Hütter, Gero : Chemoresistenzassoziierte Veränderungen der Proteinexpression bei Kolon-, Mamma-, Magen-, Pankreaskarzinom und Fibrosarkom mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten

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Kapitel 5. Diskussion

5.1. Zur Wahl des benutzten Elektrophoreseprotokolles

Die isolektrische Fokussierung im immobilisierten pH-Gradienten stellt eine effiziente Methode zur Trennung komplexer Proteingemische dar. Insbesondere bedingt die Verwendung der Immobiline die Reproduzierbarkeit und damit die vergleichende Auswertbarkeit der Ergebnisse. Die konventionelle isoelektrische Fokussierung basiert auf der Verwendung einer Vielzahl von löslichen, amphoteren Puffern, die im elektrischen Feld zu ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt wandern und nach Erreichen desselben den pH-Gradienten konstant aufrecht erhalten (Righetti 1983). Im Gegensatz dazu wird bei der Verwendung immobilisierter pH-Gradienten dieser bereits vor der Elektrophorese generiert. Hierbei sind die Puffer Acrylamidoderivate mit den Eigenschaften einer schwachen Säure bzw. Base, die kovalent an die Polyacrylamidgelmatrix gebunden sind, und damit ein näherungsweise dauerhaft stabiler pH-Gradient geschaffen wird (Bjellqvist 1982).

Die Anwendung des immobilisierten pH-Gradientens ist prinzipiell schon seit 1982 bekannt, jedoch bestanden aufgrund der chemischen Struktur der Acrylamidopuffer über lange Zeit Probleme in der breiteren Nutzung. Zum einen bestand die Möglichkeit der Autopolymerisation der basischen Acrylamidopuffer, zum anderen die der Hydrolyse der Amidbindung; beides mit weitreichenden negativen Folgen für die Durchführung der Gelelektrophorese.

Diese Probleme führten zur Etablierung von Acrylamidopuffern, deren basischer Anteil 0,2 M Propanol und deren saurer Anteil geringe Mengen eines Polymerisationsinhibitors (Hydrochinon) enthielten (Gaveby 1988). Dank dieser neuen Generation von Acrylamidopuffern kann heute die isoelektrische Fokussierung im immobilisierten pH-Gradienten als weitgehend störungsfrei mit bisher nicht erreichten Auflösungsvermögen bezeichnet werden.

Speziell für die Durchführung der 2-D-Elektrophorese für meine Aufgabenstellung ergaben sich folgende Gesichtspunkte:

  1. Das Protokoll zur Durchführung der 2-D-Elektrophorese.
  2. Den zu verwendenden pH-Bereich in der ersten Dimension.
  3. Das adäquate Proteinnachweisverfahren.

Ad 1. Das von mir benutzte Protokoll nach Rabilloud bietet den Vorteil, keine Änderungen, außer der eingesetzten Proteinmenge, bei analytischer und präparativer 2-D-Elektrophorese vor-


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nehmen zu müssen. Damit ergibt sich eine bessere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse für die Analyse der detektierten Änderungen im Proteinmuster.

Ad 2. Mit der Einführung der Immobiline war es möglich Gradienten für eine Bereich von pH 4 bis 8 zu generieren. In diesem Bereich ist die Pufferkapazität des Wassers zu vernachlässigen, welche aber außerhalb des Bereiches exponentiell ansteigt und damit den Aufbau eines Gradienten verhindert (Righetti 1989). Überwunden werden konnte diese Problematik durch die Neusynthese von Acrylamidopuffern die einen pK von 3,1 bzw. 10,3 besitzen (Gelfi 1987; Sinha 1987).

Die Überlegung, nicht den erweiterten Gradientenbereich zu benutzen gründet sich darauf, daß der überwiegende Anteil der Proteinfraktion sich im pH Bereich von 4-8 repräsentiert.

Ad 3. Zur Auswahl standen zwei unspezifische Proteinnachweisverfahren: die Silberfärbung und die Färbung mit Coomassie Blau.

Die Silberfärbung ist eine extrem empfindliche Methode zum Nachweis von Proteinen in Polyacrylamidgelen. Die Nachweisempfindlichkeit beträgt 0,005 µg gegenüber 0,5 µg der entsprechenden Coomassie Färbemethoden und kommt in ihrer Sensitivität an die der Autoradiographie heran.

Die Detektion sehr geringer Proteinmengen mit Coomassie Blau erfordert konzentrierte Proteinlösungen bzw. große Probenvolumina. Die daraus resultierenden Elektrophoresemuster sind manchmal durch Überlagerungen gestört und das Auflösungsvermögen vermindert.

Obwohl die Silberfärbung weitaus empfindlicher ist, hat sie dennoch einige entscheidende Nachteile gegenüber der mit Coomassie Blau: kleine Abweichungen vom Färbeprotokoll können sehr starke Auswirkungen auf Sensitivität und Reproduzierbarkeit und vor allen auf die Hintergrundfärbung haben. Außerdem ist der lineare Bereich bei der densiometrischen Auswertung sehr schmal. Gerade die letzten beiden Punkte erschweren die Auswertung mit dem PDQuest System bzw. machen sie unmöglich. Daher wurde bei allen Gelen die Coomassiefärbung durchgeführt, mit den Vorteilen: bessere Reproduzierbarkeit, fast hintergrundfreie Färbung ohne Entfärbeschritt durch die Verwendung der kolloidalen Färbemethode nach Neuhoff und ein größerer Linearititätsbereich bei der densiometrischen Auswertung.

Die Reproduzierbarkeit von Proteinkarten, die mit Hilfe der 2-D-Elektrophorese erstellt wurden ist abhängig von der Probengewinnung, der Probenapplikation, von der Vergleichbarkeit in der Qualität der Gele der ersten und zweiten Dimension, von der Gelfärbung und schließlich von der Qualität der verwendeten Chemikalien-Charge (Klose 1995).


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Für die Auswertbarkeit der erstellten Proteinkarten ist in erster Linie die Qualität der Gele der ersten und zweiten Dimension entscheidend, in zweiter Linie die Färbung; die übrigen Einflußgrößen spielen eine untergeordnete Rolle (Görg 1988).

Die Basis der Reproduzierbarkeit bildet aber die Elektrophorese der ersten Dimension und damit kommt den Immobilinen eine entscheidende Rolle zu. Allerdings ist es bekannt, daß die frei beweglichen Proteine selbst, auf Grund ihrer eigenen Ladung, ähnliche negative Effekte aufweisen können, wie die Trägerampholyte und damit die Reproduzierbarkeit von Versuch zu Versuch verschlechtern können (Klose 1995).

Dabei ist insbesondere die absolute und relative Position der Proteinpunkte auf dem Gel und deren Intensität zu beachten. Dank der rechnergestüzten Auswertung tritt die Bedeutung der absoluten Positionen im Gel als Kriterium der Auswertbarkeit hinter den relativen Positionen zurück. Durch die Auswertungsoptionen des PDQuest-Systemes lassen sich charakteristische Proteinspots als Fixpunkte definieren; angrenzende Proteinspots lassen sich dann in der Regel einfach manuell oder automatisch richtig zuordnen, auch wenn deren absolute Positionen stärker differieren.

Abbildung 5.1.1
Beispiel für die absoluten Abweichung der Spotquantitäten zweier Pankreaskarzinomzellinien. Aufgetragen ist die Abweichung eines Gels in der optischen Dichte zu einem Vergleichsgels der gleichen Charge. Der Korrelationskoefizient beträgt in diesem Fall 0.82 bei N = 293


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5.2. Pharmakologische Eigenschaften der eingesetzten Chemotherapeutika im Hinblick auf bekannte Ursachen der Resistenzentwicklung

5.2.1. Daunorubicin

Das den Anthrazyclinen zugehörende Daunorubicin wird eine Vielzahl unterschiedlicher biochemischer Effekte zugeschrieben, wobei der exakte Mechanismus der Zytotoxizität nicht völlig aufgeklärt ist (Aubel 1984). Einigkeit besteht in der Erkenntnis, daß die Wirkung auf Tumorzellen mit einer Veränderung der Nukleinsäurensynthese einhergeht. Es gibt Hinweise darauf, daß der Mechanismus der Zytotoxizität in Abhängigkeit zum jeweiligen Gewebetyp steht.

Daunorubicin gelangt schnell in die Zelle, wobei sich die höchste Konzentration im Zellkern findet. Die Anthrazycline binden sich mit hoher Affinität an die DNA. Ihr aglykoner Anteil schaltet sich in die parallelen Anteile der gegenüberliegenden Basenpaaren ein. Die ionisierte Aminogruppe des Zuckeranteils bindet zum Zuckerphosphat-Rückgrat der DNA.

Abbildung 5.2.1
Strukturformel von Daunorubicin: (1S,3S)-3-Acetyl-1-2,3,4,6,11-hexahydro-3,5,12-trihydroxy-10-methoxy-6,11-dioxo-naphtacen-1-yl 3-amino-2,3,6-trideoxy-alpha-L-lyxopyranoside hydrochlorid

Aus der Bindung resultiert eine Inhibition der DNA-Polymerase sowie der RNA-Polymerase. Der Effekt auf die DNA-Synthese ist in erster Linie eine verminderte Rate der Ketten-Elongation mit eher untergeordnetem Effekt auf die Zellreplikation. Die Einschränkung der r-RNA ist demnach der wichtigste Faktor der Zytotoxizität (Ross 1979a).

Das mikrosomale Enzym P450-Reduktase katalysiert die Reduktion von Daunorubicin zu einer Semichinonform, welche dann ein Elektron auf molekularen Sauerstoff übertragen kann, um freie Radikale und Peroxide zu bilden. Andere Flavin abhängige Oxireduktasen sind ebenfalls befähigt, diesen Prozeß zu katalysieren (Ross 1979b).

Es ist gängige Meinung, daß Daunorubicin die DNA Funktion beeinträchtigt, indem es durch die Bildung von freien Radikalen Einzelstrangabbrüche und Fragmentierungen der DNA erzeugt. Bestätigung findet diese These dadurch, daß eine Verminderung der Radikale durch Enzyme wie Manganese Superoxid Dismutase, die als Antioxydanz wirken, die Toxizität vermindert werden kann (Kule 1994).


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Da die Zytotoxizität von Daunorubicin auch schon in niedrigeren Konzentrationen auftritt, als zur Interferenz mit der DNA notwendig wäre, sind einige andere alternative Mechanismen postuliert worden. So z.B. die Hemmung der zellulären Atmung, Veränderungen der Zellmembranfunktion und die Beeinträchtigung der Membranpermabilität für Natrium und Kalzium (Gonsalvez 1974).

Intrazellulär wird Daunorubicin, wie auch andere Anthrazyklinie, durch Karbonylreduktion inaktiviert. Die Steigerung dieses Mechanismus scheint für die Ausbildung einer sekundären Resistenz wichtig zu sein (Soldan 1996). Darüber hinaus und sicherlich für eine Chemoresistenz bedeutender ist die Rolle von PGP in der Elimination von Daunorubicin aus der Zelle.

5.2.2. Mitoxantron

Mitoxantron besitzt strukturelle Ähnlichkeiten zu den Anthracyclinen Doxorubicin und Daunorubicin und ist ein wirksamer Inhibitor der RNA und DNA Synthese.

Es interkaliert mit der DNA und bewirkt Kreuzverbindungen innerhalb und zwischen den DNA-Strängen mit Bevorzugung der G-C Basenpaare (Lown 1985). Mitoxantron ist nicht zellzyklusspezifisch, auch wenn proliferierende Zellen sensibler sind als stationäre. Direkt zytotoxisch auf die Zelle wirkt Mitoxantron im Zusammenspiel mit Cytochrom P-450 Reduktase. Es kommt zur Bildung von Semiquinonradikalen, die wiederum zellschädigende Peroxide bilden (Durr 1983). Fernerhin ist für Mitoxantron bekannt, daß die Interferenz mit Topoisomerase II für die zytotoxische Wirkung bedeutsam ist (Crespi 1985; Smith 1990), wie dies auch bei anderen interkalierenden Chemotherapeutika beschrieben wurde (Tewey 1984). Ein weiterer Aspekt der antiproliferativen Wirkung von Mitoxantron ist seine Inhibition der Proteinkinase C (Takeuchi 1992).

Intrazellulär wird Mitoxantron auf zwei Wegen metabolisiert: zum einen durch eine Konjugation an Glucuronsäure, zum anderen durch die Koppelung an Glutathion was eine vorherigen Umsatz von Mitoxantron durch Cytochrom P-450 voraussetzt (Wolf 1986).

Abbildung 5.2.2
Strukturformel von Mitoxantron: 1,4-Dihydroxy-5,8-bis [2-(2-hydroxyethyl amino)-ethylamino]-9,10-anthracenedion hydrochlorid


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Über die Mechanismen der Resistenzentwicklung gegenüber Mitoxantron ist nur wenig bekannt. Zurückliegende Studien deuten darauf hin, daß eine Überexpression von PGP nicht an der Ausbildung des MDR Phänotypes beteiligt ist (Harker 1989). Auch die vermehrte Bildung des MRP scheint nicht die entscheidende Rolle in der Resistenzentwicklung zu spielen, wie das an mehreren Zellinien gezeigt werden konnte (Futscher 1994).

Vielmehr hat sich die Interaktion mit Topoisomerase II als ein wichtiger Faktor für die reduzierte Ansprechbarkeit gegenüber Zytostatika herausgestellt. Untersuchungen an HL-60 Leukämie Zellen zeigten eindeutig eine geringere katalytische Aktivität der Topo II und eine verminderte Expression der Topoisomerase IIbeta Isoform (Harker 1991). In Hinblick auf den Abbauweg von Mitoxantron ist es denkbar und am Beispiel eines Kolonkarzinomes auch darstellbar, daß eine vermehrte Inaktivierung durch Glutathion-S-Transferase an der Ausprägung der Resistenz beteiligt ist (Peters 1992).

Schließlich ist über die von mir benutzten Magenkarzinomzellinie bekannt, daß eine Sequestrierung von Mitoxantron zu einer verminderten intrazelluären Wirkkonzentration und damit zur Ausbildung einer Resistenz beitragen kann (Dietel 1990).

5.3. Ergebnisse

5.3.1. Magenkarzinom

5.3.1.1. Annexin-1

Sowohl in der gegen Mitoxantron resistenten Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV als auch in der gegen Daunorubicin resistenten Zellinie EPG85-257RDB konnte ein Proteinspot (Nr. 4302) nachgewiesen werden, der sich nicht in der parentalen Zellinie wiederfand (vgl. Abb. 4.1.5). Die Sequenzierung des Spots ergab, daß es sich dabei um Annexin-1 (Syn.: Lipocortin-1) handelt.

Annexin-1 ist ein 37 kDa großes Protein der Annexin Familie, das ursprünglich das Interesse als Second Messenger der antiinflammatorischen Wirkungen von Glukokortikoiden geweckt hat. In diesem Hinblick gemachte Untersuchungen zeigten weitere Funktionen dieses Proteins auf: so im Wachstums- und Differenzierungsystem der Zelle, der Migration neutrophiler Granulozyten,


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der ZNS-Antwort auf Zytokine, der neuroendokrinen Regulation und der neuronalen Degeneration.

Annexin-1 ist Mitglied der Familie von Ca2+/phospholipidbindender Proteine und ist das Hauptsubstrat für die Rezeptorkinase des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), die in die Membranprozesse der Endozytose involviert ist.

Annexin-1 ist an zahlreichen zellulären Prozessen beteligt, einschließlich Membrandiffusion und Regulation der Aktivität des Kalzium-Kanales. Insbesondere scheint Annexin-1 in der Granularzellschicht der Epidermis mit der Exozytose assoziiert zu sein (Ma 1996).

Es konnte dargestellt werden, daß A1 unabhängig an Kalzium und cAMP bindet, beides mit funktionellen Konsequenzen. Damit konnte für A1 als erstem Vertreter der Annexin Familie eine Nukleotidbindung nachgewiesen werden (Cohen 1995).

Unter dem Gesichtspunkt der antiinflammatorischen Eigenschaften zeigt sich, daß diese bei lokaler Anwendung von Annexin-1 in erster Linie auf einer Hemmung der Phospholipase-A2 und damit der Prostaglandinbildung beruhen; in vivo allerdings stellte es sich als ein wirksamer Inhibitor der zytokinvermittelten Leukozytenmigration, wie durch Interleukin-1, dar.

Gemeinsam mit Glukokortikoiden ist Annexin-1 fernerhin an der Regulation des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung beteiligt. Die positiven Wirkungen von Glukokortikoiden auf Zellwachstum und -differenzierung lassen sich durch Antikörper gegen Annexin-1 wirkungsvoll aufheben. Annexin-1 transloziert unter dem Einfluß von Glukokortikoiden zur Zelloberfläche, und vermag dort ApoA-1 zu binden. ApoA-1 ist in den HDL vermittelten Cholesterolmetabolismus involviert; ferner vermag es in vitro das Wachstum von T-Lymphozyten zu stimulieren und die Degranulation und Peroxidbildung von Neutrophilen Leukozyten zu inhibieren (Bronawell 1996).

Die Regulation des Zellwachstums durch Steroide ist aus mehreren Gründen ein wichtiger Gesichtspunkt: Jeder Mechanismus, der die Zellproliferation kontrolliert, muß sorgfältig auf seine Verbindungen zu Tumorzellwachstum und Chemotherapie untersucht werden, insbesondere weil Wachstumsprozesse Ausdruck oder Teil einer vermehrten Reparationsaktivität der Zelle darstellen können. In diesem Zusammenhang ist auch die protektive Wirkung von Annexin-1 auf die neuronale Degeneration zu erwähnen (Flower 1994).

Zu der mindestens acht Mitglieder zählenden Annexinfamilie gehört auch das Annexin-2, für das eine Assoziation mit Chemoresistenz beim Lungenkrebs beschrieben wurde. Bemerkenswert ist, daß die verschiedenen Annexine eine enge struckturelle Verwandtschaft aufweisen. Dies läßt die Vermutung zu, daß sie wahrscheinlich überlappende Aktivitätsspektren aufweisen (Cole 1992b). Jedes Mitglied aus dieser Familie besitzt 4 bzw. 8 siebzig Aminosäuren lange Kerndomänen, die


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für die Kalzium- und Phospholipidbindung verantwortlich sind. Über diese Kerndomänen, die ein Substrat für die Proteinkinase C darstellen, wird die Aktivität der Annexine durch Phosphorylation reguliert (vgl. Abb. 5.3.4).

Annexin-1 konnte überwiegend in tumorösen aber auch nichttumorösen Regionen des Leberzellkarzinomes gefunden werden, besonders bei schlecht differenzierten Tumoren. Interessanterweise fand es sich auch in der Nähe von hepatozellulären Karzinomen im nicht tumorösen Gewebe, das sich histologisch vom umgebenen Parenchym abgrenzen ließ. Dies zeigt, daß Annexin-1 sehr wahrscheinlich in den Prozeß der malignen Transformation und Differenzierung involviert ist (Masaki 1996). In diesem Zusammenhang ist es daher auch bemerkenswert, daß -in meinem Untersuchungsmaterial- gerade im Magenkarzinom eine vermehrte Expression von Annexin-1 nachgwiesen werden konnte, obwohl Annexin-1 physiologisch nicht im Magenschleimhautgewebe vorkommt (Dreier 1998).

Die inhibitorischen Eigenschaften gegenüber der Phospholipase-A2 sind offenbar auch der Grund dafür, daß Annexin-1 -am Beispiel von Thymozyten- diese vor der apototischen Wirkung von H2O2 schützt. Monoklonale Antikörper gegen Annexin-1, wie auch andere Inhibitoren der Phospholipase-A2, wie 3,4-Octyadecyl-Benzylacrylsäure oder Melittin bewirken eine H2O2 vermittelte gesteigerte Apoptose (Sakamoto 1996).

5.3.1.2. Thioredoxin

Nur in der gegen Mitoxantron resistenten Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV konnte ein Proteinspot (Nr. 1003) nachgewiesen werden, der sich nicht in der parentalen Ausgangszellinie wiederfand (vgl. Abb. 4.1.4). Die Sequenzierung dieses Spots ergab, daß es sich um Thioredoxin handelt. Thioredoxin (TRX) gehört zu den Redoxproteinen mit niedrigem Molekulargewicht und wird von dem Flavoenzym Thioredoxinreduktase durch NADPH abhängige reversible Reduktion zweier aktiven Stellen reguliert.

Reduzierende/oxydierende (Redox)-Prozesse sind in eine Vielzahl biologischer Systeme integriert, wie Signaltransduktion, Genexpression und Zellproliferation. TRX ist eines der wichtigsten Regulationsmoleküle für Redoxvorgänge, da seine Dithiol/Disulfid Austauschaktivität den oxydativen Status der Proteinthiole bestimmt. In zahlreichen Zellinien konnte TRX als starker


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Stimulus für die Zytokinexpression wie für Tumornekrosefaktor sowie Il-1, Il-2, Il-6 und Il-8 gefunden werden (Schenk 1996).

Die cDNA-Sequenz von Thioredoxin durch PCR-Klonierung aus menschlichem Dickdarmkrebs, Lyphoblasten und Leberzellen zeigt eine 100% Übereinstimmung mit dem autokrinen Wachstumsfaktor ADF für T-Lymphozyten (human adult T-cell leukemia derived factor) (Gasdaska 1994)

Die proliferationsfördernde Wirkung von TRX/ADF ist abhängig von Aktivierung der Proteinkinase C. Viele elementare Funktionen der Zelle, wie etwa die Aktivität des AP-1 Komplexes, NF_B und des Glukokortikoidrezeptors sowie der Schutz vor H2O2 und letztlich die Signaltransduktionen sind vom Redoxpotential abhängig. Und gerade diese Funktion wird durch Thiolderivate wie Glutathion, Metallothionein und eben TRX/ADF reguliert (Meyer 1993).

Thioredoxin ist demnach ein wachstumsstimulierendes Redoxprotein von dem bekannt ist, daß es in zahlreichen menschlichen Tumoren überexpremiert wird. Die Redoxaktivität ist entscheidend für die proliferationssteigernde Wirkung, denn mit TRX transfizierte Zellen zeigen ein vermehrtes Wachstum und eine verminderte Apoptose in vivo und vitro. Zellen die mit einer redoxinaktiven TRX-Mutante transfiziert wurden, haben dagegen eine deutlich verminderte Proliferationsrate (Powis 1998).

Thioredoxin konnte erst kürzlich als das entscheidende Regulationsprotein für die Apoptosesignalreguliernde-Kinase-1 (ASK-1) identifiziert werden. ASK-1 aktiviert die c-Jun-N-terminale-Kinase die für die durch alpha-TNF induzierte Apoptose erforderlich ist. TRX inhibiert die Wirkung von ASK-1 und damit die subsequente Apoptose (Saitoh 1998).

Eine Überexpression von TRX ist bei Ovarial- und Kolonkarzinomen gefunden worden, die eine Resistenz gegen Cisplatin zeigten. Allerdings konnte durch Transfektion von TRX in sensible Zellinien kein signifikanter Anstieg der Chemoresistenz erreicht werden. Die Vermutung liegt nahe, daß Thioredoxin an der Ausbildung des resistenten Phänotyps mitbeteiligt ist, aber nicht die alleinige oder dominierende Rolle spielt (Yamada 1997).

Andererseits gelang es durch Transfektion von Thioredoxin in Thymozyten der Maus, diese vor -in vivo und in vitro- induzierter Apoptose durch Dexmethason, Staurosporin und Etoposid zu schützen (Baker 1997).

Die Regulation von TRX erfolgt über die Thioredoxinreduktase (TR), die einen möglichen Angriffspunkt für die Chinone Diazichinon und Doxorubicin darstellt. Im Rhadomyosarkommodell konnte eine direkte positive Korrelation zwischen Hemmung der TR-Aktivität und Proliferation festgestellt werden. Der mögliche Grund für diese Beobachtung ist die verminderte Aktivität der


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Ribonukleotidreduktase, die den ersten gemeinsamen Schritt der DNA-Synthese katalysiert und die ihre reduzierende Äquivalente durch Thioredoxin wie TR erhält (Mau 1992).

Abbildung 5.3.1
Zusammenfassung der bekannten Funktion von Thioredoxin. Thioredoxin dient auch als temporärer Elektronendonor für die Thioredoxin Peroxid Reduktase (TPx) deren genaue Funktion unbekannt ist. Eine Verbindung zu den reaktiven Sauerstoffspezien und eine Beteiligung im intrazellulären Signaltransfer ist denkbar. Tpx = Thioredoxin Peroxid Reduktase; ROS = reaktive Sauerstoffspezien; PDGF/FGF = Peptidwachstumsfaktor; TSF = Transformationswachstumsfaktor; Tr = Thioredoxinreduktase.

Damit konnte gezeigt werden, daß Thioredoxin tiefgreifend an der Regulation des Zellwachstums und der Onkogenese involviert, fernerhin mit großer Wahrscheinlichkeit auch an der Ausbildung einer Chemoresistenz, wenn auch nicht als alleiniger und entscheidender Faktor, beteiligt ist. Trotzdem rückt damit Thioredoxin als pharmakodynamischer Angriffspunkt in das Interesse einer medikamentösen Beeinflussung im Hinblick auf eine Resensibilisierung oder eines komplett neuen Ansatzes für künftige Chemotherapeutika. Inzwischen konnten Disulfide wie das


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Alkyl-2-Imidazolyl-Disulfid gefunden werden, die selektiv starke inhibitorische Wirkung auf das Thioredoxin-System haben (Powis 1998).

5.3.2. Kolonkarzinom

5.3.2.1. BCSG-1

Nach Abschluß der Matchauswertungen fand sich in der gegen Daunorubicin resistenten Kolonkarzinomzellinie HT29RDB der Proteinspot Nr. 105, der nur dort und nicht in der parentalen Zellinie nachweisbar war (vgl. Abb. 4.2.7 ). Die Sequenzierung für den Spot 105 ergab, daß es sich um ein mit BCSG-1 sehr eng verwandtes Protein handelt. In einer von Ji und Mitarbeitern durchgeführten Datenbankrecherche von cDNA-Bibliotheken, wurde die dort abgelegten Sequenzen von Brustkrebs mit normalem Brustdrüsengewebe verglichen. Im Hinblick auf eine spezifische Expression auf Seiten der malignen Zellen konnte sie eine Sequenz identifizieren, von der sie dann experimentell darlegen konnten, daß sie in normalem Gewebe der Brustdrüse nicht, bei duktalen Karzinomen teilweise, aber regelmäßig bei invasiv wachsenden Tumoren vorkommt. Die so ermittelte Sequenz wurde als brustkrebsspezifisches Gen 1 (BCSG-1) bezeichnet.

Interssanterweise zeigt die Aminosäurensequenz von BCSG-1 eine enge Homologie zu einem Teil des Amyloidvorläufers beim M. Alzheimer. Die transmembranären Amyloidproteine sind große membranüberspannende Proteine, die neuroprotektiv die Zelle vor einem zu großen Kalziuminflux schützen. Die löslichen Amyloidproteine wirken wahrscheinlich durch ihre Fähigkeit den intrazellulären Kalziumspiegel zu senken, protektiv gegen die toxischen Einflüsse von Glukoseverarmung und Glutamat.

Die exakte Funktion des BCSG-1 ist unbekannt; nach den Überlegungen von Ji und Mitarbeitern ist jedoch denkbar, das es in Anlehnung zum löslichen Amyloid des M. Alzheimers, Tumorzellen vor den lokalen schädlichen Wirkungen während der Gewebeinvasion schützt (Ji 1997). Die Rolle von BCSG-1 in der Ausbildung einer Chemoresistenz ist somit noch offen.


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5.3.2.2. Adenin-Phosphoribosyltransferase

Nur in der gegen Mitoxantron resistenten Kolonkarzinomzellinie konnte der Spot 3201 nachgewiesen werden, der in der Sequenzierung als Adenin-Phosphoribosyltransferase identifiziert werden konnten (vgl. Abb. 4.2.4).

Beim hydrolytischen Abbau von Nukleinsäuren und Nukleotiden entstehen freie Purinbasen. Durch Wiederverwertungsreaktionen, die einfacher und weniger aufwendig sind als der de novo Aufbau, können Purinnukleotide aus solchen Bauteilen zurückgewonnen werden. Bei dieser salvage-Route wird eine Ribosephosphateinheit vom 5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat (PRPP) auf das Purin übertragen. Für die Wiederverwertungsreaktion stehen zwei Enzyme mit unterschiedlicher Spezifität zu Verfügung: 1.) Die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase und 2.) die Adenin-Phosphoribosyltransferase.

Eine gesteigerte Expression der Adenin-Phosphoribosyltransferase in der chemoresistenten Tumorzellinie kann Ausdruck einer vermehrten Nukleotidbildung im Zusammenhang mit einem vermehrten Umsatz von DNA und RNA sein. Diese wäre bei gesteigertem Wachstums oder Reparaturvorgängen, sowie bei der Steigerung einer oder mehrere Genprodukte zu erwarten.

5.3.3. Pankreaskarzinom

5.3.3.1. Das fettsäurebindende Protein

In der Sequenzierung von Spot 6002, der sich nur in der gegen Mitoxantron resistenten Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RNOV wiederfand, konnte dieser als fettsäurebindendes Protein vom epidermalen Typ (E-FABP) identifiziert werden (vgl. Abb. 4.3.3).

Die fettsäurebindenden-Proteine bilden eine Gruppe von 14-15 kD großen zytosolischen lipidbindenden Proteinen, die ursprünglich als Z-Proteine benannte wurden. Sie sind Carrier, die in einer Vielzahl von Zelltypen am Transport von langen Fettsäuren, Gallensäuren, organischen Anionen und anderen, schwer wasserlöslichen Metaboliten beteiligt sind (Takikawa 1992).

Zusammen mit den retinolbindenden Proteine (CRtBP) bilden sie eine strukturell und funktionell zusammengehörige Gruppe, in einer in der Evolution konservierten Genfamilie.

Zahlreiche Beobachtungen lassen den Schluß zu, daß FABP den intrazellulären Spiegel an Fettsäuren reguliert. Neuere Überlegungen sehen einen Zusammenhang in der Rolle der FAB-Proteine bei fettsäureabhängigen Prozessen wie Zellwachstum, Zellsignale und Regulation von Gentranskription. Inzwischen sind acht verschiedene FAB-Proteine isoliert worden, jeweils be-


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nannt nach dem Gewebe, in dem sie zuerst entdeckt wurden. Jedes von ihnen zeigt ein charakteristisches Vorkommensmuster und unterschiedliche Ligandenbindungseigeinschaften, die eine spezifische Funktion für jedes Protein vermuten lassen (Masouyé 1997).

Die genauen Funktionen von FABP und CRtBP sind nur ungenügend bekannt. Ungeachtet der funktionalen Unterschiede zeigen sich deutlich die Gemeinsamkeiten beider Protein-Gruppen in: 1.) der Förderung des zellulären Flusses von schlecht wasserlöslichen Liganden und damit deren Umsetzung; 2.) die Sequestration von Liganden zur Limitierung alternativer Bindungsstellen in der Zelle (Bass 1993).

Abbildung 5.3.2
Funktion der FAB-Proteine: An Albumin gebundende Liganden (in diesem Fall Fettsäuren) werden alternativ über membrangebundendes FABP bzw. andere Transportproteine in die Zelle aufgenommen. Intrazellulär gelangen die Liganden zu ihren Zielorten. Der Effekt von FABP auf das Zellwachtum ist je nach Typ diametral (Mod. n. Hohoff 1998 und Glatz 1997). Alb. BP = Albumin bindendes Protein; FATP = Fettsäuretransportprotein; FAT = Fattsäuretranslokase.

Die zellulären fettsäurebindenden Proteine gehören außerdem zu einer homogenen Familie aus zahlreichen Untereinheiten, zu der auch der Brustdrüsenwachstumsinhibitor (MDGI) gehört, der nahezu identisch mit dem FABP vom Herztyp ist. Sie sind sowohl am intrazellulären Fettsäuremetabolismus beteiligt, wie auch an Zellwachstum und -differenzierung. Am Beispiel des MDGI wird z.Z. diskutiert, ob dessen wachstumshemmende und differenzierungsfördernde Wirkung in der Behandlung des duktalen Mammakarzinomes eingesetzt werden kann (Grosse 1995).

Unabhängig davon konnte gezeigt werden, daß im Mäusemodell bei einer Behandlung eines Mammakarzinomes mit Liposomen aus gesättigten bzw. ungesättigten Fettsäuren, ein Anstieg


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des Zellwachstums signifikant mit einem Anstieg der FABP vom Herztyp assoziiert war (Naundorf 1995).

Das in der Leber zuerst isolierte L-FABP hat sich als spezifischer Mediator der Leberzellmitose offenbart, wobei zum einen eine Synergie mit ungesättigten Fettsäuren in der Induktion der Mitose besteht. Zum anderen zeigt es sich in der speziellen Erfordernis an nichtgenotoxischen Karzinogenen für diese Induktion und schließlich in den erhöhten Spiegeln von L-FABP in der Proliferation von regenerativer und maligner Leberzellen (Sorof 1994).

Die epidermale Form des FABP ist bisher in ihrer Verteilung nur im Zusammenhang mit irritativen, immunologischen und malignen Prozesse untersucht worden. So konnte bei experimentell wiederholter Reizung der Haut mit SDS eine starke Hochregulation für E-FABP erzeugt werden.

In der Verteilung findet sich E-FABP im oberen Stratum spinosum und Stratum granulosum im normalen Hautgewebe. Die Basalzellschicht bleibt frei und folgerichtig findet man E-FABP nur in gut differenzierten Plattenepithelkarzinomen und nicht in Basalzellkarzinomen (Masouyé 1997).

Es bleibt zu klären ob -im Hinblick auf den Resistenzmechanismus in unserem Probenmaterial- Mitoxantron ein Substrat für FABP darstellt. Derartige Untersuchungen die eine Antwort darauf geben können, ob FABP am Transport von Chemotherapeutika und speziell für Mitoxantron innerhalb oder aus der Zelle heraus beteiligt sein kann, liegen mir nicht vor.

5.3.3.2. Stratifin

Die Sequenz für Spot 205 war klar detektierbar und ergab ein 100% Match zu Stratifin. Spot 205 zeigte sich in der gegen Mitoxantron resistenten Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RNOV signifikant höher exprimiert als in der Ausgangszellinie (vgl. Abb. 4.34).

Stratifin ist ursprünglich durch Sequenzierungsversuche in einer Datenbank für Keratinozyten entdeckt worden, aber seine Funktion blieb bisher unbekannt.

Inzwischen konnte Stratifin als Keratinozyten zugeordnetes Protein und als Stimulator der Proteinkinase C identifiziert werden. Zu den Keratinozyten zugeordneten Proteinen gehören zwei eng verwandte Isoformen die als Sigma (Statifin) und Zeta bzw. 14-3-3-Protein bezeichnet werden (Dellambra 1995; Leffers 1993). Stratifin gehört zu einer Gruppe von Proteinen die außerdem noch Annexin-II und CaN19 einschließt, die als kalziumbindende Proteine fungieren und über die Regulation der Proteinkinase C Zellproliferation und -differenzierung beinflussen können. Die Proteinkinase C ist, wie auch deren 12 Isoenzyme, in vielfältige Signaltransduktionswe-


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ge involviert. Durch Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten können sie Proteine, die in der Chemoresistenz eine Rolle spielen, funktionell modifizieren. Bekannte Substrate sind das P-Glykoprotein, die Glutathion-S-Transferasen sowie die Topoisomerase I und II (Lage 1998) (vgl. Abb. 5.3.4). Ein weiteres Substrat, daß von Stratifin aktiviert wird ist YL-8, ein ras-ähnliches Protein, daß in der Regulation des intrazellulären Proteintransportes involviert ist (Vellucci 1995).

Abbildung 5.3.3
Funktion der mit Stratifin eng verwandten 14-3-3 Proteine. Die Aufgabe von 14-3-3 besteht in der Regulation von einem Zielprotein, für das zwei Konformationen bestehen, die unterschiedliche Aktivitätszustände haben (mod. n. Palmgren 1998).

Die Behandlung des kolorektalen Karzinomes durch ionisierende Strahlung, läßt die Tumorzellen in der G1 und G2 Phase des Zellzyklus verharren, wobei es sich in der G1 Phase um eine p53 vermittelte Induktion des cyclinabhängigen Kinase Inhibitoren p21WAF1/CIP1/SDI1 handelt. Die Grundlagen für das Verharren in der G2 Phase sind unbekannt.

Am Beispiel des Dickdarmkrebses konnte gezeigt werden, daß die Bildung von Stratifin durch Gammastrahlung und andere DNS schädigende Agenzien stimuliert werden kann. Dies erfolgt durch die Induktion einer Stelle der DNS 1,8 kb vor der Startstelle für die Transkription und zwar durch ein auf p53 reagierendes Element. Die exogene Zufuhr von Stratifin bei sich replizierenden Zellen bewirkt einen Zellarrest in der G2 Phase.

Welche exakte Rolle Stratifin im Zusammenspiel der Mechanismen der Chemoresistenz zukommt, ist noch weiterhin klärungsbedürftig. Zumindest die Fähigkeit von Stratifin in die Phasen des Zellzyklus einzugreifen macht es zu einem interessanten Untersuchungsobjekt in der Suche nach chemoresistenzassoziierten Faktoren.


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Abbildung 5.3.4
Vereinfachtes Schema zur Rolle von Stratifin, Cofilin, Annexin-1 und Thioredoxin im Zusammenspiel mit der der Proteinkinase C im Hinblick auf Aspekte der Chemoresistenz. PKC= Proteinkinase C; KCIP= Proteinkinase C-Inhibitor; PGP= P-Glykoprotein.


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5.3.3.3. Cofilin

Sowohl in der gegen Mitoxantron als auch in der gegen Daunorubicin resistenten Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RNOV bzw. EPP85-181RDB konnte der Proteinspot 6000 als signifikant überexprimiert gegenüber der parentalen Zellinie dargestellt werden (vgl. Abb. 4.3.5). Der Proteinspot 6000 wurde in der Sequenzierung eindeutig als Cofilin identifiziert.

Cofilin ist ein Aktin depolymerisierendes Protein, das in tierischen und pflanzlichen Zellen weit verbreitet ist. Aktinfilamente in Nicht-Muskelzellen sind dynamische Strukturen, die sich ständig auflösen und neu bilden. Sie werden durch schrittweise Addition von Aktinmonomeren an freien Enden verlängert. Aktin enthät ein einziges gebundenes Nucleotid, ATP oder ADP, und katalysiert die langsame Hydrolyse von gebundenem ATP zu ADP. Die freien Aktinmonomere polymerisieren nicht spontan, weil aktinbindende Kontrollproteine anwesend sind, von denen schon über fünfzig bekannt sind und zu denen auch das ADF/Cofilin-Sytem zählt.

Abbildung 5.3.5
Physiologie der Aktiondepolymerisation durch die ADF/Cofilin Wirkung. Cofilin bindet an ADP-Aktin und fördert damit die Aktin Depolymerisation zu Aktin-Monomeren, die nach Phosphorylierung erneut für die Polymerisation zur Verfügung stehen. Der An- und Abbau von Aktin-Monomeren ist für alle Veränderungen der Zellmorphologie einschließlich Zellteilung, -motilität und Membranverschmelzung essentiell (mod. n. Carlier 1997). T = ATP-Aktin; D-Pi = ADP-Aktin-Phosphati; D = ADP-Aktin.

Cofilin bindet kooperativ Aktinfilamente, indem es zwei längs ausgerichtete Aktinuntereinheiten überbrückt. Als eine Besonderheit vermag Cofilin die Windung der Aktinfilamente zu verändern, so daß die Aktinquerverbindungen etwa 75% kürzer sind als normale (McGough 1997).


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Zelluläre Streßbelastungen sowie verschiedene andere Stimuli führen zu einer Überexpression von Cofilin, wie es durch Hitzeschock und Dimethylsulfoxid experimentell belegt werden konnte. In diesem Zusammenhang besteht für Cofilin eine nukleäre Signalsequenz, die in den Zellkern zusammen mit Aktin transloziert. Über die Funktionen dieses Mechanismus ist fernerhin nichts bekannt (Yahara 1996).

In nicht wachstumsstimulierten Zellen sind die meisten schnellwachsenden Enden der Aktinfilamente von einem 1:1 Komplex aus Aktinmonomer und Profilin -einem PIP2 Protein- bedeckt.

Bei einer Stimulation der Mitose durch Zytokine wie EGF oder PDGF wird Ras und in Folge Rac aktiviert. Rac aktiviert die PI-4-Kinase, die PIP2 erzeugt, welches Profilin bindet und den Profilin-Aktin-Komplex dissoziiert; die Folge ist eine rasche Aktinpolymerisation. Das Aufdecken der Aktinfilamente ist ein wesentlicher Faktor für die Onkogentität von Ras. Cofilin kann das Aufdecken verhindern und ist damit ein effektiver Suppressor für die durch onkogene Ras-Mutanten wie v-Ha-Ras induzierte maligne Transformation (Maruta 1997).

Schließlich scheint Cofilin als intrazellulärer Messenger für die T-Zell-Aktivierung zu wirken, wo es als assessorischer Rezeptor für die Kostimulation wirkt. In untransformierten T-Lymphozyten korreliert dieser Prozeß gut mit der Aktivierung funktioneller Prozesse, die für die T-Zell Proliferation notwendig sind (Samstag 1994). In diesem Zusammenhang ist auch eine Beobachtung von Bedeutung, die ursprünglich an dem T-Zell Lymphom Jurkat gemacht wurde (Samstag 1994). Dort konnte die spontane Dephosphorylation von Cofilin nachgewiesen werden, das dann in den Zellkern transloziert. Hemmt man diese Spontandeposphorylation durch den Serinphosphatase-Inhibitor Okadaic-Säure, führte dies zur Apoptose der Lymphomzellen (Nebl 1996; Samstag 1996).

Auch wenn sich in den bisher dargelegten bekannten Eigenschaften von Cofilin nicht exakt ableiten läßt, wie und in welchem Umfang es an der Ausbildung der Resistenz beteiligt ist, weist die Assoziation von Cofilin mit dessen Einfluß auf die Replikation -insbesondere in Verbindung mit den Onkogenen- auf eine wichtige Funktion innerhalb des Zellzyklus hin. Insbesondere die Verbindung zu der protekiven Wirkung auf die Apoptose am Beispiel des Jurkat-Lymphomes deutet darauf hin, daß Cofilin Teil des Resistenzmechanismus sein kann.


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Abbildung 5.3.6
Bekannte Aspekte von Cofilin: Neben der Aktindepolymerisation verhindert Cofilin, daß PIP Profilin vom Aktin abzieht und damit eine rasche Aktinpolymerisation. Ungeklärt ist die Rolle der nukleären Signalsequenz nach Dephosphorylation von Cofilin. Eine Inhibierung diese Dephosphorylierung mündet in die Apoptose.

5.3.4. Fibrosarkom

5.3.4.1. RHO-GDP-Dissoziationsinhibitor-beta.

In der mit Mitoxantron selektionierten Fibrosarkomzellinie EPF86-079RNOV konnte der Proteinspot 1202 nicht zum Standard der parentalen Zellinie gematched werden. Die Sequenzierung von Spot 1202 ergab, daß es sich um den RHO-GDP-Dissoziations Inhibitor-beta handelt, der sich sonst physiologisch vorzugsweise in hämatopoetischen Geweben einschließlich Knochenmark, Milz, Thymus und Lymphknoten nachweisen läßt.

Es interagiert mit der GDP-gebundenen Form von RhoA, das zu der Familie der kleinen GTPase-Proteine (G-Proteine) gehört und regelt damit den GDP/GTP Austausch, indem es die Dissoziation von GDP zu diesem verhindert (vgl. Abb. 5.3.7). Die G-Proteine der Rho-Unterfamilie regulieren das Erzin/Radixin/Moesin (ERM) CD44 System, welches in der Reorganisation der Aktinfilamente des Zytoskelettes involviert ist (Takahashi 1997).


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Zu den Rho-Proteinen zählen RhoA,B,C, rac 1, 2, Cdc42, RhoG, TC10 und RhoE. G-Proteine der Rho Familie regulieren mannigfaltig die entzündliche Zellaktivität, einschließlich Motilität und Bildung toxischer Sauerstoffmetaboliten sowie die Bildung von Zytokinen (Hall 1998; Antonarakis 1998; Sasaki 1998). Weiterhin bestehen Hinweise, daß Rho-Proteine in der Regulation der Phosphatidylinositol-3-Kinase (Zheng 1994), Phosphatidylinositol-4-Phosphat-5-Kinase (Chong 1994), Phospholipase D (Malcom 1994) und Integrin-vermittete Signalübertragung eingeschaltet sind (Laudanna 1996). Sie sind an der Kontrolle der Endozytose (Lamaze 1996), der Transkription (Hill 1995), der Zellzyklusregulation (Olson 1995), der Apoptose (Moorman 1996) und der Transformation beteiligt (Khosravi-Far 1995).

Experimentell konnte belegt werden, daß ein defiziente Regulation in der GTPase -in diesem Fall durch eine modifizierten RHO-GDP-Dissoziationsinhibitor-beta zu einer irreversiblen Gewebeschädigung führt (Danley 1996).

Abbildung 5.3.7
Schema zur Regulation und Wirkungsweise der Rho Dissoziationsinhibitoren. Die Stimuli für das GDP/GTP austauschende Protein (GEP) und dem GTPase aktivierenden Protein (GAP) sind unbekannt. Mod. n. Sasaki 1998.

Ebenfalls zu der Rho-Familie gehören neben RhoA auch Rac und Cdc42. Von diesen ist bekannt, daß sie in die Kaskade der N-teminalen c-Jun Kinase und der Kinase des mitoseaktivierenden Proteines p38 eingreifen und somit die Gentranskription beinflussen. Darüber hinaus reguliert Rac den Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat-Oxidase Komplex in Makrophagen, der für die


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Bildung von Peroxiden und Radikalen notwendig ist, wogegen die Rho GTPase die Progression in der G1 Phase des Zellzyklus zu aktivieren vermag (Hall 1998).

Schließlich findet sich die Rho Dissoziationsinhibitoren bei der durch Bax eingeleiteten Apotose. Bax, ein Mitglied der Bcl-2 Familie, bildet Homo- und Heterodimere mit Antagonisten für das Apotosesignal. Das Verhältnis von Bcl-2 Mitgliedern und den Antagonisten diktiert die Anfälligkeit der Zelle gegenüber einem apototischen Stimulus. Dies schließt die Aktivierung von Interleukin-1beta-Konversionsenzym (ICE) ähnlichen Proteasen zur Spaltung der endogenen Substrate, wie ADP-Ribosepolymerase und dem RHO-GDP-Dissoziationinhibitor-beta, ein (Xiang 1996).

Damit ergibt sich das Bild, daß der RHO-GDP-Dissoziationinhibitor-beta eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion in Verbindung mit Rho bzw. Rac und ganz besonders mit Bax einnimmt. RHO-GDP-Dissoziationinhibitor-beta ist in Hinblick auf die Mechanismen der Chemoresistenz ein interessantes Objekt, weitere Aspekte seiner Wirkung auf Zellzyklus oder dessen Interaktion mit den Onkogenen offenzulegen.

5.4. Die Bedeutung der Forschung zum MDR-Phänotyp für die klinische Praxis

5.4.1. Klinische Relevanz der MDR assoziierten Proteinexpression

Die Bedeutung der Expression einzelner MDR assoziierter Proteine, wie z.B. dem P-Glykoprotein in Hinsicht auf Prognose und Therapieerfolg der Behandlung, sind noch in der Diskussion. Es existieren widersprüchliche Studien zur Korrelation der in vivo/in vitro Expression von PGP zur klinisch evident bestehenden Chemoresistenz, so wie bei der CLL durchgeführten Untersuchung (Ito 1989). Im Gegensatz dazu fanden sich enge Korrelationen u.a. bei Ovarialtumoren (Bell 1985), Sarkomen (Gerlach 1987) oder lymphoblastischer Leukämie (Ma 1987).

Zweifelsfrei zeigt das MDR1 Genprodukt eine enge Assoziation mit chemoinsensiblen Tumoren wie Myelomen, Lymphomen, Mamma- und Ösophguskarzinomen (Fojo 1987; Goldstein 1989). Bei Kindern mit Sarkomen, die traditionell eine sensitive Tumorart darstellen, konnte bei allen Rezidiven eine PGP Expression festgestellt werden (Gerlach 1987). Schwieriger ist es, den Einfluß des PGP auf die Behandlung des Mammakarzinomes nachzuweisen, da die Kombinationstherapie mit nicht MDR Therapeutika eine Analyse des PGP Effektes erschwert. Es konnte aber eine Korrelation zwischen Lymphknotenbeteiligung und dem Ausgang der Chemotherapie in Hinsicht auf die Bildung von PGP offengelegt werden (Schneider 1989; Ro 1990)


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Eine vorläufige Studie an mehr als 400 verschiedenen menschlichen Tumoren zeigt eine weitverbreitete Expression des MDR1 Gens sowohl bei intrinsischer als auch erworbener Vielfachresistenz (Goldstein 1989). Die intrinsische Expression von MDR1 ist in malignen Neoplasien von Niere, Leber, Kolon und Nebenniere nachweisbar (Fojo 1987; Kakehi 1988). Im Fall der Nierenzellkarzinome wurde eine Erhöhung der MDR1-mRNA insbesondere bei differenzierten Tumoren gefunden, als ein Hinweis auf die Verbindung von MDR1 Expression und Differenzierungsgrad (Kanamaru 1989).

Verschiedene andere Tumoren weisen hohe Spiegel von MDR1-RNA auf, wobei es sich häufig um Neoplasien handelt, deren ursprüngliche Ausgangsgewebe keine größere MDR1 Expression zeigen. Dazu gehören akute und chronische Leukämien bei Kindern und Erwachsenen (Sato 1990; Rothenberg 1989; Herweijer 1990), Nichtkleinzellige Bronchialkarzinome (Lai 1989), Neuroblastome (Goldstein 1990; Bourhis 1989), non-Hodgkin Lymphome, Sarkome und Astrozytome (Goldstein 1989). Im Fall von Neuroblastom und Sarkom im Kindesalter besteht eine enge Korrelation zwischen der PGP Expression und schlechter Prognose, einschließlich des Nichtansprechens der Chemotherapie (Chan 1990).

Die Beobachtung, daß die PGP-Synthese bei Tumoren deren Ursprungsgewebe nicht MDR1 exprimieren führte zu der Vermutung, daß die maligne Transformation per se das MDR1 Gen aktivieren kann. Bestätigung für diese Überlegung fand sich in einer Studie, in der der MDR1-Promotor durch ras und p53 stimuliert werden konnte, zwei Genen die gewöhnlich mit Tumorprogression assoziiert sind (Chin 1992).

Ungeachtet des kurzen Zeitraumes seit Entdeckung des vielfachresistenzassoziierten Proteins wachsen die Erkenntnisse über die Rolle und Wichtigkeit in der klinischen Praxis stetig. Dies gilt insbesondere für die Aussagekraft von MRP als prognostischer Faktor oder als mögliches Ziel für eine pharmakologische Reversion der Resistenzentwicklung.

Hohe Spiegel von MRP-mRNA wurden charakteristischerweise in Tumoren gefunden, die gewöhnlich schlecht auf eine Chemotherapie ansprechen, wie etwa bei Bronchialkarzinomen (Nooter 1996) oder Neuroblastomen, letztere auch mit einer signifikanten Korrelation mit der Expression von n-myc, einem Onkogen, welches z.Z. den stärksten Indikator für ein Therapieversagen darstellt (Bordow 1994). Diese Beobachtung läßt den Schluß zu, daß eine enge Beziehung zwischen zellulären Prozessen der Tumorprogression und der Ausbildung von Faktoren der Chemoresistenz besteht.

Mehrere Studien konnten belegen, daß bei schrittweiser Selektion zur Chemoresistenz in erster Linie MRP bei niedrigeren Konzentrationen zu finden ist, als PGP; ein möglicher Hinweis dar-


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auf, daß die Expression von MRP in geringen, klinisch relevanten Resistenzstufen srärker ausschlaggebend ist (Brock 1995).

Schließlich findet sich MRP häufig in verschiedenen Leukämieformen. Eine interessante Beobachtung konnte an der seltenen Subklasse M4Eo der akuten myeloischen Leukämie gemacht werden. Dort fand sich eine Deletion eines der MRP Allele, verbunden mit einem deutlich verlängerten, rückfallfreien Intervall nach primärer Therapie (Kuss 1994).

5.4.2. Pharmakologische Resensibilisierung von Chemoresistenz

In den letzten zehn Jahren sind zahlreiche Substanzen gefunden worden, die den PGP vermittelten Auswärtstransport der Chemotherapeutika zu inhibieren vermögen. Die sogenannten Modulatoren des MDR oder Chemosensitiver verteilen sich auf ein breite Varietät von Substanzen wie Kalziumkanalblocker, einige Dihydropyridine, Amiodaron, Steroide, Cyclosporin, Chinin u.a. (Überblick in Ecker 1995). Einige dieser Agenzien konnten in Phase I und II der klinischen Prüfung eintreten. Erste Ergebnisse zeigen, daß sich damit eine Beeinflussung der MDR in vivo zwar erreichen läßt, allerdings für den Preis regelmäßig auftretender erheblicher Nebenwirkungen (Raderer 1993). Im allgemeinen gilt, daß die Modulatoren in sehr viel höheren als in deren ursprünglichen therapeutischen Dosen appliziert werden müssen.

Bei der Suche nach Chemosensitivern bei nicht PGP expremierenden Zellinien, deren Resistenz auf das Vorhandensein von MRP zurückzuführen ist, sind ebenfalls diverse Modulatoren bekannt. Dazu gehören: Verampamil, Dihydropyridin, Tiapamil Analoge, der Bisindolylmaleimid Protein C Kinase Inhibitor und zahlreiche weitere Substanzen (Überblick in Loe 1996). Einige dieser Stoffe bewirken eine Revision der Chemosensibilität erst in Konzentrationen, die eine therapeutische Anwendung verbieten. Außerdem kann das Maß der Revision stark zwischen den einzelnen Zellinien, ja sogar in einer einzelnen variieren.

Die Fähigkeit von MRP, Substrate nach Bindung mit Gluthation zu transportieren, führte zu Versuchen die intrazellulären Spiegel von GSH zu beeinflussen. Experimentell wird dazu Buthionin Sulphoximin eingesetzt. Damit konnte bei einigen Tumorzellinien eine Resensibilisierung erreicht werden (Loe 1996).


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5.4.3. Ausblick

Aus onkolgischer Sicht gelten chemoresistente Zellen als abnorme Zellen, die den Therapieerfolg verhindern. Man erlang den Eindruck, als ob die resistente Zelle immer der ”mutierte“ und die sensitive immmer der ”normale“ Phänotyp ist. Dagegen wendet Harries ein, daß die meisten natürlichen Gewebe recht wiederstandsfähig gegenüber der Chemotherapie sind. Es ist daher auch nicht verwunderlich, daß Tumoren die aus diesen Geweben erwachsen in der Regel eine Chemoresistenz zeigen. Letztlich bedarf es nur der Aktivierung von 3-7 Onkogenen um aus normalen Zellen Tumorzellen zu machen. Geht man davon aus, daß das menschliche Genom etwa 100000 Gene enthält, so ist die Tumorzelle -aus genetischer Sicht- zu 99,99% normal, zumindestens initial.

Die logische Konsequenz daraus scheint in der provokativen These von Harris zu bestehen, daß die ”normale“ Tumorzelle chemosensibel, bis zu ihrer Mutation, ist (Harris 1985).

Dabei ist die Chemoresistenz das zentrale Problem in der Krebsbehandlung, insbesondere bei den disseminierten Tumoren die in der Regel nicht für einen chirugischen oder strahlentherapeutischen Ansatz geeignet sind.

Auch wenn die Resistenzmechanismen in Untersuchungen präzisiert werden können, ist es nicht unproblematisch von diesen Ergebnissen auf den klinischen Patienten zu extrapolieren: Zellen in Kultur fehlt die funktionelle Enbindung in das Gewebe, sie sind meist weniger heterogen als im soliden Tumor und es ist nicht zu erwarten, daß sie dort ähnlich homogen vom Chemotherapeutikum ausgesetzt sind, wie es in vitro der Fall ist.

Trotz dieser Schwierigkeiten finden die Ergebnisse auf diesem Gebiet jetzt schon Anwendung, so z.B. als klinischer Marker zur Vorhersage des Ansprechens eines Therapieregimes. Letztendlich bleibt zu hoffen, daß weitere Erkenntisse zu einer Überwindung der Chemoresistenz, sei es durch Unterbindung der die Chemoresistenz auslösenden Faktoren oder sei es durch geziehlte Entwicklung eines Therapeutikums, das kein Substrat für den Resistenzmechanismen darstellt, führen.


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