[Seite 39↓]

5  Zusammenfassung

Das Tat-Protein ist als Transaktivator bei der HIV-1-Infektion für die Replikation und Expression von HIV-1 verantwortlich. Außerdem ist es beteiligt an der Unterwanderung des Immunabwehr-Systems durch das HIV-1. Die Antigenprozessierung und die Antigenpräsentation sind wichtige Prozesse im Immunabwehr-System. Das 20S Proteasom ist als zentraler Bestandteil des Ubiquitin-abhängigen Proteinabbauweges am Verdau vieler intrazellulärer Proteine und bei der Generierung der durch MHC Klasse-I Moleküle präsentierten Epitope beteiligt. Der 11S Regulator ist ein wichtiger Regulator des 20S Proteasoms und spielt bei der Antigenprozessierung eine Rolle. In vitro konkurriert das Tat-Protein mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom. Daher wurde untersucht, ob das Tat-Protein die 11S Regulator-vermittelte Antigenpräsentation beeinflussen kann.

Es konnte gezeigt werden, dass das exprimierte Tat-Protein an das zelluläre 20S Proteasom und das 26S Proteasom in vivo bindet. Die Bindungsstelle des Tat-Proteins befindet sich zwischen den Aminosäuren 37-72.

Das exprimierte Tat-Protein konnte den 26S Proteasom-abhängigen Abbau der Transkriptionsregulatoren IκB und c-Jun verstärken. Für diesen Prozess sind die Aminosäuren 37-72 des Tat-Proteins essentiell. Darüber hinaus sind die Aminosäuren 37-72 für die Hemmung des 20S Proteasoms und für die Konkurrenz mit dem 11S Regulator erforderlich. Durch die Deletion der basischen Domäne des Tat-Peptides 37-72 ging die Hemmung des 20S Proteasoms und die Konkurrenz mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom verloren.

Mittels Computer-gestützter Strukturanalyse wurde eine gemeinsame Struktur im Tat-Protein (Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67) und in der 11S Regulator α-Untereinheit (REGα) (Aminosäuren Glu235, Lys236 und Lys239) identifiziert.

Wild-type REGα (REGαwt), mutiertes REGα (REGαm) (Substitutionen der Aminosäuren Glu235Ala und Lys236Ala) und REGβ wurden rekombinant als GST-Fusionsproteine in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Nach Abspaltung des GST-Fusionsanteils erfolgte die biochemische Charakterisierung der Proteine. Die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität des 20S Proteasoms ist abhängig von der eingesetzten Menge an REGαwt oder REGαwt + REGβ. REGαm oder REGαm + REGβ sind nicht in der Lage, das 20S Proteasom zu stimulieren.

REGαm hat keinen Einfluß auf die Komplexbildung mit sich selbst oder mit REGβ oder mit dem 20S Proteasom. Die Bindungsfähigkeit an das 20S Proteasom ist vergleichbar mit der von REGαwt. Diese Daten zeigen, dass die Aminosäuren Glu235 und Lys236 von REGα für die Aktivierung des 20S Proteasoms erforderlich sind. Der Einfluss von REGα auf die Antigenpäsentation wurde in Maus B8 Zellen bestätigt, die Epitope des MCMV Proteins pp89 mittels MHC Klasse I Molekülen präsentieren. Eine stabile Überexpression von REGαm führte zu einer deutlichen Reduzierung der Antigenpräsentation im Vergleich zur Überexpression von REGαwt.

Die Mutation des Tat-Peptides 37-72 in den Aminosäuren Lys51Ala, Arg52Ala und Asp67Ala führte zum Verlust der Hemmung der Chymotrypsin-ähnlichen Aktivität des 20S Proteasoms und der Fähigkeit REGαwt vom 20S Proteasom zu verdrängen.

Sowohl das vollständige Tat-Protein als auch das Tat-Peptid 37-72 sind in der Lage, die Präsentation eines pp89 Epitops zu hemmen, während das mutierte Peptid (Lys51Ala, Arg52Ala und Asp67Ala) keine Hemmwirkung aufweist. Diese Daten zeigen, dass das Tat-Protein die 11S Regulator-vermittelte Antigenpräsentation hemmt und somit einen Einfluss auf die Entstehung der Immuninsuffizienz während der AIDS-Erkrankung haben kann.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
26.05.2005