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2  Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Kits

Biorad protein assay

Biorad

BM chemiluminescence western blotting reagent

Boehringer Mannheim

Endofree Maxi Plasmidkit

Qiagen

Mini Plasmidkit

Qiagen

PerfectTM Transfection Kit

Invitrogen

Qiaquick Gelreingungskit

Qiagen

Site-directed Mutagenesis Kit

Stratagene

Thrombin-Cleavage-Capture-Kit

Novagen

2.1.2 Enzyme

Restriktionsenzyme

Biolabs

T4 Bakteriophage DNA Polymerase

Biolabs

T4 DNA-Ligase

Roche

Taq-Polymerase

Roche

2.1.3 Sonstiges


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3MM Papier

Whatman

Acrylamid 30 %, 29:1

Roth

Aprotinin

Applichem

Bacto-Agar

DIFCO

Bacto-Trypton

DIFCO

Centricon

Amicon/Millipore

DMSO

Fluka

Elektroporationsküvetten

Peqlab

FCS

Seromed

Fluorogene Proteasom Substrate

Bachem Biochemica

Hefe-Extrakt

DIFCO

IgG-Standard

Biolab

Glutatathion-Agarose

Sigma

L-Glutamin

Seromed

Lactacystin

Affiniti

Mikroliterspritze

Hamilton

Molekulargewichtsstandard, DNA

GibcoBRL

Molekulargewichtsstandard, Protein

Amersham

Nitrocellulose Membran

Schleicher&Schuell

Penicillin/Streptomycin

Seromed

Phast-System, Nativ-Gel-Pufferstreifen

Pharmacia

PMSF

Sigma

pcDNA3.1 Vektor

Invitrogen

Röntgenfilme

Kodak

Schwarze Mikrotiter-Platten

Dynatec

Sekundärantikörper

Seramun

Steriles Plastikmaterial für die Zellkultur

Falcon

Sterilfilter

Microgen

TEMED

Serva

Trypanblau-Lösung

Sigma

Trypsin-EDTA

Gibco BRL

Zellkultur-Medien

Seromed

Zephiranchlorid, 17 %

ICN

β-Mercaptoethanol

Serva

2.1.4 Geräte


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Agarosegelkammer Geltray

Renner

Eismaschine AF-10

Scotsman

Elektroporationsgerät

Peqlab

Feinwaage MC1

Satorius

Fluorimeter Fluostar Reader

SLT

French Press

SIM-AMINCO

Geltrockner Drystar

Hölzel

Heizblock

Eppendorf

Inverses Mikroskop DMI

Leica

Kühlzentrifuge 5417R

Eppendorf

Kühlzentrifuge Avanti J-25

Beckman

Kühlzentrifuge RC24

Sorvall

Magnetrührer

Heidolph

Medifuge

Heraeus

Membranvakuumpumpe

Vacuumbrand

Mikrowelle

Moulinex

MilliQ-Anlage

Millipore

Mixer 5432

Eppendorf

PCR Thermocycler UNO Block

Biometra

Phast Gel System

Pharmacia

Photometer

Shimadzu

Pipetten

Gilson

Pipettus-Akku

Hirschmann

Röntgenfilmentwickler Hyperprocessor

Amersham

Rotor SS34

Sorvall

Rotor SW40

Beckman

Schüttlerwasserbad

GFL

Schüttler

Infos

Sterilbank

Baker

Stickstofftank

Taylor-Wharton

Tischultrazentrifuge Optima TLX

Beckman

Ultrazentrifuge Ultra Pro 80

Sorvall

Vakuumtrockner

Labcono

Mischer Vortex VF2

Janke & Kunkel

Waage BP2100S

Sartorius

Wasserbad U3

Julabo

Zellkultur-Inkubator BB4220CV

Heraeus

2.2 Methoden

2.2.1 Amplifikation von DNA durch PCR (Polymerase Chain Reaction)

Primer für 86-AA Tat und Tat-Fragment DNA-Konstrukte (5´ → 3´)

Primer A: ACG TGG ATC CTG ATG GAG CCA GTA GAT CCT AGA

Primer B: TCG CTC GAG CTA TTC CTT CGG GCC TGT CGG


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Primer C: ACG TAC GTT ACC TTG GCA ATG AAA GCA ACA

Primer D: ACG TGG TAC CCC ACC TCC CAA TCC CGA GGG

PCR-Ansatz (100 μl):

2 μl DNA (10 ng/μl)

Je 2 μl Primer (0.1 μg/ml)

10 μl 10 x PCR-Puffer

8 μl MgCl2 (25 mM)

je 2 μl dNTP (0,2 mM)

0,5 μl Taq-Polymerase (2,5 U)

aqua dest. ad 100 μl

Die Template-DNA (GST-Tat Konstrukt von NIH AIDS Reagent Program, USA) und die Oligonukleotide wurden vor der PCR 3 min bei 95°C denaturiert. Es wurden folgende PCR-Bedingungen gewählt: 1 min, 95°C; 45 sec, 52°C; 45 sec, 72°C; 33 Zyklen; 5 min, 72°C. Um die gewünschten amplifizierten Fragmente von sonstiger DNA im PCR-Ansatz zu trennen, wurde der gesamte Reaktionsansatz auf ein präparatives 1%iges TAE-Agarosegel aufgetragen. Die entsprechenden DNA-Fragmente wurden ausgeschnitten und mit einem Gel-Extraktions-Kit von QIAGEN isoliert.

2.2.2 Klonierung von pcDNA3-Flag-Tat und pcDNA3-Flag-ΔTat (Abkürzung: Flag-Tat und Flag-ΔTat)

Flag-Tat: Mittels PCR wurden die kodierenden DNA-Fragmente für Tat 1-86 amplifiziert. Dabei wurden der Primer 1 mit einer N-terminalen-BamHI-Schnittstelle, der Primer 2 mit einer C-terminalen-XhoI Schnittstelle und pGEX 2TK-Tat 1-86 als Matrize benutzt. Nach entsprechendem Restriktionsverdau wurde Tat-cDNA gerichtet über die Restriktionsschnittstellen BamHI und EcoRI in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3-Flag ligiert. Die Ligation wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.

Flag-ΔTat: Mittels PCR wurde Tat-DNA 1-36 mit Primer 1 mit einer N-terminalen-BamHI-Schnitstelle und Primer 3 mit einer C-terminalen-KspA1-Schnittstelle sowie pGEX 2TK-Tat-DNA 1-86 als Matrize amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und KspA1 verdaut.

Mittels PCR wurde Tat-DNA 73-86 mit Primer 4 mit einer N-terminalen-KpnI-Schnittstelle und Primer 2 mit einer C-terminalen-XhoI-Schnittstelle und pGEX 2TK als Matrize amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen KpnI und XhoI verdaut. Die überstehenden Nukleotide wurden weiter mit T4 Bakteriophagen-DNA-Polymerase abgebaut. Danach erfolgte die stumpfe-Enden (blunt-end) Ligation der behandelten Tat-DNA 1-36 und Tat-DNA 73-86. Nach der Ligation wurde die ligierte DNA mit Primer 1 mit einer N-terminalen-BamHI-Schnittstelle und Primer 2 mit einer C-terminalen-XhoI-Schnittstelle sowie den Ligationsprodukten als Matrize amplifiziert. Nach entsprechendem Restriktionsverdau wurde ΔTat-cDNA gerichtet über die Restriktionsschnittstellen BamHI und XhoI in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3-Flag ligiert. Die Ligation wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.


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2.2.3  Spezifische Mutagese der REGα-Untereinheit

Primer für REGα (5´ → 3´)

Primer E: CCT GAA GAA CTT CGC GGC GCT CAA GAA GCC C

Primer F: GGG CTT CTT GAG CGC CGC GAA GTT CTT CAG G

PCR-Ansatz (100 μl):

10 x PCR-Puffer

10 μl

dNTPs (25 mM je dNTP)

0,8 μl

DNA Template (100 ng/μl)

1 μl

Primer E (100 ng/μl)

2,5 μl

Primer F (100 ng/μl)

2,5 μl

Pfu Turbo DNA Polymerase

1 μl (2,5 U)

Aqua dest. ad 100 μl

 

Entsprechend der Vorschrift des „Site-directed Mutagenesis Kit“ wurde das folgende Programm gewählt: 3 min, bei 95°C vordenaturiert; 30 sec, 95°C; 1 min, 55°C; 12 min, 68°C; 12 Zyklen. Um die parentale unmutierte DNA zu verdauen, wurde das Restriktionsenzym Dpn I (1 μl, 10 U/μl) zugegeben. Dann wurde die Transformation in E. Coli, XL-1-Blue, durchgeführt. Die Mutation wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.

2.2.4 Umklonierung von pcDNA3.1-HisC-REGαwt und pcDNA3.1-HisC-REGαm (Abkürzung: HisC-REGαwt und HisC-REGαm)

Für GSTαwt und -αm wurde der Vektor pcDNA3.1-HisC aus den Serien pcDNA3.1-His verwendet. Die Vektoren pcDNA3.1-HisC und pGEX 2TK-11 Sαwt und -αm wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI geschnitten. Die cDNA-Fragmente von REGαwt und REGαm wurden gerichtet über die Restriktionsschnittstellen BamHI und EcoRI in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3.1-HisC ligiert.

2.2.5 Agarosegele, Gelreinigung von DNA-Fragmenten und DNA-Fällung

50 x Puffer für Agarosegel-Elektrophorese (50 x TAE):

Tris

242 g

Essigsäure

57,1 ml

0,5 M EDTA (pH 8.0)

100 ml

Bidest, auf 1l

 

DNA-Fragmente wurden in 0,8 bis 1,6%igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel [Seite 11↓]enthielt 0,006% Ethidiumbromid (nach Abkühlen der aufgekochten Agarose zugegeben). Die Elektrophorese erfolgte mit 5 V je cm.

Die zu reinigende DNA wurde auf Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die gewünschte Bande wurde unter UV-Licht ausgeschnitten und die DNA mit dem Gelaufreinigungskit Qiaquick der Firma Qiagen nach Firmenvorschrift eluiert.

Die DNA-Lösung wurde mit 1/10 Volumen 3 M Natrium-Acetat, pH 4,8, versetzt und anschließend wurden 2,5 Volumen 100% Äthanol (kalt) zugegeben. Die Fällung erfolgte bei –70°C oder auf Eis für 30 min. Die DNA wurde 15 min mit 17000 x g bei 4°C abzentrifugiert, einmal mit 70% Äthanol (kalt) gewaschen (Zentrifugation: 10 min, 17000 x g, 4°C) und nach dem Trocknen im Vakuumtrockner in H2O oder TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) aufgenommen.

2.2.6 Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen und Ligation

Der Restriktionsverdau von Insert-DNA, Vektor-DNA und zu analysierender Plasmid-DNA wurde mit entsprechenden Enzymen und entsprechenden 10 x Puffern der Firma BIOLABS durchgeführt. Eine Enzymeinheit verdaut 1 μg DNA in 1-3 h (bei optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen). Insert- und Vektor-DNA für Klonierungen wurden nach dem Verdau auf ein präparatives 1%iges Agarosegel aufgetragen, um die geschnittenen Oligonucleotidfragmente abzutrennen und damit den Klonierungserfolg zu erhöhen. Die Bestimmung der DNA-Konzentration einer Probe erfolgte durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm. 50 μg/ml Doppelstrang-DNA entsprechen
OD260 = 1.

Ca. 200 ng Vektor wurden mit Insertfragment im Verhältnis 1:3-1:5 pro 20 μl Ligationsansatz mit 200 U T4 DNA-Ligase in Ligationspuffer inkubiert. Die Ligation erfolgte bei 22°C für 2 h oder bei 16°C über Nacht.

2.2.7 Anzucht von E.coli

Lösungen:

LB medium (1l)

10 g Baktotrypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl

LB Agar (1l)

10 g Baktotrypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 15 g Agar

LB-Amp-Agarplatten

LB Agar, 50 μg/ml Amp

Amp-Stammlösung: 50 mg/ml Ampicillin in 50% Äthanol

Glycerinkultur: 1 ml einer Übernachtkultur wurde mit 1 ml sterilem 99% Glycerin gemischt und bei –80°C aufbewahrt.

Die E. coli-Kulturen wurden bei 37°C mit einer Frequenz von 180 pro Minute geschüttelt und bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 1-1,5 inkubiert.

2.2.8 Kompetente E. coli-Zellen

Transformationspuffer 1: 100 mM RbCl2, 50 mM MnCl2, 30 mM KAc, 10 mM CaCl2, 15% (w/v) Glycerin, pH 6,8, eingestellt mit 0,2 M Essigsäure.


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Transformationspuffer 2: 10 mM MOPS, pH 7,0, 10 mM RbCl2, 75 mM CaCl2, 15% (w/v) Glycerin.

100 ml LB wurden mit 100 μl einer Übernacht-Kultur angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Die Zellen wurden mit 2500 rpm für 10 min bei 4°C abzentrifugiert und in 30 ml Transformationspuffer 1 resuspendiert und anschließend 2 h auf Eis inkubiert. Danach wurde mit 2500 rpm bei 4°C für 10 min zentrifugiert und die Zellen in 4 ml Transformationspuffer 2 aufgenommen. Die kompetenten Zellen wurden in 200 μl-Aliquoten bei –70°C gelagert.

2.2.9 Transformation

Die Zellen wurden auf Eis aufgetaut. Nach Zugabe von 5-10 μl Ligationsansatz oder anderer Plasmid-DNA (2 ng) wurde der Transformationsansatz 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde ein Hitzeschock von 2 min bei 42°C durchgeführt und danach nochmals 5 min auf Eis inkubiert. Es wurde 1 ml LB Medium zugegeben und 1 h bei 37°C leicht geschüttelt. Dann wurden die Zellen bei 2000 rpm 3 min pelletiert, resuspendiert und ein Volumen von 100 bis 200 μl auf einer LB-Amp-Agarplatte ausplattiert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37°C.

2.2.10 Plasmid-Isolierung („Mini-Präp“ und „Maxi-Präp“)

Zur Analyse der Klone aus der Transformation wurden von der LB-Amp-Agarplatte Einzelkolonien gepickt und über Nacht in 3 ml LB-Amp-Medium bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Die Plasmidisolation erfolgte nach Maniatis et al, 1989. Die Plasmid-DNA aus 1,5 ml Kultur wurde in
50 μl TE-Puffer aufgenommen. Davon wurden 5-10 μl für die Analyse im Restriktionsverdau eingesetzt. Die Verdaue wurden auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen.

Für die Vermehrung von Vektor-DNA wurde nach entsprechender Transformation eine Einzelkolonie in 5 ml LB-Amp-Medium über Nacht bei 37°C geschüttelt. 300 ml LB-Amp-Medium wurden mit 1 ml Übernachtkultur angeimpft und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Die Isolation der Plasmid-DNA erfolgte mit dem „Endofree Maxiprep Plasmid Kit“ der Firma Qiagen.

2.2.11 Zellen und Zellkultur

Die B8 Zellen sind eine embryonale Fibroblasten-Zelllinie der Maus. Sie wurden mit dem MCMV IE1-Gen, welches für pp89 Protein kodiert, stabil transfiziert.

HeLa Zellen: European Tissue Cultur Collection

Medium für HeLa Zellen:

RPMI 1640 Medium

10% FCS

100 U/100 μg/ml Penicillin/Streptomycin

2 mM L-Glutamin


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Medium für B8 Zellen (Vollmedium):

Basal ISCOVE Medium

10% FCS

100 U/100 μg/ml Penicillin/Streptomycin

2 mM L-Glutamin

HeLa und B8 Zellen wurden im Medium bei 37°C unter 5% CO2 kultiviert. Cytolytische T-Lymphozyten wurden wie beschrieben (Pamer, 1994) generiert Das H2O im Inkubator wurde mit 0,0068% Zephiranchlorid versetzt. Das Medium für B8 enthielt zusätzlich 125 μg/ml G418 (Geniticin). Waren die Zellen konfluent, wurden sie nach einmaligem Waschen mit 1 x PBS mit Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst und neu ausplattiert. Die Zentrifugationsschritte erfolgten bei
200 x g für 5 min bei 4°C.

2.2.12 Transfektion mit der Lipid-Methode

Exponentiell wachsende Kulturen wurden einen Tag vor der Transfektion zu ca. 5 x 106 Zellen pro 16 cm-Kulturschale ausplattiert. Für eine Reaktion wurden 30 μg Endofree Vektor, 180 μg Lipid fx2 und 8 ml Serumfreies Medium verwendet. Nach 4 h wurde das Medium der Kulturen entfernt und frisches Medium zugegeben. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert.

2.2.13 Lyse der Zellen

Lysepuffer:

50 mM

Tris-HCl (pH 8,5)

150 mM

NaCl

0,02%

Natriumazid

0,1%

SDS

1%

NP-40

0,5%

Natriumdesoxycholat

1 mM PMSF und 7 μM Aprotinin wurden frisch zugegeben

Das Medium wurde zunächst entfernt und die Zellen mit 1 x PBS gewaschen und 10 min auf Eis inkubiert. Das eisgekühlte Lysispuffer wurde zugegeben, und mit einem Schaber wurden die Zellen gesammelt. Auf Eis wurden die Zelllysate mit einer 21-Spritze 6 mal angesaugt und 10 min bei 17000 x g und 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden mit 4 x Proben-Puffer (Firma Roth) 5 min lang gekocht. Die Proben wurden entweder bei 4°C gelagert oder sofort auf das SDS-Gel aufgeladen. Die gleichen Überstände wurden auch für die Nicht-denaturierende Gelelektrophorese oder die Immunopräzipitation verwendet.


[Seite 14↓]

2.2.14  Trichloressigsäure (TCE)-Präzipitation

Die Proben wurden mit 10% (Endkonzentration) TCE 20 min auf Eis inkubiert und gefällt. Nach Zentrifugation (15 min, 17000 x g, 4°C) wurden die Pellets einmal mit 5% TCA (10 min, 17000 x g, 4°C) und zweimal mit kaltem Aceton (10 min, 17000 x g, 4°C) gewaschen. Das restliche Aceton wurde bei RT oder 37°C verdampft.

2.2.15 SDS-PAGE Elektrophorese

Lösungen:

4 x Sammelgelpuffer: 250 mM Tris HCl pH 6,8, 0,8% SDS

4 x Trenngelpuffer: 150 mM Tris HCl, pH 8,8, 0,4% SDS

Elektrophoresepuffer: 25 mM Tris, 190 mM Glycerin, 0,1% SDS

Die Proben wurden in 4 x SDS-PAGE-Probenpuffer aufgenommen, 5 min bei 95°C im Heizblock erhitzt und anschließend 3 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Um die Proteinmengen auszugleichen, wurden die Proben zuerst im Photometer bei der OD280 gemessen. Für den Lauf durch das Sammelgel wurde eine Spannung von 70V angelegt und beim Übergang der Proteine ins Trenngel wurde die Spannung auf 140V erhöht.

2.2.16 Nicht-denaturierende Gelelektrophorese

Nicht-denaturierende Gelelektrophorese wurde mit dem Phast-System von Pharmacia durchgeführt. Es wurden Gradientengele von 4-15% Acrylamid genutzt. Folgende Laufbedingungen wurden gewählt: 300 Vh bei 10 V, 0,1 mA, 1 W, 4°C.

2.2.17  Dichtegradientenzentrifugation

Mit einem Gradientenmischer wurde ein kontinuierlicher Gradient von 10-40% Glycerin in Beckman SW40-Zentrifugenröhrchen gegossen. 0,3-0,5 ml Proben wurden auf den Gradienten geschichtet und bei 40000 rpm im Beckman SW40-Rotor für 16 h bei 4°C zentrifugiert. Der Gradient wurde von oben nach unten in 600-800 μl Fraktionen aliquotiert. Die Proteine der Fraktionen wurden mit TCE präzipitiert.

2.2.18 Western Blot

Blotpuffer: 14,4 g Glycerin, 3,04 g Tris, auf 1 Liter H2O

Waschpuffer (PBS-T): 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,3 und 0,1% Tween-20


[Seite 15↓]

Nach der SDS-PAGE wurden die aufgetrennten Proteine elektrophoretisch (120 mA bei 4°C über Nacht oder 200mA bei RT 2h) auf Nitrocellelose-Membranen überführt und immunochemischgetestet. Die Membran wurde zuerst mit Ponceau S gefärbt und dann mit 5% Milch (in PBS-T) 1-2 h blockiert. Danach erfolgte die Inkubation mit dem geeigneten Antikörper. Die Detektion der Proteine erfolgte mit dem BM-Chemiluminescence ECL-Kit nach der Vorschrift von Boehringer. Die Röntgenfilme (XDS, XAR von KODAK) wurden in der Entwicklerautomaten „Hyperprocessor“ (Amersham) entwickelt.

2.2.19 Immunpräzipitation (IP)

IP-Puffer:

50 mM

Tris/HCl pH 8,5

150 mM

NaCl

0,02%

Natriumazid

0,1%

SDS

1%

NP-40

0,5%

Natriumdesoxycholat

Um unspezifische Bindungen zu beseitigen, wurden die Überstände (ca. 300 μl) der Zelllysate zunächst mit Protein A-Agarose (30 μl) vorinkubiert (1 h, 4°C, auf dem Schüttler). Nach dem Zentrifugieren (1 min 14000 rpm) wurden die Antikörper (1-3 μg anti-C2 oder anti-S4) zu den Überständen zugegeben und inkubiert (1 h, 4°C, auf dem Schüttler). Danach wurden zu dem Gemisch 60 μl Protein A-Agarose zugegeben und über Nacht bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Nachdem dem Zentrifugieren (1 min 14000 rpm) wurden die Überstände vorsichtig mit einer Absaugpumpe entfernt. Anschließend wurde 1 ml IP-Puffer zugesetzt und 5 min bei 4°C geschüttelt. Diese Schritt wurde 5 mal wiederholt. Anschließend wurden 20 μl 1 x Proben-Puffer zugegeben und 5 min gekocht. Nach dem Zentrifugieren wurden die Proben auf die SDS-Gele aufgetragen und dann Western Blot mit dem anti-Flag Antikörper durchgeführt.

2.2.20 Bestimmung der Proteinkonzentration

Der Protein-Assay ist eine Modifikation der Proteinbestimmung nach Bradford (1976). Zu 200 μl Probe wurden 800 μl Bio-Rad-Lösung zugegeben und gut durchmischt. Für die Erstellung einer Eichkurve wurden BSA-Lösungen mit Konzentrationen von 2, 5, 10, 20 und 50 μg/ml vermessen. Die Messungen wurden in Einweg-Acryl-Küvetten bei einer Wellenlänge von 590 nm gegen Wasser durchführt. Die Differenz aus dem Messwert bei 590 nm wurde gegen die eingesetzte Proteinmenge der entsprechenden Eichlösung aufgetragen und die Proteinmenge der Probe anhand der Eichgeraden ermittelt.

2.2.21 Expression und Aufreinigung der GST-Fusionsproteine

Puffer 1: Tris-HCl pH 8,4, NaCl 150 mM, MgCl2 2,5 mM

Puffer 2: Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 2,5 mM


[Seite 16↓]

  1. 300 ml LB-Amp plus 2% Glucose (die Zugabe von Glucose vermindert die basale Expression) wurden mit 3 ml einer Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,6-0,8 geschüttelt.
  2. Induktion wurde mit 1mM IPTG (End-Konzentration) für 1 h bei 30°C unter schwachen Schütteln inkubiert (100 rpm).
  3. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 rpm, 15 min bei 4°C in der Sorvall-Zentrifuge geerntet (GS-3 Rotor).
  4. Das Pellet wurde in 15-20 ml eiskaltem 1 x PBS resuspendiert und dann zweimal unter der French Press bei 800-1000 psi gepresst.
  5. Nach Zentrifugation für 15 min bei 14000 rpm und 4°C in der Sorvall (SS-34 Rotor) wurde der Überstand in 80 mg Glutathion-Agarose (Agarose in 15 ml Bidest 2 h gequollen, anschließend in 1 x PBS äquilibriert) auf einer Säule überführt.
  6. 3 x Zellaufschluß wurde auf die Säule geben und langsam mit 4 x Säulenvolumen 1 x PBS gewaschen, mit 2 x Säulenvolumen Puffer 1 äquilibriert und dann in 1,8 ml 1 x Thrombinpuffer mit 1 U (ca. 2 μl) Thrombin über Nacht bei leichtem Schütteln inkubiert.
  7. Zur Sicherheit wurden nach dem Auslaufen des Thrombinpuffers 1,8 ml Puffer 2 auf die Säule gegeben, ca. 10 min bei 4°C auf geschüttelt und dann ausgelaufen.
  8. Zur Bindung des biotinylierten Thrombins an Streptavidin-Agarose 30 min bei 4°C im Drehteller inkubiert. Pro Enzymeinheit wurden 20 μl 50%ige Streptavidin-Agarose zugegeben (Capture). Die Abtrennung der Streptavidin-Agarose erfolgte mit einem speziellen Filter (Spin Filter „Thrombin-Cleavage-Capture-Kit) durch Zentrifugation bei 1000 rpm 3 min lang.
  9. Die Proteinbestimmung erfolgte, nachdem die Proben nach Bedarf konzentriert wurden. Danach erfolgte die Zugabe von Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 20% und die Lagerung der Aliquots bei –70°C.
  10. Die Regeneration der Glutathion-Agarose wurde mit 1 ml Glutathion-Elutionspuffer, 10 min bei RT durchgeführt (Drehinkubator). Danach erfolgte das Waschen mit 25 ml TBE + 0,5 M NaCl, anschließend mit Bidest, dann mit 0,1 M NaAc pH 4 + 0,5 M NaCl und danach nochmals mit Bidest. Die Lagerung erfolgte 1 M NaCl bei 4°C. Vor dem erneuten Gebrauch wurde mit 1x PBS aquilibriert.

2.2.22  Durchführung von Proteaseassays mit fluorogenen Substraten

Substratpuffer:

50 mM

Tris pH 7,5

25 mM

KCl

10 mM

NaCl

1 mM

MgCl2

0,1 mM

EDTA

1 mM

DTT, frisch zugesetzt

Stammlösung des Peptidsubstrats: 4 mM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC in DMF gelöst

Die Assays wurden in der Regel in 100 μl Substratpuffer mit 0,1 μg 20S Proteasom und 100 μM Peptidsubstrat (Endkonzentration) durchgeführt. Es wurden schwarze 96-Lochplatten verwendet. Die Fluoreszenz der vom Substrat abgespaltenen Gruppe (AMC) wurde mit dem „Fluostar STL“ oder „Fluoroscan II“ (Labsystems) bei einer Exzitation von 390 nm und einer Emission von 460 nm bei RT oder bei 37°C gemessen. Der „Gain“ betrug 20, die Anzahl der „Blitze“ 10. Die Fluoreszenz [Seite 17↓]wurde in ΔF/min angegeben.

  1. Titration ansteigender Mengen von Tat-Peptiden gegen eine konstante Menge des 20S Proteasoms.

    0,1 μg 20S Proteasom wurden mit je 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,15625 und 0 μg/ml der Tatpep1, Tatpep2, Tatpep3 und Tatpep4 30 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde das Peptidsubstrat zugegeben und die Fluoreszenz mit dem „Fluoroscan II“ (Labsystems) bei 37°C gemessen.
  2. Titration ansteigender Mengen von Tat-Peptiden gegen eine konstante Menge des nativen 11S Regulators und des 20S Proteasoms.

    0,1 μg 20S Proteasom und 0,16 μg nativer 11S Regulator wurden mit 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 und 0 μg/ml Tatpeptide 1, 2, 3 und 4 30 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde das Peptidsubstrat zugegeben und die Fluoreszenz mit dem „Fluoroscan II“ (Labsystem) bei 37°C gemessen.
  3. Titration ansteigender Mengen von REGαwt oder REGαm gegen eine konstante Menge des 20S Proteasoms.

    0,1 μg 20S Proteasom wurden mit 120, 60, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,8725 und 0 μg/ml REGαwt oder REGαm 30 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde das Peptidsubstrat zugegeben und die Fluoreszenz mit dem „Fluostar STL“ bei RT gemessen.
  4. Titration ansteigender Mengen von REGαwt/REGβ oder REGαm/REGβ gegen eine konstante Menge des 20S Proteasoms.

    0,1 μg 20S Proteasom wurden mit 20, 10, 05, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 und 0 μg/ml REGαwt und REGβ oder REGSαm und REGβ 60 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde das Peptidsubstrat zugegeben und die Fluoreszenz mit dem „Fluostar STL“ bei RT gemessen.
  5. Titration ansteigender Mengen von REGαwt gegen eine konstante Menge der REGαwt/REGβ und des 20S Proteasoms.

    0,1 μg 20S Proteasom und 0,3 μg REGαwt, 0,3 μg REGβ wurden mit 30, 20, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0 μg/ml REGαwt 60 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde das Peptidsubstrat zugegeben und die Fluoreszenz mit dem „Fluostar STL“ bei RT gemessen.

  6. Titration ansteigender Mengen von REGαm gegen eine konstante Menge der REGαwt/REGβ und das 20S Proteasom.

    0,1 μg 20S Proteasom und 0,3 μg REGαwt, 0,3 μg REGβ wurden mit 30, 20, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 und 0 μg/ml REGαm 60 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde das Peptidsubstrat zugegeben und die Fluoreszenz mit dem „Fluostar STL“ bei RT gemessen.
  7. Titration ansteigender Mengen der Tatpeptide gegen eine konstante Menge des 20S Proteasoms.

    0,1 μg 20S Proteasom wurden mit 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,15625 und 0 μM/ml Tatpeptide 1, 2 und 5 30 min bei 37°C vorinkubiert. Anschließend wurde das Peptidsubstrat zugegeben und die Fluoreszenz mit dem „Fluostar STL“ bei RT gemessen.


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Die Daten wurden nach folgender Formel analysiert:

V =

Vmax1 + Vmax2[Tat]

(K1 + [Tat]) (K2 + [Tat])

Dabei wurden für das Tat-Protein und den 11S Regulator zwei Bindungsstellungen am 20S Proteasom angenommen. Die Bedeutungen der kinetischen Konstanten Vmax1, Vmax2, K1 und K2 sind durch folgende Gleichungen erklärt:

Vmax1 = (K1TatK2Tat/K1REG + K2REG) [REG]2

Vmax2 = Vmax (K1Tat/K1REG + K2Tat/K2REG) [REG]

K1 = K1Tat(1 + [REG]/K1REG)

K2 = K2Tat(1 + [REG]/K2REG)

2.2.23 Dot-Blot

Entsprechend der Gebrauchsanweisung wurde die Nitrocellulose Membran in die Dot-Blot-Apparatur eingelegt. 1 µg 20S Proteasom (0,55 mg/ml) wurde auf jedes Loch gegeben. Nach 15 min wurde mit Waschpuffer (PBS-T, wie in 2.2.17) 5 min lang 3 mal gewaschen. Die Membran wurde mit Blockpuffer 2 h bei RT oder Übernacht bei 4ºC blockiert. Die geschnittenen Membranstreifen wurden mit unterschiedlichen Proteinen (REGα und Tat Peptide) 2 h bei RT unter ständigem Schütteln inkubiert (REGα und die Tat-Peptiden wurden zuerst 30 min bei 37ºC vorinkubiert). Nach dem Waschen (6 mal, je 5 min) wurde mit dem Anti-REGα Antikörper (1:10000) und weiterem Waschen (6 mal, je 5 min) mit dem zweiten Antikörper (1:10000) inkubiert. ECL erfolgte wie Gebrauchsanweisung.

2.2.24 Inkubation der Tat Peptide und des vollständiges Tat-Proteins mit B8 Zellen

Am ersten Tag wurden die B8 Zellen in 6-well-Platten (je ca. 0,5 x 106 Zellen pro Well) verteilt. Am zweiten Tag wurden Tatpep1, Tatpep5, (je 2 μg/ml, Endkonzentration) und das rekombinante Tat-Protein (1,6 μg/ml, Endkonzentration) zu den B8 Zellen zugesetzt. Nach 24 h wurden die behandelten und die unbehandelten B8 Zellen (Kontrolle) geerntet. Nach der Zellzählung wurden gleiche Mengen der B8 Zellen zum CTL-Assay durchgeführt.

2.2.25 Herstellung stabiler Transfektanten von REGαwt und REGαm

Lösungen:

1 mg/ml G418 (1 g G418 in 5 ml PBS + 5 ml 1 M HEPES, pH 7,7)

2 M CaCl2


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2 x HBS (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HPO4, 12 mM Glucose, 50 mM HEPES pH 7,05)

10 μg des Konstrukts pcDNA3.1 HisC REGαwt cDNA oder pcDNA3.1 HisC REGαm und 2 μg des pLXSP wurden mit dem 0,1 fachen Volumen 3 M NaAc (pH 5,1) und dem 2,5 fachen Volumen 99-100% Äthanol bei -70°C präzipitiert, danach mit 70% Äthanol gewaschen und in 440 μl sterilem bidest. H2O aufgenommen. 500 μl 2 x HBS und 62 μl 2 M CaCl2 wurden innerhalb von einer Minute zu dem Transfektionsansatz unter langsamem Schütteln zugesetzt und bei RT für 30 min inkubiert. Der gesamte Ansatz wurde dann zu 1 x 106 B8 Zellen pipettiert und 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeit wurde das Vollmedium gewechselt und die Zellen wurden für weitere zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurden 104 Zellen/Well, 103 Zellen/Well und 2 x 102 Zellen/Well in eine 96 Well-Mikrotiterplatte ausplattiert. Dieses Grenzverdünnungsverfahren wurde eingesetzt, um letztendlich eine Klonalität, dass heißt, eine Zelle pro Well zu erreichen. Nach ca. zwei Tagen (70% konfluent gewachsene Zellen) wurden die B8 REGαwt - bzw. B8 REGαmt-Transfektanten mit Puromycin (2,5 μg/Well) versetzt. Die Klone, die das Puromycin-Resistenz-Gen enthielten, konnten unter diesen Bedingungen wachsen und wurden dann weiter unter Selektionsdruck kultiviert. Mittels Western Blot (mit dem anti-Xpress Antikörper) wurden die positiven Klone ausgewählt und eingefroren.

2.2.26  CTL-Messung

Dieser Test wurde durchgeführt, um die Antigenpräsentation der Zielzellen (Targetzellen) zu messen. Hierzu wurden die Targetzellen mit 51Chrom markiert und anschließend zusammen mit cytolytischen T-Lymphozyten (CTL) inkubiert. Da die CTL die Targetzellen lysieren, wenn sie ihr Antigen auf deren Oberfläche erkennen, ist die freigesetzte Radioaktivität im Überstand ein Maß für die spezifische Lyse.

2 x 105 Targetzellen wurden 2 Stunden mit 20 μCi Na51CrO4 markiert und anschließend dreimal mit Vollmedium gewaschen. Jeweils 5000 markierte Zellen wurden in einer Mikrotiterplatte (96 Well-Platte) zu den titrierten Effektorzellen (CTL) hinzugegeben. Um die räumliche Nähe von CTL und Targetzellen zu gewährleisten, wurde die Platte 2 min bei 200 x g zentrifugiert und anschließend für 4 h bei 37°C in einem Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden 100 μl Kulturüberstand abgenommen und die freigesetzte Radioaktivität bestimmt. Zur Bestimmung der Gesamtaktivität wurden die Targetzellen mit 1% Triton versetzt und die Radioaktivität ebenfalls in 100 μl bestimmt. Die Spontanlyse stellt die freigesetzte Radioaktivität (in 100 μl) in Abwesenheit der CTL dar. Die spezifische Lyse berechnet sich nach der Gleichung:

Spezifische Lyse (%) =

cpm (Probe) –cpm (Spontanlyse)

x 100

cpm (Gesamtaktivität) – cpm (Spontanlyse)

2.2.27 Vergleich der Struktur des Tat-Proteins mit der von REGα

Mittels automatischer Superposition in DIP (Dictionary of Interfaces in Proteins) wurden die Strukturdaten des Tat-Proteins (PDB-code: TBC) und mit denen des REGα (PDB-code: AVO) verglichen (Preissner et al., 1998). Um die Ähnlichkeit zwischen dem Tat-Protein und dem REGα zu testen (Preissner et al., 1999), wurde die Struktur des Tat-Proteins in die Segmente zergliedert. Nur wenige sekundäre strukturale Elemente konnten gefunden wurden. Es wurden nur die zugänglichen Region des Tat-Proteins mit dem REGα verglichen. Die Struktur des humanen 20S Proteasoms wurde von Gille et al. übernommen (Gille et al., 2000).


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26.05.2005