1  Einleitung

• 1.1 HIV-1

• 1.2 Das Tat-Protein

• 1.3 Das Proteasom-System

• 1.4 Der 11S Regulator und seine Rolle bei der Antigenpräsentation

• 1.5 Die Regulation der Stabilität von IκB und c-Jun durch das Protesom-System

• 1.6 Fragestellungen und Ziele

2  Material und Methoden

• 2.1 Material

  • 2.1.1 Kits

  • 2.1.2 Enzyme

  • 2.1.3 Sonstiges

  • 2.1.4 Geräte

• 2.2 Methoden

  • 2.2.1 Amplifikation von DNA durch PCR (Polymerase Chain Reaction)

  • 2.2.2 Klonierung von pcDNA3-Flag-Tat und pcDNA3-Flag-ΔTat (Abkürzung: Flag-Tat und Flag-ΔTat)

  • 2.2.3  Spezifische Mutagese der REGα-Untereinheit

  • 2.2.4 Umklonierung von pcDNA3.1-HisC-REGαwt und pcDNA3.1-HisC-REGαm (Abkürzung: HisC-REGαwt und HisC-REGαm)

  • 2.2.5 Agarosegele, Gelreinigung von DNA-Fragmenten und DNA-Fällung

  • 2.2.6 Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen und Ligation

  • 2.2.7 Anzucht von E.coli

  • 2.2.8 Kompetente E. coli-Zellen

  • 2.2.9 Transformation

  • 2.2.10 Plasmid-Isolierung („Mini-Präp“ und „Maxi-Präp“)

  • 2.2.11 Zellen und Zellkultur

  • 2.2.12 Transfektion mit der Lipid-Methode

  • 2.2.13 Lyse der Zellen

  • 2.2.14  Trichloressigsäure (TCE)-Präzipitation

  • 2.2.15 SDS-PAGE Elektrophorese

  • 2.2.16 Nicht-denaturierende Gelelektrophorese

  • 2.2.17  Dichtegradientenzentrifugation

  • 2.2.18 Western Blot

  • 2.2.19 Immunpräzipitation (IP)

  • 2.2.20 Bestimmung der Proteinkonzentration

  • 2.2.21 Expression und Aufreinigung der GST-Fusionsproteine

  • 2.2.22  Durchführung von Proteaseassays mit fluorogenen Substraten

  • 2.2.23 Dot-Blot

  • 2.2.24 Inkubation der Tat Peptide und des vollständiges Tat-Proteins mit B8 Zellen

  • 2.2.25 Herstellung stabiler Transfektanten von REGαwt und REGαm

  • 2.2.26  CTL-Messung

  • 2.2.27 Vergleich der Struktur des Tat-Proteins mit der von REGα

3  Ergebnisse

• 3.1 Die Aminosäuren 37-72 des Tat-Proteins sind essentiell für die Bindung an die Proteasomen in HeLa Zellen

• 3.2 Die basische Domäne des Tat-Proteins spielt bei der Inhibition des 20S Proteasoms eine entscheidende Rolle

• 3.3 Das Tat-Peptid 37-72 konkurriert mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom

• 3.4 Identifizierung einer gemeinsamen Struktur im Tat-Protein und in der 11S Regulator α-Untereinheit (REGα)

• 3.5 Herstellung des rekombinanten REGαwt, REGαm und REGβ

• 3.6 Messung der Chymotrypsin-ähnlichen 20S Proteasom-Aktivität in Anwesenheit von REGαwt, REGαm mit oder ohne REGβ in vitro

• 3.7 Die Mutation der rekombinanten REG α-Untereinheit hat keinen Einfluss auf die Komplexbildung mit sich selbst oder mit dem REGβ oder mit dem 20S Proteasom

• 3.8 Die Mutation des Tat-Peptides 37-72 (Tatpep1) in den Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 (Tatpep5) verhindert die Konkurrenz mit dem 11S Regulator

• 3.9 Der Einfluss des Tat-Proteins und der Tat-Peptide (Tatpep1 und Tatpep5) auf die Antigenpräsentation in vivo

• 3.10 Herstellungen stabiler Transfektanten mit REGαwt und REGαm und deren Rolle bei der Antigenpräsentation

• 3.11 Der Einfluss des Tat-Proteins auf die Stabilität der Transkriptionsregulatoren IκBα und c-Jun in vivo

4  Diskussion

• 4.1 Der Effekt des Tat-Proteins auf das 20S Proteasom in vitro und in vivo

• 4.2 Das Tat-Protein beeinflusst die Stabilität der Transkriptionsregulatoren IκBα und c-Jun

• 4.3 Identifizierung einer gemeinsamen Struktur im HIV-1 Tat-Protein und in der 11S Regulator α-Untereinheit, die für die Konkurrenz der beiden Proteine verantwortlich ist

• 4.4 Das Tat-Protein hemmt die 11S Regulator-vermittelte Antigenpräsentation

5  Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

Danksagung

Lebenslauf

Eidestattliche Erklärung

Abb. 1.1: Übersicht über die Gene des HIV-1 Provirus und ihre Anordnung

Abb. 1.2: Die Sequenz und die Domänen des HIV-1 Tat-Proteins. AA 1-21: N-Terminale Domäne; AA 22-36: Cystein-reiche Domäne; AA 37-48: Kerndomäne; AA 49-57 Basische Domäne; AA 58-86 C-Terminale Domäne

Abb. 3.1: Die Aminosäuren 37-72 von dem Tat-Protein sind essentiell für die Bindung an die Proteasomen in HeLa Zellen. A, Immunpräzipitation: Die Vektoren pcDNA3 mit der Flag-Tat cDNA oder mit der Flag-ΔTat cDNA wurden in HeLa Zellen transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert und die Überständen für die Immunpräzipitation verwendet. Der anti-C2 Antikörper wurde zur Präzipitation des 20S Proteasoms und der anti-S4 Antikörper zur Präzipitation des 19S Regulators (oder 26S Proteasom) verwendet. Das Lysat der nicht-transfizierten HeLa Zellen wurde mit dem anti-C2 Antikörper als Kontrolle präzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden im Western Blot mit dem anti-Flag Antikörper getestet. B, Nicht-denaturierende Geleletrophorese: Die Lysate (wie in A) wurden auf die nicht-denaturierende Geleletrophorese aufgetragen und im Phast-System aufgetrennt. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose geblottet. Im Western Blot wurde der anti-Flag Antikörper benutzt. Die Positionen des 26S Proteasoms (26S), des 19S Regulator (19S) und des 20S Proteasoms wurden im gleichen Blot mit dem anti-S4 Antikörper und dem anti-C2 Antikörper identifiziert. C, Western Blot mit Fraktionen von Glyceringradienten: Die Lysate (wie in A) wurden auf 10-40% Glyceringradienten aufgeladen. Nach dem Zentrifugieren wurden die Gradienten von oben nach unten in 18 Fraktionen (je 0,68 ml) aliquotiert. Die Proteinpräzipitate (TCE-Fällung) wurden im Western Blot mit dem anti-Flag Antikörper getestet.

Abb. 3.2: Der basische Bereich des Tat-Proteins spielt bei der Inhibition des 20S Proteasoms eine entscheidende Rolle. A, Sequenzen der Tat-Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4, die in den Experimenten verwendet wurden. B, Ansteigende Mengen des vollständigen Tat-Proteins und der Tat-Peptide wurden gegen eine konstante Menge des 20S Proteasoms in Anwesenheit von Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA titriert. Die Peptidaseaktivität wurde als ΔF (F = Fluoreszenz) pro min und als relative Aktivität (1.0 = 20 ΔF/min pro μg des Proteasoms) berechnet. Die Punkte sind experimentelle Daten. Die Kurven wurden mittels eines Modells mit zwei Bindungsstellen des Tat-Proteins am 20S Proteasom berechnet (siehe 2.2.22). Die berechneten kinetischen Konstanten Vmax, K1 und K2 für das vollständig Tat-Protein und die Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4 sind in der Tabelle zusammengefasst. Die Exprimente wurden viermal unabhängig wiederholt.

Abb. 3.3: Das Tat-Peptid 37-72 konkurriert mit dem 11S Regulator um die Bindungsstelle am 20S Proteasom. Ansteigende Mengen der Tat-Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4 wurden gegen eine konstante Menge des 20S Proteasoms und des isolierten 11S Regulators (Molares Verhältnis des 20S Proteasoms und des 11S Regulator = 1 : 6) in Anwesenheit von Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA titriert. Die Aktivität wurde als ΔF (F = Fluoreszenz) pro min bestimmt und als relative Aktivität (1.0 = 20-fache Baseline-Aktivität mit dem 20S Proteasom alleine) ausgedrückt. Die Punkte sind experimentelle Daten. Die Kurven wurden mittels eines Modells mit zwei Bindungsstellen des Tat-Proteins am 20S Proteasom berechnet (siehe 2.2.22). Die berechneten kinetischen Konstanten Vmax, K1 und K2 für die Tat-Peptide Tatpep1, 2, 3 und 4 sind in der Tabelle zusammengefasst. Die Experimente wurden viermal unabhängig wiederholt.

Abb. 3.4: Identifizierung einer gemeinsamen Struktur im Tat-Protein und in der 11S Regulator α-Untereinheit (REGα). A, Darstellung der identifizierten Struktur im Tat-Protein und in REGα. Die an den Oberflächen befindlichen Reste Lys236 and Lys239 von REGα und Lys51 und Arg52 des Tat-Proteins sind mit hellem Blau und die Aminosäuren Glu235 (REGα) und Asp67 (Tat-Protein) mit Gelb gekennzeichnet. B, Die heptamere Struktur von REGα wurde durch rote Zylinder (α-Helix) und grüne Bänder (Schleifenregion) dargestellt. Für eine der sieben Untereinheiten wurden N und C Termini und die Aktivierungsdomäne gekennzeichnet . Die gekennzeichneten drei Reste (Glu235, Lys236 und Lys239) sind Teil einer kurzen α-Helix, die sich in der Nähe des C Terminus befindet. Das Rückrad des Tat-Proteins wurde durch ein rotes Band dargestellt, welches in der Region der Aminosäuren 37 bis 72 weiß ist. C, Darstellung des humanen 20S Proteasoms mit seiner sekundären Struktur (rote Zylinder: α-Helix; Gelbe Pfeile: β-Sheets; grüne Bänder: Schleifen). Die Hauptkette des heptameren REGα wurde durch ein violettes Band dargestellt. Die Reste 235, 236 und 239 sind gekennzeichnet. Es wurde eine heptamere Ringstruktur aus 7 Tat-Molekülen konstruiert. Die gekennzeichneten Reste 51, 52 und 67 liegen in ähnlicher Position zum 20S Proteasom wie die des REGα.

Abb. 3.5: Herstellung der rekombinanten REGαwt, REGαm und REGβ Proteine. A, Coomassiegefärbte SDS-Gele nach Proteinaufreinigung: 1) Molekulargewichtsmarker; 2) Thrombinverdautes, rekombinantes REGαwt; 3) Thrombinverdautes, rekombinantes REGαm; 4) Thrombinverdautes, rekombinantes REGβ. B, Western Blot: 1) bis 4) sind wie in Abb. 3.5A. 2 und 3 wurden mit dem anti- REGα Antikörper inkubiert. 4 wurde mit dem anti- REGβ Antikörper inkubiert.

Abb. 3.6: Messung der Chymotrypsin-ähnlichen 20S Proteasom-Aktivität in Anwesenheit von REGαwt, REGαm mit oder ohne REGβ in vitro. A, Ansteigende Mengen der rekombinanten REGαwt oder REGαm Proteine wurden gegen konstante Mengen des 20S Proteasoms in Anwesenheit von Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA titriert. Die Fluoreszenz wurde bei RT gemessen. Die Kurve und die kinetischen Konstanten wurden mit dem gleichen Modell wie in Abb. 3.2B berechnet. B, Ansteigende Mengen der Kombinationen aus den rekombinanten REGαwt + REGβ oder REGαm + REGβ wurden gegen konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Die Fluoreszenz wurde wie in A gemessen und berechnet. C, Ansteigende Mengen der rekombinanten REGαwt wurden gegen konstante Menge der rekombinanten REGαwt + REGβ und konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Die Fluoreszenz wurde wie in A gemessen und berechnet. D, Ansteigende Mengen von REGαm wurden gegen konstante Mengen der rekombinanten REGαwt + REGβ und konstante Mengen des 20S Proteasoms titriert. Die Fluoreszenz wurde wie in A gemessen und berechnet.

Abb. 3.7: Die Mutation der rekombinanten REGα Untereinheit hat keinen Einfluss auf die Komplexbildung mit sich selbst oder mit dem REGβ oder mit dem 20S Proteasom. A, Die Komplexbildung des REGα mit sich selbst oder mit dem REGβ. Die Verteilungen von REGαwt, REGαm, REGαwt + REGβ und REGαm + REGβ wurden in den Fraktionen von 10-40% Glyceringradierten verglichen. Die Gradienten wurden in 14 Fraktionen (ca. 800 μl) aliquotiert und im Western Blot mit dem Anti-REGα Antikörper oder mit dem Anti-REGβ Antikörper getestet. B, Komplexbildung des REG mit dem 20S Proteasom. Die Verteilungen von REGαwt + REGβ und REGαm + REGβ wurden mit der des 20S Proteasoms in den Fraktionen von 10-40% Glyceringradierten verglichen. Die Gradienten wurden in 18 Fraktionen (ca. 680 μl) aufgeteilt und im Western Blot mit dem Anti-C2 (Identifizierung der Position des 20S Proteasoms) oder mit dem Anti-REGβ Antikörper getestet.

Abb. 3.8: Die Mutation des Tat-Peptides37-72 (Tatpep1) der Aminosäuren Lys51, Arg52, und Asp67 (Tatpep5) verhindert die Konkurrenz mit dem 11S Regulator. A, Die Sequenz des Tatpep5. Die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 wurden durch Ala substituiert. B, Messung der Chymotrypsin-ähnlichen 20S Proteasom-Aktivität. Tatpep1, Tatpep2 und Tatpep5 wurden mit dem 20S Proteasom und dem Peptidsubstrat Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC inkubiert. Die Fluoreszenz wurde bei RT gemessen. Die Peptidaseaktivität wurde als ΔF (F = Fluoreszenz) pro min ausgedrückt. C, Die Dot-Blots. Das 20S Proteasom wurde auf Nitrocellulose-Membranen aufgetragen. Danach wurden Nitrocellulose-Streifen mit je drei Proteasom-Dots mit REGαwt oder REGαm mit oder ohne Tatpep1, 2, 5 inkubiert. Anschließend erfolgte die Detektion mit dem anti-REGα Antikörper.

Abb. 3.9: Der Einfluss des vollständigen Tat-Proteins, der Tat-Peptide (Tatpep1 und Tatpep5) und der stabilen Transfektanten (REGαwt und REGαm) auf die Antigenpräsentation in vivo. A, CTL-Assay mit den Tat-Peptiden. Die Tat-Peptide Tatpep1 und Tatpep5 wurden mit B8 Zellen inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen im CTL-Assay gemessen. Die spezifische Lyse wurde mittels eines Modells (siehe 2.2.26) berechnet. B, CTL-Assay mit dem Tat-Protein. Das vollständige Tat-Protein wurde mit B8 Zellen inkubiert. Nach 24 h wurden die Zellen im CTL-Assay gemessen. Die spezifische Lyse wurde mittels eines Modells (siehe 2.2.26) berechnet. C, CTL-Assay mit den stabilen Transfektanten REGαwt und REGαm. Gleiche Mengen der drei REGαwt-exprimierenden und fünf REGαm-exprimierenden Zellklone wurden gesammelt und im CTL-Assay getestet. Die spezifische Lyse wurde mittels eines Modells (siehe 2.2.26) berechnet.

Abb. 3.10: Der Einfluss des Tat-Proteins auf die Stabilität der Transkriptionsregulatoren IκBα und c-Jun in vivo. 4 h vor der Lyse wurde 20 μM Lactacystin zu den Zellen gegeben. Nicht-transfizierte HeLa Zellen dienten als Kontrolle. Die Proteinmengen der Überstände der Lysate (wie in Abb. 3.1A) wurden mit dem Photometer bei OD 280 nm abgeschätzt. Gleiche Mengen der Überstände wurden auf die SDS-Gele aufgeladen. Im Western Blot wurden der anti-IκB oder anti-c-Jun Antikörper benutzt.