Hütter, Gero : Chemoresistenzassoziierte Veränderungen der Proteinexpression bei Kolon-, Mamma-, Magen-, Pankreaskarzinom und Fibrosarkom mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten

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Kapitel 1. Einleitung

1.1. Chemoresistenz bei der Behandlung maligner Neoplasien: Stand der Forschung

Bei der Behandlung disseminierter maligner Neoplasien ist die Chemotherapie mit Hilfe zytostatisch oder zytotoxisch wirksamer Substanzen oftmals die einzige Therapiestrategie mit Aussicht auf Erfolg. Seit dem erstmaligen Gebrauch von Nitrogen Mustard zur Behandlung bösartiger Tumore Mitte der vierziger Jahre (Rhoads 1946), konnten zahlreiche andere chemotherapeutische Wirkstoffe gefunden werden, die Einzug in die klinische Anwendung fanden. Therapielimitierend ist jedoch häufig die Manifestation einer Chemoresistenz, die nicht nur gegen Vertreter einer Stoffklasse gerichtet ist, sondern meist ein breites Spektrum strukturell unterschiedlicher Substanzen einschließt.

Die Ursachen für die Entwicklung einer Chemoresistenz können grundsätzlich auf allen zellulären Ebenen begründet liegen. Sie reichen von der Aufnahme durch die Zellmembran, über die intrazelluläre Modifikation bis zur verminderten Affinität zum Wirkungspunkt des therapeutischen Agens.

Zusammenfassend lassen sich die wichtigsten dieser Mechanismen aufteilen in:

Verminderte Aufnahme des Substrates in die Zelle

Vermehrte Inaktivierung oder verminderte Aktivierung des Substrates intrazellulär

Verminderte Affinität des Substrates zu den intrazellulären Zielen

Gesteigerte Reparationskapazität der Zelle

Die oben aufgeführten Möglichkeiten zur Ausbildung einer Chemoresistenz sind zum Teil substratspezifisch und stehen somit nicht alle im direkten Zusammenhang mit der klinisch bedeutsamen unspezifischen Vielfachresistenz gegen ein weites Feld von Therapeutika. Für diesen Fall läßt sich ein fünfter Punkt definieren, der die Wirkung energieabhängiger Transportproteine zur zellulären Detoxifikation beschreibt:

Geringere intrazelluläre Konzentration durch einen auswärtsgerichteten Substratstrom, der durch Transportproteine vermittelt wird


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Abbildung 1.1.1
Biochemische Grundmechanismen der Chemoresistenz (mod. n. Hayes 1990). Erläuterungen der Punkte 1-5 siehe Kapitel 1.1.1 bis 1.1.5

1.1.1. Verminderte Aufnahme des Substrates in die Zelle

Mutationen an den Genen der für das Eindringen der Chemotherapeutika notwendigen Transportproteine ist für Resistenzen verantwortlich, wie sie für Methotrexat beschrieben worden sind. Methotrexat (MTX), ein 4-NH2-N10-methyl Analog der Folsäure gelangt durch einen aktiven Transportprozeß, welcher physiologischer Weise für N5-Methyltetrahydrofolat und für N5-Formyltetrahydrofolat besteht, in die Zelle (Goldman 1978, Bender 1975, Schilisky 1981). Bei hoher MTX Konzentration ist noch ein zweiter, allerdings weniger effektiver Mechanismus zur intrazellulären Aufnahme des Pharmakons vorhanden (Hill 1979, Henderson 1984).

Eine Verminderung des Transportes kann entweder durch eine geringere Affinität an dem Rezeptor oder eine Senkung der Transportrate begründet sein. Studien an leukämischen Mäusen zeigten bei dem resistenten Phänotyp L1210 eine 3-5fache Reduktion des maximalen Substrateinstromes in die Zellen (Hill 1979, Sirotnak 1981, Bertino 1980). Den überlebensnotwendigen Bedarf, der durch die Transportminderung ebenfalls betroffene Folsäureaufnahme, erfolgt über zusätzliche Wege: Zum einen über einen Folsäurerezeptor mit geringer Affinität (Sirotnak 1987), zum anderen über ein Folsäure bindendes Protein mit hoher Affinität (Jansen 1989). Beide alternative Wege sind gegenüber einer Beeinträchtigung von MTX insensibel.


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1.1.2. Vermehrte Inaktivierung oder verminderte Aktivierung des Substrates intrazellulär

Eine besondere Bedeutung kommt hierbei der Detoxifikation durch Konjugation mit Glutathion zu. Glutathion wirkt als Sulfhydrylpuffer, indem es von einer reduzierenden Thiolform (GSH) in die oxydierende Form (GSSG) wechselt. GSSG wird anschließend von der Glutathion-Reduktase, einem Flavoprotein mit NADPH als Elektronendonator, zu GSH reduziert. Die Neusynthese von GSH erfolgt über zwei ATPabhängige Schritte: 1.) gamma-Glutamylcystein-Synthetase katalysiert eine Amidbindung zwischen Cystein und dem gamma-Carboxyl von Glutamat; 2.) GSH-Synthetease ermöglicht die Reaktion von Glycin mit Cysteincarboxyl des gamma-Glutamylcystein um das Tripeptid gamma-Glutamylcysteinylglycin zu bilden (Arrik 1984).

Glutathion scheint für eine Vielzahl zytotoxischer Agenzien entgiftend zu wirken. Beschrieben sind u.a. Effekte bei: Mechlorethamin (Hirono 1961; Goldenberg 1969), Cyclophosphamid (Gurtoo 1981), Adriamycin (Babson 1981), Daunorubicin und Mitomycin C (Arrick 1984).

Der geschwindigkeitslimitierende Schritt im GSH Stoffwechsel bildet die gamma-Glutamycystein-Synthetase (Meister 1988). Eine Überexpression von mRNA der gamma-Glutamycystein-Synthetase konnte bei Nitrosourea behandelten Gliomen nachgewiesen werden (Gomi 1997).

An Hand von Ovarialkarzinomen konnte dieser Effekt auch gegenüber alkylierenden Substanzen sowie cis-Platin dargestellt werden. Ein spezifischer Inhibitor der Glutathion-S-Transferse -Buthionin sulphoximin (BSO)- bewirkt in vitro eine Revision der Resistenz (Perez 1990).

Eine 15fache Unempfindlichkeit gegen Nitrogen Mustard konnte experimentell bei einer Tumorzellinie der Ratte erzeugt werden. Die resistenten Zellen zeigten einerseits höhere Konzentration von Glutathion-S-Transferase (GST), andererseits ließen sich mit Hilfe von SDS Gel-Elektrophorese und Western Blot Isoenzyme der GST nachweisen. Insbesondere die Überexpression eines 29,5 kDa großen Isoenzymes der GST scheint für den Nitrogen Mustard resistenten Phänotyp mitverantwortlich zu sein (Clapper 1987). Für eine gegen Doxorubicin selektionierte Brustkrebszellinie MCF7 gelang der Nachweis einer Überexpression einer neuen anionischen Form der GST (Batist 1986), die als GSTpi bezeichnet wird.

Erst kürzlich konnte ein Bleomycin detoxifizierendes Enzym gefunden werden: die Bleomycin-Hydrolase mit struktureller Ähnlichkeit zur Cystein-Proteinase (Ferrando 1996). Es besteht für die Bleomycin-Hydrolase eine gute Übereinstimmung zur Ausprägung der Resistenz gegen Bleomycin in der Chemotherapie.


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In einer anderen Studie konnte gezeigt werden, daß vermehrte Expression von Metallothionein den Therapieerfolg von cis-Platin limitiert. Metallothionine sind cystinreiche Proteine, die in breiter Variation in eukaryonten Zellen vorkommen. Physiologisch spielen sie eine entscheidende Rolle in der Zn2+ und Cu2+ Homoestase und bei der Detoxifikation von Schwermetallionen. Experimentell konnte in vitro einen Resistenz gegen cis-Platin aufgebaut werden: Einerseits durch Exposition von Schwermetallionen andererseits durch Transfektion mit einem Bovinen Papilloma Virus, das DNA enthielt, die für humanes Metallothion-IIA kodiert (Kelley 1988).

Neben einer gesteigerten Inaktivierung durch Überexpression eines protektiven Faktors, kann auch die Herabregulation substrataktivierender Mechanismen zur Ausbildung von Resistenzen führen. Als Beispiel dafür gilt Cyclophosphamid, das über ein Cytochrom P-450 System durch Ringhydroxylierung in a-Stellung zu 4-Hydroxycyclophosphamid überführt wird, welches den Ausgangspunkt darstellt für die Bildung des elektrophilen Aktivierungsproduktes am Ende der Aktivierungskette (Hayes 1990).

Ein anders Beispiel für dieses Form der Chemoresistenz findet sich im Metabolismus der Cytosin Arabinoside (ara-C3) bei verschieden Leukämieformen. Ara-C3 ist ein synthetisches Nukleotid, dessen Phosphorylation und Inkorporation in die DNA mit der zytotoxischen Wirkung korreliert. Die ara-C3 resistenten akuten Leukämien zeigten eine signifikant niedrigere Phosphorylation des Therapeutikums (Kessel 1969).

Ein alternativer Weg der Zelle die Konzentration des Zytostatikums intrazellulär zu vermindern, ist die Kompartimentierung. In der von mir benutzten gegen Mitoxantron resistenten Magenkarzinomzellinie EPG 257-85 RNOV wurde im Interferenz-Mikroskop die Akkumulation von mitoxantronhaltigen Vesikeln -dicht unter der Zellmembran- nachgewiesen. Sensitive Zellen zeigten eine diffuse Verteilung des Mitoxantron mit den Zeichen der toxischen Wirkung: Zerstörung des Zytoplasmas und Karyopyknose (Dietel 1990; Seidel 1995). Vergleichbare Beobachtungen der Kompartimentierung konnten auch bei zahlreichen anderen Zellinien gemacht werden (Mazzoni 1990; Rutherford 1993; Cornwell 1986).


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1.1.3. Verminderte Affinität des Substrates zu den intrazellulären Zielen

Die pharmakologische Wirkung von Methotrexat an der Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) besteht in der Inhibition des Folsäurestoffwechsel. In der Zelle bindet MTX schnell an Dihydrofolat-Reduktase und inaktiviert diese dadurch. Dieses Enzym spielt eine wichtige Rolle zur Aufrechterhaltung des Pools an Tetrahydrofolsäure (FH4) in dem es Dihydrofolsäure (FH2), das während der Thymidylatsynthese entsteht, reduziert. Die Inhibition der DHFR führt zu einem Abfall der FH4 Konzentration bei gleichzeitiger Akkumulation der FH2 bei bestehender Thymidylatsynthese.

Die Hemmung der Thymidylat-Synthase und die Hemmung der vom Folsäurestoffwechsel abhängigen Purinsynthese bewirken die therapeutisch beabsichtigte Beinträchtigung der DNA Replikation (Moran 1979).

Es konnte gezeigt werden, daß eine Punktmutation der cDNA an Position 22 der DHFR mit Austausch von Arginin für Leucin zur Ausbildung einer Chemoresistenz führt. Die Mutation fand in einer Region statt, die für die Bindungsstelle des Inhibitors Methotrexat entscheidend ist (Simonsen 1983).

Ebenfalls für Methotrexat ist eine vermehrte Expression der nicht mutierten Dihydrofolat-Reduktase beschrieben worden. Im Wettbewerb von MTX und Dihydrofolsäure um freie Bindungsstellen der DHFR erhält die Zelle mit dieser Genamplifikation den überlebensnotwendigen Folsäurestoffwechsel aufrecht (Cohen 1978, Whit 1975). An Hand einer resistenten Zellinie von Ovarien des chinesischen Hamsters konnten im Durchschnitt 150 Kopien des Gens innerhalb der DNA dargestellt werden (Nunberg 1978).

Das Zielenzym von 5-Fluorouracil (5FU) ist die Thymidylate-Synthase (Spears 1988). Die Festigkeit der Verbindung von Thymidylat-Synthase und dem 5FU Nucleotid 5F-dUMP ist besonders stark, wenn die Konzentration von reduzierten Folaten erhöht ist (Keyomarsi 1986).

In der Methotrexat insensitiven Lymphomzellinie L5178Y konnten zwei Isoformen der Folat-Reduktase isoliert werden. Die erste besitzt eine hohe Bindungsaffinität zu MTX und wird sowohl in der sensitiven als auch der insensitiven Linie exprimiert. Die zweite findet sich nur in der insensitiven Linie, wobei dieses Isoenzym der Folat-Reduktase eine sehr geringe Affinität zu MTX zeigt. Die Bindungsfähigeit zu dem physiologischen Substrat -der Folsäure- ist jedoch geblieben. Es besteht eine direkte Korrelation zwischen der Höhe der Expression der MTX-insensitiven Variante der Folat-Reduktase und der Ausprägung der MTX-Resistenz (Goldie 1980).


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Weiterhin gibt es vielfältige Hinweise darauf, wie die Topoisomerasen in den Prozeß der Resistenzbildung involviert sind (Glisson 1987). Die Überführung der Topoisomere einer DNA ineinander wird durch Enzyme katalysiert, die man als Topoisomerasen bezeichnet. Diese Enzyme verändern die Windungszahl der DNA, indem sie einen dreistufigen Prozeß katalysieren: 1.) Spaltung eines der beiden Stränge der DNA, 2.) Durchtritt eines DNA-Abschnittes durch die entstandene Lücke und 3.) die Wiederverknüpfung der DNA-Bruchstelle. Die Typ-I Topoisomerasen spalten nur einen DNA-Strang, Enzyme vom Typ II dagegen beide.

Die zytotoxische Wirkung der Epipodophyllotoxine wird durch die Inhibition der Topoisomerease II im dritten Schritt während der Replikation mit der Folge von Doppelstrangbrüchen erklärt. Resistenzen gegen Epipodophyllotoxine rühren von der verminderten Expression der Topoisomerase II und damit der Reduktion des Zielenzyms für Topo II inaktivierender Chemotherapeutika (Pommier 1986) her. Da Topo II für die Zellteilung unabkömmlich ist, bestehen Grenzen für die Abnahme der Topo II Konzentration und damit für den Grad der Chemoresistenz im Hinblick auf diesen Mechanismus (Holm 1989).

1.1.4. Gesteigerte Reparationskapazität der Zelle

Als Schutz vor der Wirkung alkylierender Substanzen konnte als Resistenzmechanismus die vermehrte Synthese von O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (MGMT) aufgedeckt werden (Demple 1985, Pegg 1990). O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase schützt die DNA vor den genotoxischen Effekten alkylierender Agenzien, indem sie O6-Alkylguaninresiduen wie O6-Methylguanin zu Guanien umwandelt. Dies geschieht unter dem Verlust eines Cysteinrestes auf der aktiven Seite, verbunden mit der irreversiblen Inaktivität der MGMT (Dalby 1994).

Transfektion mit bakterieller MGMT induziert Resistenz gegen Bischloroethyl-Nitrosourea bei zuvor sensiblen Säugetierzellen (Dumenco 1989).

Als Mechanismus der Zytotoxizität von cis-Platin wird die Bindung an die DNA mit konsekutiver Interferenz von Transkription und Replikation angesehen. Die einzige Möglichkeit der Zelle zum weiteren Überleben dieser kovalenten Interaktion besteht in einer effizienten Reparatur dieser Läsion. Einzelheiten des Mechanismus, wie Zellen die potentiell letalen Beschädigungen erkennen und beheben, erfordern das Zusammenspiel einer Vielzahl von Enzymsystemen, welche allgemein als Reparatur durch Herausschneiden oder “excision repair“ zusammengefaßt werden (Friedberg 1985). Als Maß für die als “excision repair“ subsumierten Reperaturvorgänge dient die Aufnahme von [3H]-Thymidin in die DNA. So zeigte die cis-Platin resistente menschli-


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che Ovarialkarzinom Zellinie A2780 eine signifikant höhere Aufnahme von [3H]-Thymidin in die DNA als die parentale Zellinie, gleichsam Ausdruck einer -für die Resistenz notwendigen- gesteigerten Reparationsleistung .

Daß vielfältige Einzelreaktion an der Wiederherstellung Zytostatika induzierter Läsionen beteiligt sind, konnte an Hand der ausschneidenden DNA-Polymerase und den wieder verbindenden Ligasen gezeigt werden (Scanlon 1989). In Übereinstimmung damit führt eine Behinderung der Reparaturvorgänge durch Aphidicolin, einem Inhibitor der DNA-Polymerase-alpha, zu einem Anstieg der Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika in der zuvor resistenten Linie (Masuda 1988).

Der cyclinabhängige Kinaseninhibitor p21WAF1/CIP1 ist essentiell für die Koordination von S- und M-Phase im Zellzyklus. Die Identifizierung von p21 als ein transkriptionelles Ziel von p53 lieferte die molekulare Erklärung für den Zellzyklusstillstand nach Exposition DNAschädigener Agenzien. Da der Stillstand im Zellzyklus der Zelle die Möglichkeit gibt, DNA-Schäden vor der Replikation zu reparieren, kann der Verlust von p21 zu einer Zunahme der Chemosensitivität führen. In vitro konnte bei p21-/- Zellen eine defiziente Reparatur nach Schäden, die durch ultraviolettes Licht oder zytotoxischen Stoffen verursacht wurden, festgestellt werden. Es scheint sich herauszukristallisieren, daß die cyclinabhängigen Kinaseninhibitoren p21 und p16 die Apoptose wirksam verhindern und chemoprotektiv wirken können (Waldman 1996).

1.1.5. Geringere intrazelluläre Konzentration durch einen transportproteinabhängigen auswärtsgerichteten Substratstrom

1.1.5.1. Das Phänomen der Vielfachresistenz oder Multidrug Resistance

Das Auftreten einer pleiotropen Resistenz gegen eine Vielzahl strukturell bzw. funktionell unterschiedlicher Agenzien wird als Multidrug Resistance (MDR) bezeichnet. Der MDR Phänotyp schließt eine Kreuzresistenz gegen Anthrazycline (Doxorubicin, Daunorubicin), Epipodophylltoxine (Etoposid), Vinca Alkaloide (Vinblastin, Vincristin), Taxol und andere Gruppen ein. Anfänglich durchgeführte physiologische und pharmazeutische Studien zeigten Hinweise auf eine verminderte Anreicherung des Therapeutikums in der Zelle (Kessel 1968). Als Ursache dafür wurden ein vermehrter Auswärtstransport (Dano 1973) bzw. eine verminderte Zellpermeabilität (Ling 1974) diskutiert.

Zu den bisher bekannten Mechanismen die zur MDR führen, werden die vermehrte Expression von P-Glykoprotein (PGP) sowie dem Multidrug Resistenz assoziierten Protein (MRP) und Lungen-Resistenz-Protein (LRP) gezählt.


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PGP und MRP gehören zu der Familie der ABC-Transporter, die als gemeinsames Merkmal der molekularen Architektur zwei große transmembranäre Domänen und zwei nukleotidbindende Domänen (NBD) mit Bevorzugung von ATP besitzen (Higgins 1992). Gemäß den Schwierigkeiten große Membranproteine zu kristallisieren, konnten die dreidimensionalen Strukturen im einzelnen nicht hinlänglich geklärt werden.

Zahlreiche eukaryonte und prokaryonte ABC Proteine sind dahingehend beschrieben worden, in den Transport von Molekülen und Ionen involviert zu sein (Higgins 1992). Besondere strukturelle Verwandtschaft zum MRP bestehen für den erst kürzlich identifizierten Sulfunylharnstoffrezeptor (SUR) (Aguilar-Bryan 1995) und dem Zystischen Fibrose transmembranären Konduktanz Regulator (CFTR) mit 19% Aminosäurenübereinstimmung (Riordan 1989, Stutts 1992). Weiterhin besteht 32% Aminosäurenübereinstimmung zu ItpgpA, einem Leishmania Protein, das u. a. Resistenz gegen Arsen vermittelt (Papadopoulou 1994). Schließlich zwei Hefe Proteine, zum einen YORI, welches Oligomycinresistenz vermittelt (Katzmann 1995) und YCF1 mit 43% Aminosäurenübereinstimmung zu MRP im Zusammenhang von Resistenzbildung gegen Cadmium (Szczypka 1994).

1.1.5.2. Das P-Glykoprotein

Die Entdeckung des P-Glykoproteins brachte ausgedehnte Studien zum Wirkungsmechanismus, wie auch der klinischen Bedeutung dieses Phänomens mit sich. Erstmalig konnte 1976 die Überexpression dieses Proteins in einer Zellinie des chinesischen Hamsters nachgewiesen werden (Juliano 1976).

PGP ist ein 170 kDa großes transmembranäres Protein das einen ATP abhängigen Pumpmechanismus unterhält (Gerlach 1986; Pastan 1987). Entsprechend der vermuteten Funktion im Prozeß der natürlichen Detoxifikation der Zelle, findet sich PGP auch in normalen menschlichen Geweben, insbesondere solcher mit sekretorischer oder schrankenbildener Funktion, wie auch in peripheren Blutzellen.

Das für PGP kodierende Gen wird als MDR1 bezeichnet (Gros 1986; Ueda 1986). Das MDR1 Gen ist 100 kb groß und enthält 29 Exons. Es gehört zu einer kleinen Familie von zwei in menschlichen Zellen vorkommenden Genen (MDR1/MDR2), sowie drei Mitgliedern von Nagetieren (Chinesischer Hamster: pgp1, 2 und 3; Maus: mdr1a/1b und mdr2). Transfektion mit MDR Genom oder genspezifischer cDNA zeigten, daß das MDR1 Gen alleine zur Ausbildung des MDR Phänotyps ausreicht.


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PGP, das Genprodukt von MDR1, besteht aus 1280 Aminosäuren und enthält zwei homologe Hälften. Jede Hälfte hat sechs membranübergreifende Domänen, die drei transmembranäre Schleifen bilden und eine intrazelluläre Bindungsstelle für ATP; eine Verminderung des intrazellulären ATPs bedingt folgerichtig einen Anstieg der Chemosensibilität (Broxterman 1988).

PGP unterhält einen energieabhängigen Efflux von hydrophoben xenobiotischen Agenzien; die natürlichen endogenen Substrate sind bisher unbekannt (Cornwell 1987; Pastan 1987).

Zum Mechanismus der Regulierung der Expression von PGP ist bekannt, daß er bei den meisten Nagetierzellinien über eine Genamplifikation abläuft (Van der Bliek 1989). Im Gegensatz dazu finden sich in menschlichen Zellinien eher eine Aktivierung der Transkription (Shen 1986; Van der Bliek 1988; Baas 1990). In klinischen Beispielen der PGP Überexpression konnte eine Genamplifikation überhaupt nicht nachgewiesen werden (Goldstein 1989; Rothenberg 1989).

1.1.5.3. MRP, das mit Vielfachresistenz assoziierte Protein

Hinweise auf ein neues von PGP unabhängiges Transportsystem ergaben sich aus Untersuchungen an der Leukämiezellreihe HL60/ADR (McGrath 1988). Die Isolierung dieses membranären Transportglykoproteins gelang allerdings an einer P-Glykoprotein negativen Linie des kleinzelligen Bronchialkarzinoms H69AR, das schrittweise mit Doxorubicin selektioniert wurde (Mirski 1987). Keiner der bis dahin bekannten Resistenzmechanismen konnte als Erklärungsmodell dafür dienen. Die Identifizierung einer 6,5 kb großen mRNA, die in H69AR ca. 100fach überexprimiert war, führt über die Sequenzierung eines cDNA Klones dieser mRNA zur Entdeckung des MRP (Cole 1992a). Untersuchungen an anderen Zellinien zeigten, daß sich bei den meisten PGP unabhängigen Multiresistenzen eine Überexpression von MRP nachweisen läßt (Krishnamachary 1993; Barand 1994; Slovak 1993; Sumizawa 1994; Zamam 1993).

MRP gehört zu der ATP bindenden Familie der membranständigen Transportproteine mit geringer sequentiellen Homologie zu PGP. Transfektion von MRP cDNA in menschliche Tumorzellen resultiert Vielfachresistenz (Grant 1994).

Als MRP Genlokus konnte das Chromosom 16p13.13-13.12 detektierte werden (Krishnamachary 1993; Slovak 1993). Fernerhin konnte gezeigt werden, daß eine Genverstärkung zu einer vermehrten Expression von MRP mRNA in den in vitro selektierten Zellen beiträgt (Cole 1992a; Slovak 1993), welche Verstärker-Domänen von komplexen Ursprung besitzen (Ray 1994). Die Überexpression von MRP kann also einerseits durch eine Amplifikation des kodierenden Gens am ursprünglichen Genort erfolgen (Slovak 1993), oder andererseits auf anderen Chromosomen


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wie etwa 1,6 oder 7. Es finden sich allerdings auch zahlreiche Hinweise darauf, daß eine vermehrte Produktion von MRP auch ohne Genamplifikation stattfinden kann (Cole 1992a; Eijdems 1995). Eine Analyse des Initalpromoters vom MRP Gen zeigt multiple Startpunkte für die Transkription und übereinstimmende Bereiche für eine positive oder negative Regulation (Zhu 1994).

Für die dreidimensionale Struktur des 1531 Aminosäuren großen MRP existieren verschiedene Modelle. Die größte Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz im Vergleich zu den anderen Mitgliedern der ABC Familie besteht in den Nukleosid bindenden Domänen (NBD). Die erste Vorhersage für die Sekundärstruktur des MRP beinhaltete ein Molekül mit acht transmembranären Domänen auf der N-terminalen- und vier auf der Carboxylseite, jede Seite jeweils einmal N-glykolisiert (Cole 1992a, Cole 1993). Alternativ dazu besteht das Modell von Loe, das 11-12 N-terminale und sechs carboxylterminale Segmente beinhaltet, wobei in den ersten 230 Aminosäuren fünf oder sechs Segmente auf der N-terminalen Seite liegen (Loe 1996). Auf Grund struktureller Ähnlichkeiten mit dem CFTR kommt die Arbeitsgruppe um Bakos zu einer Vorhersage des Aufbaues, die drei membraneingebundene Regionen beinhaltet, die von großen zytoplasmatischen Schleifen voneinander getrennt sind. Basierend auf den Analysen des hydrophobischen Kräfteverhältnisses, konnten zwei mögliche Varianten der Glykolisierungsregion auf der N-terminalen Seite vorhergesagt werden (Bakos 1996).

Transfektion mit HeLa und nicht kleinzelligen Bronchialkarzinomzellinien sicherten die Erkenntnis, daß mit einer Überexpression von MRP eine Resistenz gegen eine Vielzahl wichtiger Chemotherapeutika assoziiert ist (Grant 1994; Zaman 1994). Dazu gehören Doxorubicin, Vincristin, Vinblastin und Etoposid; weniger betroffen sind davon Mitoxantron und Taxol.

Im Gegensatz zu P-Glykoprotein kann MRP als sogenannte GS-X-Pumpe (ATP-dependent glutathione S-conjugate efflux pump) wirken, bei der ein Transport der mit GSH konjugierten chemotherapeutischen Agenzien aus der Zelle stattfindet (Jedlitschky 1996).

MRP exprimierende Zellen zeigen einen ATP abhängigen Transport von Leukotrien C4 (LTC4) und S-2,4-Dinitropphenyl Glutathion in Membranvesikeln als Hinweis auf einen Glutathion-S-Konjugate vermittelten auswärtsgerichteten Pumpmechanismus (Leier 1994, Zaman 1994).

Dieser engen Koppelung von Glutathiondetoxifikation, wie sie oben beschrieben wurde, und dem MRP vermittelten Auswärtstransport kommt eine wichtige Rolle in der Ausbildung des vielfachresistenten Phänotyps zu.


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Es ist bekannt, daß reduzierte GSH kein Substrat für MRP darstellt (Muller 1994); allerdings bestehen Hinweise darauf, daß MRP mit GSH im Sinne eines Cotransportes einen Auswärtstransport aufrechterhalten kann (Rappa 1997).

Neben GSH-Konjugaten stellen auch glukorinierte und sulfatierte endogene und exogen Produkte ein Substrat für MRP dar (Jedlitschky 1996).

Schließlich gibt es Hinweise darauf, daß für MRP1 Homologe existieren, die am Phänomen der MDR beteiligt sind. Dazu werden das cMOAT oder auch MRP2 genannte Protein gezählt, das in Menschen- und Nagetierzellinien gefunden wurde (Paulusma 1996; Ito 1997; Taniguchi 1996). cMOAT, das eine 49% Übereinstimmung mit MRP1 auf Proteinebene besitzt, arbeitet ebenfalls als GS-X Pumpe und befindet sich in erster Linie in den kanikulären Membranen der Hepatozyten. Eine Recherche in der EST Bibliothek (expressed sequence tag) brachte weitere MRP1 Homologe zu Tage , die als MRP3, MRP4 und MRP5 bezeichnet werden, deren Rolle in der Ausprägung des MDR Phänotyps im einzelnen noch ungeklärt sind (Kool 1997).

1.1.5.4. Das Resistenzprotein der Lunge

Die Entdeckung des Resistenzproteins der Lunge (LRP) zeigt einen möglichen Weg zur Entwicklung einer Chemoresistenz auf, der nicht durch ein Protein vermittelt wird, das aus der Familie der ABC-Transporter stammt (Scheper 1993; Scheffer 1995). Vielmehr gehört es zu der Gruppe der Vault-Proteine, deren ungewöhnliche Struktur es vermuten lassen, Teil des Zellkern-Porenkomplexes zu sein (Rome 1995). Erstmalig in einer Zellinie eines Bronchialkarzinomes detektiert, konnte es auch in den meisten anderen Neoplasien nachgewiesen werden, deren Chemoresistenz nicht auf eine Expression von P-Glykoprotein zurückzuführen war.

LRP ist ein 110 kDa großes Protein, daß ähnlich wie PGP im natürlichen Gewebe an xenobiotisch exponierten Stellen vermehrt exprimiert wird, ausgenommen die Gallenkanäle, wo sich zwar PGP aber kein LRP nachweisen läßt (Izquierdo 1996b). Mit dem Lungenresistenzprotein spezifischen Antikörper LRP-56b gefärbt, findet es sich in erster Linie zytoplasmatisch in groben Granula; ein Hinweis darauf, daß es mit einem Molekül interagiert, das mit vesikulären bzw. lysosomalen Strukturen assoziiert ist (Scheper 1993). Die cDNA, die für das LRP kodiert, konnte an der menschlichen Fibrosarkomzellinie HT1080/DR4 isoliert werden. Dual-Color-Fluoreszenz Hybridisation konnten als Genort das chromosomale Segment 16p11.2 lokalisieren -etwa 27 cM in der Nähe des MRP Lokus (Scheffer 1995).


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Über die Funktion des Lungenresistenzprotein besteht nach wie vor Unklarheit. In Analogie zur anderen Vaults nimmt man an, daß LRP an der Regulation des nukleozytoplasmatischen bzw. vesikulären Transportes verschiedener Substrate teilnimmt. Gestützt wird diese These von der Beobachtung einer verminderten nukleo-/zytoplasmatischen Konzentration und der Exozytose in Vesikeln von Chemotherpeutika in LRP überexpremiernden Zellen (Schuurhuis 1991).

1.1.6. Weitere Aspekte zur Entwicklung der Chemoresistenz

1.1.6.1. Weitere Alternativen

Neben den oben erwähnten näher vorbeschriebenen Mechanismen, die zu einer Chemoresistenz führen können, gibt es zahlreiche Hinweise darauf, daß noch weitere Faktoren eine Rolle spielen.

In einer Actionomycin (ACT-D) resistenten Brustkrebszellinie MDA-231 konnte nachgewiesen werden, daß epidermaler Wachstumsfaktor und der insulinähnliche Wachstumsfaktor-1 Zellen vor dem ACT-D induzierten Zelltod schützen (Geier 1994). Der genaue Mechanismus ist nicht sicher aufgeklärt, jedoch sind Wachstumsfaktoren dafür bekannt, als Stimulatoren für die Synthese von Makromolekülen zu dienen (Pusztai 1993).

Ungeklärt ist auch die Rolle eines 85 kDa großen Membranproteins, das in zahlreichen Adriamycin resistenten Tumoren durch monoklonale Antikörper nachgewiesen werden konnte. Die Expression dieses Proteins scheint relativ spezifisch für die Resistenzbildung gegen Adriamycin zu sein, da es in keiner mit anderen Chemotherapeutika selektionierten Zellinie vorkommt (Hamada 1988).

Darüber hinaus existieren noch zahlreiche Darstellungen anderer Faktoren, die -zum Teil nur als Einzelberichte- im Zusammenhang mit der Entwicklung einer Chemoresistenz bei malignen Tumoren erwähnt werden, deren ausführliche Schilderung aber den Rahmen dieser Einleitung bei weiten sprengen würden.

Interessant ist auch eine Beobachtung, die an Nierenzellkarzinomen im Vergleich zu normalen Nierengewebe gemacht wurde: In den Nierentumorzellen fanden sich erhöhte mRNA Spiegel der menschlichen mutT Homologe (hMTH1); hMTH1 ist daran beteiligt, daß 8-oxo-dGTP, die oxydierte Form der dGTP, nicht in die DNA inkorporiert wird. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß hMTH1 während oxydativen Stresses vermehrt gebildet wird und nicht nur der Ausdruck einer genetischen Instabilität sonder einer Assoziation mit Chemoresistenz darstellt, was letztlich aber noch nicht bewiesen ist (Okamoto 1996).


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1.1.6.2. Die Rolle der Onkogene in der Entwicklung einer Chemoresistenz

Onkogene beinflussen und steuern das Wachstum und die Teilung einer Zelle. Sie können die Geschwindigkeit des Zellzyklus ändern und Zellen in denen sie überexprimiert werden an der Apoptose hindern. Auf Grund dieser Eigenschaften sind Onkogene bevorzugter Gegenstand der Untersuchung im Hinblick auf intrinsischer oder erworbener Chemoresistenz.

Das Onkogen Her-2/neu kodiert für ein 185 kD großen transmembranären Rezeptor -ähnlich dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor- mit entsprechender Tyrosin-Kinase-Aktivität. Das Vorhandensein von Her-2/neu ist mit weit fortgeschrittener Erkrankung und schlechtem Überleben verbunden. Am Beispiel des nichtkleinzelligen Bronchialkarzinomes konnte gezeigt werden, daß dessen Chemoresistenz nicht vom MDR1 Phänotyp abhängig ist, sehr wohl aber eine enge Korrelation mit der Her-2/neu Expression im Hinblick auf eine primäre Resistenz besteht (Tsai 1993).

Für Bcl-2 -ein 26 kD großes Protein- sind verschiedenen Wege bekannt, den programmierten Zelltod durch c-myc, p53 oder anderer DNAschädigender Stoffe aufzuhalten. Eine Assoziation mit der Ausbildung einer Chemoresistenz durch Bcl-2 wird vermutet, allerdings finden sich auch Gegenbeispiele, die diese Überlegung nicht stützen. Gefunden wurden erhöhte Spiegel an Bcl-2 in cisplatinresistenten Ovarialkarzinomen; eine exogene Zufuhr von Bcl-2 in zuvor sensitive Zellen schütz diese vor der Apoptose. Im Gegenzug kann die Blokade von Bcl-2 durch Transfektion mit antisense Oligonukletiden oder Plasmiden die zytotoxischen Effekte von Chemotherapeutika in vitro verstärken (Eliopoulos 1995).

Der Wildtyp von p53 ist ein Tumorsupressorgen und wirkt als starker Induktor der Apotose in der Folge DNAschädigender Einflüsse. Mutationen an p53 sind bei Tumoren sehr häufig zu finden. In vielen Studien konnte gezeigt werden, daß der Verlust der p53 Funktion assoziiert ist mit Tumorprogression, genetischer Instabilität, schlechter Prognose und Chemoresistenz (Velvulescu 1996). Weiterhin berichten andere Studien darüber, daß Zellen mit einem mutierten p53 System eine verminderte Expression von Bcl-2-Homologe und bax zeigen, als Zeichen dafür, daß in diesen Fällen der Verlust von bax in der Ausbildung einer Chemoresistenz resultiert (Thomas 1996).

Desweitern werden c-myc und ras als klassische Onkogene im Zusammenhang von Chemoresistenz genannt (Sklar 1991).

Schließlich sind sowohl für c-jun als auch für c-fos bekannt, daß sich ihre Expression durch Chemotherapeutika induzieren läßt und sich in chemoresistenten Zellinien erhöhte Spiegel fin-


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den. Außerdem sind c-jun und c-fos in der Regulation der GST-pi Expression beteiligt, als mögliche Ursache für ihre Wirksamkeit im Zusammenspiel der Chemoresistenz (Moffat 1994).

1.2. Allgemeine Aspekte zur 2-D-Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten

Die 2-D-Elektrophorese stellt eine Methode zur Analyse komplexer Proteingemische dar. Das zu Grunde liegende Prinzip besteht zum einen aus einer Auftrennung nach den isoelektrischen Punkten (erste Dimension) und zum anderen in einem zweiten Arbeitsschritt, in der elektrophoretischen Beweglichkeit im Polyacrylamidgel (zweite Dimension).

Seit der Etablierung dieser Technik Ende der 60er Jahre durch Dale und Latner (Dale 1969), Macko und Stegemann (Macko 1969) sowie Margolis und Kenrick (1969), die die Elektrophorese unter nicht denaturienden Bedingungen mit wasserlöslichen Proteinen durchführten, erfuhr die Methode zahlreiche Änderungen und Verbesserungen.

Durch die 1975 von Klose (Klose 1975) und O´Farrel (O´Farrel 1975) eingeführte Denaturierung der Proteine in einem Gemisch aus Harnstoff und Dithiothreitol bzw. Harnstoff, Dithiothreitol und Nonidet P-40, wurden auch wasserunlösliche Proteine der Methode zugänglich. Hochmolarer Harnstoff dissoziiert die Wasserstoffbrückenbindungen; Chaps bzw. Nonidet P-40 lösen hydrophobe Bindungen auf. Schließlich vermag Dithiothreitol als reduzierende Thiolverbindung die Quartärstruktur der Proteine zu spalten.

Die zweite Dimension fand ihre entscheidende Verbesserung in der Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) (Shapiro 1967).

Eine Weiterentwicklung in Richtung einer apparativen Unterstützung der Arbeitsweise für eine Routine-Analytik wurde von Anderson durch das Iso-Dalt-System geliefert (Anderson 1982).

Das sich daraus ergeben Konzept der isoelekrische Fokussierung mit Trägeramphlyten in harnstoff- und detergenzienhaltigen Polyacrylamidgelen in der ungenügenden Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.

Ein Teil dieser Probleme konnte durch die Standardisierung der Arbeitsvorschriften, Geräte und Chemikalien überwunden werden (Anderson 1988). Ungelöst blieb jedoch das Problem der Proteinpräzipation nahe des isoelektrischen Punktes oder auch die Generierung enger pH-Gradienten. Von entscheidendem Nachteil waren jedoch die divergierenden Fokussierungsmuster, die zum einen von den verwendeten Trägerampholyten, zum anderen durch die Kathodendrift von der Fokussierungszeit abhängen (Chrambach 1973).


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Abhilfe brachte erst die Einführung des immobilisierten pH-Gradienten (IPG) in der ersten Dimension der zweidimensionalen Elektrophorese (Bjellqvist 1982).

Immobilisierte pH-Gradienten unterscheiden sich grundsätzlich von den mit Trägerampholyten erzeugten pH-Gradienten, da sie in die Gelmatrix kopolymerisiert werden und somit im elektrischen Feld weder auf- noch abgebaut werden . Der Verlauf des immobilsierten pH-Gradienten ist unbeeinflußt von der Produktionscharge, da die Erzeugung eines IPG anstelle eines heterogenen Synthesegemisches, bestehend aus hunderten unterschiedlichen Trägerampholyten, entfällt. Die chemische Struktur der Immobiline war lange Zeit, bis auf die Tatsache, daß es sich um Acrylamidoverbindungen handelt, unbekannt. Es ist das Verdienst von Rhigetti und seiner Arbeitsgruppe, wesentliche Beiträge zur Synthese und Reinigung der Substanzen beigetragen zu haben. (Chiari 1989a; Chiari 1989b). Der Gradient driftet nicht in Abhängigkeit der Fokussierungszeit in Richtung Kathode, sondern ist stabil. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, einen pH-Gradienten noch vor der isoelektrischen Trennung aufzubauen, so daß die Proteine genügend Zeit haben, zu ihren tatsächlichen isoelektrischen Punkten zu wandern. Es resultiert ein zeitunabhängiges Fokussierungsmuster, wodurch die Reproduzierbarkeit der Protein-Spot Positionen in der ersten Dimension erhöht wird.

Das von mir benutzte 2D-Elektrophorese Konzept basiert im wesentlichen auf den von Rabilloud vorgestellten Arbeitsvorschriften (Rabilloud 1994). Dabei werden die Proteinproben nicht unilokulär auf einen Gelstreifen der ersten Dimension aufgetragen, sondern im Rehydratisierungsschritt vom Gel aufgenommen. Während des zwölfstündigen Rehydratisierungsvorganges haben die Proteine die Möglichkeit, entlang des zuvor generierten pH-Gradienten ihre Position im Gel einzunehmen. Das darauffolgende Anlegen des elektrischen Feldes dient der Fokussierung und damit der eigentlichen Auftrennung.


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