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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1. Material

3.1.1. Zellproben

Für die Durchführung der zweidimensionalen Elektrophorese stand Material folgender Zellinien zu Verfügung (Tab. 1), die mir freundlicherweise von Prof. Dr. M. Dietel (Charité) überlassen wurden:

Tabelle 3.1
Die von mir benutzten Tumorzellinien nach Ausgangsgewebe und mit der entsprechenden im weiteren Text benutzten Nomenklatur.

Ausgangstumor	Zellinie	Selektion
Magenkarzinom	EPG85-257P EPG85-257RNOV EPG85-257RDB	_ Mitoxantron Daunorubicin
Pankreaskarzinom	EPP85-181P EPP85-181RNOV EPP85-181RDB	_ Mitoxantron Daunorubicin
Kolonkarzinom	HT29P HT29RNOV HT29RDB	_ Mitoxantron Daunorubicin
Mammakarzinom	MDA-MB-231P MDA-MB-231RNOV	_ Mitoxantron
Fibrosarkom	EPF86-079P EPF86-079RNOV	_ Mitoxantron

Die entnommenen Gewebe wurden in einem serumfreien Medium zunächst mechanisch und dann enzymatisch mit 0,1 U/ml Kollagenase und 0,8 U/ml Dispase (Boehringer, Deutschland) zerkleinert. Nach Zentrifugation mit 600 U/min bei 25° C wurde das Sediment auf Kulturflaschen (Falcon, Deutschland) ausgesät. Als Kulturmedium wurde Leibovitz L 15 (Boehringer, Deutschland) genutzt, bestehend aus 5% Kälberserum (Biochrom, Deutschland), 500 µg Glutamin, 3,1 mg Fetuin, 40 IE Insulin, 1,25 mg Transferrin, 0,56 g NaHCO₃, 5 ml essentielle Vitamine und 250 mg Glucose (Sigma, Deutschland) auf je 500 ml.

Die Selektionierung erfolgte schrittweise über max. 120 Tage, beginnend mit 0,001 µg/ml mit Daunorubicin (Farnitalia, Deutschland) bis 2,4 µg/ml und für Mitoxantron (Cyanamid/Lederle, Deutschland) bis 0,2 µg/ml, ausgenommen für EPP85-181RNOV bis 0,02 µg/ml (Dietel 1987; Dietel 1990).

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3.1.2. Reagenzien

Von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) wurden CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-Dimethyalmino]-Propansulfat), DTT (1,4-Dimercaptobuten-2,3-Diol), Spermine und Taurin bezogen.

Die Immobiline II mit den pK-Werten 3.6, 4.6, 6.2, 7.0, 8.5, 9.3, Repel-Silan, Gel Bond PAG für Polyacrylamidgele, Pharmalyte und Ampholine im Bereich von pH 3 bzw. 3,5 bis pH 10 für IEF, sowie die Glasplatten zum Gießen der Gele wurden von Pharmacia Biosystems (Uppsala, Schweden) geliefert.

Von Bio-Rad Laboratories (Richmond, USA) kamen: Bis (N-N´-Methylene-bis-acrylamide), TEMED (N,N,N`,N`-Tetra-methyl-ethylendiamin), APS (Amoniumpersulfat), Coomassie Brillant Blue R-250, Acrylamid, SDS (Natriumlauryl-sulfat).

Alle anderen Chemikalien mit dem Reinheitsgrad p.A. lieferte Merk (Darmstadt, Deutschland).

3.1.3. Geräte

Die Proteinkonzentrationsbestimmung wurde auf einem Dynatech MR 5000 Photometer durchgeführt.

Für die Zentrifugenarbeiten wurde eine Eppendorf Centrifuge 5402 benutzt.

Zur pH-Messung diente das 763 Multicalimatic pH-Meter von Knick (Berlin, Deutschland).

Die Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten geschah in rechnergesteuerte Büretten der Firma Desaga (Heidelberg, Deutschland). Als Steuerplattform diente ein Apple II.

Für die erste Dimension wurden Multiphor II 2117 Electrophoresis Unit als Elektophoresekammer und für die Stromversorgung Electrophoris Power Supply EPS 3500 XL, beide von Pharmacia Biosystems (Uppsala, Schweden), verwendet.

Die Gele der zweiten Dimension wurden in der Protean^TM II Multi-Gel Casting Chamber von Bio-Rad Laboratories (Richmond, USA) gegossen.

Die Auftrennung der Gele entsprechend ihrer Molekulargewichte fand in der Protean II Multicell Elektrophoresekammer von Bio-Rad Laboratories (Richmond, USA) statt. Die Stromversorgung lieferte ein Power PAC 350 System, ebenfalls von Bio-Rad. Die Kühlung besorgte ein colora FK350 Flüssigkeitsumwälzer.

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3.2. Methodik

3.2.1. Zweidimensionale Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten

3.2.1.1. Aufarbeitung der Zellen

Pro Gefäß werden 3 ml eines Lösungspuffers bestehend aus 9 M Harnstoff, 4% CHAPS, 20 mM Spermine, 40 mM DTT und 0,4% Pharmalyte (40%) auf den Zellrasen pipettiert. Nach 45 Minuten beständiger Aequilibrierung des Ansatzes wurde dieser abpipettiert und je Zellinie in einem Zentrifugenröhrchen gepoolt und 15 Minuten im Coulter Mixer geschüttelt. Die Lösung wird zu je 1 ml Aliquots auf Eppendorfhütchen verteilt und eine Stunde lang bei 4°C mit 14000 U/min zentrifugiert.

Es folgt eine photometrische TCA-Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem Dynatech MR5000. Nicht zum sofortigen Gebrauch benötigte Lösungen werden zu diesem Zeitpunkt bei -80° C eingefroren.

3.2.1.2. Erstellen der Gele für die erste Dimension mittels eines rechnergestützten Programms zur Generierung des pH-Gradienten

Die Polyacryamid-Gele für die erste Dimension werden als 180 160 1 mm große Platten auf einem Träger-Gel-Bond PAG erstellt. Das Gießen erfolgte mit Hilfe dreier rechnergesteuerter Büretten, von denen die erste die saure und die zweite die basische Lösung enthielt. Die dritte Bürette enthielt 2,5 % Amoniumpersulfat zur Polymerisation.

Die Gele werden bei 50° C eine Stunde lang auspolymerisiert und zur Beseitigung von Immobilinresten in 2 % Glycerin für jeweils 20 Minuten gewaschen, anschließend getrocknet, in 160 5 mm messende Streifen geschnitten und bei -20° C eingefroren.

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Tabelle 3.2
Arbeitsprotokoll zur Erstellung einer Charge Gele für die erste Dimension. Bürette 1 enthielt die Lösung für den sauren, Bürette 2 die für den basischen pH-Bereich. Bürette 3 enthielt das zur Polymerisation notwendige Amoniumpersulfat.

	Bürette 1 pH = 4,0	Bürette 2 pH = 8,0	Bürette 3
Immobiline pK 3,6	4515 µl	0 µl
Immobiline pK 4,6	1945 µl	3690 µl
Immobiline pK 6,2	1805 µl	2395 µl
Immobiline pK 7,0	900 µl	945 µl
Immobiline pK 8,5	1300 µl	2230 µl
Immobiline pK 9,3	0 µl	1920 µl
T30C2.7	13,4 ml	13,4 ml
KBr (30%)	30,66 ml	8,34 ml
1 M Tris-Mops	14,4 ml	12,5 ml
Temed	172 µl	150 µl
Amoniumpersulfat			1 g
Volumen	115 ml	100 ml	50 ml

3.2.1.3. Vorbereitung für die Elektrophorese der ersten Dimension

Die Gelstreifen wurden in einer 5% Glycerin-Lösung erneut gewaschen und anschließend für 12 Stunden im Kaltluftstrom getrocknet.

Nach Einlegen der Gelstreifen in die Quellkammer nach Rabilloud wurden von den zuvor erstellten Zellinienlösungen Aliquots gebildet, die jeweils 1,5 mg Protein enthielten und mit 9 M Harnstoff, 4% Chaps, 20 mM Spermine, 40 mM DTT auf 1050 µl aufgefüllt wurden. Zu diesem Ansatz kamen je 10 µl 0,4 % Pharmalyte pH 3-10, Ampholine pH 3,5-10, 0,2% NP-40(20%), 0,1% Na-taurodesoxycholat (10%)und 0,01% Orange G (10mg/ml) dazu. Die Rehydrierung der Gelstreifen erfolgte über einen Zeitraum von 12 Stunden (Gelfi 1984).

Für die präparativen Läufe wurden pro Gel 5 mg Protein aufgetragen.

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3.2.1.4. Starten der ersten Dimension

Die Gele wurden aus der Quellkammer genommenen und die überschüssige Proteinlösung abgetupft. Nach Einlegen in die Elektrophoresekammer (Multiphor II 2117 Electrophoresis Unit), stellte angefeuchtetes Filterpapier auf den Gelenden den elektrischen Kontakt her und gegen das Austrocknen der Gele schützte eine ausreichend dicke Schicht Paraffin.

Das Elektophoreseprogramm (Electrophoris Power Supply EPS 3500 XL) wurde gestartet:

Tabelle 3.3
Elektrophoreseprogramm für die erste Dimension. Die Spannung wird langsam erhöht, um unerwünschte stärkere Ionenbewegungen im Gel zu vermeiden. Anschließend werden die Proteine für 9 Stunden bis zum Erreichen der 60 kVh fokussiert.

Spannung in V	Zeit in Minuten	I = const. 5 mA
150	30
300	150
700	30
1500	30
2000	30
3000	540

3.2.1.5. Erstellen der Gele für die Elektrophorese der zweiten Dimension

Zur Herstellung der linearen 12% Polyacrylamidgele der zweiten Dimension kam eine Protean^TM II Multi-Gel Gießkammer für 10 Gele zu 2mm Stärke, zur Anwendung.

Tabelle 3.4
Arbeitsprotokoll zum Gießen von zehn Gelen für die zweite Dimension

Acrylamid	84g
Bis	2,24g
1,002M Tris Puffer	117ml
0,6M HCl	117ml

Der Ansatz wird mit aqua. dest. auf 700 ml aufgefüllt und eine halbe Stunde lang mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe entgast.

Kurz vor dem Gießvorgang werden zugesetzt

TEMED	350µl
SDS(4%)	17,5ml
APS(40%)	350µl

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3.2.1.6. Starten der Elektrophorese der zweiten Dimension

Die Gelstreifen der ersten Dimension wurden in 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 0,15 M Bis/Tris-Buffer, 0,1 M HCl, 2,5% SDS und 10 mM DTT zweimal für je 10 Minuten äquillibriert und anschließend an die freie Kante der Gele der zweiten Dimension angelegt.

Für die nahtlose Verbindung der Gele sorgte eine erhitzte Versiegelungslösung, bestehend aus 1% Agarose, 0,2% SDS, 0,15 M Bis/Tris-Puffer und 0,1 M HCl. Zur Kenntlichmachung der Proteinlauffront in der Elektrophorese wurde der Versiegelungslösung als Marker etwas Bromphenolblau zugesetzt. Nach dem Erkalten der Lösung konnten die Gele in den Dalt Tank eingesetzt werden. Für die Anode kam ein auf 4°C gekühlter Standard Laemmli Puffer für SDS-PAGE zur Anwendung; der Kathoden-Puffer enthielt 0,1 M Tris, 0,1 M Taurine und 0,1% SDS. Der Ansatz für einen zehnfach konzentrierten Anodenpuffer bestand aus 0,1% SDS, 14,4% Glycin und 3% Tris. Die Elektrophorese wurde bei 4° C über eine Stunde mit konstant 25 V und dann bis zum erreichen des Gelendes mit 40mA/Gel durchgeführt.

Hatte die Bromphenolblaufront das Gelende erreicht, konnten die Gele in 50% Ethanol und 2% Phosphorsäure für 12 Stunden fixiert werden.

3.2.1.7. Färben der Gele

Nach gründlichem Waschen in destillierten Wasser, sind die Gele nach Neuhoff in 17% Ammoniumsulfat, 3% Phosphorsäure, 34% Methanol für eine Stunde inkubiert und anschließen dazu 1g Coomassie Blue, das zuvor in 250 ml Neuhoff-Lösung solubilisiert und abfiltriert wurde, gegeben worden (Neuhoff 1988). Nach drei Tagen im Färbebad konnte überschüssiges Coomassie Blau mit destilliertem Wasser ausgewaschen werden.

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Abbildung 3.1
Schematische Darstellung der Arbeitsschritte 3.2.1.2 bis 3.2.1.6 im Text.

3.2.2. Auswertung der Gele mit PDQUEST^TM

Nach dreitägigem Färbebad und einem weiteren Tag in Aqua destillata zur Ausdiffussion von überschüssigem Coomassie Blue, konnten die Gele der zweiten Dimension der rechnergestüzten Auswertung zugeführt werden. Zur Anwendung kam das PDQUEST^TM-System von pdi, welches weltweit auch in zahlreichen anderen Arbeitsgruppen größere Verbreitung gefunden hat (Garrels 1989; Blose 1985)

Als Arbeitsplattform diente eine Sun SPARC Workstation und in der Peripherie ein DeskTop^TM Scanner. Unter Solaris 2.1 mit OpenWindows^TM als graphische Benutzeroberfläche, wurden mit PDQUEST^TM alle weiteren Operationen vorgenommen.

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3.2.2.1. Einscannen der Gele

Für die Grauwertkalibration des Scanners diente ein Kodak Step Tablet No. 312ST114 im roten Wellenlängenbereich.

Der eigentlichen Scanvorgang wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

1.) Es wurde der für die Coomassie Blue vorgesehene Wellenlängenbereich des Rotlichtes gewählt.

2.) Die optische Dichte als der dekadische Logarithmus des Quotienten von abgegebener zur aufgenommenen Lichtintensität wurde auf Werte von 0.0 bis 2.0 eingestellt.

3.) Die Pixelgröße betrug 127 127 µm.

3.2.2.2. Proteinspot Erkennung

PDQUEST^TM bietet ein Verfahren zur automatischen Erkennung der angefärbten Proteinspots an, das sich zum Teil benutzerdefiniert einrichten läßt. Für die Gele der zweiten Dimension wurden folgende Optionen genutzt:

1.) Arbeitsschritt: Averaging Smooth

Eine Prozedur in der Störungen des Hintergrundes und nicht fokusiertes Protein entfernt werden.

2.) Arbeitsschritt: Remove Background

Ein von pdi entwickeltes Verfahren, um den schwach gefärbten Hintergrund von den eigentlichen Spots abzuziehen. Dabei wird das Gel in vertikalen Säulen durch eine rotierende Scheibe abgetastet. Es ergibt sich eine Dichtemessung mit Maximal- und Minimalwerten. Verbindet man die Basis aller Maximalwerte zu einem Graphen, werden alle Werte unterhalb des Graphen als Hintergrund definiert und rechnerisch subtrahiert (Abb. 3.2.1). Der Radius der Meßscheibe läßt sich den individuellen Verhältnissen der Gele anpassen. Ein sehr klein gewählter Radius entfernt den Hintergrund sehr zuverlässig, allerdings mit der Gefahr sehr schwach gefärbte Spots ebenfalls zu eliminieren. Ein großer Radius bereitet bei der späteren Auswertung Probleme, da der Hintergrund nur ungenügend entfernt wird (Abb. 3.2.2).

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Abbildung 3.2.1
Die Meßscheibe verbindet die Basen der Dichtespur zu einer Hintergrundspur unter der alle optischen Dichten subtrahiert werden (Mod. n. PdQuest^TM Users´s Guide).

Abbildung 3.2.2
Je nach Größe des abtastenden Radius der Meßscheibe erhält man ein unterschiedliches Gelimage. Die Optimierung des Radius ist für die optimale Auswertung der Gele von entscheidender Bedeutung (Mod. n. PdQuest^TM Users´s Guide).

3.) Arbeitsschritt: Processing the Gel Image

Im nächsten Arbeitsschritt wird ein Abbild des überarbeiteten Scans erstellt. In diesem sogenannten Gel Image werden ab jetzt alle weiteren Operationen durchgeführt.

4.) Arbeitsschritt: Detect Spots

Für jede Quantität oberhalb des rechnerisch subtrahierten Hintergrundes wird ein Mittelpunkt bestimmt und dieser dann als Spot definiert.

5.) Arbeitsschritt: Fit all Spots

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Der oben beschriebene Vorgang vermag einen großen Anteil Proteinspots automatisch zu erkennen. Trotzdem muß in jedem Fall manuell nachgearbeitet werden. Artefakte auf dem Gel, nicht vollständig entfernte horizontale und vertikale Streifen, sehr dicht beieinander liegende oder sehr große Spots werden häufig nicht richtig eingeordnet bzw. nicht erkannt. Von der Gesamtzahl erkannter Spots müssen noch ca. 15 bis 20 % als falsch bzw. doppelt gesetzte abgezogen werden. Ca. 3-5% werden nicht als Spot erkannt und müssen manuell gesetzt und eingepaßt werden, bzw. bei etwa 2% mußte nur die Einpassung nach Gauß -bei falsch eingesetzter Spotmitte- wiederholt werden.

3.2.2.3. Erstellen eines Matchsets

Anschließend wird aus den drei Läufen der zweiten Dimension ein virtuelles Standardgel erstellt, daß die Informationen aller drei Gele enthält. Dies wird für alle Zellinien der Ausgangs- und der resistenten Reihe gleichermaßen durchgeführt. Nur auf der Ebene der jeweiligen Standard-Gele lassen sich mit PDQUEST^TM die Auswertungsfunktion nutzen.

Die Vorgehensweise ist wie folgt:

Von einem der drei Gel Images wird eine Kopie erstellt, die die Information des ursprünglichen Gel Images und das der beiden anderen in sich vereint. Das Standard Gel Image dient dazu, Änderungen für alle Gele vorzunehmen und vergleichende Informationen abzurufen. Die Zusammenfassung der drei Gele in den Standard ist der Versuch, alle drei Läufe zur Deckung zu bringen. Zunächst wählt man einige charakteristische Spots aus, die man gleichsam auf dem Standard wie auf den Gel Images markiert. PDQUEST nutzt diese sog. Landmarks als Fixpunkte und mit der Aufforderung ”Match all Gels to Standard“ können weiter unmarkierte Spots zur Deckung gebracht werden. Der Vorgang aus Landmark setzten und matchen wird solange wiederholt, bis alle matchfähigen Spots ihre Entsprechung im Standard finden. Den erkannten Spots werden automatisch übereinstimmende Nummern zugewiesen.

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Für die Kontrolle der Qualität von 2-D-Elektrophorese und dem Match-Vorgang stehen mehrere Hilfsmittel zu Verfügung:

1.) Nach Normalisierung und Matchen, bietet PDQUEST^TM die Möglichkeit, die Quantitäten eines Gels (Abszisse) gegen die eines anderen Gels (Ordinate) aufzutragen und den Korrelationskoeffizienten zu berechnen (vgl. Abb. 5.1.1).

2.) Es existieren weiterhin mehrere Menüs, die es ermöglichen, nicht markierte oder nur teilweise in das Matchset aufgenommene Spots herauszufiltern, um gezielt etwaige Fehlzuordnungen zu erkennen und zu beheben.

3.) PDQUEST^TM bietet die Möglichkeit, sich die Abweichungsvektoren aller Spotpositionen in einem Matchset im einzelnen Gel sichtbar zu machen. 2-D-Gele sind nie völlig deckungsgleich. Abweichungen ergeben sich aus Inhomogenitäten während des Gießvorganges in der zweiten Dimension, minimale Laufzeitänderungen oder Störungen in der Elektrophorese und schließlich durch divergierender Wahl des Ausschnitts beim Scannvorgang. Die Richtung und die Größe der Abweichung läßt sich im Verhältnis zum Standardgel, dessen Spots als relativer Fixpunkt dienen, graphisch darstellen. Die Aussagekraft der Offsets besteht darin, die während des Matchvorgangs falsch zugeordneten Spots sichtbar zu machen. Die Abweichungsvektoren sind regional immer gleich ausgerichtet, überkreuzen sie sich aber, so deutet dies auf einen Fehler in der Spotzuordung hin (vgl. Abb. 3.2.3).

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Abbildung 3.2.3
In einem Gel des Matchsets ist die Spotzuordnung zum Standard falsch erfolgt. Um in einer unübersichtlichen Menge an Spots dieses zu erkennen, lassen sich die Abweichungsvektoren relativ zu den Spots des Standards als Offsets darstellen. Eine Überkreuzung der Abweichungsvektoren deutet auf eine Fehlzuordnung hin (Mod. n. PdQuest^TM Users´s Guide).

Sind die Matchsets der einzelnen Zellinien erstellt, bietet PDQUEST^TM mehrere Verfahren zur Datenanalyse, die je nach Fragestellung zur Anwendung kommen.

1.) Auswertungsmenü: Qualitative User Analysis Set

Hier können ON/OFF-Phänomene selektiv dargestellt werden. Anders als bei der Darstellung nicht gematchter Spots, werden hier korrespondierend Spotpaare verglichen. Der Faktor, um welchen sich die Quantitäten unterscheiden sollen, ist frei wählbar.

2.) Auswertungsmenü: Quantitative User Analysis Set

Es werden entweder zwei unterschiedliche Gele oder definierbare Gelgruppen nach quantitativen Gesichtspunkten untersucht. Der Multiplikator ist von 0.01 bis 10.00 frei wählbar.

3.) Auswertungsmenü: Boolean User Analysis Set

Zwei unter 1.) und 2.) erstellte Sets können mit diesem Menü verknüpft werden. Zur Darstellung können dann die Spots kommen, die in beiden insgesamt, in beiden gemeinsam oder nicht in beiden gemeinsam vorhanden sind.

4.) Auswertungsmenü: Statistic User Analysis Set

Die Analyseverfahren unter 1.) bis 3.) betrachten immer das Einzelgel im Vergleich zu einem anderen, auch wenn man mehrere Gele zu einer Gruppe zusammengefaßt hat. Um der Relevanz einer Quantititätsänderung in einer Gruppe von Gelen beurteilen zu können, steht Student´s T-Test bzw.- ein Man-Whitney-Test zur Verfügung. Das Konfidenzintervall läßt

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Abbildung 3.2.4
Übersicht der Arbeitschritte im PDQUEST-System. Ausgehend von einer Charge von drei Gelen der zweiten Dimension für die parentale und die ein oder zwei Chargen der resistenten Zellinien, stehen am Ende die Ergebnisse zu den Fragen der ON/OFF Phänomene bzw. der Hoch-/Herabregulation einzelner Proteine.

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3.2.3. Sequenzierung der in der zweidimensionalen Elektrophorese ermittelten Proteine

Die Proteinspots in den präparativen Läufen der zweidimensionalen Elektrophorese wurden direkt aus dem Gel ausgeschnitten. Die anschließende Auslösung aus dem Gel, enzymatische Hydrolyse, Massenspektrophotographie und nachfolgende Sequenzierung mit Micropore-HPLC wurden von der WITA GmbH (Deutschland) durchgeführt (Übersicht in Jungblut 1996)

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