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Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, erstmals MBP-reaktive T-Helferzellen bei MS-Patienten und Gesunden direkt nachzuweisen. Zellen des peripheren Blutes bzw. Liquorzellen wurden sechs Stunden durch Antigenzugabe stimuliert. Man macht sich dabei zunutze, dass von außen zugegebenes Antigen von antigenpräsentierenden Zellen (APC) des peripheren Blutes innerhalb weniger Stunden effektiv aufgenommen, prozessiert und als Peptidfragmente überwiegend in MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert wird. Die Antigenspezifität von T-Helferzellen wurde anhand reaktiver Zytokinexpression nachgewiesen. Es wurden zwei ver­schiedene Methoden zum Nachweis von Zytokinexpression nach Antigenstimulation benutzt, die unterschiedliche Sensiti­vitäten aufwiesen. Die erste Methode, die intrazelluläre Zytokinfärbung, erfordert die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen. Bei der zweiten Methode dagegen, dem IFNγ-Sekretions­assay, wird sezerniertes Zytokin mit Hilfe einer Fangmatrix auf der Zell­oberfläche gebunden. Die Zellen müssen dafür nicht fixiert werden und können anschließend magnetisch angereichert werden.

5.1 Optimierung der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen mittels intrazellulärer Färbung

Die Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen wurde als Methode zur Detektion antigenspezifischer T-Helferzellen in den letzten Jahren ausführlich etabliert. Waldrop et al. zeigten 1997 die Abhängigkeit der T-Zellaktivierung von der Peptidpräsentation in MHC-Klasse-II-Molekülen, sowie die Zugehörigkeit der zytokinexprimierenden T-Zellen zum Gedächtnispool (CD45RO+). Die Korrelation der Ergebnisse der intrazellulären Zytokinfärbung mit der Seroreaktivität wurde 1998 von Suni et al. demonstriert. Nomura et al. untersuchten 2000 die Kinetiken der Expression verschiedener Zytokine und bestätigten die optimale Stimulationszeit von sechs Stunden. Bisher wurden mit dieser Methode T-Helferzellen untersucht, die für virale Antigene (CMV) spezifisch sind. Die Frequenzen dieser Zellen beliefen sich auf 10-4 bis 10-3 in PBMC (Waldrop et al., 1997), während die zu erwartenden Frequenzen autoreaktiver Zellen mit ca. 10-4 bis 10-5 in PBMC weit geringer sind (Eming et al., 2000). Die entscheidende Frage ist also, ob mit der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen nach sechsstündiger Antigenstimulation auch niederfrequente autoantigenspezifische Zellen nachweisbar sind. Es wurden zunächst einige ausgewählte Aspekte dieser Methode näher untersucht.


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Die Stimulation von Vollblut ergab verglichen mit der Stimulation von PBMC höhere Frequen­zen zytokinexprimierender Zellen. Dies steht in Einklang mit Ergebnissen von Waldrop et al. 1997 und ist ein Hinweis dafür, dass die T-Zellstimulation durch viele im weitesten Sinne kosti­mulatorische Signale reguliert und verstärkt wird, bei denen auch Serumbestandteile eine Rolle spielen könnten. Die erhöhte Zytokinexpression in der Negativkontrolle weist auf eine unspezi­fische Stimulation während der PBMC-Aufarbeitung hin und ist ein weiteres Argument für die Verwendung von Vollblut. Dies unterstützt die Vorstellung, mit der Vollblutstimulation durch direkten Nachweis antigenspezifischer Zellen möglichst nahe an den Verhält­nissen zu bleiben und die Manipulationen so gering als möglich zu halten.

Des weiteren wurden aus Mehrfachmessungen die Variabilitätskoeffizienten als Maß der „Intra Assay Variabilität“ bestimmt. Die Ergebnisse von 5 bis 8,5% weisen auf eine sehr gute Repro­duzierbarkeit der Methode hin und stimmen ebenfalls mit den Literaturangaben (Waldrop et al., 1997; Nomura et al. 2000) überein.

In allen für diese Arbeit verwendeten Experimenten wurde eine Mindestzellzahl von 100 000 CD4+-Zellen analysiert, wobei die durchschnittlich untersuchten Zahlen bei 200 000 CD4+-Zellen lagen. Dies entspricht in etwa dem doppelten der in der Literatur (Waldrop et al., 1997; Nomura et al. 2000) angegebenen Mindestzellzahlen. Die Untersuchung einer hohen Anzahl von Zellen ist jedoch gerade bei den zu erwartenden sehr geringen Frequenzen autoreaktiver Zellen von großer Bedeutung.

In einer Verlaufsanalyse wurden die Schwankungen der T-Zellantwort auf verschiedene Anti­gene zu unterschiedlichen Zeitpunkten untersucht. Innerhalb von zwei Monaten wurden Abweichungen von bis zu 50% des Mittelwertes gemessen. Es zeigte sich die Tendenz, dass sich die Zytokinexpression als Antwort auf die beiden Antigene TT und CMV bei einem Spender zu den verschiedenen Zeitpunkten jeweils in die gleiche Richtung, d.h. zu höheren oder niedrigeren Frequenzen hin, veränderte. Dies lässt vermuten, dass an einem bestimmten Zeitpunkt eine indi­viduelle Tendenz zu einer mehr oder weniger ausgeprägten Zytokinantwort besteht. Diese könnte auf Veränderungen der T-Zellen selbst oder anderer an der T-Zellaktivierung beteiligter Faktoren, wie zum Beispiel Makrophagen oder Serumkomponenten beruhen. Tageszeitliche Schwankungen können weitgehend ausgeschlossen werden, da die Blutabnahme in einem Zeit­fenster von zwei Stunden erfolgte.


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5.2  Der IFNγ-Sekretionsassay zum Nachweis lebender antigenspezifischer T-Helferzellen

Der IFNγ-Sekretionsassay erlaubt es, reaktive IFNγ-Sekretion in lebenden Zellen nachzuweisen und diese Zellen anschließend anzureichern bzw. zu isolieren. Dies bringt zwei entscheidende Vorteile gegenüber der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen mit sich: Zum einen kann durch die Anreicherung antigenspezifischer Zellen die Sensitivität der Methode erhöht werden. Zum anderen können autoantigenspezifische T-Helferzellen isoliert, weiter charakterisiert und durch Manipulation therapeutisch nutzbar gemacht werden.

Die Detektion niederfrequenter Zellen bedarf der Untersuchung einer großen Zellzahl in der Ausgangslösung, um signifikante Populationen nachweisen zu können. Ohne Anreicherung ist der Grenzwert des untersuchten Materials ca. 1-2 ml Vollblut – für größere Zellmengen ist die durchflußzytometrische Analyse zu aufwendig. Durch die Anreicherung ist es möglich, größere Zellzahlen im Ausgangsmaterial zu untersuchen, da nur ein kleiner Teil der zu Beginn des Expe­rimentes vorhandenen Zellen durchflußzytometrisch analysiert wird. Mit Hilfe des IFNγ-Sekretionsassays konnten je Ansatz ca. 10-20 ml Blut untersucht werden. Der limitierende Fak­tor war hier die Verfügbarkeit relativ großer Mengen Blut von Patienten, die ohnehin durch häufige Blutabnahmen belastet sind.

Brosterhus et al. beschrieben 1999 die gute Reproduzierbarkeit und Spezifität dieser Methode.In dieser Arbeit wurde die optimale Stimulationszeit untersucht. Nach sechs Stunden wiesen IFNγ-sezernierende CD4+-Zellen eine maximale Fluoreszenz auf und bildeten eine klar abgrenzbare Population. Dagegen wurde nach zwölf Stunden eine höhere Frequenz zytokinbildender Zellen erreicht, wobei die Population dieser Zellen nicht mehr so gut abgrenzbar war. Die ebenfalls nach sechs Stunden ansteigende Frequenz CD69-exprimierender Zellen, die kein Zytokin expri­mierten, spricht für eine unspezifische Stimulation von nicht-antigen­spezifischen Zellen. Eine mögliche Erklärung dafür wäre ein verändertes Zytokinmilieu im Stimulationsansatz (Frentsch, DRFZ/AG Thiel, persönliche Mitteilung). Die hier gezeigte Kinetik der IFNγ-Sekretion nach Antigenstimulation stimmt im übrigen mit der von Nomura et al. durch intrazelluläre IFNγ-Färbung ermittelten Kinetik überein (Nomura et al., 2000).

Die Untersuchung des Zellverlustes während des Experimentes ergab, dass ca. 27% der ursprünglich vorhandenen Zellen in der Auswertung rückgewonnen wurden. Der Zell­verlust lässt [Seite 64↓]sich durch die wiederholten Zentrifugationsschritte und Wechsel der Reaktionsgefäße erklären. Geht man davon aus, dass bei jedem Zentrifugationsschritt 10 bis 15% der Zellen verloren gehen, ist das Ergebnis plausibel.

5.3 Sensitivität der verwendeten Methoden

5.3.1 Theoretischer Hintergrund

Die zu erwartenden Frequenzen autoreaktiver Zellen sind gering – sie bewegen sich in Höhe von ca. 10-4 bis 10-5 in PBMC (Eming et al., 2000). In der Durchflußzytometrie ist die Abgrenzung sehr kleiner Populationen von großen Populationen umso exakter möglich, je mehr Parameter zur Auftrennung verfügbar sind. In der eindimensionalen Darstellung eines Histogramms beispielsweise ist die Auftrennung gut möglich, solange die Merkmalsaus­prägungen „positiv“ und „negativ“ klar getrennt sind (Abb. 5-1 A) - bestehen dagegen fließende Übergänge, ist eine klare Abgrenzung nicht mehr möglich (Abb. 5-1 B). Stehen zwei Parameter zur Unterscheidung zweier Populationen zur Verfü­gung, ist die Auftrennung jedoch auch bei unscharfen Grenzen zwischen den Merkmalsausprägungen „positiv“ und „negativ“ möglich (Abb. 5-1 C bzw. D).


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Abbildung 5-1: Die Abgrenzung sehr kleiner Populationen ist umso besser möglich, je mehr Parameter zur Verfügung stehen. Sie ist davon abhängig, wie scharf die Merkmalsausprägungen "positiv" (dunkelgrau) und "negativ" (hellgrau) voneinander trennbar sind. Sind diese klar abgrenzbar, ist eine ein- (A) und auch eine zwei- (C) dimensionale Auftrennung möglich. Gibt es jedoch fließende Übergänge, läßt sich mit Hilfe von zwei Parametern eine kleine Population abgrenzen (D), die in der einparametrischen Auftrennung teilweise in der großen Population verschwindet (B).

Um die zu detektierende Population der antigenspezifischen zytokinexprimierenden Zellen besser abgrenzen zu können, wurde zusätzlich zur Zytokinfärbung der Aktivierungsmarker CD69 auf der Zelloberfläche angefärbt. So wurde eine zweidimensionale Auftrennung erreicht. Beim Sekretionsassay stellt die anschließende magnetische Anreicherung sogar eine dritte Dimension zur Abgrenzung der kleinen antigenspezifischen Population von der großen nicht-spezifischen Population dar. Dies ist der theoretische Hintergrund für eine Erhöhung der Sensiti­vität, die auch experimentell mittels einer Verdünnungsreihe nachgewiesen wurde.


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5.3.2  Bestimmung der Sensitivität mit Hilfe einer Verdünnungsreihe

5.3.2.1 Die Sensitivität der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen mittels intrazellulärer Färbung liegt bei ca. 1x10-4 in PBMC.

Um mit Hilfe der intrazellulären Zytokinfärbung nach Antigenstimulation spezifische T-Helfer­zellen nachweisen zu können, müssen diese von der unstimulierten Negativkontrolle abgrenzbar sein. Mehrfachmessungen dieser Negativkontrolle bei zwei verschiedenen gesunden Spendern zeigten sehr hohe Variabilitätskoeffizienten von fast 100%. Diese hohe relative Schwankung ist durch die Nähe der Messwerte zum Nullpunkt zu erklären. Die absolute Schwankung betrug bei wiederholt durchgeführten Messreihen jedoch immer weniger als 0,02% in CD4+-Zellen. Dieser Wert wurde deshalb als „Cut-off point“ definiert: Nur solche Proben wurden als Nachweis antigen­spezifischer Zellen bewertet, bei denen die Frequenz zytokinexprimierender Zellen um mindestens 0,02% in CD4+-Zellen höher lag als in der Negativkontrolle. Bei einer Mindestzell­zahl von 100 000 analysierten CD4+-Zellen besteht eine antigenspezifische Population somit aus mindestens 20 Zellen, die sich von 0 Zellen in der Negativkontrolle abheben. Mittels einer Verdünnungsreihe wurde schließlich für die Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen eine Sensitivität von 1x10-4 in PBMC bestimmt.

5.3.2.2 Die Sensitivität des IFNγ-Sekretionsassays ist abhängig von der Frequenz IFNγ-exprimie­render Zellen in der Negativkontrolle und beträgt ca. 2x10-5 in PBMC.

Die Sensitivität des IFNγ-Sekretionsassays ist in erster Linie abhängig von der Frequenz IFNγ+CD69+CD4+-Zellen, die in der Negativkontrolle angereichert wurden und von denen sich eine antigenspezifische Population per definitionem durch einen Stimulationsindex größer drei abheben muss. Um unspezifische Stimulation weitestgehend auszuschließen, wurden alle Schritte des Experimentes vor der Sekretionsphase ohne Fremdproteine durchgeführt. Monozyten und tote Zellen werden bei der magnetischen Zellseparation unspezifisch angereichert. Deshalb wurden sie durch Anfärbung von CD14 bzw. Propidiumjodid (PI) aus der Analyse ausge­grenzt. Bei allen untersuchten Patienten und gesunden Probanden fanden sich in den Negativkontrollen Frequenzen IFNγ-sezernierender CD69+CD4+-Zellen von 4,49x10-7 bis 8,32x10-6 in PBMC mit einem arithmetischen Mittelwert von 4,82x10-6. In diese Frequenzen ist die Rückgewinnungsrate von 27% bereits eingerechnet, sie stehen im Einklang mit Angaben von Brosterhus et al., 1999. Die durch die Verdünnungsreihe ermittelte Sensitivität von ca. 2x10-5 entspricht ungefähr dem dreifachen der mittleren Hintergrundaktivierung – d.h. der per definitionem geringsten Frequenz, die gerade detektierbar ist. Da sie von der jeweiligen [Seite 67↓]Zytokinsekretion der unstimulierten Negativkontrolle abhängt, ist diese Sensitivität spender­abhängig. Eine variierende Zytokin- und CD69-Expression unstimulierter Zellen wurde im übrigen auch bei Verwendung der intrazellulären Zytokinfärbung gefunden (Suni et al., 1998).

Der Nachweis sehr seltener Zellen mit Hilfe der magnetischen Zellseparation wurde bereits in einem anderen Kontext eingesetzt: zur Detektion von Tumorzellen im peripheren Blut von Krebspatienten (Martin et al., 1998). In diesem Zusammenhang gab es keine falsch positiven Ereignisse, d.h. Zellen, die das gesuchte Antigen exprimierten, aber keine Krebszellen waren. Die Sensitivität betrug für diese Methode 1x10-6 bis 1x10-8. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, dass die Sensitivität des IFNγ-Sekretionsassays nicht durch die Technik der magnetischen Anreicherung limitiert ist, sondern tatsächlich durch die IFNγ-Sekretion von CD4+-Zellen in der Negativkontrolle begrenzt wird.

5.4 Das Autoantigen MBP kann von APC des peripheren Blutes aufgenommen, prozessiert und präsentiert werden.

Bei der Stimulation von T-Helferzellen macht man sich zunutze, dass von außen zugege­benes Antigen von antigenpräsentierenden Zellen des peripheren Blutes aufgenommen, prozessiert und in MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert wird. Ob dies auch für das Autoantigen MBP zutrifft, sollte hier untersucht werden.

Es wurde zunächst gezeigt, dass ausschließlich Monozyten, die Makrophagen des peripheren Blutes, nach zwei Stunden Inkubation mit FITC-markiertem MBP eine erhöhte Fluoreszenz aufwiesen. Dies zeigt die Aufnahme von MBP durch Monozyten. Im weiteren Verlauf wurde auch die Prozessierung und Präsentation von MBP durch APC des peripheren Blutes gezeigt: Zellen einer MBP-spezifischen CD4+-Zelllinie einer gesunden Spenderin wurden mit MBP restimuliert. Als antigenpräsentierende Zellen wurden autologe fluoreszenzmarkierte PBMC zugegeben und nach sechsstündiger Inkubation wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Reaktive IFNγ-Sekretion der MBP-spezifischen Zellen wurde mittels intrazellulärer Zytokin­färbung nachgewiesen. Nur nach Inkubation der T-Zelllinie in Gegenwart von sowohl PBMC als auch dem Antigen exprimierten MBP-spezifische Zellen IFNγ. Dies zeigt, dass MBP von Zellen des peripheren Blutes aufgenommen und präsentiert wird und dieser Stimulus ausreicht, um innerhalb von sechs Stunden die Expression von IFNγ in einer T-Zelllinie zu induzieren.


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5.5  Analyse IFNγ- und TNFα-exprimierender T-Helferzellen nach Stimulation mit einem Impf- und einem viralen Kontrollantigen

Es wurden Vollblutproben von insgesamt 34 MS-Patienten und 25 gesunden Kontrollpersonen mittels der intrazellulären Zytokinfärbung auf das Vorhandensein antigenspezifischer Th1-Zellen untersucht. Nach Stimulation mit Tetanus Toxoid (TT) bzw. Cytomegalie Virus Antigen (CMV) wurde die reaktive Expression von IFNγ bzw. TNFα in T-Helferzellen nachgewiesen. TT und CMV sind sogenannte „Recall-Antigene“, d.h. Antigene, die mit hoher Wahrscheinlichkeit das Immunsystem der untersuchten Probanden mehrmals stimuliert haben. Man kann also davon ausgehen, dass bei einem großen Teil der untersuchten Personen T-Gedächtniszellen gegen diese Antigene vorliegen. Deshalb wurden sie in dieser Arbeit als Kontrollantigene eingesetzt, um die Fähigkeit der reaktiven Zytokinexpression von T-Helferzellen des peripheren Blutes zwischen MS-Patienten und Gesunden zu vergleichen.

5.5.1 Die T-Helferzellantwort auf die Antigene TT und CMV unterscheidet sich nicht zwischen MS-Patienten und Gesunden.

Sowohl der prozentuale Anteil der Personen, bei denen antigenspezifische Zellen nachweisbar waren, als auch die Frequenzen antigenspezifischer T-Helferzellen wiesen keinerlei statistisch signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Patienten und Gesunden auf. TT-reaktive T-Helferzellen zeigten 96% der gesunden Spender und 82% der MS-Patienten. Diese Differenz war statistisch nicht signifikant. Der hohe prozentuale Anteil der Probanden, bei denen TT-spezi­fische Zellen nachgewiesen werden konnten, ist in Anbetracht der empfohlenen Schutzimpfung nicht erstaunlich. Die detektierten Frequenzen TT-spezifischer CD4+-Zellen stehen in Einklang mit Frequenzangaben aus der Literatur, die durch den Nachweis reaktiver IFNγ-Expression in einem Enzym-Immunoassay (ELISPOT-Assay) ermittelt wurden (Helms et al., 2000). Auch die Antwort auf Stimulation mit CMV zeigte keine statistischen Unterschiede: Bei 52% der MS-Patienten und 46% der Gesunden konnten CMV-spezifische CD4+-Zellen nachgewiesen werden. Dies entspricht Literaturangaben der CMV-Durchseuchungsrate (Brooks et al., 2001). Die ermittelten Frequenzen CMV-spezifischer T-Helferzellen konnten die Ergebnisse einer anderen Arbeitsgruppe (Waldrop et al., 1997) bestätigen.

5.5.2 Klinische Untergruppen der MS-Patienten weisen tendenzielle Unterschiede in der antigenspezifischen T-Helferzellantwort auf.

Bei Patienten mit chronischen MS-Formen (SPMS, n=3 bzw. PPMS, n=2) wurden geringere Frequenzen TT-reaktiver T-Helferzellen nachgewiesen als bei RRMS-Patienten bzw. Gesunden. [Seite 69↓]Wegen der geringen Fallzahlen muss dieses Ergebnis mit Vorsicht bewertet werden. Auffällig ist außerdem, dass die Patienten mit SPMS bzw. PPMS durchschnittlich 10 bis 13 Jahre älter waren als die RRMS-Patienten bzw. Gesunden. Somit ist denkbar, dass dieser Altersunterschied hinsichtlich der Impfungsrate eine Rolle spielt. Des weiteren ist es möglich, dass Befürchtungen impfassoziierter Exazerbationen dazu führen, dass bei MS-Patienten Impfungen weniger häufig durchgeführt wurden, obwohl dies nicht den aktuellen Therapieempfehlungen entspricht (Zipp et al., 2001).

MS-Patienten mit immunsuppressiver Therapie (n=5) zeigten eine statistisch signifikante Verminderung der Frequenz TT-spezifischer T-Helferzellen gegenüber Gesunden. Die Frequenz CMV-spezifischer Zellen unterschied sich hingegen nicht. Aufgrund der geringen Fallzahl ist es schwierig, Aussagen über mögliche kausale Zusammenhänge zu machen. Es ist jedoch auch hier auffällig, dass drei von fünf immunsupprimierten Patienten chronisch progrediente Verlaufs­formen aufwiesen und durchschnittlich älter waren als Gesunde bzw. MS-Patienten mit anderen Medikationen. Es wäre also denkbar, dass die geringere TT-Antwort ein Epiphänomen darstellt und der eigentliche Grund dafür die niedrigere Impfungsrate der immunsupprimierten Patienten ist. Dies erscheint insbesondere plausibel, da sich die CMV-spezifische T-Helferzellantwort nicht von der bei Gesunden unterscheidet.

MS-Patienten im Schub zeigten eine statistische Tendenz zu erhöhten Frequenzen CMV-spezifischer T-Helferzellen im Vergleich zu Patienten in klinischer Remission. Obwohl verschiedene virale Erkrankungen als Kofaktoren oder Auslöser für MS-Schübe diskutiert werden (Sibley et al., 1985), konnte bisher kein Zusammenhang zwischen der CMV-Seroreaktivität und der Krankheitsaktivität MS-Kranker nachgewiesen werden (Simmons, 2001; Myhr et al., 1998).

5.6 MBP-spezifische Th1-Zellen lassen sich im peripheren Blut nicht oder nur in sehr geringen Frequenzen nachweisen.

Bei keiner der untersuchten Blutproben von 33 MS-Patienten und 25 gesunden Kontrollpersonen waren mittels der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen MBP-spezifische Zellen nachweisbar. Eine mögliche Erklärung dafür ist eine unzureichende Sensitivität der Methode. Dies würde bedeuten, dass MBP-spezifische T-Helferzellen in einer geringeren Frequenz als 1x10-4 im peripheren Blut vorliegen. Im weiteren Verlauf wurde Blut [Seite 70↓]von acht MS-Patienten mit dem sensitiveren IFNγ-Sekretionsassay auf MBP-spezifische Zellen untersucht, parallel wurden intrazelluläre Zytokinfärbungen durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde bei denjenigen Patienten, bei denen aus früheren Analysen antigenreaktiver Zytokin­expression in fixierten Zellen das Vorhandensein TT-reaktiver Zellen bekannt war, eine Probe mit TT stimuliert. Die Frequenzen TT-reaktiver CD4+-Zellen der intrazellulären IFNγ-Färbungen stimmten mit den nach dem IFNγ-Sekretionsassay rückgerechneten Frequenzen überein, was die Korrelation der Ergebnisse der beiden Methoden verdeutlicht. Bei einer Patientin konnten mit dem IFNγ-Sekretionsassay MBP-spezifische Zellen gezeigt werden. Der Stimulationsindex betrug 4,35 und die rückgerechnete Frequenz der MBP-spezifischen CD4+-Zellen in PBMC lag mit 2,15x10-5 nahe an der Sensitivitätsgrenze. Bei den anderen untersuchten Patienten waren keine MBP-spezifischen Zellen nachweisbar.

Es ist wahrscheinlich, dass die Frequenzen autoreaktiver Zellen interindividuell eine ebenso hohe Schwankungsbreite zeigen wie die Frequenzen TT- oder CMV-spezifischer Zellen. Es ist dann denkbar, dass die Frequenzen bei den meisten Patienten unterhalb der Sensitivitätsgrenze der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen und auch des IFNγ-Sekretionsassays liegen, während bei einigen Patienten, so bei der hier gezeigten Patientin, MBP-spezifische Zellen in höheren Frequenzen vorliegen und damit nachweisbar sind.

Bisherige Literaturangaben über die Frequenzen MBP-spezifischer CD4+-Zellen beziehen sich vorwiegend auf die Berechnung von Vorläuferfrequenzen aus Limiting Dilution Assays (LDA), d.h. einer Methode, die Proliferation als antigenspezifische T-Zellantwort nachweist (Lodge et al., 1996; Lovett-Racke et al., 1998; Muraro et al., 2000; Tejada-Simon et al., 2000). Die so ermittelten Häufigkeiten sind sehr unterschiedlich, durchschnittlich belaufen sie sich auf Werte im Bereich 10-7 bis 10-5. Daneben gibt es Frequenzberechnungen aus Enzym-Immunoassays (ELISPOT-Assays), die Antigenspezifität anhand reaktiver Zytokinsekretion nach 20 bis 48 Stunden nachwiesen (Söderström et al., 1994; McCutcheon et al., 1997; Hellings et al., 2001). Diese Untersuchungen kamen zu Ergebnissen im Bereich 3 bis 9,5x10-5. Die einzige Detektion MBP-spezi­fischer T-Zellen erfolgte indirekt über den Nachweis TCR-kodierender mRNA und zeigte Frequenzen von 4x10-4 bis 3x10-3 (Bieganowska et al., 1997). Es wurde mRNA nachgewiesen, die bestimmte TCRα- und TCRβ-Ketten kodierte, die zuvor bei MBP-spezifischen T-Zellklonen derselben Patienten gefunden worden waren. Diese Frequenzen sind [Seite 71↓]jedoch nicht repräsentativ, da nur zwei MS-Patienten untersucht wurden, die aufgrund einer hohen Frequenz MBP-reaktiver Zellen im LDA vorselektiert worden waren.

Verschiedene Methoden weisen oft sehr unterschiedliche Frequenzen antigenspezifischer Zellen nach. Es ist mehrfach gezeigt worden, dass Methoden, die auf der Proliferation antigenspezi­fischer Zellen beruhen, geringere Frequenzen spezifischer Zellen aufzeigen als der direkte Nachweis dieser Zellen (Kuzushima et al., 1999; Tan et al., 1999). Eine plausible Erklärung dafür ist der programmierte Zelltod (Apoptose), der auch in reifen T-Zellen durch Stimulation induziert werden kann (Wesselborg et al., 1993; Russell, 1995). Dieser Mechanismus wurde auch an MBP-spezifischen T-Zelllinien von MS-Patienten und Gesunden gezeigt (Pelfrey et al., 1995). Das Ergebnis des direkten Nachweises antigenspezifischer T-Zellen wird von apoptotischem Zelltod nicht beeinflusst.

Es wäre möglich, dass sich autoreaktive T-Zellen des peripheren Blutes in einem anergen Zustand befinden, der eine Induktion der Zytokinexpression nicht zulässt. Diese MBP-spezifischen Zellen ließen sich mit der Tetramerfärbung nachweisen. Diese wäre allerdings in Anbetracht der Vielfalt der in Frage kommenden HLA-Typen sowie mehrerer immundominanter Peptide äußerst aufwendig. Die MHC-Klasse-II-Tetramerfärbung ist noch in Entwicklung und kann noch nicht standardmäßig für solche Untersuchungen eingesetzt werden.

5.7 Auch im Liquor von MS-Patienten sind keine MBP-spezifischen Th1-Zellen nachweisbar.

Frühere Publikationen haben gezeigt, dass die Frequenz myelinspezifischer T-Helferzellen im Liquor von MS-Patienten ca. 100fach höher ist als im peripheren Blut (Olsson et al. (2), 1990; Söderström et al., 1994). Dies gilt neben MBP auch für andere Myelinantigene und erscheint plausibel – ist doch das ZNS der Ort des Geschehens dieser neurologischen Erkrankung. Liquor­untersuchungen spielen in der Erstdiagnostik der MS zum Nachweis intrathekaler IgG-Synthese eine entscheidende Rolle, im weiteren Verlauf der Erkrankung haben sie jedoch keine Bedeutung mehr. Bei Patienten, deren Liquorproben untersucht werden können, handelt es sich also vornehmlich um Patienten mit kurzer Krankheitsdauer. Diese zeitliche Nähe zum Krankheitsausbruch macht es wahrscheinlich, die pathogenetisch verantwortlichen Faktoren tatsächlich nachweisen zu können. Des weiteren nehmen die meisten der Patienten in diesem Stadium noch keine Medikamente, was die Aussagekraft immunologischer Experimente erhöht.


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Für diese Arbeit konnten nur drei MS-Patienten untersucht werden. Dementsprechend können aus den Ergebnissen keine definitiven Aussagen geschlossen werden. Sie können nur Hinweise dafür geben, ob und wie weitere Untersuchungen sinnvoll erscheinen. Bei keinem der drei MS-Patienten wurden IFNγ-exprimierende Zellen nach MBP-Stimulation detektiert. Dies könnte bedeuten, dass die Zellen in einer Frequenz vorliegen, die unterhalb der Nachweisgrenze der verwendeten Methode liegt. Die bei der MS nur mäßig erhöhte Zellzahl im Liquor und die nur sehr begrenzte Verfügbarkeit des Liquors führt dazu, dass insgesamt nur geringe Zellzahlen zur Untersuchung erhältlich sind. Pro Ansatz konnten zwischen 3,7x103 und 5x104 CD4+-Zellen untersucht werden. Definiert man auch hier eine Zellzahl von 20 als Mindestgröße einer Population und geht von einer Rückgewinnungsrate von ca. 50% (Hochrechnung aus je 90% Rückgewinnungs­rate bei insgesamt sechs Zentrigugationsschritten) aus, so läge die Detektionsgrenze bei 1x10-2 bis 8x10-4. Bei einer anderen organspezifischen Autoimmunerkrankung, der Reaktiven Arthritis, wurden in der Synovialflüssigkeit betroffener Gelenke mittels Analyse antigenreaktiver Zytokin­expression in fixierten Zellen bakterienspezifische T-Helferzellen in Frequenzen von ca. 1-2% in CD4+-Zellen nachgewiesen. Auch bei dieser Erkrankung fanden sich im betroffenen Organ, dem Gelenk, bis zu 30% höhere Frequenzen antigenspezifischer Zellen im Vergleich zu peripherem Blut (Thiel et al., 2000). Lägen bei der MS ähnliche Frequenzen autoantigenspezifischer CD4+-Zellen im Liquor vor, so wären sie mit der hier beschriebenen Methode nachweisbar. Es bleibt allerdings zu betonen, dass der Liquor selbst nicht das betroffene Organ darstellt, sondern das ZNS nur umgibt und es somit möglich wäre, dass pathogenetisch relevante Zellen nur im ZNS selbst in höheren Frequenzen zu finden sind. Nach SEB-Stimulation konnten bei allen Patienten Populationen IFNγ-exprimierender Zellen nachgewiesen werden. Dies bedeutet, dass Liquor­zellen, vergleichbar mit Zellen des peripheren Blutes, durch Kurzzeitstimulation zur Zytokinexpression aktivierbar sind – zumindest durch ein bakterielles Superantigen, das T-Zellen polyklonal durch Quervernetzung von TCR und MHC-Molekülen aktiviert. Es ist jedoch nicht bewiesen, dass diese Stimulation auch via Erkennung von Peptiden in Assoziation mit MHC-Molekülen möglich ist. Hierzu müssten zytokinexprimierende Liquorzellen nach Zugabe eines konventionellen Antigens, dessen Peptide in MHC-Molekülen präsentiert werden, nachge­wiesen werden. Die auffällig höheren Frequenzen SEB-reaktiver CD4+-Zellen im Liquor im Vergleich zu PBMC lassen sich durch das selektive Übertreten der Blut-Hirn-Schranke durch aktivierte Lymphozyten und die dadurch unterschiedliche Zusammensetzung der Lymphozyten­population in Liquor und peripherem Blut erklären: Der prozentuale Anteil der Gedächtniszellen an CD4+-[Seite 73↓]Zellen ist im Liquor sowohl bei MS-Patienten als auch bei Gesunden mit ca. 90% fast doppelt so hoch wie im peripheren Blut (Vrethem et al., 1998).

Um wirkliche Aussagen über das Vorhandensein bzw. die Frequenz MBP-spezifischer T-Helfer­zellen im Liquor von MS-Patienten machen zu können, ist es nötig, eine größere Anzahl von Liquorproben zu untersuchen.

5.8 Ausblick

Die Pathogenese der MS ist trotz intensiver Forschung ungeklärt. Neben der in Frage kommenden Myelinantigene gibt es eine Vielzahl anderer im ZNS MS-Kranker exprimierter Moleküle, die als Autoantigene in Frage kommen. Die ausgeprägte interindividuelle Hetero­genität histopathologischer und auch klinischer Merkmale der Erkrankung deuten auf eventuell verschiedenartige zugrunde liegende Pathomechanismen hin. So wäre es möglich, dass für ein bestimmtes Autoantigen spezifische Zellen nur zu einem gewissen Zeitpunkt der Krankheits­entwicklung eine Rolle spielen. Es konnte zum Beispiel der histopathologische Nachweis autoreaktiver Zellen gegen verschiedene Antigene mit dem Alter der MS-Läsionen korreliert werden (Lucchinetti CF et al., 1996). In den letzten Jahren haben sich neue Möglichkeiten zur direkten Detektion niederfrequenter antigenspezifischer Zellen entwickelt. Ein möglicher Ansatz, unbefangen neue Technologien einzusetzen, wäre der Versuch der Detektion auto­reaktiver T-Zellen ohne Vorselektion der in Frage kommenden Autoantigene. Es erscheint sinnvoll, sich nicht auf die in der Literatur bekannten potentiellen Autoantigene zu beschränken, sondern mit neuen Methoden noch einmal einen Schritt weiter vorn zu beginnen: bei der Stimu­lation von T-Zellen aus peripherem Blut bzw. Liquor cerebrospinalis mit humanem ZNS-Homogenat oder Homogenat aus MS-Läsionen.

Die hier verwendeten Methoden zeichnen sich durch eine einfache Durchführung, gute Reprodu­zierbarkeit und Spezifität aus. Sie haben eine Sensitivität von bis zu 2x10-5 in PBMC gezeigt. Die klinische Bedeutung der Detektion MBP-spezifischer T-Helferzellen bei MS-Patienten liegt in der möglichen Anwendung in Diagnostik und Therapie: Seit langer Zeit wird nach einem Marker der Krankheitsaktivität gesucht, der gesundheitsökonomischen Ansprüchen genügt - das heißt, der zuverlässig, einfach und nicht zu kostenaufwendig bestimmbar ist. Daneben bietet die Isolierung MBP-spezifischer T-Helferzellen und deren Manipulation die Möglichkeit zur antigenspezifischen Therapie. So kann die Impfung mit autologen bestrahlten MBP-reaktiven T-[Seite 74↓]Zellen zur selektiven Eliminierung dieser spezifischen Population im peripheren Blut führen (Zhang et al., 2002). Als Wirkmechanismus dieser sogenannten T-Zell-Vakzination wird eine Erkennung spezifischer TCR-Sequenzen durch zytotoxische CD8+-Zellen angenommen. Ein anderer therapeutischer Ansatz stützt sich auf die Hypothese, dass ein Ungleichgewicht zwischen Th1- und Th2-Zellen zur Entstehung der MS führt (vgl. Kap.1.1.3). Nach der Isolierung patho­genetisch verantwortlicher, autoreaktiver Th1-Zellen könnte man deren Zytokinprofil modulieren und die Expression antiinflammatorischer bzw. regulatorischer Zytokine induzieren. Nach adoptivem Zelltransfer könnten sie dann durch ihre Antigenspezifität direkt am Ort des Geschehens protektiv wirken.

Auf der Suche nach einem Marker der Krankheitsaktivität scheinen die hier verwendeten Methoden zunächst nicht geeignet, da die Frequenz MBP-spezifischer T-Helferzellen bei den meisten geringer als 2x10-5 in PBMC zu sein scheint. Es ist jedoch möglich, dass für ein anderes Auto­antigen spezifische T-Zellen in höheren Frequenzen vorliegen. Es bliebe dann weiterhin zu klären, ob die Frequenz solcher Zellen mit der Krankheitsaktivität korreliert oder ob ein anderes Merkmal dieser Zellen erfasst werden kann, das den Verlauf der Erkrankung widerspiegelt.


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08.01.2004