Hütter, Gero : Chemoresistenzassoziierte Veränderungen der Proteinexpression bei Kolon-, Mamma-, Magen-, Pankreaskarzinom und Fibrosarkom mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten

Humboldt-Universität zu Berlin


DISSERTATION
Chemoresistenzassoziierte Veränderungen der Proteinexpression bei Kolon-, Mamma-, Magen-, Pankreaskarzinom und Fibrosarkom mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

Aus dem Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie


der medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. E. Köttgen

Gero Hütter

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
PD Dr. Dr. P. Sinha
Prof. Dr. D. Schadendorf
Prof. Dr. M. Dietel

Datum der Promotion: 4.2.2000

Keywords:
Cancer, chemoresistance, proteomics, 2D-electrophoresis

Abstract

The therapy of advanced cancer using chemotherapy alone or in combination with radiation or hyperthermia yields an overall response rate of about 20-50%. This success is often marred by the development of resistance to cytostatic drugs. The aim was to study the global analysis of protein expression in the development of chemoresistance in vitro. We therefore used a cell culture model derived from the gastric, colorectal, pancreatic, mamma carcinoma and fibrosarcoma cell line selected to daunorubicin and mitoxantrone. These cell lines were analysed using two-dimensional electrophoresis in immobilized pH-gradients (pH 4.0-8.0) in the first dimension and linear polyacrylamide gels (12%) in the second dimension. After staining with coomassie brilliant blue, image analysis was performed using the PDQuest system. Spots of interest were isolated using preparative two-dimensional electrophoresis and subjected to microsequencing after enzymatic hydrolysis in gel, mass spectrometric data and sequencing of the peptides after their fractionation using microbore HPLC identified. Eight proteins were identified that were overexpressed in chemoresistant cell lines: Thioredoxin, Annexin 1, Cofilin, Stratifin(14-3-3sigma), Rho-GDP-dissoziation Inhibitor, fatty acid binding protein(E-FABP), adenin phosphoribosyl Transferase, and BCSG-1.

Schlagwörter:
Krebs, Chemoresistenz, Proteomics, 2D-Electrophorese

Zusammenfassung

Die Therapie von disseminierten malignen Tumoren durch Chemotherapie allein oder in Kombination mit Bestrahlung oder Hyperthermie führt nur in 20-50% zu einem Ansprechen. Dieser Behandlungserfolg wird häufig dadurch limitiert, daß im Verlauf der Therapie zur Entwicklung einer Chemoresistenz kommt. Ziel der Arbeit war es, eine generelle Analyse der Proteinexpression in der in vitro herbeigeführten Chemoresistenz durchzuführen. Dafür wurden Zellkulturen von Magen-, Kolon-, Pankreas, Mammakarzinom und Fibrosarkom die eine Resistenz gegen Daunorubicin und Mitoxantron besitzen benutzt und mit der zweidimensionalen Gelelektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten (pH 4,0-8,0) in der ersten Dimension und einen linearen Polyarcylamidgel (12%) in der zweiten Dimension analysiert. Nach Färbung in Coomassie blau wurde eine rechnergestützte Imageanalyse mit dem PDQuest System durchgeführt. Proteinspots die eine auffällige Änderung zeigten wurden isoliert, und nach enzymatischer Gelhydrolyse mikrosequenziert bzw. durch Massenspektrometrie und anschließender micropore HPLC Analyse identifiziert. Acht Proteine, die in den chemoresistenten Zellinien überexprimiert waren, konnten identifiziert werden: Thioredoxin, Annexin 1; Cofilin, Stratifin(14-3-3sigma), Rho-GDP-Dissoziations Inhibitor, Fettsäurebindendes Protein(E-FABP), Adenin Phosphoribosyl Transferase, und BCSG-1


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteChemoresistenzassoziierte Veränderungen der Proteinexpression bei Kolon-, Mamma-, Magen-, Pankreaskarzinom und Fibrosarkom mit Hilfe der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten
1 Einleitung
1.1. Chemoresistenz bei der Behandlung maligner Neoplasien: Stand der Forschung
1.1.1. Verminderte Aufnahme des Substrates in die Zelle
1.1.2. Vermehrte Inaktivierung oder verminderte Aktivierung des Substrates intrazellulär
1.1.3. Verminderte Affinität des Substrates zu den intrazellulären Zielen
1.1.4. Gesteigerte Reparationskapazität der Zelle
1.1.5. Geringere intrazelluläre Konzentration durch einen transportproteinabhängigen auswärtsgerichteten Substratstrom
1.1.5.1. Das Phänomen der Vielfachresistenz oder Multidrug Resistance
1.1.5.2. Das P-Glykoprotein
1.1.5.3. MRP, das mit Vielfachresistenz assoziierte Protein
1.1.5.4. Das Resistenzprotein der Lunge
1.1.6. Weitere Aspekte zur Entwicklung der Chemoresistenz
1.1.6.1. Weitere Alternativen
1.1.6.2. Die Rolle der Onkogene in der Entwicklung einer Chemoresistenz
1.2. Allgemeine Aspekte zur 2-D-Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten
2 Fragestellung
3 Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Zellproben
3.1.2. Reagenzien
3.1.3. Geräte
3.2. Methodik
3.2.1. Zweidimensionale Elektrophorese im immobilisierten pH-Gradienten
3.2.1.1. Aufarbeitung der Zellen
3.2.1.2. Erstellen der Gele für die erste Dimension mittels eines rechnergestützten Programms zur Generierung des pH-Gradienten
3.2.1.3. Vorbereitung für die Elektrophorese der ersten Dimension
3.2.1.4. Starten der ersten Dimension
3.2.1.5. Erstellen der Gele für die Elektrophorese der zweiten Dimension
3.2.1.6. Starten der Elektrophorese der zweiten Dimension
3.2.1.7. Färben der Gele
3.2.2. Auswertung der Gele mit PDQUESTTM
3.2.2.1. Einscannen der Gele
3.2.2.2. Proteinspot Erkennung
3.2.2.3. Erstellen eines Matchsets
3.2.3. Sequenzierung der in der zweidimensionalen Elektrophorese ermittelten Proteine
4 Ergebnisse
4.1. Magenkarzinom
4.2. Kolonkarzinom
4.3. Pankreaskarzinom
4.4. Fibrosarkom
4.5. Mammakarzinom
5 Diskussion
5.1. Zur Wahl des benutzten Elektrophoreseprotokolles
5.2. Pharmakologische Eigenschaften der eingesetzten Chemotherapeutika im Hinblick auf bekannte Ursachen der Resistenzentwicklung
5.2.1. Daunorubicin
5.2.2. Mitoxantron
5.3. Ergebnisse
5.3.1. Magenkarzinom
5.3.1.1. Annexin-1
5.3.1.2. Thioredoxin
5.3.2. Kolonkarzinom
5.3.2.1. BCSG-1
5.3.2.2. Adenin-Phosphoribosyltransferase
5.3.3. Pankreaskarzinom
5.3.3.1. Das fettsäurebindende Protein
5.3.3.2. Stratifin
5.3.3.3. Cofilin
5.3.4. Fibrosarkom
5.3.4.1. RHO-GDP-Dissoziationsinhibitor-beta.
5.4. Die Bedeutung der Forschung zum MDR-Phänotyp für die klinische Praxis
5.4.1. Klinische Relevanz der MDR assoziierten Proteinexpression
5.4.2. Pharmakologische Resensibilisierung von Chemoresistenz
5.4.3. Ausblick
6 Zusammenfassung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Bibliographie Literaturverzeichnis
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 3.1
Die von mir benutzten Tumorzellinien nach Ausgangsgewebe und mit der entsprechenden im weiteren Text benutzten Nomenklatur.
Tabelle 3.2
Arbeitsprotokoll zur Erstellung einer Charge Gele für die erste Dimension. Bürette 1 enthielt die Lösung für den sauren, Bürette 2 die für den basischen pH-Bereich. Bürette 3 enthielt das zur Polymerisation notwendige Amoniumpersulfat.
Tabelle 3.3
Elektrophoreseprogramm für die erste Dimension. Die Spannung wird langsam erhöht, um unerwünschte stärkere Ionenbewegungen im Gel zu vermeiden. Anschließend werden die Proteine für 9 Stunden bis zum Erreichen der 60 kVh fokussiert.
Tabelle 3.4
Arbeitsprotokoll zum Gießen von zehn Gelen für die zweite Dimension

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1.1
Biochemische Grundmechanismen der Chemoresistenz (mod. n. Hayes 1990). Erläuterungen der Punkte 1-5 siehe Kapitel 1.1.1 bis 1.1.5
Abbildung 3.1
Schematische Darstellung der Arbeitsschritte 3.2.1.2 bis 3.2.1.6 im Text.
Abbildung 3.2.1
Die Meßscheibe verbindet die Basen der Dichtespur zu einer Hintergrundspur unter der alle optischen Dichten subtrahiert werden (Mod. n. PdQuestTM Users´s Guide).
Abbildung 3.2.2
Je nach Größe des abtastenden Radius der Meßscheibe erhält man ein unterschiedliches Gelimage. Die Optimierung des Radius ist für die optimale Auswertung der Gele von entscheidender Bedeutung (Mod. n. PdQuestTM Users´s Guide).
Abbildung 3.2.3
In einem Gel des Matchsets ist die Spotzuordnung zum Standard falsch erfolgt. Um in einer unübersichtlichen Menge an Spots dieses zu erkennen, lassen sich die Abweichungsvektoren relativ zu den Spots des Standards als Offsets darstellen. Eine Überkreuzung der Abweichungsvektoren deutet auf eine Fehlzuordnung hin (Mod. n. PdQuestTM Users´s Guide).
Abbildung 3.2.4
Übersicht der Arbeitschritte im PDQUEST-System. Ausgehend von einer Charge von drei Gelen der zweiten Dimension für die parentale und die ein oder zwei Chargen der resistenten Zellinien, stehen am Ende die Ergebnisse zu den Fragen der ON/OFF Phänomene bzw. der Hoch-/Herabregulation einzelner Proteine.
Abbildung 4.1.1
Standardimage der parentalen Magenkarzinomzellinie EPG85-257P.
Abbildung 4.1.2
Standardimage der mit Daunorubicin selektionierten Magenkarzinomzellinie EPG85-257RDB.
Abbildung 4.1.3
Standardimage der mit Mitoxantron selektionierten Magenkarzinomzellinie EPG85-257RNOV.
Abbildung 4.1.4
Detailansicht mit den nichtmatchbaren Spots 1003, 2001 und 3003 in EPG85-257RNOV. Spot 1003 stellt sich in der Sequenzierung als Thioredoxin dar. Für Spot 3003 konnten zwei Sequenzen ermittelt werden, die aber keinem bekannten Protein zuordnenbar sind. Spot 2001 konnte nicht sequenziert werden.
Abbildung 4.1.5
Detailansicht von Spot 4302, der sich sowohl in der gegen Mitoxantron als auch Daunorubicin resistenten Zellinie nachweisen ließ. Die Sequenzierung ergab, daß es sich hierbei um Annexin-1 handelt.
Abbildung 4.1.6
Detailansicht der Spots 4104 und 4105, die sich nur in der mit Daunorubicin selektionierten Magenkarzinomzellinie fanden.
Abbildung 4.1.7
Detailansicht des Proteinspots 3502 in der mit Daunorubicin selektionierten Magenkarzinomzellinie.
Abbildung 4.1.8
Detailansicht der Spots 8201 und 9202, die sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten Magenkarzinomzellinie fanden.
Abbildung 4.1.9
Detailansicht von Spot 1205, der sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten Magenkarzinomzellinie fand.
Abbildung 4.1.10
Proteinspot 6002, der sich sowohl in der mit Mitoxantron als auch mit Daunorubicin selektionierten Magenkarzinomzellinie fand, zeigt in der parentalen eine deutlich höhere Expression als in den resistenten Zellinien.
Abbildung 4.2.1
Standard Image der parentalen Kolonkarzinom Zellinie HT29P.
Abbildung 4.2.2
Standard Image der mit Mitoxantron selektionierten Kolonkarzinom Zellinie HT29RNOV.
Abbildung 4.2.3
Standard Image der mit Daunorubicin selektionierten Kolonkarzinom Zellinie HT29RDB.
Abbildung 4.2.4
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 3201 (Adenin-Phosphoribosyltransferase).
Abbildung 4.2.5
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 405. Ein Sequenzierungsversuch wurde nicht unternommen.
Abbildung 4.2.6
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spots 9802/9702.
Abbildung 4.2.7
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 105 für den in der Sequenzierung eine enge Homologie zu BCSG-1 nachgewiesen werden konnte.
Abbildung 4.2.8
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spots 8101/8204.
Abbildung 4.3.1
Standardimage der parentalen Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181P.
Abbildung 4.3.2
Standardimage der mitoxantronselektionierten Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RNOV.
Abbildung 4.3.3
Detailansicht vom Proteinspot 6002 der sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten Pankreaskarzinomzellinie fand.
Abbildung 4.3.4
Proteinspot 205 fand sich in der mit Mitoxantron selektionierten Pankreaskarzinomzellinie signifikant vermehrt im Gegensatz zur parentalen Zellinie. Die Sequenzierung zeigte, daß es sich um Stratifin handelt.
Abbildung 4.3.5
Proteinspot 6000 fand sich sowohl in der mit Mitoxantron als auch Daunorubicin selektionierten Pankreaskarzinomzellinie signifikant vermehrt im Gegensatz zur parentalen Zellinie. Die Sequenzierung zeigte, daß es sich um Cofilin handelt.
Abbildung 4.4.1
Standard Image der parentalen Fibrosarkomlinie EPF86-079P.
Abbildung 4.4.2
Standard Image der Mitoxantron selektionierten Fibrosarkomlinie EPF86-079RNOV.
Abbildung 4.4.3
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 1202.
Abbildung 4.4.4
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spot 7301.
Abbildung 4.4.5
Detailausschnitt mit dem nicht in der parentalen Zellinie vorhanden Spots 3307/3309.
Abbildung 4.4.6
Veränderung der optischen Dichte bei Proteinspot 3811 (A) und 4201 (B) in der mit Mitoxantron selektionierten Fibrosarkomzellinie. In beiden Fällen fand sich in der resistenten Zellinie eine signifikante Erhöhung der O.D.
Abbildung 4.4.7
Veränderung der optischen Dichte bei Proteinspot 8304 (A) und 8205 (B) in der mit Mitoxantron selektionierten Fibrosarkomzellinie. In beiden Fällen fand sich in der resistenten Zellinie eine signifikante Verminderung der O.D.
Abbildung 4.5.1
Standardimage der parentalen Mammakarzinomzellinie MDA-MB-231P.
Abbildung 4.5.2
Standardimage der mit Mitoxantron selektionierten Mammakarzinomzellinie MDA-MB-231RNOV.
Abbildung 4.5.3
Detailansicht von Proteinspot 6001, der sich nur in der mit Mitoxantron selektionierten Mammakarzinomzellinie fand.
Abbildung 4.5.4
A: Proteinspot 6201 war in der mit Mitoxantron selektionierten Mammakarzinomzellinie signifikant höher exprimiert als in der parentalen. B: Proteinspot 5601 dagegen fand sich in der parentalen Zellinie höher exprimiert als in der Resistenten.
Abbildung 5.1.1
Beispiel für die absoluten Abweichung der Spotquantitäten zweier Pankreaskarzinomzellinien. Aufgetragen ist die Abweichung eines Gels in der optischen Dichte zu einem Vergleichsgels der gleichen Charge. Der Korrelationskoefizient beträgt in diesem Fall 0.82 bei N = 293
Abbildung 5.2.1
Strukturformel von Daunorubicin: (1S,3S)-3-Acetyl-1-2,3,4,6,11-hexahydro-3,5,12-trihydroxy-10-methoxy-6,11-dioxo-naphtacen-1-yl 3-amino-2,3,6-trideoxy-alpha-L-lyxopyranoside hydrochlorid
Abbildung 5.2.2
Strukturformel von Mitoxantron: 1,4-Dihydroxy-5,8-bis [2-(2-hydroxyethyl amino)-ethylamino]-9,10-anthracenedion hydrochlorid
Abbildung 5.3.1
Zusammenfassung der bekannten Funktion von Thioredoxin. Thioredoxin dient auch als temporärer Elektronendonor für die Thioredoxin Peroxid Reduktase (TPx) deren genaue Funktion unbekannt ist. Eine Verbindung zu den reaktiven Sauerstoffspezien und eine Beteiligung im intrazellulären Signaltransfer ist denkbar. Tpx = Thioredoxin Peroxid Reduktase; ROS = reaktive Sauerstoffspezien; PDGF/FGF = Peptidwachstumsfaktor; TSF = Transformationswachstumsfaktor; Tr = Thioredoxinreduktase.
Abbildung 5.3.2
Funktion der FAB-Proteine: An Albumin gebundende Liganden (in diesem Fall Fettsäuren) werden alternativ über membrangebundendes FABP bzw. andere Transportproteine in die Zelle aufgenommen. Intrazellulär gelangen die Liganden zu ihren Zielorten. Der Effekt von FABP auf das Zellwachtum ist je nach Typ diametral (Mod. n. Hohoff 1998 und Glatz 1997). Alb. BP = Albumin bindendes Protein; FATP = Fettsäuretransportprotein; FAT = Fattsäuretranslokase.
Abbildung 5.3.3
Funktion der mit Stratifin eng verwandten 14-3-3 Proteine. Die Aufgabe von 14-3-3 besteht in der Regulation von einem Zielprotein, für das zwei Konformationen bestehen, die unterschiedliche Aktivitätszustände haben (mod. n. Palmgren 1998).
Abbildung 5.3.4
Vereinfachtes Schema zur Rolle von Stratifin, Cofilin, Annexin-1 und Thioredoxin im Zusammenspiel mit der der Proteinkinase C im Hinblick auf Aspekte der Chemoresistenz. PKC= Proteinkinase C; KCIP= Proteinkinase C-Inhibitor; PGP= P-Glykoprotein.
Abbildung 5.3.5
Physiologie der Aktiondepolymerisation durch die ADF/Cofilin Wirkung. Cofilin bindet an ADP-Aktin und fördert damit die Aktin Depolymerisation zu Aktin-Monomeren, die nach Phosphorylierung erneut für die Polymerisation zur Verfügung stehen. Der An- und Abbau von Aktin-Monomeren ist für alle Veränderungen der Zellmorphologie einschließlich Zellteilung, -motilität und Membranverschmelzung essentiell (mod. n. Carlier 1997). T = ATP-Aktin; D-Pi = ADP-Aktin-Phosphati; D = ADP-Aktin.
Abbildung 5.3.6
Bekannte Aspekte von Cofilin: Neben der Aktindepolymerisation verhindert Cofilin, daß PIP Profilin vom Aktin abzieht und damit eine rasche Aktinpolymerisation. Ungeklärt ist die Rolle der nukleären Signalsequenz nach Dephosphorylation von Cofilin. Eine Inhibierung diese Dephosphorylierung mündet in die Apoptose.
Abbildung 5.3.7
Schema zur Regulation und Wirkungsweise der Rho Dissoziationsinhibitoren. Die Stimuli für das GDP/GTP austauschende Protein (GEP) und dem GTPase aktivierenden Protein (GAP) sind unbekannt. Mod. n. Sasaki 1998.

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