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4  Diskussion

4.1 Der Effekt des Tat-Proteins auf das 20S Proteasom in vitro und in vivo

Die präsentierten Daten bestätigen frühere Ergebnisse (Seeger et al., 1997), die zeigten, dass das Tat-Protein an das 20S Proteasom in vitro binden kann. Auch andere virale Proteine wie z. B. E1A (Adenovirus early region 1 a protein) können an das 20S Proteasom binden und die Aktivität des 20S-11S-Komplexes hemmen (Grand et al., 1999). Darüber hinaus binden die viralen Proteine HBX (Hepatitis B Virus X Protein) (Hu et al., 1999) und TAX (Human T-Cell Leukaemia Virus Transactivator) (Rousset, et al., 1996) an das 20S Proteasom. HBX kann die Peptidaseaktivität des 20S Proteasoms hemmen, und TAX hat einen Einfluss auf den Proteasom-abhängigen Abbau von IκB. Offensichtlich ist das Proteasom-System der Angriffsort vieler Viren, was mit seiner essentiellen Rolle bei der Immunabwehr und der Zellzyklus-Regulation erklärt werden kann.

Sowohl das vollständige Tat-Protein als auch das Tat Peptid 37-72 können die Zellmembran permeieren (Fawell et al., 1994). Im Vergleich mit dem vollständigen Tat-Protein besitzt das Tat Peptid 37-72 einen sehr ähnlichen Hemmeffekt auf das 20S Proteasom. Um den für den Effekt auf das Proteasom-System zuständigen Bereich des Tat Proteins weiter einzugrenzen, wurden die Tat Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4 synthetisiert und getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass der basische Bereich des Tat-Proteins bei der Inhibition des 20S Proteasoms eine essentielle Rolle spielt. Es ist bekannt, dass der basische Bereich die RNA-Bindungsdomäne und die NLS (Nuclear Location Sigal) (Endo et al.,1989; Hauber et al., 1989) enthält und zuständig ist für den freien Transport des Tat-Proteins durch die Zellmembran (Vives et al., 1997). Diese Region vermittelt die Bindung des Tat-Proteins an die TAR-RNA (Rana et al., 1999) und ist essentiell für die Verstärkung der p300/CBP transkriptionalen Koaktivatoren (Marzio et al., 1998). Das heißt, dass der basische Bereich für unterschiedliche biologische Funktionen notwendig ist. Unsere Experimente zeigen, dass das Tat Peptid Tatpep5, in dem Lys51, Arg52 (Aminosäuren im basischen Bereich) und Asp67 durch Ala substituiert wurden, keinen Hemmeffekt auf das 20S Proteasom und die 11S Regulator-Bindung an das 20S Proteasom hat. Die Aminosäuren Lys51 und Arg52 sind in allen Tat-Proteinen, die aus HIV-1 oder HIV-2 stammen, hoch konserviert.

4.2 Das Tat-Protein beeinflusst die Stabilität der Transkriptionsregulatoren IκBα und c-Jun

Es ist bekannt, dass zwei Untereinheiten des 19S Regulators, S6b (auch bekannt als TBP1,Tat-Binding Protein 1) und S7 (auch bekannt als MSS1, Mammalian Suppressor of Sgv1), mit dem Tat-Protein wechselwirken (Nelbock et al., 1990; Shibuya et al., 1992). S6b und S7 gehören zu einer Gruppe von ATPasen, die als AAA (ATPase-Associated Activity) –Familie bezeichnet wird (Confalonieri et al.,1995). Sie enthalten eine bzw. zwei hochkonservierte nukleotidbindende Regionen von etwa 200 Aminosäuren. Die untereinander zu etwa 50% identischen ATPasen des 19S Regulators besitzen jeweils eine dieser Regionen. Diese ATPase-Untereinheiten sind vermutlich für die ATP-spaltende Aktivität des 26S Proteasoms verantwortlich.

Die viralen Proteine E7 (Human Papillomavirus 16 E7 Oncoprotein) und E1A binden ebenfalls an proteasomale ATPasen. Die Bindung des E7-Proteins stimuliert die S4-ATPase Aktivität, wodurch die Proteolyse beschleunigt werden könnte (Berezutskaya et al.,1997). Dadurch wird vermutlich die Degradation des Retinoblastom-Proteins verstärkt, was zu einer onkogenen Transformation führt (Boyer et al., 1996). Die Bindung mit dem E1A Protein verstärkt die Degradation der Topoisomerase-II-α, wodurch eine Apoptose induziert werden konnte. Eine Folge der Interaktion der viralen Proteine mit dem proteasomalen ATPasen könnte die Aktivierung des Abbaus von Ubiquitin-Konjugaten durch das 26S Proteasom sein, wie es für das Tat-Protein gezeigt wurde (Seeger et al., 1997).


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Mit Hilfe des exprimierten Tat-Proteins wurde in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen, dass das Tat-Protein nicht nur an das 20S Proteasom sondern auch an den 19S Regulator binden kann. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Aminosäuren 37-72 des Tat-Proteins auch für die Bindung an den 19S Regulator erforderlich sind. Die meisten Substrate des 26S Proteasoms werden mit Hilfe des Ubiquitin-Systems selektiert. Polyubiquitinierte Substratproteine werden vom 26S Proteasom gebunden und abgebaut. Die Transkriptionsregulatoren c-Jun und IκB werden durch das Ubiquitin-System abgebaut.

Frühere Daten zeigten, dass das Tat-Protein die Aktivität des 26S Proteasoms erhöht. Aus meinen Ergebnisse geht hervor, dass das exprimierte Tat-Protein den 26S Proteasom-abhängigen Abbau von IκBα beschleunigt. Dieser Tat-Effekt führt vermutlich zu einer erhöhten Freisetzung und Aktivität von NF-κB. Tatsächlich konnte eine Aktivierung von NF-κB durch das Tat-Protein nachgewiesen werden (Westendorp et al., 1995; Demarchi et al., 1996; Chen et al., 1997; Kelly et al., 1999; Manna et al., 2000; Ehret et al., 2001). Dagegen wurde gezeigt, dass das Tat-Protein den Abbau von IκBα in ausdifferenzierten SK-N-MC Zellen nicht beeinflussen konnte (New et al., 1998). Meiner Meinung nach ist die Diskrepanz auf die Verwendung unterschiedlicher Zellen und Methoden zurückzuführen. Es ist bekannt, dass eine Bindungsstelle für NF-κB im HIV-1 Promotor enthalten ist (Siebenlist et al., 1994). Die Bindung von NF-κB an die Tat-Protein-TAR-RNA verstärkt die Initiation und Elongation von HIV-1 auf der Transkriptionsebene. Die Aktivierung von NF-κB könnte ein weiterer Grund sein, warum das Tat-Protein essentiell bei der HIV-Infektion und -Replikation ist (Westendorp et al., 1995).

Die AP-1 Familie besteht aus den Transkriptionsfaktoren Jun, Fos, und ATF (Activating Transcription Factor), die Homo- oder Heterodimere bilden. c-Jun ist ein zentraler Bestandteil von allen AP-1 Komplexen (Karin et al., 1997). Der bisher bekannte Regulationsmechanismus der Stabilität von c-Jun erfolgt über die Phosphorylierung durch die JNK (Jun N-terminal Kinase), welche durch den MAP Kinase (Mitogen-Activated Protein Kinase) Weg aktiviert wird. Darüber hinaus wird c-Jun durch das CSN (COP9 Signalosome) (Naumann et al., 1999) stabilisiert. Unsere Daten zeigen, dass das Tat-Protein den 26S Proteasom-abhängigen Abbau von c-Jun stimuliert. Dabei ist unklar, ob c-Jun gleichzeitig phosphoryliert oder dephosphoryliert wurde. Gu et al.(Gu et al., 2001) und Mischiati et al. (Mischiati et al., 1999) haben berichtet, dass das Tat-Protein die JNK aktivieren kann. Das würde jedoch zu einer Stabilisierung von c-Jun führen und widerspricht unseren Daten, die einen Tat-Protein-induzierten Abbau von c-Jun zeigen.

4.3 Identifizierung einer gemeinsamen Struktur im HIV-1 Tat-Protein und in der 11S Regulator α-Untereinheit, die für die Konkurrenz der beiden Proteine verantwortlich ist

Frühere Daten (Seeger et al., 1997) und die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren, dass das Tat-Protein mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom konkurriert. Ein Sequenzvergleich erbrachte keine Homologien in der Primärstruktur der beiden Proteine. Nur der Vergleich der vorhandenen Raumstruktur-Daten des Tat-Proteins (Bayer et al., 1995) und von REGα (Knowlton et al., 1997) führte zur Identifizierung einer gemeinsamen Struktur. Diese Struktur wird im Tat-Protein aus den Aminosäuren Lys51 und Arg52 aus der basischen Region und dem Asp67 aus der C-terminalen Region gebildet. Lys51 und Arg52 sind in allen Tat-Varianten hoch konserviert. Das mutierte Tat-Peptid Tatpep5 ist nicht in der Lage, mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom zu konkurrieren. Das bedeutet, dass die identifizierte Struktur essentiell für die Konkurrenz des Tat-Proteins mit dem 11S Regulator ist. Im REGα besteht die gemeinsame Struktur aus den Aminosäuren Glu235, Lys236 und Lys239. Die drei Aminosäuren sind Teil einer geladenen α-Helix, die in der Nähe der 20S Proteasom-Bindungsregion (Aminosäuren 241-249) und in der Nähe der Aktivierungsregion (Aminosäuren 141-149) lokalisiert ist (Zhang et al., 1998). Im Gegensatz zu Lys239 sind Glu235 und Lys236 in allen REG (α, β und γ) konserviert und wurden daher durch Alanin (Ala) substituiert. Die REGα-Mutante (REGαm) kann weder allein noch mit REGβ gemeinsam die Aktivität des 20S Proteasoms stimulieren. Andererseits kann REGαm ähnlich wie REGαwt mit sich selbst oder mit REGβ Komplexe bilden. Darüber hinaus bindet REGαm an das 20S Proteasom. REGαm ist die erste Mutante mit einem Aminosäureaustausch außerhalb der Aktivierungsstelle des 20S Proteasoms, die an das 20S [Seite 37↓]Proteasom bindet aber die Aktivität des 20S Proteasoms nicht stimulieren kann. Die Ergebnisse mit RGEαm sind ähnlich wie die mit Mutanten der Aktivierungsstelle des 20S Proteasoms (Zhang et al., 1998). Daher wird angenommen, dass die Aminosäuren Glu235 und Lys236 von REGα an der Öffnung (gating) bzw. Aktivierung des 20S Proteasoms beteiligt sind.

Viele Faktoren können die Öffnung des 20S Proteasoms bewirken (Whitby et al., 2000). Das REGα alleine kann als heptamerer Komplex mittels seiner Bindungsregion am 20S Proteasom-Komplex binden. Dann erfolgt die Öffnung des 20S Proteasoms mit Hilfe der Aktivierungsregion von REGα. Ähnlich wie REGα kann vermutlich auch das Tat-Protein einen heptameren Komplex bilden. Mit der von uns identifizierten Struktur, gebildet durch die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67, bindet der Tat-Protein-Komplex am 20S Proteasom. Diese Bindung führt jedoch nicht zur Öffnung des 20S Proteasoms. Die REGαm besitzt die Bindungsregion und die Aktivierungsregion, aber aktiviert das 20S Proteasom ebenfalls nicht. Das heißt, es gibt eine zusätzliche Struktur im REGα, die für die Stimulierung des 20S Proteasoms erforderlich ist. Diese Struktur wird mit hoher Wahrscheinlichkeit von den REGα Aminosäuren Glu235 und Lys236 gebildet.

4.4 Das Tat-Protein hemmt die 11S Regulator-vermittelte Antigenpräsentation

Im Säugetierorganismus existiert ein spezieller Abwehrmechanismus gegen virale Infektionen. Befallene Zellen signalisieren die Infektion durch Präsentation antigener Peptide auf ihrer Zelloberfläche mittels MHC Klasse I-Molekülen. Das ermöglicht die Erkennung und Eliminierung dieser Zellen durch cytotoxische CD8-T-Zellen.

In unserem experimentellen Modell enthalten die B8 Zellen die immundominanten Epitope des Maus-Cytomegalovirus (MCMV) immediate-early-Proteins pp89. Das pp89 Protein wird durch den Ubiquitin- und 26S Proteasom-abhängigen Abbauweg verdaut. Das immundominante Peptid DMYPHFNATNL wird von einem heterodimeren Peptidtransporter (Knuehl et al., 2001), dem sogenannten TAP (Transporter associated with Antigen Processing), in das ER-Lumen geschleust. Dort bindet es sich an MHC Klasse I-Moleküle und gelangt in einem trimeren Komplex bestehend aus MHC Klasse I-Molekül, β2 Mikroglobulin und Peptid an die Zelloberfläche (Lehner et al., 1996). T-Zell-Rezeptoren auf der Oberfläche von CD8+ cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) erkennen spezifisch verschiedene Subtypen von MHC Klasse I-Molekülen mit den gebundenen Peptiden. Die Bindung führt über eine Rezeptor-vermittelte Signalkaskade zur Aktivierung und Proliferation der cytotoxischen T-Lymphocyten und zur Lyse der MHC Klass I Peptid-präsentierenden Zellen (Momburg et al., 1998).

Der 11S Regulator spielt eine Rolle bei der Prozessierung antigener Peptide. Er könnte die Konformation des Proteasoms verändern und damit auch den katalytischen Mechanismus der Peptidhydrolyse (Dick et al., 1996). Der 11S Regulator bewirkt eine bis zu 100fach gesteigerte Produktion immundominanter Epitope (Elliott et al., 1995). Mittels Koimmunpräzipitationen wurde gezeigt, dass das 20S Proteasom gleichzeitig den 19S und 11S Regulator in vivo binden kann (Hendil et al., 1998). Es wird postuliert, dass die Erkennung von Proteinsubstraten und der Zugang zum katalytischen Zentrum durch den 19S-Komplex an einer Seite des Proteasoms ermöglicht wird und der weitere Abbau der entstandenen Intermediate durch den 11S Komplex auf der anderen Seite aktiviert wird. In unseren Experimenten verwendeten wir stabil exprimierende RERαwt- und REGαm-Zellen, um in vivo zu testen, welchen Einfluss die Mutation der RERα Untereinheit auf die Präsentation immundominanter Epitope des pp89 Proteins an der Zell-Oberfläche hat. Die Ergebnisse zeigen, dass der 11S Regulator an der Antigenprozessierung des pp89 Proteins beteiligt ist. Die Zellen, die stabil REGαm exprimieren, zeigen eine deutlich verminderte Antigenpräsentation im Vergleich zu den Zellen die stabil REGαwt exprimieren. Diese Beobachtung stimmt mit früheren Ergebnisse überein (Groettrup et al., 1996b).

Es ist bekannt, dass das Tat-Protein einen Beitrag zur Unterwanderung des Immunsystems durch das HIV-1 leistet. Ein Mechanismus für diesen Tat-Effekt könnte die Hemmung des Promoters von MHC Klasse I Genen sein (Howcroft et al., 1993). Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Tat-Protein auch durch die Konkurrenz mit dem 11S Regulator einen Einfluss auf die Antigenpräsentation hat. Die Ergebnisse mit dem vollständigen Tat-Protein und dem Tat-Peptid Tatpep1 zeigen eine deutliche Hemmung der 11S Regulator-abhängigen Antigenpräsentation eines Epitops des pp89 [Seite 38↓]Proteins. Die Mutation der Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 im Tat-Peptid (Tatpep5) hebt die Hemmung der Antigenpräsentation auf. Das bedeutet, dass die identifizierte Struktur im Tat-Protein für die Hemmung der Antigenpräsentation eine entscheidende Rolle spielt. Viele virale Proteine beeinflussen die Antigenprozessierung und Antigenpräsentation und greifen auf unterschiedlichen Stufen mit verschiedenartigen Mechanismen in die Immunabwehr ein (Jonathan et al., 1999). Zum Beispiel haben die HIV-1 Proteine Vpu und Nef einen Effekt auf die Antigenprozessierung und Antigenpräsentation (Schubert et al.,1998; Le Gall et al., 1998). Nachdem das HIV in die Zellen eingedrungen ist, werden die viralen Proteine, Tat, Vpu und Nef synthetisiert. Diese Proteine schwächen das Immunabwehr-System und das Virus kann dem Immunsystem entfliehen. Das HIV-Virus kann sich nun in den Wirtszellen (CD4+) vermehren und ausbreiten und das Immunsystem weiter zerstören. Die Folge davon ist AIDS.


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26.05.2005