprimierten relativ mehr T-Helferzellen die untersuchten Zytokine als nach Stimulation von PBMC des gleichen Spenders zum selben Zeitpunkt.Dagegen waren die Frequenzen zytokin­exprimierender T-Helferzellen in der unstimulierten Kontrolle der PBMC-Stimulation im Vergleich zur Negativkontrolle der Vollblutstimulation höher (Abb. 4-1). Die Vollblutstimulation bietet dementsprechend optima­lere Bedingungen für die intrazelluläre Zytokinfärbung nach Antigenstimulation.


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Abbildung 4-1: Vergleich der Vollblutstimulation mit der Stimulation von PBMC. PBMC bzw. Vollblut des gleichen Spenders wurde zeitgleich sechs Stunden mit CMV stimuliert, Brefeldin A wurde nach zwei Stunden zugegeben. Nach anschließender Fixierung und Permeabilisierung wurden auf der Zelloberfläche CD4 und der Aktivierungsmarker CD69 gefärbt, intrazellulär die Zytokine IL2, TNFα, IL4 und IFNγ. Als Negativkontrollen wurden unstimulierte Proben untersucht. Angegeben sind die relativen Häufigkeiten (Frequenzen) zytokinexprimierender aktivierter T-Helferzellen in CD4+-Zellen. Alle untersuchten Zytokine wurden nach Vollblutstimulation von einer höheren Frequenz von T-Helferzellen exprimiert als nach Stimulation von PBMC. Dagegen waren die Frequenzen zytokinexprimierender Zellen in der Negativkontrolle der Stimulation von PBMC höher als bei der Stimulation von Vollblut.

4.1.2 „Intra Assay Variabilität“

Die „Intra Assay Variabilität“ beschreibt die Streuung der Werte bei wiederholten Messungen innerhalb eines Experimentes. Zur Bestimmung wurden von einem gesunden Spender jeweils zehn Vollblutproben mit Tetanustoxoid (TT) und Cytomegalie Virus Antigen (CMV) stimuliert. [Seite 33↓]Anschließend wurde der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung der Messwerte errechnet.

Ein Maß für die Variabilität ist der Variabilitätskoeffizient (VC):

Variabilitätskoeffizient = Standardabweichung / arithmetischer Mittelwert.

Es zeigte sich, dass der Variabilitätskoeffizient der mit den Antigenen TT bzw. CMV stimu­lierten Proben von 5,20% bis 8,12% reichte und damit in diesem Frequenzbereich eine gute Reproduzierbarkeit der Methode gewährleistet ist (Tabellen 4-1 und 4-2).

Tabelle 4-4.1: Berechnung der Variabilitätskoeffizienten der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen. Jeweils zehn Ansätze wurden mit TT bzw. CMV stimuliert. Aus den gemessenen Frequenzen IFNγ-exprimierender Zellen wurden der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung berechnet und daraus der Variabilitätskoeffizient gebildet.

 

Frequenz aktivierter IFN γ -exprimierender Zellen in CD4 + -Zellen

 

Arithmetischer Mittelwert ( )

Standardabweichung (SD)

Variabilitätskoeffizient (VC=SD/ )

TT-Stimulation

0,04893%

0,00397%

8,12%

CMV-Stimulation

1,02036%

0,06209%

6,09%

Tabelle 4-4.2: Berechnung der Vaiabilitätskoeffizienten der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen. Jeweils zehn Ansätze wurden mit TT bzw. CMV stimuliert. Aus den gemessenen Frequenzen TNFα-exprimierender Zellen wurden der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung berechnet und daraus der Variabilitätskoeffizient gebildet.

 

Frequenz aktivierter TNF α -exprimierender Zellen in CD4 + -Zellen

 

Arithmetischer Mittelwert ( )

Standardabweichung (SD)

Variabilitätskoeffizient (VC=SD/ )

TT-Stimulation

0,10604%

0,00551%

5,20%

CMV-Stimulation

1,11357%

0,05791%

5,20%

4.1.3 Definition des „Cut-off point“

Um antigenreaktive T-Helferzellen von spontan zytokinexprimierenden Zellen abgrenzen zu können, muss bekannt sein, wie stark die Zytokinexpression von T-Helferzellen in der Negativ­kontrolle schwankt. Es wurden analog zur Bestimmung der „Intra Assay Variabilität“ jeweils zehn Negativkontrollen von zwei Spendern untersucht. Der Variabilitätskoeffizient lag hier deutlich höher, er reichte bis zu 94,79%. Dies erklärt sich durch die Nähe der Messwerte zum [Seite 34↓]Nullpunkt, einige gemessene Frequenzen waren sogar gleich null. Aus dieser hohen relativen Schwan­kungsbreite ergab sich das Problem der Definition einer Nachweisgrenze. Der sonst häufig verwendete Stimulationsindex (Quotient zwischen antigenstimulierter Probe und Negativ­kontrolle, der ab dem Wert drei als signifikant angesehen wird) konnte hier nicht verwendet werden, da die relative Schwankung der Negativkontrollen zu hoch ist. Die absolute Schwankung der Negativkontrollen belief sich bei wiederholten Mehrfachmessungen jedoch immer auf Werte kleiner 0,02%. Es wurde daher die Defini­tion eines „Cut-off point“ festgelegt:

+

Da die Genauigkeit der errechneten Frequenzen von der Gesamtzahl der durchflußzytometrisch gezählten Zellen abhängt, wurden nur Daten in die Gesamtauswertung einbezogen, bei denen mindestens 100 000 CD4+-Zellen gezählt worden waren.

4.1.4 Verlaufsanalyse der antigenspezifischen Zytokinantwort

Unabhängig von der Reproduzierbarkeit der Methodik stellte sich die Frage, inwieweit die anti­genspezifische Immunantwort eines Probanden zu verschiedenen Zeitpunkten schwankt. Es wurden deshalb über einen Zeitraum von zwei Monaten bei drei verschiedenen Spendern wiederholt Blutproben entnommen, mit den Antigenen TT und CMV stimuliert und anschließend mit Antikörpern gegen die Oberflächenantigene CD4 und CD69 sowie intrazellulär gegen die Zytokine IFNγ und TNFα gefärbt. Untersucht wurden Blutproben zu Beginn des Experimentes, sowie einen Tag danach, eine Woche, einen Monat und zwei Monate später. Um den zeitlichen Verlauf der relativen Ab- oder Zunahme der Frequenz von zytokinbildenden Zellen zu verdeutlichen, wurde zunächst der arithmetische Mittelwert der Messwerte zu allen untersuchten Zeitpunkten gebildet. Untersucht wurde dann die prozentuale Abweichung der einzelnen Messwerte von diesem Mittelwert:

Prozentuale Abweichung = (Messwert – Mittelwert) / Mittelwert

Exemplarisch sei hier für einen Spender der Verlauf der antigenreaktiven Zytokinexpression nach Stimulation mit TT bzw. CMV gezeigt (Abb. 4-2).


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Abbildung 4-2: Verlauf der Zytokinantwort TT- bzw. CMV-spezifischer T-Helferzellen bei einem gesunden Probanden. Vollblutproben wurden im Verlauf von zwei Monaten mit den Antigenen TT und CMV stimuliert und intrazellulär die Zytokine IFNγ und TNFα angefärbt. Die arithmetischen Mittelwerte der Frequenzen TT-reaktiver T-Helferzellen betrugen im Mittel 0,04% (IFNγ) bzw. 0,08% (TNFα), die CMV-reaktiver Zellen 0,86% (IFNγ) bzw. 0,84% (TNFα) in CD4+-Zellen. Dargestellt sind die prozentualen Abweichungen der einzelnen Messwerte von diesen Mittelwerten.

Die Messwerte des hier gezeigten Probanden zeigen Abweichungen von –25% bis +25% bei den Frequenzen IFNγ-exprimierender T-Helferzellen bzw. -30% bis +42% für die Frequenzen der TNFα-Produzenten. Bei den anderen beiden untersuchten Probanden waren die Ergebnisse [Seite 36↓]vergleichbar, die minimale Abweichung einer gemessenen Reihe betrug –10/+12%, das Maximum –41/+54%. Es fällt auf, dass sich die Zytokinexpression als Antwort auf die beiden Antigene bei einem Spender zu den verschiedenen Zeitpunkten jeweils in die gleiche Richtung, d.h. zu höheren oder niedrigeren Frequenzen hin, verändert. Es sei aber angemerkt, dass diese Tendenz bei jedem der untersuchten Probanden unterschiedlich war.

4.2 Etablierung des IFNγ-Sekretionsassays

Der IFNγ-Sekretionsassay stellt eine weitere Möglichkeit des Nachweises reaktiver Zytokin­expression nach Antigenstimulation dar. Im Gegensatz zur intrazellulären Zytokinfärbung werden die Zellen bei dieser Methode nicht fixiert. Das sezernierte Zytokin wird an einen biva­lenten αCD45αIFNγ-Antikörper außen an die Zellmembran gebunden und kann dort mit einem weiteren αIFNγ-Antikörper an lebenden Zellen detektiert werden (vgl. Abb. 1-4).

4.2.1 Kinetik des IFNγ-Sekretionsassays

Zur Bestimmung der optimalen Stimulationsdauer wurden von einem gesunden Spender jeweils vier Vollblutproben mit CMV stimuliert und eine Probe als Negativkontrolle nicht stimuliert. Untersucht wurden Stimulationszeiten von vier bis 36 Stunden. Die Frequenz aktivierter IFNγ-sezernierender Zellen war nach einer Stimulationsdauer von zwölf Stunden maximal (Abb. 4-3).


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Abbildung 4-3: Kinetik der IFN γ -Sekretion nach CMV-Stimulation. Vollblut wurde mit dem Antigen CMV stimuliert und anschließend sezerniertes IFNγ mit Hilfe des IFNγ-Sekretionsassays nachgewiesen. Außerdem wurden CD4 und CD69 auf der Zelloberfläche gefärbt und tote Zellen sowie Makrophagen mittels PI bzw. CD14-Färbung ausgegrenzt. Dargestellt sind die Frequenzen aktivierter (CD69+) IFNγ+ CD4+-Zellen als Mittelwert vier untersuchter Proben sowie deren Standardabweichung.

Es fiel jedoch auf, dass die mittlere Fluoreszenz der detektierten IFNγ+ Zellen nach einem Maximum bei sechs Stunden wieder abfiel. Dagegen nahm die Anzahl der aktivierten, CD69+-Zellen, die kein Zytokin bilden, zu (Abb. 4-4).


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Abbildung 4-4: Kinetik der IFN γ -Expression nach CMV-Stimulation. Das Experiment wurde wie in Abb. 4-3 beschrieben durchgeführt. Die hier dargestellten Punktdiagramme sind auf lebende CD4+-Lymphozy­ten beschränkt. Während die Frequenz IFNγ-exprimierender aktivierter CD4+-Zellen nach zwölf Stunden ihr Maximum erreichte, nahm nach sechs Stunden die mittlere Fluoreszenz der IFNγ-exprimierenden T-Helferzellen wieder ab und die Frequenz der aktivierten (CD69+) Zellen, die kein Zytokin bilden, zu.

Alle weiteren Experimente mit dem IFNγ-Sekretionsassay wurden nach einer Stimulationsdauer von sechs Stunden durchgeführt.


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4.2.2  Bestimmung der Rückgewinnungsrate

Nach der Detektion antigenspezifischer Zellen und anschließender magnetischer Anreicherung ist es nicht mehr möglich, Aussagen über Frequenzen in der Ausgangslösung, z.B. Vollblut, zu machen. Um solche Frequenzen nachträglich berechnen zu können, müssen Angaben darüber vorliegen, wie viel Prozent der Zellen nach welchem Schritt des Experimentes rückgewonnen werden können. Um diese Angaben machen zu können, wurden während eines IFNγ-Sekretions­assays nach CMV-Stimulation in den verschiedenen Phasen des Experimentes definierte Aliquots der Zellsuspension entnommen. Die Proben wurden anschließend mit einer kalibrierten Anzahl an fluoreszenten Mikropartikeln („beads“) versetzt und dann durchflußzytometrisch untersucht. Mit Hilfe des Verhältnisses der gemessenen fluoreszenten beads zur Gesamtzahl der zugesetzten beads ließ sich so rückrechnen, wie viele Zellen insgesamt in der Zellsuspension vorhanden waren. In Tabelle 4-3 sind für die verschiedenen Phasen des Versuches die so berech­neten Zellzahlen angegeben, sowie die errechnete Rückgewinnungsrate der CD4+CD69+IFNγ+-Zellen, d.h. derjenigen Zellen, die es anzureichern galt. Daraus ergibt sich, dass die Rückgewin­nungsrate nach Stimulation, Sekretionsphase und anschließender Färbung 28% beträgt, während die magnetische Anreicherung über zwei Säulen fast keinen Verlust von Zellen bedeutet, so dass insgesamt 27% der zu Beginn des Experimentes gezählten Zellen schließlich in der Auswertung wiedergefunden wurden. Der vermeintliche geringe Zugewinn von Zellen während der ersten Phase der Anreicherung ist durch Messungenauigkeiten der Volumina zu erklären.

Tabelle 4-4.3: Zur Berechnung des Zellverlustes während der einzelnen Schritte des Experimentes wurden zu verschiedenen Zeitpunkten definierte Aliquots entnommen, mit fluoreszierenden Mikropartikeln versetzt und so die Zellzahl der gesamten Probe bestimmt.

Schritt des Experimentes

Lebende Lymphozyten
in gesamter Probe

CD4 + CD69 + IFN γ +
in gesamter Probe

Errechnete Rückgewinnungsrate

vor Stimulation

4,07x107

  

nach Sekretionsphase und Färbung

1,15x107

2,99x104

28%

nach Anreicherung über eine Säule

 

3,18x104

30%

nach Anreicherung über zwei Säulen

 

2,93x104

27%


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4.2.3  Berechnung des Stimulationsindex

Zur Bewertung, ob eine Probe nach Antigenstimulation eine T-Helferzellaktivierung im Sinne einer erhöhten Frequenz an Zytokinproduzenten aufweist, wurde der Stimulationsindex errech­net. Der Stimulationsindex (SI) berechnet sich aus dem Quotient der Anzahl IFNγ-exprimierender T-Helferzellen in Anwesenheit von Antigen und deren Anzahl ohne Antigen­präsenz. Als Grenzwert wurde folgende gängige Definition benutzt:

Es wurde außerdem eine Mindestanzahl der angereicherten CD4+CD69+IFNγ+-Zellen von 20 Zellen festgelegt, die als Grenze der Populationsbildung angesehen wurde.

4.3 Bestimmung der Sensitivität der verwendeten Methoden

Es stellte sich die Frage nach der Sensitivität der beiden verwendeten Methoden: Welche Fre­quenz von zytokinexprimierenden Zellen kann mit der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen bzw. mit dem IFNγ-Sekretionsassay gerade noch nachge­wiesen werden? Zur Bestimmung wurden Verdünnungsreihen durchgeführt. Eine mit CMV stimulierte Probe wurde 1:5 mit einer unstimulierten Probe versetzt, diese verdünnte Probe dann wiederum 1:5 mit einer unstimulierten Probe gemischt, bis schließlich eine 1:625 Verdünnung erreicht wurde (Abb. 4-5).


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Abbildung 4-5: Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Sensitivität. Eine CMV-stimulierte Probe wurde mit einer unstimulierten Probe 1:5 verdünnt, diese Verdünnung dann wiederum 1:5 mit einer unstimulierten Probe versetzt usw., bis eine Verdünnung von 1:625 entstand.

Die Verdünnungsreihen wurden jeweils parallel für die Analyse antigenreaktiver Zytokin­expression in fixierten Zellen und den Sekretionsassay durchgeführt, d.h. es wurde Vollblut bzw. PBMC des gleichen gesunden Probanden zum selben Zeitpunkt verwendet. Insgesamt wurden drei Verdünnungsreihen untersucht. Anschließend wurde anhand der in Kapitel 4.1.3 bzw. 4.2.3 definierten Kriterien bewertet, ob in den einzelnen Verdünnungsschritten antigenspezifische zytokinexprimierende T-Helferzellen nachgewiesen werden konnten. Da jeder Spender mit einer anderen Frequenz von IFNγ-exprimierenden T-Helferzellen auf die CMV-Stimulation reagierte, musste eine Möglichkeit gefunden werden, um die drei Verdünnungsreihen miteinander zu ver­gleichen. Anhand der in der intrazellulären Färbung gemessenen Frequenz IFNγ-exprimierender T-Helferzellen in CD4+-Zellen der unverdünnten CMV-stimulierten Probe wurde deshalb für die einzelnen Verdünnungsstufen die theoretische Frequenz von IFNγ-exprimierenden Zellen in PBMC errechnet und als Maßstab für die Sensitivität definiert.

4.3.1 Sensitivität der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression
in fixierten Zellen nach sechsstündiger Antigenstimulation

In Abbildung 4-6 sind den mit Hilfe der intrazellulären Färbung gemessenen Frequenzen der IFNγ-produzierenden Zellen die jeweils berechnete Frequenz in PBMC zugeordnet. Beide Skalierungen sind logarithmisch, jede Kurve repräsentiert eine Verdünnungsreihe. Die schwarz [Seite 42↓]eingezeichneten Messwerte repräsentieren Proben, die als antigenspezifische T-Helferzell­antwort bewertet wurden. Grau sind alle Messwerte eingezeichnet, bei denen keine antigenspezifische Zytokinexpression nachgewiesen werden konnte.

Abbildung 4-6: Verdünnungsreihen der intrazellulären Zytokinfärbung. Dargestellt sind die Ergebnisse von drei Experimenten. Auf der x-Achse sind die rückgerechneten Frequenzen in PBMC angegeben, auf der y-Achse sind die gemessenen Frequenzen zytokinexprimierender T-Helferzellen in CD4+-Zellen aufgetragen. Messwerte, die als Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen bewertet wurden, sind schwarz eingezeichnet. Die grauen Messwerte repräsentieren Proben, in denen keine antigenspezifische T-Helferzellantwort detektiert wurde. Der lineare Verlauf der Kurven spiegelt den Sensitivitätsbereich bis ca. 1x10-4 in PBMC wider.

Alle drei Verdünnungsreihen zeigen bei Frequenzen größer als 1x10-4 IFNγ-exprimierender T-Helferzellen in PBMC einen linearen Verlauf. Im Bereich der Proben, bei denen keine antigen­spezifische Stimulation nachgewiesen werden konnte, ist der Kurvenverlauf nicht mehr linear, sondern nähert sich der Leerkontrolle an bzw. spiegelt deren Schwankungen wider.

-4


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4.3.2  Sensitivität des IFNγ-Sekretionsassays mit nachfolgender magnetischer Anreicherung

Den im IFNγ-Sekretionsassay ermittelten Stimulationsindizes sind in Abb. 4-7die jeweils rech­nerisch ermittelten Frequenzen IFNγ-exprimierender T-Helferzellen in PBMC zugeordnet. Die schwarz eingezeichneten Messwerte repräsentieren Proben, bei denen antigenspezifische T-Helferzellen nachgewiesen werden konnten. Grau sind die Messwerte aller Proben eingezeichnet, bei denen keine antigenspezifische T-Helferzellantwort detektiert wurde. Der lineare Verlauf der Kurven spiegelt den Sensitivitätsbereich der Methode bis ca. 2x10-5 wider, während unterhalb dieser Grenze die Kurven nicht mehr linear verlaufen.

Abbildung 4-7: Verdünnungsreihe des IFN γ -Sekretionsassays. Dargestellt sind die Ergebnisse von drei Experimenten. Auf der x-Achse sind die rückgerechneten Frequenzen in PBMC angegeben, auf der y-Achse sind die gemessenen Stimulationsindizes aufgetragen. Messwerte, die als Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen bewertet wurden, sind schwarz eingezeichnet. Die grauen Messwerte repräsentieren Proben, in denen keine antigenspezifische T-Helferzellantwort detektiert wurde. Der lineare Verlauf der Kurven spiegelt den Sensitivitätsbereich bis ca. 2x10-5 in PBMC wider.

-5


[Seite 44↓]

4.4  Nachweis der Aufnahme, Prozessierung und Präsentation von MBP durch antigenpräsentierende Zellen (APC)

Wird eine Blutprobe mit einem Antigen stimuliert, muss dieses Antigen zunächst von phagozy­tierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und dann in MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden. Erst auf diesem Wege wird es von T-Helferzellen erkannt und kann diese zur Zytokin­expression anregen. Um sicherzustellen, dass Myelin Basic Protein (MBP) von antigen­präsentierenden Zellen des peripheren Blutes aufgenommen und präsentiert werden kann, wurden folgende Versuche durch­geführt.

4.4.1 Aufnahme von FITC-markiertem MBP durch APC

Zunächst wurde MBP an das Fluorochrom FITC gekoppelt. Anschließend wurden PBMC eines gesunden Spenders zwei Stunden mit dem fluoreszenzmarkierten Protein inkubiert, mit Formal­dehyd fixiert und durchflußzytometrisch analysiert. Als Kontrolle wurden PBMC untersucht, die mit FITC-markiertem Ovalbumin bzw. ohne Antigen inkubiert worden waren.

Ovalbumin ist ein 45 000 Dalton schweres Glykoprotein, das die Hauptkomponente von Hühner­eiweiß darstellt. Es wird von phagozytierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und die Peptidfragmente in MHC-Molekülen präsentiert. Abbildung 4-8 stellt die gemessenen Ergeb­nisse dar: Anhand der auf der Ordinate aufgetragenen seitlichen Lichtstreuung, die die Granularität der Zellen repräsentiert, lassen sich Monozyten von Lymphozyten unterscheiden. Es ist erkennbar, dass die Zellen in der Negativkontrolle die Autofluoreszenz im ersten Fluores­zenzkanal (FL1) nicht überschreiten, während in den mit Ovalbumin-FITC bzw. MBP-FITC inkubierten Proben die Monozyten eine erhöhte Fluoreszenz aufweisen.


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Abbildung 4-8: Nachweis der MBP-Aufnahme durch APC des peripheren Blutes. MBP bzw. Ovalbumin wurden an den Fluoreszenzfarbstoff FITC gekoppelt und anschließend zur zweistündigen Stimulation von PBMC verwendet. Durch die seitliche Lichtstreuung (y-Achse) lassen sich Monozyten anhand ihrer höheren Granularität von Lymphozyten unterscheiden. Die Monozytenpopulation zeigt nach Inkubation mit FITC-markiertem MBP bzw. Ovalbumin eine deutlich erhöhte Fluoreszenz im ersten Fluoreszenzkanal.

4.4.2 Restimulation einer MBP-spezifischen T-Zelllinie

Während der in 4.4.1 beschriebene Versuch nur die MBP-Aufnahme durch antigenpräsen­tierende Zellen untersucht, besteht die Möglichkeit, auch die Prozessierung und Präsentation von MBP in MHC-Klasse-II-Molekülen nachzuweisen. Hierzu wurde eine MBP-spezifische T-Zell­linie, die aus einer gesunden Spenderin gewonnen worden war, mit MBP restimuliert. Als antigenpräsentierende Zellen (APC) wurden autologe, mit Carboxyfluorescein Diacetat-Succi­nimidyl Ester (CFDA-SE) fluoreszenzmarkierte PBMC zugegeben. Die MBP-spezifischen T-Zellen können MBP nur erkennen und dadurch zur Zytokinproduktion angeregt werden, wenn das Protein zuvor von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und präsentiert wurde. Nach sechs Stunden Inkubationszeit mit Zugabe von Brefeldin A nach zwei Stunden wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD4, CD69 und IFNγ gefärbt. Die Analysefenster in Abbildung 4-9 beschränken sich auf die Zellen der T-Zelllinie, die nicht mit CFDA-SE markiert waren. Gezeigt sind die IFNγ- und CD69-Expression in der Negativkontrolle, der Stimulation mit MBP und der Positivkontrolle (Stimulation mit dem Mitogen PMA-Ionomycin). Nach MBP-Stimulation exprimierten nahezu alle Zellen den Aktivierungsmarker CD69, 32,28% exprimierten IFNγ.


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Abbildung 4-9: Restimulation einer MBP-spezifischen CD4 + -Zelllinie. Autologe PBMC wurden mit CFDA markiert und als APC zur sechsstündigen Stimulation einer MBP-spezifischen T-Zelllinie mit MBP zugegeben. Brefeldin A wurde nach zwei Stunden hinzugefügt. Nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden die Oberflächenantigene CD4 und CD69 sowie intrazellulär IFNγ gefärbt. Gezeigt sind die CFDA- Zellen der T-Zelllinie, dargestellt sind in der Negativkontrolle und nach MBP-Stimulation die CD4+-Zellen, nach PMA-Ionomycin-Stimulation wurden aufgrund der CD4-Downregulation die CD8- Zellen analysiert. Nach MBP-Stimulation exprimierten 32,28% der Zellen IFNγ, fast alle der T-Helferzellen sind jedoch aktiviert (CD69+).

4.4.3 Bestimmung der optimalen Stimulationskonzentration von MBP

Durch Titration der MBP-Konzentration bei der Stimulation der MBP-spezifischen T-Zelllinie wurde die optimale Stimulationskonzentration ermittelt. Getestet wurden die Konzentrationen 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml und 200 μg/ml. Bei einer Konzentration von 50 μg/ml wurde die höchste Frequenz zytokinbildender T-Helferzellen erreicht (Abb. 4-10).


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Abbildung 4-10: Titration der optimalen Stimulationskonzentration von MBP. Eine MBP-spezifische CD4+-Zelllinie wurde mit verschiedenen MBP-Konzentrationen restimuliert. Eine maximale Frequenz IFNγ-exprimierender T-Helferzellen fand sich bei einer Konzentration von 50μg/ml.

4.5 Vergleich der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten T-Helferzellen bei gesunden Probanden und MS-Patienten

Es wurden Vollblutproben von 25 gesunden Probanden und 34 MS-Patienten mit den Antigenen TT, CMV und MBP stimuliert. Als Positivkontrolle wurde je eine Probe mit dem bakte­riellen Superantigen Staphylococcus Enterotoxin B (SEB) stimuliert, das T-Zellen polyklonal durch direkte Bindung an die Vβ-Kette des TCR und MHC-Klasse-II-Moleküle der APC akti­viert. Alle der untersuchten Personen zeigten nach SEB-Stimulation reaktive zytokin­exprimierende T-Helferzellen.

Nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden auf der Zelloberfläche CD4 und der Aktivierungsmarker CD69 sowie intrazellulär die Zytokine IFNγ und TNFα angefärbt. Ausge­wertet wurden die Frequenzen der aktivierten IFNγ- bzw. TNFα-bildenden CD4+-Zellen. Bei Mehrfachuntersuchungen von Proben einer Person zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden die [Seite 48↓]arithmetischen Mittelwerte dieser Messungen als Einzelwert in die statistische Auswertung ein­bezogen.

4.5.1 Untersuchte gesunde Probanden

Es wurden 25 gesunde Probanden im Alter von 24 bis 41 Jahren mit einem mittleren Alter von 32,11 Jahren untersucht. Elf der Probanden waren weiblich, 14 männlich.

4.5.1.1 Mittels Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen konnten bei Gesunden TT- und CMV-reaktive T-Helferzellen detektiert werden, nicht jedoch MBP-spezifische CD4+-Zellen.

Untersucht wurden bei allen Probanden die Frequenzen der aktivierten IFNγ- bzw. TNFα-exprimierenden Zellen nach Stimulation mit den verschiedenen Antigenen. In Tabelle 4-4 sind die Medianwerte der Frequenzen zytokinexprimierender CD4+-Zellen sowie die jeweils dazugehörige Standard­abweichung dargestellt. Als Lagemaß wurde der Medianwert bestimmt, um Ausreißer weniger stark in die Bewertung einzubeziehen.

Tabelle 4-4.4: Ergebnisse der intrazellulären Zytokinfärbung nach Antigenstimulation bei 25 untersuchten gesunden Probanden. Angegeben sind die Anzahl der Probanden, bei denen antigenreaktive T-Helferzellen detektiert wurden, sowie die Medianwerte +/- Standardabweichungen der Frequenzen zytokin­exprimierender CD4+-Zellen. Diese sind sowohl für die Gesamtheit der Proben angegeben, als auch für diejenigen Proben, bei denen antigenspezifische CD4+-Zellen nachgewiesen wurden.

 

Negativ­kontrolle

TT

CMV

MBP

Anzahl antigenreaktiver Proben/ Anzahl der untersuchten Probanden

0/25

24/25

11/24

0/25

Frequenz IFN γ + CD69 +

gesamt

0,00%

+/- 0,00%

0,03%

+/- 0,07%

0,01%

+/- 0,41%

0,00%

+/- 0,00%

antigenreaktive Proben

 

0,04%

+/- 0,07%

0,43%

+/- 0,46%

 

Frequenz TNF α + CD69 +

gesamt

0,01%

+/- 0,01%

0,14%

+/- 0,17%

0,03%

+/- 0,44%

0,01%

+/- 0,01%

antigenreaktive Proben

 

0,15%

+/- 0,17%

0,45%

+/- 0,48%

 

Es sollen hier beispielhaft die Punktdiagramme der durchflußzytometrischen Messungen von Vollblutproben eines gesunden Probanden nach Stimulation mit den verschiedenen Antigenen gezeigt werden (Abb. 4-11).


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Abbildung 4-11: Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen bei einem gesunden Probanden. Vollblut wurde sechs Stunden mit den Antigenen TT, CMV und MBP stimuliert. Brefeldin A wurde nach zwei Stunden zugegeben. Nach Erythrozytenlyse, Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden auf der Oberfläche die Antigene CD4 und CD69 gefärbt, intrazellulär die Zytokine IFNγ und TNFα. Die hier dargestellten Punktdiagramme beschränken sich auf CD4+-Lymphozyten.


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4.5.2  Untersuchte MS-Patienten

Insgesamt wurden Blutproben von 34 Multiple Sklerose Patienten mit gesicherter Diagnose gemäß der Poser-Kriterien (Poser et al., 1983) untersucht. Das Alter der Patienten betrug im Mittel 35,82 Jahre, der jüngste Patient war zum Zeitpunkt der Blutentnahme 20, der älteste 59 Jahre alt. 25 der Patienten waren weiblich, neun männlich. Die klinischen Charakteristika der Patienten sind in Tabelle 4-5 dargestellt.

Tabelle 4-5: Klinische Charakteristika der 34 untersuchten MS-Patienten.

 

30 stabil

4 im Schub

Verlaufsform der MS

29 Rezidivierend Remittierende MS (RRMS)

3 Sekundär Progressive MS (SPMS)

2 Primär Progressive MS (PPMS)

Dauer der Erkrankung
(Erstmanifestation vor ... Jahren)

Arithmetisches Mittel = 4,85 Jahre

Standardabweichung = 5,66 Jahre

Aktivität der Erkrankung
(Anzahl der Schübe in den letzten 2 Jahren)

Arithmetisches Mittel = 1,88

Standardabweichung = 1,14

Ausmaß der MS-bedingten Behinderung:
Expanded disability status scale (EDSS)
(Kurtzke, 1983)

Arithmetisches Mittel = 2,01

Standardabweichung = 1,71

Medikation

18 Keine Medikation

9 Interferonβ-Präparat

2 Copolymer I

5 Immunsuppressive Therapie

4.5.2.1 Auch bei MS-Patienten waren mittels Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen keine MBP-spezifischen CD4+-Zellen nachweisbar, während TT- und CMV-reaktive T-Helferzellen detektiert wurden.

Analog zur Verfahrensweise bei den gesunden Probanden wurden auch bei MS-Patienten die Frequenzen der zytokinexprimierenden T-Helferzellen nach Antigenstimulation untersucht. In Tabelle 4-6 sind die Medianwerte und die Standardabweichungen der Frequenzen zytokin­bildender Zellen angegeben.

Tabelle 4-6: Ergebnisse der intrazellulären Zytokinfärbung nach Antigenstimulation bei 34 untersuchten MS-Patienten. Angegeben sind die Anzahl der Patienten, bei denen antigenreaktive T-Helferzellen detektiert wurden, sowie die Medianwerte und +/- Standardabweichungen der Frequenzen zytokinexprimierender CD4+-Zellen. Diese sind sowohl für die Gesamtheit der Proben angegeben, als auch für diejenigen Proben, bei denen antigenspezifische CD4+-Zellen nachgewiesen wurden.

 

Negativ-

kontrolle

TT

CMV

MBP

Anzahl antigenreaktiver Proben/ Anzahl der untersuchten Probanden

0/34

28/34

16/31

0/33

Frequenz IFN γ + CD69 +

gesamt

0,00%

+/- 0,00%

0,02%

+/- 0,03%

0,01%

+/- 0,21%

0,00%

+/- 0,00%

antigenreaktive Proben

 

0,03%

+/- 0,04%

0,30%

+/- 0,21%

 

Frequenz TNF α + CD69 +

gesamt

0,01%

+/- 0,01%

0,10%

+/- 0,09%

0,02%

+/- 0,24%

0,01%

+/- 0,01%

antigenreaktive Proben

 

0,14%

+/- 0,09%

0,37%

+/- 0,24%

 

Beispielhaft seien hier die Punktdiagramme der durchflußzytometrischen Messungen von Blut­proben eines MS-Patienten nach Stimulation mit den verschiedenen Antigenen gezeigt (Abb. 4-12).


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Abbildung. 4-12: Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen bei einem MS-Patienten. Vollblut wurde sechs Stunden mit den Antigenen TT, CMV und MBP stimuliert. Brefeldin A wurde nach zwei Stunden zugegeben. Nach Erythro­zytenlyse, Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden auf der Oberfläche die Antigene CD4 und CD69 gefärbt, intrazellulär die Zytokine IFNγ und TNFα. Die hier dargestellten Punktdiagramme beschränken sich auf CD4+-Lymphozyten.


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4.5.3  Statistischer Vergleich der antigenspezifischen T-Helferzellantwort auf verschiedene Antigene bei Gesunden und MS-Patienten

4.5.3.1 Die Zytokinantwort auf die Antigene TT, CMV und MBP unterscheidet sich nicht zwischen MS-Patienten und Gesunden.

Die erste Fragestellung bezog sich auf den Vergleich der Analyse antigenreaktiver Zytokin­expression in fixierten Zellen nach Antigenstimulation bei allen untersuchten Gesunden und allen MS-Patienten. Der Chi-Quadrat-Test ergab keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Anteils der gesunden Probanden bzw. Patienten, bei denen antigenreaktive Zellen gegen TT, CMV und MBP nachgewiesen werden konnten (p>0,05). Mit dem Mann-Whitney-Test wurden die Frequenzen der zytokinexprimierenden Zellen nach Stimulation mit den Antigenen TT, CMV und MBP verglichen. Es wurde kein Unterschied der detektierten Frequenzen zytokin­exprimierender CD4+-Zellen zwischen gesunden Probanden und MS-Patienten gefunden (p>0,05).

4.5.3.2 Klinische Subgruppen der MS-Patienten weisen statistische Unterschiede in der T-Helfer­zellantwort auf die Antigene TT und CMV auf.

Anschließend wurde die Gruppe der MS-Patienten anhand der in Tabelle 4-5 aufgeführten klini­schen Charakteristika weiter unterteilt. Die Subgruppierungen anhand der Parameter Krankheitsaktivität, Krankheitsdauer und EDSS-Wert ergaben keine signifikanten Unterschiede dieser Subgruppen zur Gruppe der gesunden Probanden.

Patienten mit chronisch progressiven MS-Formen (SPMS, PPMS) zeigten im Vergleich zu Gesunden bzw. RRMS-Patienten geringere Frequenzen zytokinexprimierender Zellen nach TT-Stimulation. Bei Patienten mit sekundär progredienter MS wurden tendenziell weniger TT-reak­tive IFNγ-bildende CD4+-Zellen nachgewiesen (p=0,042) als bei Gesunden. Bei PPMS-Patienten fanden sich tendenziell weniger IFNγ- und signifikant weniger TNFα-exprimierende Zellen als bei Gesunden (p=0,011 bzw. p=0,006). Ebenso zeigten PPMS-Patienten tendenziell geringere Frequenzen TT-reaktiver TNFα-exprimierender T-Helferzellen als RRMS-Patienten (p=0,017). Bei immunsupprimierten MS-Patienten wurden signifikant geringere Frequenzen zytokin­bildender T-Helferzellen nach TT-Stimulation nachgewiesen als bei gesunden Probanden (IFNγ: p=0,001; TNFα: p=0,004).

Die Frequenz zytokinbildender T-Helferzellen nach CMV-Stimulation war bei MS-Patienten im Schub tendenziell höher als bei Patienten in Remission (IFNγ: p=0,024; TNFα: p=0,033).


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4.6  Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen mit dem IFNγ-Sekretionsassay

Nachdem mittels der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen keine MBP-reaktiven T-Helferzellen bei MS-Patienten und Gesunden nachgewiesen werden konnten, wurde der sensitivere IFNγ-Sekretionsassay eingesetzt, um bei MS-Patienten autoreaktive Zellen zu detektieren. Dazu wurden jeweils mindestens 1x107 PBMC eines MS-Patienten mit MBP stimu­liert und ebenso viele Zellen als Negativkontrolle ohne Antigen inkubiert. Das entspricht ca. der zehnfachen Menge an Zellen, wie sie in einem Milliliter Vollblut vorliegen, der zur Stimulation für die Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen verwendet wird. Bei der Hälfte der Patienten war aus vorherigen intrazellulären Färbungen das Vorliegen TT-spezifischer T-Helferzellen bekannt, so dass zusätzlich als Positivkontrolle eine Probe mit TT stimuliert wurde.

4.6.1 Untersuchte MS-Patienten

Insgesamt wurden acht MS Patienten untersucht, sechs waren weiblich, zwei männlich. Der jüngste Patient war zum Zeitpunkt der Untersuchung 22, der älteste 51 Jahre alt, das Durch­schnittsalter betrug 36,14 Jahre. Tabelle 4-7 zeigt die klinischen Charakteristika.

Tabelle 4-7: Klinische Charakteristika der Patienten, die mit dem IFNγ-Sekretionsassay untersucht wurden.

Schub zum Zeitpunkt der Blutentnahme

6 stabil,

2 im Schub

Verlaufsform der MS

8 Rezidivierend Remittierende MS (RRMS)

Dauer der Erkrankung
(Erstmanifestation vor ... Jahren)

Arithmetisches Mittel = 3,56 Jahre

Standardabweichung = 2,73 Jahre

Aktivität der Erkrankung
(Anzahl der Schübe in den letzten 2 Jahren)

Arithmetisches Mittel = 2,13

Standardabweichung = 0,93

Expanded disability status scale (EDSS)
(Kurtzke JF, 1983)

Arithmetisches Mittel = 2,06

Standardabweichung = 1,07

Medikation

4 Keine Medikation

3 Interferonβ-Präparat

1 Immunsuppressive Therapie

Die Zellzahl pro Stimulationsansatz reichte von 1,17x107 bis 3x107 PBMC.


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4.6.2  Nachweis geringer Frequenzen MBP-spezifischer T-Helferzellen

Es wurde für alle antigenstimulierten Proben der Stimulationsindex (SI) berechnet. Dieser errechnet sich aus den nach Antigenstimulation angereicherten CD4+CD69+IFNγ+-Zellen geteilt durch die in der Negativkontrolle angereicherten Zellen. Wie in Kapitel 4.2.3 beschrieben, beschränkte sich die Berechnung auf diejenigen Proben, bei denen die Zahl der angereicherten Zellen über 20 lag. In Tabelle 4-8 sind alle berechneten Stimulationsindizes dargestellt.

Tabelle 4-8: Ergebnisse des IFNγ-Sekretionsassays: Anzahl der angereicherten Zellen und Stimulations­indizes.

 

Negativkontrolle

MBP-Stimulation

TT-Stimulation

angereicherte Zellen

angereicherte Zellen

SI

angereicherte Zellen

SI

Patient 1

5

15

   

Patient 2

27

24

0,89

  

Patient 3

27

42

1,56

1084

40,15

Patient 4

9

6

   

Patient 5

2

9

   

Patient 6

21

48

2,29

4202

200,10

Patient 7

40

174

4,35

258

6,45

Patient 8

24

36

1,50

272

11,33

Bei sieben der acht Patienten konnten keine MBP-spezifischen T-Helferzellen nachgewiesen werden, während bei Patientin 7 MBP-reaktive IFNγ-sezernierende CD4+-Zellen gezeigt werden konnten. Diese Patientin war zum Zeitpunkt der Blutentnahme 34 Jahre alt und befand sich nicht im Schub. Die RRMS war bei ihr vor drei Jahren diagnostiziert worden, sie hatte in den letzten zwei Jahren zwei Schübe gehabt und wurde mit IFNβ therapiert. Bei dieser Patientin waren pro Ansatz 3x107 PBMC stimuliert worden. Geht man davon aus, dass etwa 27% dieser Zellen letztlich in der Analyse rückgewonnen wurden (vgl. Kap. 4.2.2), so errechnet sich eine Ausgangsfrequenz von ca. 2,15x10-5 MBP-spezifischen T-Helferzellen in PBMC.

Bei allen vier Patienten, bei denen schon zuvor TT-spezifische T-Helferzellen mit Hilfe der intrazellulären Zytokinfärbung nachgewiesen worden waren, konnten diese auch im IFNγ-Sekretionsassay und anschließender magnetischer Anreicherung detektiert werden.


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Um zu demonstrieren, inwieweit die Ergebnisse des IFNγ-Sekretionsassays die der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen widerspiegeln, sollen hier die Daten zweier Patienten gezeigt werden.

In Abbildung 4-13 sind die Daten der einzigen Patientin, bei der MBP-spezifische Th1-Zellen detektiert wurden, gezeigt. Die intrazelluläre Färbung zeigte nach MBP-Stimulation zwar erhöhte Frequenzen IFNγ- und TNFα-exprimierender Zellen, die jedoch unterhalb des „Cut-off point“ lagen. Nach magnetischer Anreicherung hingegen war eine MBP-spezifische Population klar abgrenzbar. Nach TT-Stimulation wurden mit der intrazellulären Färbung TNFα-exprimie­rende Zellen gezeigt. Diese wurden als antigenspezifisch bewertet, da die Differenz der Frequenz zur Negativkontrolle mehr als 0,02% betrug. Obwohl mit der intrazellulären Färbung keine IFNγ-exprimierenden Zellen nachgewiesen werden konnten, waren diese Zellen nach magnetischer Anreicherung detektierbar.


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Abbildung 4-13: Vergleich der intrazellulären Zytokinfärbung mit dem IFN γ -Sekretionsassay mit nach­folgender magnetischer Anreicherung nach sechs­stündiger Stimulation mit den Antigenen MBP und TT bei einer MS-Patientin. Für die intrazelluläre Zytokinfärbung wurde 1 ml Vollblut je Ansatz stimuliert, für den Sekretionsassay 3x107 PBMC je Ansatz. Darge­stellt sind alle CD4+-Lymphozyten. Mit der intrazellulären Zytokinfärbung konnten keine MBP-spezifischen T-Helferzellen nachgewiesen werden, während diese mit dem IFNγ-Sekretionsassay und nachfolgender magnetischer Anreicherung gezeigt werden konnten. Als Positivkontrolle konnten sowohl mit der intrazellulären Zytokinfärbung als auch mit dem IFNγ-Sekretionsassay TT-spezifische CD4+-Zellen geringer Frequenzen detektiert werden.

Abbildung 4-14 zeigt die Daten einer immunsupprimierten Patientin, bei der weder mit der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen, noch im IFNγ-Sekretionsassay MBP-spezifische T-Helferzellen nachgewiesen werden konnten. Bei dieser Patientin wurden nach TT-Stimulation sowohl in der intrazellulären Färbung als auch im IFNγ-Sekretionsassay antigenspezifische Zellen detektiert. Auch hier konnte durch die Anreicherung nach dem [Seite 58↓]Sekretionsassay eine Population IFNγ-exprimierender antigenspezifischer Zellen sichtbar gemacht werden, deren Frequenz unterhalb der Sensitivitätsgrenze der Analyse antigenreaktiver IFNγ-Expression in fixierten Zellen lag.

Abbildung 4 -14: Vergleich der intrazellulären Zytokinfärbung mit dem IFN γ -Sekretionsassay mit nach­folgender magnetischer Anreicherung nach sechsstündiger Stimulation mit den Antigenen MBP und TT bei einer MS-Patientin. Für die intrazelluläre Zytokinfärbung wurde 1 ml Vollblut je Ansatz stimuliert, für den Sekretionsassay 1,2x107 PBMC je Ansatz. Dargestellt sind CD4+-Lymphozyten. Nach MBP-Stimulation konnten keine antigenspezifischen T-Helferzellen nachgewiesen werden, während als Positivkontrolle TT-spezifische CD4+-Zellen sowohl mit der intrazellulären Zytokinfärbung als auch mit dem IFNγ-Sekretionsassay und nachfolgender magnetischer Anreicherung nachgewiesen werden konnten.


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4.7  Untersuchung von Liquorzellen

In den bisher beschriebenen Versuchen wurden Zellen des peripheren Blutes von MS-Patienten und gesunden Probanden untersucht. Es stellte sich jedoch die Frage, ob Zellen, die für die Pathogenese der Multiplen Sklerose relevant sein können, nicht in viel höheren Frequenzen „am Ort des Geschehens“, d.h. im ZNS bzw. im das ZNS umgebenden Liquor cerebrospinalis, vor­liegen. Im Folgenden wurden deshalb Zellen aus dem Liquor von MS-Patienten untersucht.

Durch Lumbalpunktion wurden je 10 ml Liquor von MS-Patienten gewonnen, aus denen zwischen 1,1x104 und 1,5x105 Liquorzellen isoliert werden konnten. Zeitgleich wurden autologe PBMC isoliert und mit CFDA-SE fluoreszenzmarkiert. Die Liquorzellen wurden zu den PBMC zugegeben und mit MBP stimuliert. Als Positivkontrolle wurde ein Ansatz mit dem Superantigen SEB stimuliert, das T-Zellen polyklonal durch Quervernetzung von TCR und MHC-Molekülen stimuliert. Nach SEB-Stimulation ist eine Frequenz von etwa 1% aktivierten T-Helferzellen zu erwarten. Als Negativkontrolle wurde ein Ansatz ohne Antigen inkubiert, sowie PBMC ohne Zugabe von Liquorzellen stimuliert. Nach anschließender Fixierung und Permeabilisierung wurden die Oberflächenantigene CD4 und CD69 gefärbt, sowie intrazellulär das Zytokin IFNγ.

Untersucht wurden drei Patienten und eine Kontrollperson mit einer anderen neurologischen Erkrankung. Tabelle 4-9 zeigt die klinischen Charakteristika.

Tabelle 4-9: Klinische Charakteristika der untersuchten Patienten.

 

Patient 1

Patient 2

Patient 3

Kontrolle 1

Geschlecht

weiblich

männlich

weiblich

weiblich

Alter [Jahre]

37

26

28

35

Schub zum Zeitpunkt der Blutentnahme

nein

ja

ja

-

Erstmanifestation vor ... Jahren

3 Jahre

1 Woche

2 Wochen

-

Anzahl der Schübe
in den letzten 2 Jahren

2

1

1

-

Expanded disability status scale (EDSS)

2,0

1,0

1,0

-

Medikation

keine

keine

keine

keine

Bei allen drei Patienten konnten nach SEB-Stimulation CD69+IFNγ+CD4+-Zellen nachgewiesen werden. Auffällig war eine durchschnittlich ca. vierfach erhöhte Frequenz an IFNγ-exprimierenden CD4+-Zellen in Liquorzellen im Vergleich zu PBMC. Bei keinem der [Seite 60↓]untersuchten Patienten konnten nach Stimulation der Liquorzellen mit MBP IFNγ+CD69+CD4+-Zellen nachgewiesen werden.

Abbildung 4-15 zeigt exemplarisch die Ergebnisse von Patientin 3.

Abbildung 4-15: Stimulation von Liquorzellen einer MS-Patientin mit den Antigenen SEB und MBP. Aus 10 ml Liquor wurden Zellen isoliert und in Anwesenheit von autologen, CFDA-markierten PBMC sechs Stunden mit Antigen stimuliert, wobei nach zwei Stunden Brefeldin A zugegeben wurde. Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und die Oberflächenmoleküle CD4 und CD69, sowie intrazellulär IFNγ gefärbt. Die hier gezeigten Punktdiagramme beschränken sich in der oberen Reihe auf CD4+ CFDA--Liquorzellen, in der unteren Reihe auf CD4+ CFDA+-Zellen des peripheren Blutes Nach Stimulation mit SEB exprimierten im Liquor 2,79% der CD4+-Zellen IFNγ, während nur 0,63% der CD4+-Zellen des peripheren Blutes das Zytokin exprimierten. Nach MBP-Stimulation konnten keine aktivierten IFNγ-exprimierenden CD4+-Zellen detektiert werden.


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08.01.2004