Hütter, Gero : Chemoresistenzassoziierte Veränderungen der Proteinexpression bei Kolon-, Mamma-, Magen-, Pankreaskarzinom und Fibrosarkom mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1. Magenkarzinom

Das Standardmatchset der parentalen Magenkarzinomzelline EPG85-257P enthielt 393 Proteinpunkte (Abb. 4.1.1), die resistenten Zellinien EPG85-257RNOV 221 (Abb. 4.1.2) und EPG85-257RDB 281 Spots (Abb. 4.1.3). Von diesen konnten bei der mit Mitoxantron selektionierten 189 (85%) und bei der mit Daunorubicin selektionierten Zellinie 231 (82%) dem parentalen Standard zugeordnet werden. Neu in EPG85-257RNOV aufgetreten waren acht Proteinspots und in EPG85-257RDB drei Proteinspots, wobei der Spot 4302 sowohl in EPG85-257RDB, als auch in EPG85-257RNOV zu finden war.

Abbildung 4.1.1
Standardimage der parentalen Magenkarzinomzellinie EPG85-257P.


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Abbildung 4.1.2
Standardimage der mit Daunorubicin selektionierten Magenkarzinomzellinie EPG85-257RDB.

Abbildung 4.1.3
Standardimage der mit Mitoxantron selektionierten Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV.


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Abbildung 4.1.4
Detailansicht mit den nichtmatchbaren Spots 1003, 2001 und 3003 in EPG85-257RNOV. Spot 1003 stellt sich in der Sequenzierung als Thioredoxin dar. Für Spot 3003 konnten zwei Sequenzen ermittelt werden, die aber keinem bekannten Protein zuordnenbar sind. Spot 2001 konnte nicht sequenziert werden.

Für das Protein 1003 (Abb. 4.1.4) konnte die Sequenz Thr-Ala-Phe-Gln-Glu-Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Gly-Asp-Lys ermitteltund damit eindeutig als Thioredoxin (TRX) identifiziert werden.

Dagegen konnten bei Spot 3003 (Abb. 6) zwei Sequenzen ermittelt werden; allerdings blieb eine Datenbankrecherche nach einer bekannten korrespondierenden Sequenz erfolglos. Das beste Match fand sich mit 69,8% Aminosäurenübereinstimmung für ADP-Ribosylationsfaktor-1, einem Protein aus der Familie der GTP-bindenden Proteine, die am intrazellulären Proteintransport im Zusammenhang mit dem Golgi Apparat beteiligt sind.

Bei der nur geringen Übereinstimmung von knapp 70% zu ADP-Ribosylationsfaktor 1 ist es sehr wahrscheinlich, daß es sich bei Protein 3003 um ein bislang unbekanntes Protein handelt.


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Abbildung 4.1.5
Detailansicht von Spot 4302, der sich sowohl in der gegen Mitoxantron als auch Daunorubicin resistenten Zellinie nachweisen ließ. Die Sequenzierung ergab, daß es sich hierbei um Annexin-1 handelt.

Für Proteinspot 4302 (Abb. 4.1.5) konnte die Sequenz Asp-Leu-Glu-Leu-Lys ermittelt werden; mit den Daten aus der Massenspektrographie ergab sich ein eindeutiges Match mit Annexin-1 (A1).

A1 hemmt durch Inhibition der Autophosphorylation die Insulinrezeptor Protein-Tyrosin-Kinase (Melki 1994).

Abbildung 4.1.6
Detailansicht der Spots 4104 und 4105, die sich nur in der mit Daunorubicin selektionierten Magenkarzinomzellinie fanden.

Die Spots 4104 und 4105 (Abb. 4.1.6) wurden auf Grund von Überlagerungen benachbarter Proteinpunkte in der präparativen zweidimensionalen Elektrophorese verdeckt und konnten damit einer Sequenzierung nicht zugeführt werden.


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Abbildung 4.1.7
Detailansicht des Proteinspots 3502 in der mit Daunorubicin selektionierten Magenkarzinomzellinie.

Auch Spot 3502 (Abb. 4.1.7) war in der präparativen zweidimensionalen Elektrophorese nicht mehr zu reidentifizieren.

Abbildung 4.1.8
Detailansicht der Spots 8201 und 9202, die sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten Magenkarzinomzellinie fanden.

Für die Spots 8201 und 9202 (Abb. 4.1.8) wurden nach Spaltung mit LysC und Trennung der Peptide per Mikro-HPLC Sequenzierungsversuche unternommen, die aber ohne Erfolg blieben.

Abbildung 4.1.9
Detailansicht von Spot 1205, der sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten Magenkarzinomzellinie fand.


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Auf Grund von Mengenproblemen konnte für den Spot 1205 (Abb. 4.1.9) nach Spaltung mit LysC keine Peptidsequenz erstellt werden.

Abbildung 4.1.10
Proteinspot 6002, der sich sowohl in der mit Mitoxantron als auch mit Daunorubicin selektionierten Magenkarzinomzellinie fand, zeigt in der parentalen eine deutlich höhere Expression als in den resistenten Zellinien.


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4.2. Kolonkarzinom

Nach der zweidimensionalen Elektrophorese mit den Zellinien HT29P, HT29RNOV und HT29RDB konnten für jede Zellinie Standard Images erstellt werden, von denen das der parentalen Kolonkarzinomlinie 393 Proteinspots (Abb. 4.2.1), das der mit Mitoxantron selektionierten 221 (Abb. 4.2.2) und das der Daunorubicin selektionierten 281 enthält (Abb. 4.2.3). Nach Erstellung des Matchsets konnten der parentalen Linie 231 (82%) von HT29RDB und 189 (85%) Spots von HT29RNOV zugeordnet werden. Die Spots 3201 und 405 fanden sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten, wogegen die Spots 105, 9802, 8204, 8101 und 8204 sich nur in der mit Daunorubicin selektionierten Zellinie nachweisen ließen. Es fanden sich fernerhin zahlreiche Proteinspots in beiden resistenten Zellinien, die eine vermehrte bzw. verminderte optische Dichte zeigten, ohne jedoch eine deutliche Signifikanz zu zeigen.

Abbildung 4.2.1
Standard Image der parentalen Kolonkarzinom Zellinie HT29P.


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Abbildung 4.2.2
Standard Image der mit Mitoxantron selektionierten Kolonkarzinom Zellinie HT29RNOV.

Abbildung 4.2.3
Standard Image der mit Daunorubicin selektionierten Kolonkarzinom Zellinie HT29RDB.


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Abbildung 4.2.4
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 3201 (Adenin-Phosphoribosyltransferase).

Nach interner Spaltung mit Trypsin konnten in der HPLC für den Spot 3201 (Abb. 4.2.4) fünf Massen im Reflectron nachgewiesen werden. Die Sequenz ergab Ala-Ala-Ile-Gly-Leu-Leu Ala-Arg; die Interpretation war eindeutig: Es handelt sich um Adenin-Phosphoribosyltransferase.

Abbildung 4.2.5
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 405. Ein Sequenzierungsversuch wurde nicht unternommen.

Abbildung 4.2.6
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spots 9802/9702.


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Abbildung 4.2.7
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 105 für den in der Sequenzierung eine enge Homologie zu BCSG-1 nachgewiesen werden konnte.

Für den Spot 105 (Abb. 4.2.7) fanden sich nach interner Spaltung mit Trypsin in der HPLC 3 bis 5 Massen im Refectormode. Die Zuordnung war nicht eindeutig möglich. Es konnten zwei Sequenzen ermittelt werden:

1.) Glu-Gly-Val-Val-Gly-Ala-Val-Glu-Lys mit acht Aminosäuren Homologie zu humanen BCSG-1.

2.) Gly-Phe-Ser-Ile-Ala-Lys mit sechs Aminosäuren Homologie zu humanen BCSG-1.

Da es zu BCSG-1 kein 100% Match gab, liegt die Vermutung nahe, daß es sich um ein eng verwandtes, noch nicht vorbeschriebenes und daher unbekanntes Protein handelt.

In der präparativen zweidimensionalen Elektrophorese konnte nur der Spot 9802 (Abb. 4.2.6) zur Sequenzierung dargestellt werden. Für diesen fanden sich nach interner Spaltung mit LysC keine Spitzen im Massenfingerabdruck: Eine Identifizierung von Spot 9802 war damit nicht möglich.


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Abbildung 4.2.8
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spots 8101/8204.

Die beiden Spots 8101/8204 (Abb. 4.2.8) konnten im präparativen Lauf auf Grund von Überlagerungen benachbarter Proteine nicht mehr reidentifiziert werden. Ein Sequenzierungsversuch wurde nicht unternommen.


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4.3. Pankreaskarzinom

Der Standard der Ausgangszellinie vom Pankreaskarzinom enthielt 499 Proteinspots (Abb. 4.3.1), der Zellinie EPP85-181RNOV 316 (Abb. 4.3.2) bzw. 164 für EPP85-181RDB.

198 (63%) Proteinspots der mit Mitoxantron selektionierten Zellinie ließen sich dem Standard zuordnen, dagegen nur 117 (71%) für EPP85-181RDB. Auf Grund des schlechten Matchergebnisses ist es auch zu erklären, daß für diese Zellinie kein eindeutiger Hinweis auf eine klare Hochregulation eines Proteines zu finden war.

Abbildung 4.3.1
Standardimage der parentalen Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181P.


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Abbildung 4.3.2
Standardimage der mitoxantronselektionierten Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RNOV.

Für die EPP85-181RNOV Zellinie konnten 19 Hinweise für eine Hochregulation um mehr als das zweifache gefunden werden, von denen aber nur bei zweien eine Signifikanz bestand (Spots 205 und 6000). Proteinspot 6000 zeigte allerdings auch in der daunorubicinresistenten Zellinie einen vermehrtes Vorkommen. Klar und gut abgrenzbar war der Spot 6002 in EPP85-181RNOV. Für die Sequenzierung konnten alle drei vorgenannten Spots im präparativen Lauf erkannt und isoliert werden.


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Abbildung 4.3.3
Detailansicht vom Proteinspot 6002 der sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten Pankreaskarzinomzellinie fand.

Die Sequenzierung von 6002 (Abb. 4.3.3) ergab die Aminosäurenabfolge Glu-Leu-Gly-Val-Gly-Ile-Ala-Leu-Arg und konnte damit als fettsäurebindendes Protein (FABP) identifiziert werden.

Abbildung 4.3.4
Proteinspot 205 fand sich in der mit Mitoxantron selektionierten Pankreaskarzinomzellinie signifikant vermehrt im Gegensatz zur parentalen Zellinie. Die Sequenzierung zeigte, daß es sich um Stratifin handelt.

Für Spot 205 (vgl. Abb. 4.3.1 u. 4.3.2) fand sich in der mitoxantronresistenten Zellinie eine Erhöhung der optischen Dichte um mehr als das doppelte (Abb. 4.3.4). Die Sequenz für Spot 205 war klar detektierbar und bestand aus Gly-Asp-Tyr-Tyr-Arg-Tyr-Leu-Ala-Glu-Val-Ala-Thr. Sie ergibt ein 100% Match zu Stratifin.


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Abbildung 4.3.5
Proteinspot 6000 fand sich sowohl in der mit Mitoxantron als auch Daunorubicin selektionierten Pankreaskarzinomzellinie signifikant vermehrt im Gegensatz zur parentalen Zellinie. Die Sequenzierung zeigte, daß es sich um Cofilin handelt.

Proteinspot 6000 (vgl. Abb. 4.3.1 u. 4.3.1) zeigte sowohl in der mit Mitoxantron als auch in der mit Daunorubicin selektionierten Pankreaskarzinomzellinie einen Anstieg der optischen Dichte um mehr als das Doppelte (Abb. 4.3.5).

Für den Proteinspot 6000 ergab sich die Sequenz Tyr-Ala-Leu-Tyr-Asp-Ala-Thr-Tyr-Glu-Ser-Lys und konnte damit eindeutig als Cofilin identifiziert werden.


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4.4. Fibrosarkom

Das Standard Image der parentalen Fibrosarkomlinie enthält 391 Proteinspots (Abb. 4.4.1), das der mit Mitoxantron selektionierten 463 (Abb. 4.4.2). Nach Erstellung des Matchsets ließen sich 347 (75%) Spots davon beiden zuorden.

Für vier Proteinspots der resistenten Zellinie zeigte sich kein Äquivalent in der parentalen Linie. Eine signifikante Änderung der optischen Dichte konnte bei zwei Spots im Sinne einer vermehrten

Abbildung 4.4.1
Standard Image der parentalen Fibrosarkomlinie EPF86-079P.


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Abbildung 4.4.2
Standard Image der Mitoxantron selektionierten Fibrosarkomlinie EPF86-079RNOV.

Expression und in einem Fall als verminderte Expression in der Zellinie EPF86-079RNOV nachgewiesen werden.

Für den Proteinspot 1202 (Abb. 4.4.3) konnten nach interner Spaltung mit Trypsin in der HPLC vier schwache Massenfingerabdrücke im Reflectormode detektiert werden. Es fanden sich zwei Sequenzen: 1.) Tyr-Val-Glu-His-Thr-Tyr-Arg mit einer 100% Homolo-


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gie von sieben Aminosäuren und 2.) X-Leu-Leu-Gly-Asp-Val-Pro-Val-Val-Ala-Asp-Pro mit neun Aminosäuren Homologie zu RHO-GDP-Dissoziations Inhibitor-beta. Es handelt sich bei Spot 1202 zweifelsfrei um RHO-GDP-Dissoziations Inhibitor-beta.

Abbildung 4.4.3
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 1202.

Abbildung 4.4.4
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 7301.

Nach interner Spaltung mit LysC zeigten sich sechs Massen im Reflectron, die Messung konnte allerdings nicht wiederholt werden. Es konnte ein Polypeptid von 12 Aminosäuren Länge identifiziert werden, dessen Sequenz aber nicht durchgängig lesbar war (X-Ser-Ala-X-Glu-Glu-Ala-Asn-X-Arg-Pro). Die gefundene Sequenz ist in der Zuordnung eher unsicher, als bestes Match fand sich YER7-Yeast; es handelt sich eventuell um ein unbekanntes Protein.


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Abbildung 4.4.5
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spots 3307/3309.

Die Proteinspots 3307 und 3309 (Abb.4.4.5) konnten in der präparativen zweidimensionalen Elektrophorese nicht mehr reidentifiziert werden; es bestanden ausgedehnte Überlagerungen mit benachbarten angefärbten Proteinen, so daß ein Sequenzierungsversuch unterblieb.

Abbildung 4.4.6
Veränderung der optischen Dichte bei Proteinspot 3811 (A) und 4201 (B) in der mit Mitoxantron selektionierten Fibrosarkomzellinie. In beiden Fällen fand sich in der resistenten Zellinie eine signifikante Erhöhung der O.D.


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Abbildung 4.4.7
Veränderung der optischen Dichte bei Proteinspot 8304 (A) und 8205 (B) in der mit Mitoxantron selektionierten Fibrosarkomzellinie. In beiden Fällen fand sich in der resistenten Zellinie eine signifikante Verminderung der O.D.

Für die Proteinspots 3811 und 4201 (Abb. 4.4.6) bestand eine signifikant vermehrte optische Dichte bzw. für die Spots 8304 und 8205 (4.4.7) eine verminderte O.D. in der chemoresistenten Zellinie. Ein Sequenzierungsversuch wurde für keinen der Spots unternommen.


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4.5. Mammakarzinom

Das Standardimage der parentalen Mammakarzinomzellinie enthielt 597 Proteinspots (Abb. 4.5.1). Zu diesem ließen sich 178 von 218 (81%) aller Spots der resistenten Linie vergleichen (Abb. 4.5.2). Der Spot 6001 fand sich nur in der resistenten Zellinie MDA-MB-231RNOV. Spot 6201 zeigte eine signifikante Hochregulation bzw. Spot 5601 eine Herabregulation in der Mit mitoxantron selektionieten Mammakarzinomzellinie in Hinblick auf die verglichenen optischen Dichten.

Abbildung 4.5.1
Standardimage der parentalen Mammakarzinomzellinie MDA-MB-231P.

Abbildung 4.5.2
Standardimage der mit Mitoxantron selektionierten Mammakarzinomzellinie MDA-MB-231RNOV.


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Abbildung 4.5.3
Detailansicht von Proteinspot 6001, der sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten Mammakarzinomzellinie fand.

Abbildung 4.5.4
A: Proteinspot 6201 war in der mit Mitoxantron selektionierten Mammakarzinomzellinie signifikant höher exprimiert als in der parentalen. B: Proteinspot 5601 dagegen fand sich in der parentalen Zellinie höher exprimiert als in der Resistenten.

Auf Grund der geringen Ausbeute an detektierten Proteinen für eine anschließende Sequenzierung, wurde für die Mammakarzinomzellinie kein Versuch unternommen, eine präparative zweidimensionale Elektrophorese durchzuführen.


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