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3  Ergebnisse

3.1 Die Aminosäuren 37-72 des Tat-Proteins sind essentiell für die Bindung an die Proteasomen in HeLa Zellen

Vor 3 Jahren hat unsere Arbeitsgruppe gezeigt, dass das Tat-Protein an das 20S Proteasom und den 19S Regulator des 26S Proteasoms in vitro binden kann. In der vorliegenden Arbeit habe ich getestet, ob diese Bindung auch in vivo nachzuweisen ist. Die eukaryotischen Vektoren mit Flag-Tat cDNA oder mit der Flag-ΔTat cDNA wurden in HeLa Zellen mittels Lipofektion (Lipid-Method) (ca. 3 x 107 HeLa Zellen, ca. 90 μg Plasmid-cDNA) transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die Überstände für die Immunpräzipitation verwendet.

300 μl des mit dem Flag-Tat transfizierten HeLa Zelllysats wurden bei jedem Versuch eingesetzt. Außerdem wurden 300 μl Lysat von nicht-transfizierten HeLa Zellen als Kontrolle benutzt. 2 μg anti-C2 Antikörper wurden zur Präzipitation des 20S Proteasoms verwendet und zunächst mit 300 μl Lysat der transfizierten HeLa Zellen oder mit 300 μl Lysat der nicht-transfizierten HeLa Zellen inkubiert. 2 μl anti-S4 Antikörper wurden zur Präzipitation des 19S Regulators verwendet und ebenfalls mit 300 μl Lysat der mit Flag-Tat transfizierten HeLa Zelllysate inkubiert. Die Immunpräzipitate wurden im Westen Blot mit dem anti-Flag Antikörper (1:2000) getestet. In der Abb. 3.1A ist eine deutliche Bande in der Immunpräzipitation zu sehen. Das Ergebnis zeigt, dass das exprimierte Tat-Protein sowohl an das 20S Proteasom als auch an den 19S Regulator des 26S Proteasoms in HeLa Zellen bindet. In den nicht-transfizierten (Kontrolle) HeLa Zellen ist keine Bande im Präzipitat zu sehen.

Die Bindung des Tat-Proteins an intrazelluläre Proteasomen wurde durch nicht-denaturierende Gelelektrophorese bestätigt. 2 μl Lysate der mit Flag-Tat oder Flag-ΔTat transfizierten HeLa Zellen wurden auf Gradientengele (4-15% Acrylamid) aufgetragen, im Phast-System aufgetrennt und die Proteine auf Nitrocellulose geblottet. Im Western Blot wurde der anti-Flag Antikörper (1:2000) benutzt. In der Abb. 3.1B ist zu sehen, dass das exprimierte vollständige Tat-Protein mit dem 26S Proteasom und dem 20S Proteasom unter nativen Bedingungen co-migriert. Im Gegensatz dazu kann das exprimierte Fragment ΔTat 37-72 nicht nachgewiesen werden und läuft vermutlich unter diesen Bedingungen aus dem Gradientengel aus.

Ähnliche Resultate wurden mit der Dichtgradientenzentrifugation erzielt. 300 μl Lysate von Flag-Tat oder Flag-ΔTat transfizierten HeLa Zellen wurden auf 12 ml 10-40% Glyceringradienten vorsichtig aufgeladen. Nach dem Zentrifugieren wurden die Gradienten von oben nach unten in 18 Fraktionen (je 0,68 ml) aliquotiert und anschließend die Proteine der Fraktionen mit TCE präzipitiert. Die präzipitierten Proteine wurden in Probenpuffer aufgenommen und über SDS-PAGE getrennt. Im anschließenden Western Blot wurde der anti-Flag Antikörper verwendet. In der Abb. 3.1C ist gezeigt, dass die Verteilung des exprimierten vollständigen Tat-Proteins der Verteilung des 26S Proteasoms und des 20S Proteasoms in dem 10-40% Glyceringradienten entspricht. Im Gegensatz dazu liegt das exprimierte Tat-Fragment (Tat Δ37-72-Protein) in den Fraktionen mit geringer Dichte vor.

Die Experimente demonstrieren, dass das exprimierte Tat-Protein an das endogene 20S Proteasom und das 26S Proteasom bindet. Die Bindungsstelle des Tat-Proteins befindet sich zwischen den Aminosäuren 37-72.

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Abb. 3.1: Die Aminosäuren 37-72 von dem Tat-Protein sind essentiell für die Bindung an die Proteasomen in HeLa Zellen. A, Immunpräzipitation: Die Vektoren pcDNA3 mit der Flag-Tat cDNA oder mit der Flag-ΔTat cDNA wurden in HeLa Zellen transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die Überständen für die Immunpräzipitation verwendet. Der anti-C2 Antikörper wurde zur Präzipitation des 20S Proteasoms und der anti-S4 Antikörper zur Präzipitation des 19S Regulators (oder 26S Proteasom) verwendet. Das Lysat der nicht-transfizierten HeLa Zellen wurde mit dem anti-C2 Antikörper als Kontrolle präzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden im Western Blot mit dem anti-Flag Antikörper getestet. B, Nicht-denaturierende Geleletrophorese: Die Lysate (wie in A) wurden auf die nicht-denaturierende Geleletrophorese aufgetragen und im Phast-System aufgetrennt. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose geblottet. Im Western Blot wurde der anti-Flag Antikörper benutzt. Die Positionen des 26S Proteasoms (26S), des 19S Regulator (19S) und des 20S Proteasoms wurden im gleichen Blot mit dem anti-S4 Antikörper und dem anti-C2 Antikörper identifiziert. C, Western Blot mit Fraktionen von Glyceringradienten: Die Lysate (wie in A) wurden auf 10-40% Glyceringradienten aufgeladen. Nach dem Zentrifugieren wurden die Gradienten von oben nach unten in 18 Fraktionen (je 0,68 ml) aliquotiert. Die Proteinpräzipitate (TCE-Fällung) wurden im Western Blot mit dem anti-Flag Antikörper getestet.

3.2 Die basische Domäne des Tat-Proteins spielt bei der Inhibition des 20S Proteasoms eine entscheidende Rolle

Um die Wirkung der Tat-Region 37-72 auf das Proteasom besser untersuchen zu können, wurde ein Tat-Peptid 37-72 synthetisiert (Tatpep1). Außerdem wurden veränderte Versionen von Tatpep1 [Seite 22↓]synthetisiert und ihre Wirkung getestet. In Tatpep2 wurde die basische Domäne (AA 49-57) deletiert. Tatpep3 hat eine Deletion des C-terminalen Bereichs von Tatpep1. In Tatpep4 wurde die Kern-Region deletiert (siehe Abb. 3.2A). Die Tat-Peptide 1-4 wurden mit isoliertem 20S Proteasom getestet. 0,1 μg 20S Proteasom wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen der vier Tat-Peptide 30 min bei 37°C vorinkubiert. Mit Hilfe von fluorogenen Substraten lässt sich die Inhibition des 20S Proteasoms durch die Tat-Peptide im in vitro-System untersuchen. Die Freisetzung der fluoreszierenden Substanz AMC ist Maß für die Aktivität des 20S Proteasoms. Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC ist ein Substrat der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität (Schnitt nach hydrophoben Aminosäuren) des Proteasoms. Das vollständige Tat-Protein wurde als positive Kontrolle benutzt. Zur Berechnung der kinetischen Parameter wurde ein Modell verwendet, dass von zwei Bindungsstellen des Tat-Proteins am 20S Proteasom ausgeht. Aus den Hemm-Kurven und den kinetischen Parametern (Abb. 3.2B) ist ersichtlich, dass der Hemmeffekt des Tatpep1 auf das 20S Proteasom sehr ähnlich wie dem vollständigen Tat-Proteins ist. Durch die Deletion der basischen Domäne ging die Hemmung verloren, während die Deletion des C-terminalen und des Kern-Bereichs wenig Einfluß hatten.

Abb. 3.2: Der basische Bereich des Tat-Proteins spielt bei der Inhibition des 20S Proteasoms eine entscheidende Rolle. A, Sequenzen der Tat-Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4, die in den Experimenten verwendet wurden. B, Ansteigende Mengen des vollständigen Tat-Proteins und der Tat-Peptide wurden gegen eine konstante Menge des 20S Proteasoms in Anwesenheit von Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA titriert. Die Peptidaseaktivität wurde als ΔF (F = Fluoreszenz) pro min und als relative Aktivität (1.0 = 20 ΔF/min pro μg des Proteasoms) berechnet. Die Punkte sind experimentelle Daten. Die Kurven wurden mittels eines Modells mit zwei Bindungsstellen des Tat-Proteins am 20S Proteasom berechnet (siehe 2.2.22). Die berechneten kinetischen Konstanten Vmax, K1 und K2 für das vollständig Tat-Protein und die Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4 sind in der Tabelle zusammengefasst. Die Exprimente wurden viermal unabhängig wiederholt.


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3.3 Das Tat-Peptid 37-72 konkurriert mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom

In früheren Experimenten hatten wir beobachtet, dass das Tat-Protein mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom konkurriert. Aus diesem Grund wurden die Tat-Peptide1-4 mit dem 20S Proteasom (je 0,1 μg) und dem isolierten humanen 11S Regulator (je 0,16 μg) 30 min bei 37°C vorinkubiert und dann das fluorogene Substrat zugegeben. In diesen Experimenten war das Verhältnis des 20S Proteasoms zum 11S Regulator ungefähr 1:6. Der 20S Proteasom-11S Regulator Komplex hat unter diesen Bedingungen etwa 50% seiner maximalen Aktivität. Die basale 20S Proteasomaktivität wurde etwa 20 fach stimuliert. Die Abb. 3.3 zeigt, dass das Wildtyp Tat-Peptid 37-72 (Tatpep1) mit dem 11S Regulator konkurriert. Die Peptide Tatpep2, Tatpep3 und Tatpep4 sind nicht in der Lage, effektiv mit dem 11S Regulator zu konkurrieren.

Abb. 3.3: Das Tat-Peptid 37-72 konkurriert mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom. Ansteigende Mengen der Tat-Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4 wurden gegen eine konstante Menge des 20S Proteasoms und des isolierten 11S Regulators (Molares Verhältnis des 20S Proteasoms und des 11S Regulator = 1 : 6) in Anwesenheit von Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA titriert. Die Aktivität wurde als ΔF (F = Fluoreszenz) pro min bestimmt und als relative Aktivität (1.0 = 20-fache Baseline-Aktivität mit dem 20S Proteasom alleine) ausgedrückt. Die Punkte sind experimentelle Daten. Die Kurven wurden mittels eines Modells mit zwei Bindungsstellen des Tat-Proteins am 20S Proteasom berechnet (siehe 2.2.22). Die berechneten kinetischen Konstanten Vmax, K1 und K2 für die Tat-Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4 sind in der Tabelle zusammengefasst. Die Experimente wurden viermal unabhängig wiederholt.

3.4 Identifizierung einer gemeinsamen Struktur im Tat-Protein und in der 11S Regulator α-Untereinheit (REGα)

Da es keine Ähnlichkeit zwischen dem Tat-Protein und dem REGα bei einem einfachen Sequenzvergleich gibt, haben wir die räumliche Struktur des Tat-Proteins und die des REGα verglichen (Kooperation mit Dr. R. Preissner, Institut für Biochemie).

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Abb. 3.4: Identifizierung einer gemeinsamen Struktur im Tat-Protein und in der 11S Regulator α-Untereinheit (REGα). A, Darstellung der identifizierten Struktur im Tat-Protein und in REGα. Die an den Oberflächen befindlichen Reste Lys236 and Lys239 von REGα und Lys51 und Arg52 des Tat-Proteins sind mit hellem Blau und die Aminosäuren Glu235 (REGα) und Asp67 (Tat-Protein) mit Gelb gekennzeichnet. B, Die heptamere Struktur von REGα wurde durch rote Zylinder (α-Helix) und grüne Bänder (Schleifenregion) dargestellt. Für eine der sieben Untereinheiten wurden N und C Termini und die Aktivierungsdomäne gekennzeichnet . Die gekennzeichneten drei Reste (Glu235, Lys236 und Lys239) sind Teil einer kurzen α-Helix, die sich in der Nähe des C Terminus befindet. Das Rückrad des Tat-Proteins wurde durch ein rotes Band dargestellt, welches in der Region der Aminosäuren 37 bis 72 weiß ist. C, Darstellung des humanen 20S Proteasoms mit seiner sekundären Struktur (rote Zylinder: α-Helix; Gelbe Pfeile: β-Sheets; grüne Bänder: Schleifen). Die Hauptkette des heptameren REGα wurde durch ein violettes Band dargestellt. Die Reste 235, 236 und 239 sind gekennzeichnet. Es wurde eine heptamere Ringstruktur aus 7 Tat-Molekülen konstruiert. Die gekennzeichneten Reste 51, 52 und 67 liegen in ähnlicher Position zum 20S Proteasom wie die des REGα.

Unsere Daten zeigen, dass eine ähnliche Struktur in beiden Proteinen vorliegt. Diese Struktur wird durch die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 des Tat-Proteins und die Aminosäuren Glu235, Lys236 und Lys239 von REGα gebildet. Die Struktur ist auf der Oberfläche von beiden Proteinen lokalisiert (Abb. 3.4A) und bildet eine geladene α-Helix in REGα (Abb. 3.4B). Ausgehend von der Struktur des PA26-20S Komplexes (Whitby et al., 2000) und der humanen REGα-Struktur wurde die Bindung des REGα Heptamers an den humanen 20S Proteasom α-Ring simuliert (Abb. 3.4C). Das Modell zeigt deutlich, dass die identifizierte Struktur des REGα an den 20S Proteasom α-Ring im 11S-20S Komplex bindet. Darüber hinaus wurde ein heptamerer Ring bestehend aus 7 Tat-Molekülen konstruiert. Die identische Struktur des Tat-Proteins liegt in ähnlicher Position zum 20S Proteasom wie die des REGα.

3.5 Herstellung des rekombinanten REGαwt, REGαm und REGβ

Um die Rolle der identifizierten Struktur im 11S Regulator eingehend zu studieren, wurden die Aminosäuren Glu235 und Lys236 durch Ala mittels Site-directed Mutagenesis substituiert. Die rekombinanten Proteine wurden als GST-Fusionsproteine exprimiert und aufgereinigt. Der GST-Anteil des Fusionsproteins bindet hochspezifisch an die Glutathion-Agarose, wodurch das Protein in einem einzigen Affinitäts-chromatographischen Schritt mit einem Reinheitsgrad von bis zu 90% isoliert werden konnte. Die Thrombinschnittstelle zwischen GST und dem gewünschten Protein ermöglichte die Abspaltung und Abtrennung des GST-Anteils durch Verdau des Fusionsproteins im Glutathion-Agarose-gebundenen Zustand. Die in den nachfolgenden Versuchen eingesetzten rekombinanten Proteine REGαwt, REGαmt und REGβ wurden auf diese Weise präpariert. Weil geringe Mengen an Thrombin einen Einfluss auf die Aktivität des 20S Proteasoms haben könnten, wurde Streptavidin-Agarose zugegeben, um das biotinylierte Thrombin zu entfernen.

Die aufgereinigten REGαwt, REGαm und REGβ wurden in der SDS-PAGE getestet (Abb. 3.5A). Die Reinheit der Thrombin-verdauten rekombinanten Proteine beträgt etwa 95% (Daten nicht gezeigt). Die aufgereinigten Proteine haben die richtige Größe (ca. 30 kD) und mittels Immunoblot wurde die Identität der Proteine nachgewiesen (Abb. 3.5B).

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Abb. 3.5: Herstellung der rekombinanten REGαwt, REGαm und REGβ Proteine. A, Coomassiegefärbte SDS-Gele nach Proteinaufreinigung: 1) Molekulargewichtsmarker; 2) Thrombinverdautes, rekombinantes REGαwt; 3) Thrombinverdautes, rekombinantes REGαm; 4) Thrombinverdautes, rekombinantes REGβ. B, Western Blot: 1) bis 4) sind wie in Abb. 3.5A. 2 und 3 wurden mit dem anti- REGα Antikörper inkubiert. 4 wurde mit dem anti- REGβ Antikörper inkubiert.

3.6 Messung der Chymotrypsin-ähnlichen 20S Proteasom-Aktivität in Anwesenheit von REGαwt, REGαm mit oder ohne REGβ in vitro

In den folgenden Experimenten wurden 0,1 μg 20S Proteasom und 100 μM Peptidsubstrat (Endkonzentration) eingesetzt. Die Fluoreszenz wurde bei RT gemessen. Im ersten Schritt wurden ansteigende Mengen der rekombinanten REGαwt oder REGαm Proteine gegen konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität ist abhängig von der eingesetzten Menge an REGαwt (Abb. 3.6A). REGαm war nicht in der Lage, das 20S Proteasom zu stimulieren. Nun wurden ansteigende Mengen der Kombinationen aus den rekombinanten REGαwt + REGβ oder REGαm + REGβ gegen konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Die Daten zeigen (Abb. 3.6B), dass die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität abhängig von der eingesetzten Menge an REGαwt + REGβ ist. Die Kombination von REGαm + REGβ zeigt dagegen keine Stimulierung.

Es wurden ansteigende Mengen des rekombinanten REGαwt gegen konstante Mengen der rekombinanten REGαwt + REGβ und konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Zu konstanten Mengen an REGαwt (0,3 μg) und REGβ (0,3 μg) wurden ansteigende Mengen von REGαwt eingesetzt. Dabei wurde eine Stimulierung bei niedrigen Konzentrationen beobachtet. Die Bindungsstellen des 11S Regulators am 20 S Proteasom sind unter diesen Bedingungen nicht gesättigt. Daher wird wahrscheinlich die Aktivität des 20S Proteasoms bis zu einem Optimum [Seite 27↓]stimuliert. Dann führen ansteigende REGαwt Konzentrationen zur Konkurrenz mit dem REGαwt + REGβ Komplex um die Bindungsstelle am 20S Proteasom. Das führt zur Hemmung der Peptidaseaktivität (siehe Abb. 3.6C). Danach erfolgte die Titration mit ansteigenden Mengen von REGαm gegen konstante Mengen der rekombinanten REGαwt + REGβ und konstante Mengen des 20S Proteasoms. Unter diesen Bedingungen kam es zu einer Hemmung (siehe Abb. 3.6D). Diese Daten könnten so interpretiert werden, dass die mutierte REGαm Untereinheit zwar noch an das 20S Proteasom bindet und den 11S Regulator verdrängt, aber nicht mehr in der Lage ist, das 20S Proteasom zu stimulieren.

Abb. 3.6: Messung der Chymotrypsin-ähnlichen 20S Proteasom-Aktivität in Anwesenheit von REGαwt, REGαm mit oder ohne REGβ in vitro. A, Ansteigende Mengen der rekombinanten REGαwt oder REGαm Proteine wurden gegen konstante Mengen des 20S Proteasoms in Anwesenheit von Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA titriert. Die Fluoreszenz wurde bei RT gemessen. Die Kurve und die kinetischen Konstanten wurden mit dem gleichen Modell wie in Abb. 3.2B berechnet. B, Ansteigende Mengen der Kombinationen aus den rekombinanten REGαwt + REGβ oder REGαm + REGβ wurden gegen konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Die Fluoreszenz wurde wie in A gemessen und berechnet. C, Ansteigende Mengen der rekombinanten REGαwt wurden gegen konstante Menge der rekombinanten REGαwt + REGβ und konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Die Fluoreszenz wurde wie in A gemessen und berechnet. D, Ansteigende Mengen von REGαm wurden gegen konstante Mengen der rekombinanten REGαwt + REGβ und konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Die Fluoreszenz wurde wie in A gemessen und berechnet.

3.7 Die Mutation der rekombinanten REG α-Untereinheit hat keinen Einfluss auf die Komplexbildung mit sich selbst oder mit dem REGβ oder mit dem 20S Proteasom

Für die 11S Regulator α-Untereinheit wurden eine Bindungsstelle (Aminosäuren 240-249) und eine Aktivierungsstelle (Aminosäuren 141-149) für das 20S Proteasom beschrieben. Es ergab sich nun die Frage, warum REGαm seine Aktivität verloren hatte. Wenn REGαm die Aktivierung des 20S Proteasoms, also das Gating, verhindert, muß die Mutante in der Lage sein Komplexe mit sich selbst, mit REGβ und mit dem 20S Proteasom zu bilden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Verteilung von REGαm (24 μg) und REGαwt (24 μg) in den Fraktionen von 10-40% Glyceringradierten verglichen. Darüber hinaus wurden die Kombinantionen aus rekombinantem REGαwt (12 μg) oder REGαm (12 μg) mit dem REGβ (12 μg) verglichen. Nach dem Glyceringradienten (12 ml) wurden die Proben in 14 Fraktionen (ca. 800 μl) aufgeteilt und im Western Blot mit dem anti-REGα Antikörper oder mit dem anti-REGβ Antikörper getestet. Es wurde nachgewiesen (Abb. 3.7A), dass die Verteilung des mutierten REGαm Untereinheit sehr ähnlich der von REGαwt ist. Das heißt, dass das REGαm heptamere Komplexe bilden kann wie REGαwt. Darüber hinaus war auch die Verteilung der Kombinantion aus REGαm + REGβ gleich wie die der REGαwt + REGβ. Das heißt, dass REGαm haxamere oder heptamere Komplexe mit REGβ bilden kann.

Interessant war auch die Frage, ob REGαm an das 20S Proteasom binden kann. Dazu wurden REGαm (12 μg) + REGβ (12 μg) oder REGwt (12 μg) + REGβ (12 μg) mit dem 20S Proteasom 30 min bei 37°C vorinkubiert. Das molare Verhältnis vom 11S Regulator zum 20S Proteasom war 3 : 2. Nach dem Zentrifugieren wurden die Proben in 18 Fraktionen (ca. 680 μl) aufgeteilt. Für die Western Blot Analyse wurden der anti-C2 (20S Proteasom) Antikörper und anti-REGβ Antikörper verwendet. Die Experimente ergaben eine identische Verteilung des 20S Proteasoms in 4 Experimenten (Abb. 3.7B). Darüber hinaus ergab sich eine nahezu identische Verteilung der Kombinantion aus REGαm + REGβ und der Kombinantion aus REGαwt + REGβ. Daraus schlussfolgerten wir, dass die Mutante REGαm keinen Einfluss auf die Bindung des 11S Regulators an das 20S Proteasom hat. Um die Wechselwirkung von REGαm alleine mit dem Proteasom zu untersuchen, wurden Dot-Blots durchgeführt. Die Ergebnisse der Abb. 3.8C zeigen, dass auch REGαm alleine die Fähigkeit besitzt, an das 20S Proteasom zu binden.

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Abb. 3.7: Die Mutation der rekombinanten REGα Untereinheit hat keinen Einfluss auf die Komplexbildung mit sich selbst oder mit dem REGβ oder mit dem 20S Proteasom. A, Die Komplexbildung des REGα mit sich selbst oder mit dem REGβ. Die Verteilungen von REGαwt, REGαm, REGαwt + REGβ und REGαm + REGβ wurden in den Fraktionen von 10-40% Glyceringradierten verglichen. Die Gradienten wurden in 14 Fraktionen (ca. 800 μl) aliquotiert und im Western Blot mit dem Anti-REGα Antikörper oder mit dem Anti-REGβ Antikörper getestet. B, Komplexbildung des REG mit dem 20S Proteasom. Die Verteilungen von REGαwt + REGβ und REGαm + REGβ wurden mit der des 20S Proteasoms in den Fraktionen von 10-40% Glyceringradierten verglichen. Die Gradienten wurden in 18 Fraktionen (ca. 680 μl) aufgeteilt und im Western Blot mit dem Anti-C2 (Identifizierung der Position des 20S Proteasoms) oder mit dem Anti-REGβ Antikörper getestet.

3.8 Die Mutation des Tat-Peptides 37-72 (Tatpep1) in den Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 (Tatpep5) verhindert die Konkurrenz mit dem 11S Regulator

Wie oben gezeigt wurde, gibt es eine gemeinsame Struktur zwischen REGα und dem Tat-Protein. Diese Struktur wird im Tat-Protein durch die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 gebildet. Um diese Struktur eingehend zu studieren, wurde das Tatpep5 (Abb. 3.8A) synthesiert. Das Tatpep5 besteht aus den Aminosäuren 37 bis 72 und die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 wurden durch Ala substituiert. Tatpep1, Tatpep2 und Tatpep5 wurden mit dem isolierten 20S Proteasom und dem Peptidsubstrat Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC inkubiert (Abb. 3.8B). Die Daten zeigen, dass das Tatpep5 die Aktivität des 20S Proteasoms ähnlich wie das Tatpep2 nicht hemmen konnte. Das bedeutet, dass die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 des Tat-Proteins für die Hemmung des 20S Proteasoms eine entscheidende Rolle spielen.

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Abb. 3.8: Die Mutation des Tat-Peptides37-72 (Tatpep1) der Aminosäuren Lys51, Arg52, und Asp67 (Tatpep5) verhindert die Konkurrenz mit dem 11S Regulator. A, Die Sequenz des Tatpep5. Die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 wurden durch Ala substituiert. B, Messung der Chymotrypsin-ähnlichen 20S Proteasom-Aktivität. Tatpep1, Tatpep2 und Tatpep5 wurden mit dem 20S Proteasom und dem Peptidsubstrat Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC inkubiert. Die Fluoreszenz wurde bei RT gemessen. Die Peptidaseaktivität wurde als ΔF (F = Fluoreszenz) pro min ausgedrückt. C, Die Dot-Blots. Das 20S Proteasom wurde auf Nitrocellulose-Membranen aufgetragen. Danach wurden Nitrocellulose-Streifen mit je drei Proteasom-Dots mit REGαwt oder REGαm mit oder ohne Tatpep1, 2, 5 inkubiert. Anschließend erfolgte die Detektion mit dem anti-REGα Antikörper.

Um die Konkurrenz mit dem 11S Regulator zu untersuchen, wurden Dot-Blots durchgrführt. In diesen Experimenten wurde 1 μg 20S Proteasom auf die Nitrocellulose-Membranen aufgetragen. Nach dem Blockieren wurden Nitrocellulose-Streifen mit je drei Proteasom-Dots mit REGαwt oder REGαm mit oder ohne Tatpep1, 2 und 5 inkubiert. Anschließend erfolgte die Detektion mit dem anti-REGα Antikörper. Es wurde nachgewiesen (Abb. 3.8C), dass Tatpep1 in der Lage ist, mit dem REGαwt zu konkurrieren. Sowohl Tatpep2 als auch Tatpep5 haben ihre Fähigkeit, den 11S Regulator vom 20S Proteasom zu verdrängen, verloren.

3.9 Der Einfluss des Tat-Proteins und der Tat-Peptide (Tatpep1 und Tatpep5) auf die Antigenpräsentation in vivo

Die synthesierten Tat-Peptide Tatpep1und Tatpep5 und das rekombinante 86 AA Tat-Protein wurden mit B8 Zellen inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen gesammelt und im CTL-Assay gemessen. In diesem Testansatz wurde mit Hilfe von cytolytischen T-Lymphozyten (CTL), die ein spezifisches pp89 Epitop erkennen, die Lyse der B8 Zellen durch die CTLs gemessen. Das Ausmaß der Zelllyse ist proportional zur Menge des präsentierten pp89 Epitops. Es wurde gezeigt, dass das Tatpep1 die Antigenpräsentation hemmt. Das heißt, in Anwesenheit von Tatpep1 wird eine geringere Menge an pp89 Epitop auf der Zelloberfläche im Vergleich zu den unbehandelten Kontroll-B8 Zellen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu hat das Tatpep5 keinen Einfluss auf die Antigenpräsentation (Abb. 3.9A). Daraus wurde geschlussfolgert, dass die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 bei der Hemmung der Antigenpräsentation durch das Tat-Protein eine entscheidende Rolle spielen. Nach der Inkubation der B8 Zellen mit dem vollständigen Tat-Protein konnte ebenfalls eine verminderte Präsentation des pp89 Epitops im CTL-Assay beobachtet werden (Abb. 3.9B).

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Abb. 3.9: Der Einfluss des vollständigen Tat-Proteins, der Tat-Peptide (Tatpep1 und Tatpep5) und der stabilen Transfektanten (REGαwt und REGαm) auf die Antigenpräsentation in vivo. A, CTL-Assay mit den Tat-Peptiden. Die Tat-Peptide Tatpep1 und Tatpep5 wurden mit B8 Zellen inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen im CTL-Assay gemessen. Die spezifische Lyse wurde mittels eines Modells (siehe 2.2.26) berechnet. B, CTL-Assay mit dem Tat-Protein. Das vollständige Tat-Protein wurde mit B8 Zellen inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen im CTL-Assay gemessen. Die spezifische Lyse wurde mittels eines Modells (siehe 2.2.26) berechnet. C, CTL-Assay mit den stabilen Transfektanten REGαwt und REGαm. Gleiche Mengen der drei REGαwt-exprimierenden und fünf REGαm-exprimierenden Zellklone wurden gesammelt und im CTL-Assay getestet. Die spezifische Lyse wurde mittels eines Modells (siehe 2.2.26) berechnet.

3.10 Herstellungen stabiler Transfektanten mit REGαwt und REGαm und deren Rolle bei der Antigenpräsentation

Die Vektoren HisC-REGαwt oder HisC-REGαm wurden in B8 Zellen mit der Calciumphosphat-Methode transfiziert. Die Klone wurden mittels Western Blot mit dem Anti-Xpress Antikörper selektiert. Es wurden drei REGαwt-exprimierende und fünf REGαm-exprimierende Zellklone identifiziert. Gleiche Mengen dieser Zelle wurden gesammelt und im CTL-Assay getestet. Es konnte gezeigt werden (Abb. 3.9C), dass die drei REGαwt- exprimierenden Zelllinien die Antigenpräsentation des pp89 Epitops im Vergleich zu den Kontrollzellen verstärken (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu haben B8 Zellen, die REGαm stabil exprimieren, eine reduzierte Antigenpräsentation. Das heißt, dass die Aminosäuren Glu235 und Lys236 für die 11S Regulator-vermittelte 20S Protesom-abhängige Antigenpräsentation von entscheidender Bedeutung sind.

3.11 Der Einfluss des Tat-Proteins auf die Stabilität der Transkriptionsregulatoren IκBα und c-Jun in vivo

Die Vektoren, die für Flag-Tat und Flag-ΔTat37-72 kodieren, wurden in ca. 1 x 106 HeLa Zellen mittels beschriebener Lipofektion transfiziert. Ca.1 x 106 nicht-transfizierter HeLa Zellen dienten als Kontrolle. 4 h vor der Lyse wurden 20 μM Lactacystin zu den HeLa Zellen gegeben. Lactacystin wurde als spezifischer Hemmstoff des 20S Proteasoms eingesetzt. Nach der Lyse und dem Zentrifugieren wurde die Proteinmenge der Überstände mit dem Photometer bei der OD 280 nm abgeschätzt. Gleiche Mengen der Überstände (ca. 20 μg Protein) wurden auf die SDS-Gele aufgeladen. Im anschließenden Western Blot wurden der anti-IκBα (1:1000) oder der anti-c-Jun (1:1000) Antikörper benutzt. Der verstärkte Abbau von IκBα könnte bedeuten, dass NF-κB freigesetzt wird. In der Abb. 3.10 ist zu sehen, dass das Tat-Protein zu einer Senkung des IκBα-Spiegels und der c-Jun Konzentration in HeLa Zellen führt. Da die Abnahme sowohl von IκBα als auch von c-Jun durch Lactacystin hemmbar ist, kann sie auf eine Stimulierung der Aktivität des 26S Proteasoms zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu zeigt das Tat-Fragment (Tat Δ37-72) keinen Einfluss auf die Stabilität von IκBα und c-Jun.

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Abb. 3.10: Der Einfluss des Tat-Proteins auf die Stabilität der Transkriptionsregulatoren IκBα und c-Jun in vivo. 4 h vor der Lyse wurde 20 μM Lactacystin zu den Zellen gegeben. Nicht-transfizierte HeLa Zellen dienten als Kontrolle. Die Proteinmengen der Überstände der Lysate (wie in Abb. 3.1A) wurden mit dem Photometer bei OD 280 nm abgeschätzt. Gleiche Mengen der Überstände wurden auf die SDS-Gele aufgeladen. Im Western Blot wurden der anti-IκB oder anti-c-Jun Antikörper benutzt.


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26.05.2005