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1  Einleitung

1.1 HIV-1

Das HIV-1 (Das Humane Immundefizienzvirus-1) ist der Erreger des erworbenen Immundefektsyndroms (Acquired-Immune-Deficiency-Syndrome, AIDS). Es überzieht die Erde in einer Pandemie (Piot et al., 2001). Infolge der Immunschwäche treten opportunistische Infektionen auf (Dal Maso et al., 2001). Die Erkrankung verläuft fast immer tödlich. Nachdem Montagniers Arbeitsgruppe am Pasteur Institut in Paris die Isolierung eines Retro-Virus aus Lymphozyten eines jungen Homosexuellen mit den Krankheitszeichen des Lymphadenopathie-Syndroms im Jahre 1983 und Gallos Arbeitsgruppe in den USA die Isolierung ähnlicher Retro-Viren von Patienten im Jahre 1984 gelungen waren (Barre-Sinoussi et al., 1983; Gelmann et al., 1984), wurde das HIV-2 in Westafrika aus AIDS-Patienten im Jahre 1986 isoliert (Glavel et al., 1986). Das HIV-2 ist mit dem HIV-1 verwandt aber nicht identisch. Bei Kreuztests zeigte sich, dass die Glykoproteine der Virushülle bei HIV-1 und HIV-2 völlig verschieden sind. Die Polymerasen und die Kapsid-Antigene ließen jedoch eine Verwandtschaft zwischen HIV-1 und -2 erkennen. HIV-1 und HIV-2 gehören also zu derselben Gruppe von Viren (HIV). Das HIV wird durch homo- oder heterosexuellen Geschlechtsverkehr sowie durch Blut oder Blutprodukte übertragen. Neben dem Blut sind das Sperma und das Vaginalsekret ebenfalls Infektionsquellen. Die Infektion der Neugeborenen durch seropositive Mütter erfolgt vorwiegend perinatal, aber auch durch das Stillen (Saloojee et al., 2001).

Die HIV-1-Adsorption erfolgt durch Anlagerung des gp120 (ein Glykoprotein, das Genprodukt des Env-Gens) an die CD4- sowie an CCR5- bzw. CXC-Chemokin-Rezeptoren der CD4+- Zelle (Dragic, 2001). Das HIV-1 wird dann durch Fusion und Endozytose von der Zelle aufgenommen (Penetratio n). Nach dem Uncoating erfolgt im Zytoplasma die reverse Transkription und anschließend der Transport der DNA in den Kern mit der Integration in das Zellgenom (Provirus). Zelluläre Transkriptasen produzieren dann virale mRNAs und Genom-RNA. Nach der Translation an den Polysomen erfolgt die Spaltung der Vorläuferproteine in kleinere Moleküle. Dann erfolgt die Montage neuer Viruspartikel an der Zellmembran, die durch Knospung (budding) freigesetzt werden (Faure et al., 2000). Insgesamt gesehen ist die Kontagiosität des HIV geringer als die des Hepatitis B-Virus. Das HIV ist wegen seiner lipidhaltigen Hülle sehr empfindlich gegenüber Lipidlösungsmittel. Außerhalb des Organismus verliert es durch Austrocknen nach mehreren Stunden 90-99% seiner Infektiosität. Bisher sind nur wenige Infektionen durch kontaminierte Kanülen bei ärztlichem Personal bekannt geworden. Weltweit schätzt man bisher über 50 Millionen Infizierte, und 1998 waren 2,5 Millionen an AIDS erkrankte Personen gestorben. Die Zahl der klinisch Kranken steigt dramatisch. Sie verdoppelt sich etwa alle 3-5 Jahre (Yamey et al., 2001; Adler, 2001). Die Gesamtzahl der Infizierten in Deutschland wird auf 60 000 geschätzt, und über 10 000 sind bisher an AIDS gestorben. Deshalb ist die Identifizierung und die Erforschung der HIV-Genomsstruktur und –Pathogenese ein wichtiges und dringendes Projekt in den Fächern Medizin und Biologie.

Das durch das HIV ausgelöste AIDS ist ein Krankheitskomplex. Die Inkubationsperiode beträgt 1-15 Jahre. Man beobachtet Gewichtsabnahme, Schwächezustände, Fieber sowie zahlreiche opportunistische Infektionen (z.B. Pneumonie, orale Haarleukoplakie). Charakteristisch für AIDS ist das Auftreten des Kaposi-Sarkoms (Beral et al., 1990). Die serologisch-virologische Diagnose erfolgt zunächst durch einen Antikörper-Screening-ELISA gegen das Kern- und das Env-Antigen. HIV-spezifische Antikörper sind etwa ab der dritten Woche nach der Infektion nachweisbar. Jeder Verdachtsfall wird dann durch einen „Bestätigungstest“ (Western Blot) und den IFT (Immunofluorescence Test) abgeklärt. Der quantitative Nachweis von HIV-RNA erfolgt durch die PCR und alternative Amplifikationstechniken (bDNA: branched-DNA; NASBA, nucleic acid sequence-based Amplification) (Kellogg et al., 2001; de Baar et al., 2001). Um den klinischen Verlauf zu beurteilen, ist es wichtig, das Verhältnis von CD4/CD8-Zellen zu bestimmen. Der kritische Wert liegt bei 200 CD4+-Zellen/μl.

Man ist bisher nicht in der Lage, die Replikation von HIV im menschlichen Körper erfolgreich zu verhindern und das HIV in den Patienten zu eliminieren. Trotzdem hat die Kombination von z. B. AZT (Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitor) mit Nevirapin (Nonnukleosid-Hemmstoff, NNRTI) und einem Protease-Inhibitor (PI) deutliche Fortschritte bei der Behandlung gebracht (Brockmeyer [Seite 2↓] et al., 1999). Bisher ist noch kein Impfstoff in Sicht. Die Schwierigkeiten mit einem Vakzin gegen das HIV liegen darin, dass mehrere HIV-Typen, Subtypen und Varianten vorkommen (Kusumi et al., 1992).

Die HIV-1-RNA hat einen Informationsgehalt von etwa 9 Kb. In jedem Virus-Partikel gibt es zwei identische (+)-RNA-Stänge. Durch die hohe Mutationsrate können „Quasispezies“ entstehen. Das Genom des HIV-1 besteht aus Regulationssequenzen und Genen, die in Abb. 1.1 dargestellt sind.

Abb. 1.1: Übersicht über die Gene des HIV-1 Provirus und ihre Anordnung

1.2 Das Tat-Protein

Das Tat-Gen entsteht durch das Zusammenfügen von zwei Regionen des Virus-Genoms (Transactivation transcription) durch Spleißen. Das Tat-Protein ist essentiell für die virale Replikation und in allen Lentiviren von Primaten konserviert (Jeang et al., 1994; Gallo, 1999). Im HIV-1-infizierten Patient wird ein Tat-Protein gefunden, das aus 101 Aminosäuren besteht. Das sogenannte vollständige Tat-Protein bestehend aus 86 Aminosäuren wurde durch die Zellkultur im Labor produziert und existiert nicht in der Natur (Rana et al., 1999). Es wurde jedoch von vielen Forschern bestätigt, dass das 86-Aminosäuren-Tat-Protein genau wie das 101-Aminosäuren-Tat-Protein funktioniert.

Das 86-Aminosäuren-Tat-Protein wird von zwei Exons kodiert. Die ersten 72 Aminosäuren werden von dem ersten Exon kodiert, die übrigen 14 C-terminalen Aminosäuren vom zweiten Exon. Das Tat-Protein besteht aus 5 Domänen; einer N-Terminalen-, einer Cystein-reichen-, einer Kern-, einer Basischen und einer C-Terminalen- Region. Die basische Region enthält die RNA-Bindungsdomäne und ein NLS (Nuclear Localization Signal). Außerdem ist sie zuständig für den freien Durchgang durch die zelluläre Membran. Im Gegensatz dazu bindet die Cystein-reiche Region unspezifisch an viele Komplexe und ist für die Oligomerisierung des Tat-Proteins zuständig (Rana et al., 1999). Die Deletion dieser Region vereinfacht die Analyse des Tat-Proteins (siehe Abb. 1.2).


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Abb. 1.2: Die Sequenz und die Domänen des HIV-1 Tat-Proteins. AA 1-21: N-Terminale Domäne; AA 22-36: Cystein-reiche Domäne; AA 37-48: Kerndomäne; AA 49-57 Basische Domäne; AA 58-86 C-Terminale Domäne

Das Tat-Protein bewirkt eine Verstärkung der Ablesung des HIV-Genoms (Berkhout et al., 1990). Auf einer frühen Stufe wird das Tat-Protein im Zellplasma synthetisiert, geht danach in den Zellkern und bindet an das sogenannte TAR-Element (Transacting Responsive Element). Das TAR-RNA-Element befindet sich in der 5´- LTR (Long Terminal Sequence Repeat) – Sequenz. Die Struktur von + 19 bis + 42 in der HIV-mRNA ist Voraussetzung für die Tat- Bindung (Jakobovits et al., 1988).
Das Tat-Protein erhöht durch eine verstärkte Initiation und Prolongation der Transkription die Konzentration viraler RNAs (Frankel, 1992). Es stimuliert die Expression von HIV-Genen um mehr als das Tausendfache. Darüber hinaus wird auch die Expression von Wirtszellproteinen unspezifisch erhöht (Huang et al., 1994).

1.3 Das Proteasom-System

Das Proteasom-System prozessiert virale Antigene und ist daher für die Abwehr viraler Infektionen von großer Bedeutung (Jonathan et al., 1999; Stoltze et al., 2000; Kloetzel, 2001). Der proteolytische Kern des Proteasom-Systems ist das 20S Proteasom, eine multikatalytische Protease, die in allen Organismen von Archaebakterien bis zu Mammaliazellen nachgewiesen wurde (Baumeister et al., 1998). Es ist im Zytoplasma, am ER und im Zellkern lokalisiert. Als zentraler Bestandteil des Ubiquitin-abhängigen Proteinabbauweges ist es am Abbau vieler zellulärer Proteine beteiligt (Rock et al., 1994). Die Substrate des Ubiquitin-Proteasom-Systems sind zumeist Proteine, die als Regulatoren in verschiedensten zellulären Prozessen, wie z.B. im Metabolismus (Bercovich et al., 1993), bei der Transkription (Treier et al., 1994; Palombella et al., 1994), und der Zellzykluskontrolle (Seufert et al., 1995) fungieren. Außerdem werden falsch gefaltete Proteine abgebaut (Hiller et al., 1996). Das Proteasom ist an der Generierung der Epitope beteiligt, die durch MHC Klasse I (Major Histocompatibility Complex) -Moleküle präsentiert werden (Momburg et al., 1998). In eukaryotischen Zellen besteht das 20S Proteasom aus 7 verschiedenen α- und 7 verschiedenen β-Untereinheiten. Der Komplex ist aus vier heptameren Ringen (α1-7, β1-7, β1-7, α1-7) aufgebaut. Die beiden äußeren Ringe des Enzymkomplexes werden aus den 7 α-Untereinheiten gebildet und die zwei inneren Ringe sind aus den 7 β-Untereinheiten (Kopp et al., 1993; Lupas et al., 1993) zusammengesetzt. Auf den β-Untereinheiten befinden sich die katalytischen Zentren, die in das Innere des proteasomalen Kompartiments gerichtet sind. Die α-Untereinheiten formen an den beiden Enden eine zentrale Öffnung, die mit einem Durchmesser von 13 Å vermutlich nur den Zugang von entfalteten Polypeptidketten zulässt (Löwe et al., 1995). Das Proteasom besitzt mindestens fünf verschiedene peptidspaltende Aktivitäten. Künstliche Peptidsubstrate werden an der Carboxylseite von hydrophoben (Chymotrypsin-ähnliche Aktivität), von basischen (Trypsin-ähnliche Aktivität) und von sauren (Peptidyl-Glutamyl-Peptid-spaltende Aktivität) Aminosäuren gespalten (Rivett, 1989; Orlowski, 1990). Darüber hinaus sind die BrAAP-Aktivität (Spaltung nach verzweigten Aminosäuren) und die SNAAP-Aktivität (Spaltung nach kleinen neutralen Aminosäuren) beschrieben (Orlowski et al., 1993). Es gibt eine Reihe von Inhibitoren, die die hydrolytische Aktivität des 20S Proteasoms in vivo wie auch in vitro hemmen. Sehr spezifisch wirkt Lactacystin. Die in wässriger Lösung als Lacton vorliegende Substanz modifiziert die katalytisch aktiven Threoninreste der entsprechenden [Seite 4↓]Untereinheiten (Cerundolo et al., 1997; Craiu et al., 1997).

1.4 Der 11S Regulator und seine Rolle bei der Antigenpräsentation

Der 11S Regulator, auch PA28 oder REG genannt, ist eine Komponente des Immunabwehr-Systems. Er kann ATP-unabhängig mit den α-Endplatten des 20S Proteasoms assoziieren (Dubiel et al., 1992; Ma et al., 1992; Realini et al., 1994). Er konnte nur in höheren eukaryotischen Zellen nachgewiesen werden. Der 11S Regulator besteht aus zwei Untereinheiten, REGα und REGβ, die annähernd 50% Sequenzhomologie aufweisen. Das Molekulargewicht der α-Untereinheit beträgt 28,7 kDa und das der β-Untereinheit 27,1 kDa. REGα besteht aus 249 Aminosäuren (Ahn et al., 1996; Song et al., 1996). Die Bindungsstelle des REGα mit dem 20S Proteasom befindet sich am C-Terminus (Aminosäuren 240-249). Der 11S Regulator bildet eine Art Kappe, die sich aus sechs oder sieben α- und β-Untereinheiten zusammensetzt (Gray et al., 1994). Biochemische Daten verschiedener Arbeitsgruppen sprechen für ein Hetero-Hexamer, das zu gleichen Teilen aus α- und β-Untereinheiten gebildet wird (Ahn et al., 1996; Kuehn et al., 1996). Im Gegensatz dazu formt das rekombinante REGα alleine einen heptamerer Ring, wie durch röntgenkristallographische Studien bestimmt wurde (Whitby et al., 2000; Knowlton et al., 1997). Die sieben 11S Regulator α-Untereinheiten bilden eine zentrale Öffnung von 20 Å auf der dem Proteasom abgewandten Seite und eine Öffnung von 30 Å auf der Seite, die an den heptameren α-Ring des Proteasoms bindet. Es wurde bisher nicht gezeigt, ob der homo-heptamere Komplex tatsächlich in der Zelle vorliegt. Die Untereinheiten des 11S Regulators besitzen 40% (REGα) bzw. 33% (REGβ) Sequenzhomologie zu einem Kernprotein, welches ein Autoantigen bei Patienten mit systemischem Lupus Erythematosus darstellt. Die Funktion dieses sogenannten Ki-Antigens ist bisher unbekannt (Nikaido et al., 1990). Die Interaktion des 11S Regulators mit dem 20S Proteasom führt zu einer vielfachen Stimulierung der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität in vitro (Dubiel et al., 1992). Sowohl rekombinanter als auch isolierter 11S Regulator kann das 20S Proteasom aktivieren (Realini et al., 1994). Für die Aktivierung des 20S Proteasoms sind die Aminosäuren 141-149 erforderlich (Knowlton et al., 1997).

Der 11S Regulator spielt bei der Prozessierung antigener Peptide für MHC-Klasse-I Moleküle eine wesentliche Rolle (Rechsteiner et al., 2000; Klockel, 2001). Das 20S Proteasom gemeinsam mit dem 11S Regulator ist nicht in der Lage, große Proteinsubstrate abzubauen. Dafür ist ein anderer 20S Proteasom-Regulator, der 19S Regulator, zuständig. Dieser bindet ATP-abhängig an die Endplatten des 20S Proteasoms und bildet so das ca. 2000 kDa große 26S Proteasom (Peters et al., 1993; Yoshimura et al., 1993). Das 26S Proteasom erkennt ubiquitinierte Proteine und baut sie ab. Interessanterweise wurden TBP1 (Tat-Binding Protein 1) und MSS1 (Mammalian Suppressor of Sgv1), zwei ATPase-Untereinheiten des 19S Regulators, über direkte bzw. indirekte Wechselwirkung mit dem Tat-Protein identifiziert (Dubiel et al., 1993).

Das von aktivierten TH1-Zellen sezernierte γ-Interferon führt in MHC-Klasse I-Peptid-präsentierenden Zelle zur Expression zahlreicher an der Immunantwort beteiligter Proteine (Billiau, 1996). Unter ihnen sind drei proteolytisch aktive β-Untereinheiten des 20S Proteasoms (LMP2, low molecular weight protein 2, LMP7 und MECL-1, multicatalytic endopeptidase complex-like 1), die an Stelle von β1, β5 und β2 in das 20S Proteasom eingebaut werden und so das Immunoproteasom bilden (Ortiz-Navarrete et al., 1991; Kelly et al., 1991; Groettrup et al, 1996a). Darüber hinaus werden der ER-Peptidtransporter TAP (Transporter Associated with Antigen Processing) (Higgins, 1992), die MHC Klasse I schwere Kette β2 Mikroglobulin (Lehner et al., 1996) und der 11S Regulator durch das γ-Interferon induziert (Ahn et al., 1995). Das sogenannte Immunoproteasom hat eine veränderte peptidspaltende Aktivität in vitro. Es schneidet vorzugsweise nach hydrophoben und basischen Resten und generiert somit die Peptide, die eine erhöhte Affinität zum TAP-Transporter und zu MHC-Klasse-I Molekülen besitzen. Das Immunoproteasom zeigt in vitro eine erhöhte chymotryptische und tryptische Aktivität. Im Gegensatz dazu verringert sich die peptidylglutamylspaltende Aktivität (Gaczynska et al,. 1993; Tanaka et al., 1997; Sijts et al., 2000). Der ebenfalls γ-IFN-induzierbare 11S Regulator steigert vermutlich die Effektivität der Antigenpräsentation, indem er das Proteasom befähigt, immunodominante Peptide sowie deren Vorläufer in größeren Mengen zu produzieren. In vitro-Verdaue langer Polypeptidsubstrate belegen, dass der 11S Regulator die Generierung von [Seite 5↓]Epitopen und möglichen Vorläuferpeptiden bis zu 100-fach verstärkt (Dick et al., 1996; Shimbara et al,. 1997). In vivo wurde gezeigt, dass die Überexpression von REGα in Mausfibroblasten eine verbesserte Antigenpräsentation durch MHC-Klasse-I Moleküle zur Folge hat (Groettrup et al., 1996c). Für die Funktionen des 20S Proteasoms, des 11S Regulators und des 19S Regulators bei der Prozessierung antigener Peptide existiert ein Modell. In der Zelle scheint das 20S Proteasom gleichzeitig mit dem 19S Regulator und dem 11S Regulator assoziiert zu sein. Es wurde postuliert, dass die Erkennung von Proteinsubstraten und der Zugang zum katalytischen Kompartiment durch den 19S Regulator an einer Seite des 20S Proteasoms ermöglicht wird und dass der weitere Abbau der entstandenen Intermediate durch den 11S Regulator auf der anderen Seite des 20S Proteasoms reguliert wird (Hendil et al., 1998).

1.5 Die Regulation der Stabilität von IκB und c-Jun durch das Protesom-System

NF-κB (Nuclear Factor- κ B) spielt bei der transkriptionellen Regulation im Zellkern eine wichtige Rolle. Es gibt zwei Wege, durch die NF-κB im Cytoplasma freigesetzt wird und in den Zellkern geht. Der Inhibitor IκBα bindet an das NF-κB-Heterodimer, das aus den Proteinen p50 und p65 besteht und verhindert den Eintritt in den Zellkern. Infolge einer spezifischen Stimulation wird IκBα phosphoryliert, anschließend polyubiquitinyliert und vom 26S Proteasom abgebaut (Traenckner et al.,1995; Chen et al., 1995). Beim alternativen Mechanismus wird das an p65 bindende Präkursor-Protein p105 durch das Ubiquitin-abhängige 26S Proteasom prozessiert und damit ein aktives Heterodimer aus p50 und p65 hergestellt (Palombella et al., 1994). Das Prozessieren von p105 ist das einzige bisher bekannte Beispiel für eine begrenzte Proteolyse eines Substrates durch das 26S Proteasom. NF-κB wird in den Nucleus transloziert und bindet dort an seine DNA-Ziel­sequenzen. Es ist auch für die Replikation des HIV-1 erforderlich (Westendorp et al., 1995).

Das c-Jun ist ein Mitglied der AP-1-Familie (Karin et al., 1997). Die Proteine der AP-1 Familie sind in der Lage, die Transkription bestimmter Gene durch die Bindung an spezielle DNA-responsive elements zu induzieren. Die Expression von c-Jun wird durch verschiedene extrazelluläre Stimuli erhöht. Die intrazelluläre Stabilität von c-Jun wird durch das Proteasom-System Ubiquitin-abhängig reguliert (Jariel-Encontre et al., 1995).

1.6 Fragestellungen und Ziele

Im Jahre 1997 fanden die Mitarbeiter unserer Arbeitsgruppe, dass das Tat-Protein in der Lage ist, an das 20S Proteasom sowie auch an den 19S Regulator des 26S Proteasoms in vitro zu binden. Die Tat-Bindung an das 20S Proteasom führt zu einer Hemmung der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität. Aus kinetischen Daten und den in Bindungsstudien gewonnen Erkenntnissen geht hervor, dass das Tat-Protein mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom konkurriert.

Daraus ergaben sich die Fragenstellungen der vorliegenden Arbeit:

  1. Bindet das Tat-Protein in vivo an das 20S Proteasom und den 19S Regulator des 26S Proteasoms?
  2. Welche Region des Tat-Proteins ist für die Konkurrenz mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom verantwortlich? Gibt es ähnliche Strukturen im Tat-Protein und im 11S Regulator?
  3. Hat das Tat-Protein einen Einfluß auf die 11S Regulator-vermittelte Antigenpräsentation über die MHC Klasse-I Moleküle?
  4. Beeinflusst das Tat-Protein die Stabilität von IκB und c-Jun ?


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26.05.2005