Aus dem Institut für Experimentelle Rheumatologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Direkter ex vivo Nachweis Myelin Basic Protein (MBP)-spezifischer T-Helferzellen bei Multiple Sklerose Patienten

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Barbara Juliane Holzknecht
aus Ostfildern-Ruit

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Andreas Radbruch
2. Prof. Dr. med. Dr. h. c. Thomas Krieg
3. Prof. Dr. med. Angela Gause

Datum der Einreichung: 1. August 2002

Datum der Promotion: 14. Juli 2003

Abstract

In der Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) wird autoantigenspezifischen proinflamma­torischen T-Helferzellen eine entscheidende Rolle zugeschrieben. Das am meisten untersuchte Autoantigen ist das Myelin Basic Protein (MBP). Bisher waren zum Nachweis autoantigen­spezifischer T-Zellen deren Kultur über Tage bis Monate unumgänglich. In dieser Arbeit wurden Methoden zum direkten ex vivo-Nachweis autoreaktiver T-Helferzellen etabliert, die die reaktive Sekretion der proinflammatorischen Zytokine Interferon γ und Tumor Nekrose Faktor α nach sechsstündiger Stimulation nachweisen. Die durchflusszytometrische Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen wies eine Sensitivität von 1x10^-4 in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) auf. Es konnten damit bei 34 untersuchten MS-Patienten und 25 gesunden Kontrollpersonen keine MBP-reaktiven T-Helferzellen detektiert werden, während sich die Reaktion auf die beiden Kontrollantigene Tetanus Toxoid und Cytomegalie Virus-Antigen in den beiden Gruppen nicht relevant unterschied. Deshalb wurde in einer anderen Methode reaktiv sezerniertes Zytokin extrazellulär auf lebenden Zellen gebunden und durch einen anschließenden magnetischen Anreicherungsschritt die Sensitivität auf 2x10^-5 erhöht. Bei einem von acht MS-Patienten wurde so eine Population MBP-spezifischer Zellen mit einer Ausgangsfrequenz von 2,15x10^-5 nachgewiesen. Im Liquor von drei MS-Patienten ließen sich keine MBP-reaktiven proinflammatorischen T-Helferzellen detektieren. Diese Ergebnisse implizieren, dass die Frequenz MBP-spezifischer T-Helferzellen im peripheren Blut und im Liquor der meisten MS-Patienten und Kontrollpersonen geringer ist als die Sensitivität der etablierten Methoden, diese Zellen jedoch bei einigen Patienten in höheren Frequenzen nachgewiesen werden können.

Eigene Schlagworte: Autoimmunität, Basisches Myelinprotein, Multiple Sklerose, Th1-Zellen, Zytokine

Abstract

Autoantigen-specific proinflammatory T-helper cells are assumed to play an important role in the pathogenesis of Multiple Sclerosis (MS). The most extensively studied autoantigen is Myelin Basic Protein (MBP). To detect autoantigen-specific T-cells, so far these had to be cultured for several days or months. In this work methods for the direct ex vivo detection of autoreactive T-helper cells have been established by detecting the reactive secretion of the proinflammatory cytokines Interferon γ and Tumor Necrosis Factor α after six hour stimulation. The flow cytometric analysis of antigen-reactive cytokine expression in fixed cells showed a sensitivity of 1x10^-4 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC). With this method there could not be detected any MBP-reactive T-helper cells in 34 MS-patients and 25 healthy controls, whereas the reaction after stimulation with the two control antigens Tetanus Toxoid and Cytomegalovirus antigen did not differ relevantly between the two groups. Therefore in another method the reactively secreted cytokine was bound on the surface of living cells and the sensitivity was then increased to 2x10^-5 by following magnetic enrichment. With that, there could be detected a population of MBP-specific cells in one of eight MS-patients with a frequency of 2,15x10^-5 in PBMC. There could not be found any MBP-reactive proinflammatory T-helper cells in the cerebrospinal fluid of three MS-patients. Our results suggest that the frequency of MBP-specific T-helper cells in peripheral blood and cerebrospinal fluid is below the employed methods’ detection limit in most MS-patients, but seldom these cells can be detected in higher frequencies.

Keywords: Autoimmunity, Cytokines, Multiple Sclerosis, Myelin Basic Protein, Th1-cells

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Immunologische Grundlagen
    • 1.1.1 Funktionelle Einteilung des Immunsystems:Unspezifische und spezifische, zelluläre und humorale Faktoren
    • 1.1.2 Die Aktivierung von T-Zellen durch Antigene
    • 1.1.3 Zwei Untergruppen von T-Helferzellen und deren klinische Relevanz
  • 1.2 Multiple Sklerose:eine T-zellvermittelte Autoimmunerkrankung?
    • 1.2.1 Klinische Charakteristika
    • 1.2.2 Hinweise aus epidemiologischen Untersuchungen
    • 1.2.3 Indizien für eine Autoimmungenese der Multiplen Sklerose
      • 1.2.3.1 Im Tiermodell lässt sich durch Übertragung autoreaktiver T-Helferzellen ein der MS ähnliches Krankheitsbild induzieren.
      • 1.2.3.2 Multiple Sklerose ist mit bestimmten HLA-Allelen assoziiert.
      • 1.2.3.3 In der Therapie der Multiplen Sklerose kommen immunmodulatorische Medikamente zum Einsatz.
    • 1.2.4 Die Pathogenese der MS ist multifaktoriell –viele zelluläre und humorale Faktoren sind beteiligt.
      • 1.2.4.1 Histologische Charakterisierung der MS-Läsionen im ZNS
      • 1.2.4.2  Charakterisierung der Liquorbefunde von MS-Patienten
      • 1.2.4.3 Charakterisierung der Befunde im peripheren Blut
  • 1.3 Myelin Basic Protein (MBP) als mögliches Autoantigen -Stand der Forschung
  • 1.4 Die Detektion antigenspezifischer T-Zellen
• 2  Herleitung der Aufgabenstellung
• 3  Materialien und Methoden
  • 3.1 Lösungen und Geräte
    • 3.1.1 Puffer und Medien
    • 3.1.2 Einmal-Gefäße und Geräte
  • 3.2  Zellpräparation
    • 3.2.1 Gewinnung von periphervenösem Blut
    • 3.2.2 Isolierung mononukleärer Zellen aus peripherem Blut (PBMC)
    • 3.2.3 Gewinnung von Liquorzellen
    • 3.2.4 Bestimmung der Zellzahl
      • 3.2.4.1 Durchflußzytometrische Zellzählung
  • 3.3 Fluoreszenz als Stoffeigenschaft und deren methodische Nutzung
    • 3.3.1 Fluoreszenzfarbstoffe
    • 3.3.2 Kopplung von Fluorochromen an Proteine
    • 3.3.3 Immunfluoreszenz
  • 3.4  -Stimulation humaner Zellen
    • 3.4.1 Stimulationsbedingungen und -zeiten
    • 3.4.2 Kostimulation mit αCD28-Antikörpern
    • 3.4.3 Verwendete Antigene
    • 3.4.4  Stimulation einer T-Zelllinie bzw. Stimulation von Liquorzellen
    • 3.4.5 Zugabe von Brefeldin A für die intrazelluläre Zytokinfärbung
  • 3.5 Fixierung und intrazelluläre Färbung von Zytokinen
    • 3.5.1 Ablösen der Zellen mit EDTA
    • 3.5.2  Lysierung, Fixierung und Permeabilisierung von Vollblut
    • 3.5.3 Fixierung und Permeabilisierung von PBMC
    • 3.5.4 Extra- und intrazelluläre Färbungvon fixierten und permeabilisierten Zellen
  • 3.6  Technologie der zellulären Affinitätsmatrix:IFNγ-Sekretionsassay
  • 3.7 Magnetische Zellseparation
  • 3.8 Durchflußzytometrie
  • 3.9 Auswertung der durchflußzytometrisch erhaltenen Daten
  • 3.10 Statistische Auswertung
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Etablierung der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen mittels intrazellulärer Färbung
    • 4.1.1 Vergleich der Vollblutstimulation mit der Stimulation von PBMC
    • 4.1.2 „Intra Assay Variabilität“
    • 4.1.3 Definition des „Cut-off point“
    • 4.1.4 Verlaufsanalyse der antigenspezifischen Zytokinantwort
  • 4.2 Etablierung des IFNγ-Sekretionsassays
    • 4.2.1 Kinetik des IFNγ-Sekretionsassays
    • 4.2.2  Bestimmung der Rückgewinnungsrate
    • 4.2.3  Berechnung des Stimulationsindex
  • 4.3 Bestimmung der Sensitivität der verwendeten Methoden
    • 4.3.1 Sensitivität der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpressionin fixierten Zellen nach sechsstündiger Antigenstimulation
    • 4.3.2  Sensitivität des IFNγ-Sekretionsassays mit nachfolgender magnetischer Anreicherung
  • 4.4  Nachweis der Aufnahme, Prozessierung und Präsentation von MBP durch antigenpräsentierende Zellen (APC)
    • 4.4.1 Aufnahme von FITC-markiertem MBP durch APC
    • 4.4.2 Restimulation einer MBP-spezifischen T-Zelllinie
    • 4.4.3 Bestimmung der optimalen Stimulationskonzentration von MBP
  • 4.5 Vergleich der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten T-Helferzellen bei gesunden Probanden und MS-Patienten
    • 4.5.1 Untersuchte gesunde Probanden
      • 4.5.1.1 Mittels Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen konnten bei Gesunden TT- und CMV-reaktive T-Helferzellen detektiert werden, nicht jedoch MBP-spezifische CD4+-Zellen.
    • 4.5.2  Untersuchte MS-Patienten
      • 4.5.2.1 Auch bei MS-Patienten waren mittels Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen keine MBP-spezifischen CD4+-Zellen nachweisbar, während TT- und CMV-reaktive T-Helferzellen detektiert wurden.
    • 4.5.3  Statistischer Vergleich der antigenspezifischen T-Helferzellantwort auf verschiedene Antigene bei Gesunden und MS-Patienten
      • 4.5.3.1 Die Zytokinantwort auf die Antigene TT, CMV und MBP unterscheidet sich nicht zwischen MS-Patienten und Gesunden.
      • 4.5.3.2 Klinische Subgruppen der MS-Patienten weisen statistische Unterschiede in der T-Helfer­zellantwort auf die Antigene TT und CMV auf.
  • 4.6  Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen mit dem IFNγ-Sekretionsassay
    • 4.6.1 Untersuchte MS-Patienten
    • 4.6.2  Nachweis geringer Frequenzen MBP-spezifischer T-Helferzellen
  • 4.7  Untersuchung von Liquorzellen
• 5  Diskussion
  • 5.1 Optimierung der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen mittels intrazellulärer Färbung
  • 5.2  Der IFNγ-Sekretionsassay zum Nachweis lebender antigenspezifischer T-Helferzellen
  • 5.3 Sensitivität der verwendeten Methoden
    • 5.3.1 Theoretischer Hintergrund
    • 5.3.2  Bestimmung der Sensitivität mit Hilfe einer Verdünnungsreihe
      • 5.3.2.1 Die Sensitivität der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen mittels intrazellulärer Färbung liegt bei ca. 1x10-4 in PBMC.
      • 5.3.2.2 Die Sensitivität des IFNγ-Sekretionsassays ist abhängig von der Frequenz IFNγ-exprimie­render Zellen in der Negativkontrolle und beträgt ca. 2x10-5 in PBMC.
  • 5.4 Das Autoantigen MBP kann von APC des peripheren Blutes aufgenommen, prozessiert und präsentiert werden.
  • 5.5  Analyse IFNγ- und TNFα-exprimierender T-Helferzellen nach Stimulation mit einem Impf- und einem viralen Kontrollantigen
    • 5.5.1 Die T-Helferzellantwort auf die Antigene TT und CMV unterscheidet sich nicht zwischen MS-Patienten und Gesunden.
    • 5.5.2 Klinische Untergruppen der MS-Patienten weisen tendenzielle Unterschiede in der antigenspezifischen T-Helferzellantwort auf.
  • 5.6 MBP-spezifische Th1-Zellen lassen sich im peripheren Blut nicht oder nur in sehr geringen Frequenzen nachweisen.
  • 5.7 Auch im Liquor von MS-Patienten sind keine MBP-spezifischen Th1-Zellen nachweisbar.
  • 5.8 Ausblick
• 6  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 3-3.1: In dieser Arbeit verwendete Fluorochrome.
• Tabelle 3-3.2: Verwendete monoklonale Antikörper gegen humane Oberflächenmarker.
• Tabelle 3-3.3: Verwendete monoklonale Antikörper gegen humane Zytokine.
• Tabelle 3-3.4: In dieser Arbeit verwendete Antigene.
• Tabelle 3-3.5: Charakteristika der vier zur Verfügung stehenden Fluoreszenzkanäle des FACS Calibur.
• Tabelle 4-4.1: Berechnung der Variabilitätskoeffizienten der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen. Jeweils zehn Ansätze wurden mit TT bzw. CMV stimuliert. Aus den gemessenen Frequenzen IFNγ-exprimierender Zellen wurden der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung berechnet und daraus der Variabilitätskoeffizient gebildet.
• Tabelle 4-4.2: Berechnung der Vaiabilitätskoeffizienten der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression in fixierten Zellen. Jeweils zehn Ansätze wurden mit TT bzw. CMV stimuliert. Aus den gemessenen Frequenzen TNFα-exprimierender Zellen wurden der arithmetische Mittelwert und die Standardabweichung berechnet und daraus der Variabilitätskoeffizient gebildet.
• Tabelle 4-4.3: Zur Berechnung des Zellverlustes während der einzelnen Schritte des Experimentes wurden zu verschiedenen Zeitpunkten definierte Aliquots entnommen, mit fluoreszierenden Mikropartikeln versetzt und so die Zellzahl der gesamten Probe bestimmt.
• Tabelle 4-4.4: Ergebnisse der intrazellulären Zytokinfärbung nach Antigenstimulation bei 25 untersuchten gesunden Probanden. Angegeben sind die Anzahl der Probanden, bei denen antigenreaktive T-Helferzellen detektiert wurden, sowie die Medianwerte +/- Standardabweichungen der Frequenzen zytokin­exprimierender CD4+-Zellen. Diese sind sowohl für die Gesamtheit der Proben angegeben, als auch für diejenigen Proben, bei denen antigenspezifische CD4+-Zellen nachgewiesen wurden.
• Tabelle 4-5: Klinische Charakteristika der 34 untersuchten MS-Patienten.
• Tabelle 4-6: Ergebnisse der intrazellulären Zytokinfärbung nach Antigenstimulation bei 34 untersuchten MS-Patienten. Angegeben sind die Anzahl der Patienten, bei denen antigenreaktive T-Helferzellen detektiert wurden, sowie die Medianwerte und +/- Standardabweichungen der Frequenzen zytokinexprimierender CD4+-Zellen. Diese sind sowohl für die Gesamtheit der Proben angegeben, als auch für diejenigen Proben, bei denen antigenspezifische CD4+-Zellen nachgewiesen wurden.
• Tabelle 4-7: Klinische Charakteristika der Patienten, die mit dem IFNγ-Sekretionsassay untersucht wurden.
• Tabelle 4-8: Ergebnisse des IFNγ-Sekretionsassays: Anzahl der angereicherten Zellen und Stimulations­indizes.
• Tabelle 4-9: Klinische Charakteristika der untersuchten Patienten.

Bilder

• Abbildung.1-1: Bedeutung des HLA-Typs für die Peptidpräsentation von Autoantigenen. Individuen unterschiedlichen HLA-Typs präsentieren verschiedene Peptide des Autoantigens. Eine spezifische T-Zelle erkennt in diesem Fall nur das im Kontext von HLA-DR2 präsentierte Peptid, während das von einem anderen HLA-Typ (HLA-DRx) präsentierte Peptid nicht erkannt wird.
• Abbildung 1-2: Schema der Pathogenese der Multiplen Sklerose. In der Peripherie werden autoreaktive T-Helferzellen durch verschiedene Mechanismen, wie z. B. Superantigene, Kreuzreaktivität oder Veränderungen im Zytokinmilieu, aktiviert. Sie können dann die Blut-Hirn-Schranke passieren und lösen nach Reaktivierung durch Autoantigene im ZNS eine Entzündungsreaktion aus, die schließlich zur Demyelinisierung führt.
• Abbildung 1-3: Prinzip der Analyse antigenreaktiver Zytokinexpression mittels intrazellulärer Zytokin­färbung. Nach sechsstündiger Antigenstimulation werden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen den T-Helferzellmarker CD4 und den Aktivierungsmarker CD69, sowie intrazellulär gegen die Zytokine IFNγ und TNFα gefärbt. In der Auswertung werden zunächst CD4+-Lymphozyten eingegrenzt und diese dann bezüglich der Aktivierung und Zytokinexpression ausgewertet. Die IFNγ+CD69+-Zellen repräsentieren eine antigenspezifische T-Helferzellpopulation.
• Abbildung 1-4: Prinzip des IFN γ -Sekretionsassays. Nach sechsstündiger Antigenstimulation werden die Zellen mit einem bivalenten αCD45αIFNγ-Antikörper inkubiert, der eine Fangmatrix für sezerniertes IFNγ bildet. Dieses wird in einer 45minütigen Sekretionsphase eingefangen und mit einem zweiten, fluoreszenzmarkierten αIFNγ-Antikörper angefärbt.
• Abbildung 3-1: Prinzip der magnetischen Zellseparation. Zellen werden mit an Antikörpern gebundenen superparamagnetischen Mikropartikeln markiert und anschließend über eine Säule aus Stahlwolle gegeben, die sich in einem magnetischen Feld befindet. Die markierten Zellen erhält man anschließend durch Eluieren der Säule außerhalb des Magnetfeldes.
• Abbildung 3-2: Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung. Die Fließgeschwindigkeit des Mantelstroms ist höher als die des Probenstroms und vereinzelt so die Zellen zu einer Einzelzellsuspension.
• Abbildung 3 -3: Prinzip des Durchflußzytometers. Einzelne Zellen werden durch monochromatisches Licht angeregt. Das emittierte Licht verschiedener Wellenlängen wird anschließend durch dichrote Teilerspiegel und Bandpassfilter aufgetrennt und nach Verstärkung durch Photomultiplierröhren gemessen.
• Abbildung 4-1: Vergleich der Vollblutstimulation mit der Stimulation von PBMC. PBMC bzw. Vollblut des gleichen Spenders wurde zeitgleich sechs Stunden mit CMV stimuliert, Brefeldin A wurde nach zwei Stunden zugegeben. Nach anschließender Fixierung und Permeabilisierung wurden auf der Zelloberfläche CD4 und der Aktivierungsmarker CD69 gefärbt, intrazellulär die Zytokine IL2, TNFα, IL4 und IFNγ. Als Negativkontrollen wurden unstimulierte Proben untersucht. Angegeben sind die relativen Häufigkeiten (Frequenzen) zytokinexprimierender aktivierter T-Helferzellen in CD4+-Zellen. Alle untersuchten Zytokine wurden nach Vollblutstimulation von einer höheren Frequenz von T-Helferzellen exprimiert als nach Stimulation von PBMC. Dagegen waren die Frequenzen zytokinexprimierender Zellen in der Negativkontrolle der Stimulation von PBMC höher als bei der Stimulation von Vollblut.
• Abbildung 4-2: Verlauf der Zytokinantwort TT- bzw. CMV-spezifischer T-Helferzellen bei einem gesunden Probanden. Vollblutproben wurden im Verlauf von zwei Monaten mit den Antigenen TT und CMV stimuliert und intrazellulär die Zytokine IFNγ und TNFα angefärbt. Die arithmetischen Mittelwerte der Frequenzen TT-reaktiver T-Helferzellen betrugen im Mittel 0,04% (IFNγ) bzw. 0,08% (TNFα), die CMV-reaktiver Zellen 0,86% (IFNγ) bzw. 0,84% (TNFα) in CD4+-Zellen. Dargestellt sind die prozentualen Abweichungen der einzelnen Messwerte von diesen Mittelwerten.
• Abbildung 4-3: Kinetik der IFN γ -Sekretion nach CMV-Stimulation. Vollblut wurde mit dem Antigen CMV stimuliert und anschließend sezerniertes IFNγ mit Hilfe des IFNγ-Sekretionsassays nachgewiesen. Außerdem wurden CD4 und CD69 auf der Zelloberfläche gefärbt und tote Zellen sowie Makrophagen mittels PI bzw. CD14-Färbung ausgegrenzt. Dargestellt sind die Frequenzen aktivierter (CD69+) IFNγ+ CD4+-Zellen als Mittelwert vier untersuchter Proben sowie deren Standardabweichung.
• Abbildung 4-4: Kinetik der IFN γ -Expression nach CMV-Stimulation. Das Experiment wurde wie in Abb. 4-3 beschrieben durchgeführt. Die hier dargestellten Punktdiagramme sind auf lebende CD4+-Lymphozy­ten beschränkt. Während die Frequenz IFNγ-exprimierender aktivierter CD4+-Zellen nach zwölf Stunden ihr Maximum erreichte, nahm nach sechs Stunden die mittlere Fluoreszenz der IFNγ-exprimierenden T-Helferzellen wieder ab und die Frequenz der aktivierten (CD69+) Zellen, die kein Zytokin bilden, zu.
• Abbildung 4-5: Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Sensitivität. Eine CMV-stimulierte Probe wurde mit einer unstimulierten Probe 1:5 verdünnt, diese Verdünnung dann wiederum 1:5 mit einer unstimulierten Probe versetzt usw., bis eine Verdünnung von 1:625 entstand.
• Abbildung 4-6: Verdünnungsreihen der intrazellulären Zytokinfärbung. Dargestellt sind die Ergebnisse von drei Experimenten. Auf der x-Achse sind die rückgerechneten Frequenzen in PBMC angegeben, auf der y-Achse sind die gemessenen Frequenzen zytokinexprimierender T-Helferzellen in CD4+-Zellen aufgetragen. Messwerte, die als Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen bewertet wurden, sind schwarz eingezeichnet. Die grauen Messwerte repräsentieren Proben, in denen keine antigenspezifische T-Helferzellantwort detektiert wurde. Der lineare Verlauf der Kurven spiegelt den Sensitivitätsbereich bis ca. 1x10-4 in PBMC wider.
• Abbildung 4-7: Verdünnungsreihe des IFN γ -Sekretionsassays. Dargestellt sind die Ergebnisse von drei Experimenten. Auf der x-Achse sind die rückgerechneten Frequenzen in PBMC angegeben, auf der y-Achse sind die gemessenen Stimulationsindizes aufgetragen. Messwerte, die als Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen bewertet wurden, sind schwarz eingezeichnet. Die grauen Messwerte repräsentieren Proben, in denen keine antigenspezifische T-Helferzellantwort detektiert wurde. Der lineare Verlauf der Kurven spiegelt den Sensitivitätsbereich bis ca. 2x10-5 in PBMC wider.
• Abbildung 4-8: Nachweis der MBP-Aufnahme durch APC des peripheren Blutes. MBP bzw. Ovalbumin wurden an den Fluoreszenzfarbstoff FITC gekoppelt und anschließend zur zweistündigen Stimulation von PBMC verwendet. Durch die seitliche Lichtstreuung (y-Achse) lassen sich Monozyten anhand ihrer höheren Granularität von Lymphozyten unterscheiden. Die Monozytenpopulation zeigt nach Inkubation mit FITC-markiertem MBP bzw. Ovalbumin eine deutlich erhöhte Fluoreszenz im ersten Fluoreszenzkanal.
• Abbildung 4-9: Restimulation einer MBP-spezifischen CD4 + -Zelllinie. Autologe PBMC wurden mit CFDA markiert und als APC zur sechsstündigen Stimulation einer MBP-spezifischen T-Zelllinie mit MBP zugegeben. Brefeldin A wurde nach zwei Stunden hinzugefügt. Nach Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden die Oberflächenantigene CD4 und CD69 sowie intrazellulär IFNγ gefärbt. Gezeigt sind die CFDA- Zellen der T-Zelllinie, dargestellt sind in der Negativkontrolle und nach MBP-Stimulation die CD4+-Zellen, nach PMA-Ionomycin-Stimulation wurden aufgrund der CD4-Downregulation die CD8- Zellen analysiert. Nach MBP-Stimulation exprimierten 32,28% der Zellen IFNγ, fast alle der T-Helferzellen sind jedoch aktiviert (CD69+).
• Abbildung 4-10: Titration der optimalen Stimulationskonzentration von MBP. Eine MBP-spezifische CD4+-Zelllinie wurde mit verschiedenen MBP-Konzentrationen restimuliert. Eine maximale Frequenz IFNγ-exprimierender T-Helferzellen fand sich bei einer Konzentration von 50μg/ml.
• Abbildung 4-11: Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen bei einem gesunden Probanden. Vollblut wurde sechs Stunden mit den Antigenen TT, CMV und MBP stimuliert. Brefeldin A wurde nach zwei Stunden zugegeben. Nach Erythrozytenlyse, Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden auf der Oberfläche die Antigene CD4 und CD69 gefärbt, intrazellulär die Zytokine IFNγ und TNFα. Die hier dargestellten Punktdiagramme beschränken sich auf CD4+-Lymphozyten.
• Abbildung. 4-12: Nachweis antigenspezifischer T-Helferzellen bei einem MS-Patienten. Vollblut wurde sechs Stunden mit den Antigenen TT, CMV und MBP stimuliert. Brefeldin A wurde nach zwei Stunden zugegeben. Nach Erythro­zytenlyse, Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurden auf der Oberfläche die Antigene CD4 und CD69 gefärbt, intrazellulär die Zytokine IFNγ und TNFα. Die hier dargestellten Punktdiagramme beschränken sich auf CD4+-Lymphozyten.
• Abbildung 4-13: Vergleich der intrazellulären Zytokinfärbung mit dem IFN γ -Sekretionsassay mit nach­folgender magnetischer Anreicherung nach sechs­stündiger Stimulation mit den Antigenen MBP und TT bei einer MS-Patientin. Für die intrazelluläre Zytokinfärbung wurde 1 ml Vollblut je Ansatz stimuliert, für den Sekretionsassay 3x107 PBMC je Ansatz. Darge­stellt sind alle CD4+-Lymphozyten. Mit der intrazellulären Zytokinfärbung konnten keine MBP-spezifischen T-Helferzellen nachgewiesen werden, während diese mit dem IFNγ-Sekretionsassay und nachfolgender magnetischer Anreicherung gezeigt werden konnten. Als Positivkontrolle konnten sowohl mit der intrazellulären Zytokinfärbung als auch mit dem IFNγ-Sekretionsassay TT-spezifische CD4+-Zellen geringer Frequenzen detektiert werden.
• Abbildung 4 -14: Vergleich der intrazellulären Zytokinfärbung mit dem IFN γ -Sekretionsassay mit nach­folgender magnetischer Anreicherung nach sechsstündiger Stimulation mit den Antigenen MBP und TT bei einer MS-Patientin. Für die intrazelluläre Zytokinfärbung wurde 1 ml Vollblut je Ansatz stimuliert, für den Sekretionsassay 1,2x107 PBMC je Ansatz. Dargestellt sind CD4+-Lymphozyten. Nach MBP-Stimulation konnten keine antigenspezifischen T-Helferzellen nachgewiesen werden, während als Positivkontrolle TT-spezifische CD4+-Zellen sowohl mit der intrazellulären Zytokinfärbung als auch mit dem IFNγ-Sekretionsassay und nachfolgender magnetischer Anreicherung nachgewiesen werden konnten.
• Abbildung 4-15: Stimulation von Liquorzellen einer MS-Patientin mit den Antigenen SEB und MBP. Aus 10 ml Liquor wurden Zellen isoliert und in Anwesenheit von autologen, CFDA-markierten PBMC sechs Stunden mit Antigen stimuliert, wobei nach zwei Stunden Brefeldin A zugegeben wurde. Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und die Oberflächenmoleküle CD4 und CD69, sowie intrazellulär IFNγ gefärbt. Die hier gezeigten Punktdiagramme beschränken sich in der oberen Reihe auf CD4+ CFDA--Liquorzellen, in der unteren Reihe auf CD4+ CFDA+-Zellen des peripheren Blutes Nach Stimulation mit SEB exprimierten im Liquor 2,79% der CD4+-Zellen IFNγ, während nur 0,63% der CD4+-Zellen des peripheren Blutes das Zytokin exprimierten. Nach MBP-Stimulation konnten keine aktivierten IFNγ-exprimierenden CD4+-Zellen detektiert werden.
• Abbildung 5-1: Die Abgrenzung sehr kleiner Populationen ist umso besser möglich, je mehr Parameter zur Verfügung stehen. Sie ist davon abhängig, wie scharf die Merkmalsausprägungen "positiv" (dunkelgrau) und "negativ" (hellgrau) voneinander trennbar sind. Sind diese klar abgrenzbar, ist eine ein- (A) und auch eine zwei- (C) dimensionale Auftrennung möglich. Gibt es jedoch fließende Übergänge, läßt sich mit Hilfe von zwei Parametern eine kleine Population abgrenzen (D), die in der einparametrischen Auftrennung teilweise in der großen Population verschwindet (B).