Hunger, Thomas: Die Wirkung von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Kontraktilität isolierter adulter Kardiomyozyten der Ratte

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Platelet-activating factor (PAF)

Platelet-activating factor ist das erste in der Literatur beschriebene Phospholipid mit Mediatoreigenschaften (Benveniste et al., 1977).

Am Anfang der 70iger Jahre wurde ein von Thrombozyten freigesetzter löslicher Faktor entdeckt, welcher vasoaktive Eigenschaften zeigt (Henson et al., 1970; Siraganian et al., 1970). 1972 wurde eine Substanz beschrieben, die eine Plättchenaggregation auslöst, der „platelet-activating factor (PAF)“ (Benveniste et al., 1972). 1977 gelang es, die Struktur von PAF als 1-O-Alkyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin zu entschlüsseln (Benveniste et al., 1977). Die Strukturformel ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Struktur von
1-O-Alkyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin (PAF)
(nach Benveniste et al., 1977)

Wenig später gelang die Synthese von PAF, wobei man eine Vielzahl wirksamer Substanzen mit ähnlicher Struktur entdeckte (Demopoulos et al., 1979; Blank et al., 1979). Heterogenität, Struktur, Synthese und Wirkung von PAF werden in den nächsten Abschnitten dargestellt.

Die in Abbildung 1 gezeigte Strukturformel stellt nicht das einzig mögliche plättchenaktivierende Phospholipid dar. Zur Veranschaulichung zeigt Tabelle 1 die PAF-Nomenklatur (McManus et al., 1993). Die Substanzgruppen unterscheiden sich in den Substituenten an den drei Positionen des Glyzerins. Dabei zeigen Veränderungen in Position 1 den geringsten Wirkungsverlust, strukturelle Varianten in den Positionen 2 und 3 hingegen bewirken eine starke Reduktion der plättchenaktivierenden Wirkung.


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Tabelle 1: Nomenklatur plättchenaktivierender Phospholipide (PAF)
(nach McManus et al., 1993)

PAF

- Phospholipide mit plättchenaktivierender Wirkung, die in Position 3 einen Cholinrest haben

AGEPC (Alkyl-PAF)

- 1-O-Alkyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin

- Die Alkylkette in Position 1 wird über Kettenlänge (x) und Anzahl der Doppelbindungen (y) bestimmt als x:y-AGEPC

AGPC (Azyl-PAF)

- 1-O-Azyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin

- Bestimmung der Azylkette wie bei AGEPC

APPC (Alkenyl-PAF)

- 1-O-Alk-1´-enyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin

- Bestimmung der Azylkette wie bei AGEPC

PAF-Analoga

- Kein Cholin in Position 3

- Andere kurze Ketten in Position 2

PAF bezeichnet im weitesten Sinne Phospholipide mit plättchenaktivierenden Eigenschaften.

Die strukturelle Vielfalt von PAF wurde schon 1980 von Hanahan bei Experimenten mit IgE-sensibilisierten, basophilen Leukozyten des Kaninchens vermutet (Hanahan et al., 1980). Damals fand man zwei Arten von PAF-Molekülen: 16:0-AGEPC und 18:0-AGEPC. In nachfolgenden Versuchen wurden noch weitere, in dieser Nomenklatur als AGPC und APPC einzuordnende, Lipide entdeckt (Mueller et al., 1984).

Grundsätzlich gibt es zwei Synthesewege für PAF. Sowohl im de novo- als auch im remodeling-Syntheseweg ist das entstehende Produkt durch das Substrat definiert.

Im de novo-Syntheseweg wird durch das Enzym Phosphocholintransferase eine Phosphocholingruppe auf Position 3 des Glyzerins von Membranlipiden übertragen. Die Seitenketten 1 und 2 werden nicht durch den Syntheseweg beeinflusst, es kommt zur Synthese einer Vielzahl von Substanzen unterschiedlicher Struktur und Wirkstärke (Wykle et al., 1980).

Im remodeling-Syntheseweg kommt es über das Zwischenprodukt Lyso-PAF (2-Lysophospholipide) zur PAF-Synthese. Lyso-PAF kann einerseits aus PAF durch die PAF-Azetylhydrolase gebildet werden, andererseits durch aktivierte Phospholipase A2 aus Membranlipiden entstehen. Hier werden die Seitenketten 1 und 3 nicht beeinflusst, was wiederum zur Vielfalt der entstehenden Produkte beiträgt. Das entstandene Lyso-PAF wird dann durch die PAF-Azetyltransferase in PAF umgewandelt.


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Der erste Schritt des PAF-Abbaus ist die Deazetylierung an C-2. Da die PAF-Azetylhydrolase ubiquitär vorkommt, kann auch extrazellulär gelegenes PAF sehr schnell abgebaut werden. Die Halbwertszeit im Körper beträgt 2,5 Minuten (Graham et al., 1994).

Abbildung 2: Metabolismus von PAF
(nach Wykle et al., 1980)

Anschließend kann über die Azyltransferase ein Membranlipid gebildet werden. In Zellen mit hoher Aktivität von Phospholipase A1, z.B. in polymorphkernigen Leukozyten, wird die Fettsäure an C-1 hydrolysiert und es entstehen 1-Lyso-2-azetyl-phospholipide (Hwang, 1990). In Abbildung 2 sind PAF-Synthese und PAF-Abbau im Überblick dargestellt.

Untersuchungen am Anfang der 80iger Jahre zeigten, dass stimulierte menschliche polymorphkernige Leukozyten (PMN) 16:0- und 18:0-AGEPC freisetzen (Hanahan et al., 1980; Satouchi et al., 1983).

In weiter führenden Untersuchungen zeigte sich bald, dass aus stimulierten PMN von Mensch und Kaninchen auch andere Phospholipide der PAF-Gruppe freigesetzt werden. Zur genaueren Analyse wurde der Einbau von exogen zugeführtem [3H]-Azetat in die cholinhaltigen Phospholipide


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untersucht (Ludwig et al., 1987). Peritonealmakrophagen des Kaninchens und periphere menschliche PMN wurden mit A23187, opsoniertem Zymosan oder N-formyl-methionyl-leuzyl-phenylalanin stimuliert. Mit Hochdruck-Flüssigkeitschromato-graphie (HPLC) und Massenspektrumsanalyse wurde eine große Vielfalt an AGEPC entdeckt. Ähnliche Ergebnisse erbrachten Versuche mit PMN von Ratte, Maus und Meerschweinchen (Ramesha et al., 1987).

Auch die Freisetzung von Azyl-PAF wurde untersucht. Quantitative Analysen ergaben, dass 13 - 25 % des von humanen PMN freigesetzten PAF-Gemisches aus AGPC bestehen (Mueller et al., 1984). Dieses Ergebnis warf die Frage auf, ob initial eine viel größere Menge Azyl-PAF freigesetzt wird, als messanalytisch nachgewiesen wird, da in den stimulierten Zellen auch die PLA1 eine erhöhte Aktivität aufweist. Zur Klärung dieser Frage wurde den stimulierten Zellen Phenylmethylsulfonylfluorid, ein PLA1-Antagonist, zugesetzt. Dies führte zu einer 20-fach höheren Freisetzung von Azyl-PAF aus thrombinstimulierten menschlichen Plättchen (Touqui et al., 1985; Sturk et al., 1989). Triggiani et al. zeigten, dass mehr als 75 % des in menschlichen pulmonalen Mastzellen synthetisierten PAF aus AGPC besteht (Triggiani et al., 1992).

Die anderen Fraktionen des anfangs erwähnten PAF-Gemisches konnten nur vereinzelt entdeckt werden, quantitative Analysen wurden nicht durchgeführt.

In den Jahren nach der Entdeckung von PAF wurde hauptsächlich mit den wirkungsvollsten Substanzen gearbeitet: mit 16:0- und 18:0-AGEPC. Im weiteren Text bezieht sich das Kürzel PAF - wenn nicht anders angegeben - auf eine dieser beiden Substanzen oder deren Gemisch.


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1.2 Wirkungen und Wechselwirkungen von PAF

Die Wirkungen von PAF werden über spezifische Rezeptoren vermittelt (Valone et al., 1982, 1983 & 1988; Inarrea et al., 1984; O‘Flaherty et al., 1986; Prpic et al., 1989). Des Weiteren wurde festgestellt, dass innerhalb einer Spezies die Rezeptorendichte variieren kann. So haben Patienten mit Sepsis oder kardialen und pulmonalen Störungen einen viel höheren Gehalt an PAF in ihren Thrombozyten und auch eine erhöhte Anzahl an PAF-Rezeptoren (Diez et al., 1990).

PAF-Rezeptoren wurden auf verschiedenen Zellen und Geweben gefunden: auf glatter Muskulatur, weißen Blutzellen, Gewebsmakrophagen und in fast jedem spezialisierten Gewebe.

Studien haben gezeigt, dass G-Proteine in die Vermittlung der PAF-Wirkung involviert sind (Haslam & Vanderwel, 1982; Homma & Hanahan, 1988). Die Bindung von PAF an den Oberflächenrezeptor stimuliert GTPase-Aktivität. Gleichzeitig erhöht das Vorhandensein von GTP und Analoga die PAF-Sensitivität. Teilweise kann die PAF-Wirkung durch Pertussistoxin (PTX) blockiert werden, die Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration wird aber nicht stark davon beeinflusst (Schlondorff et al., 1989). Die partielle PTX-Sensitivität weist darauf hin, dass bei der Wirkvermittlung rezeptorabhängige inhibitorische Gi-Proteine involviert sein müssen, welche die katalytische Untereinheit der Adenylatzyklase hemmen. Es kommt zur verminderten Synthese von cAMP, die Aktivität der Proteinkinase A (PKA) sinkt.

PAF aktiviert die PLA2 (McManus et al., 1980). Das führt zur direkten Freisetzung von Arachidonsäure und Lyso-PAF. Aus der Arachidonsäure werden weiter Thromboxane, Leukotriene und Prostaglandine gebildet. Dieser Effekt lässt sich durch PTX blockieren.

Die Protein-Tyrosinkinase (PTK) wird von PAF aktiviert. PTK ist ein Enzym mit vielfältigem Wirkspektrum. Es ist in die G-Proteinkaskade eingebaut, aber auch Teil der Signalkette von Wachstumsfaktoren. Es aktiviert Phospholipasen und Phosphokinasen. Die PLC wird sowohl durch PTK als auch durch PAF selbst aktiviert (Brass et al., 1988). Dieses Enzym katalysiert die Umwandlung von Phosphoinositolbisphosphat (PIP2) zu Diazylglyzerol (DAG) und Inositoltrisphosphat (IP3). IP3 führt zur Freisetzung von Kalziumionen aus dem endoplasmatischen Retikulum, DAG aktiviert die Proteinkinase C (PKC). Auch ein weiteres Enzym, mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase (MAPK), wird durch PAF aktiviert.

Sowohl MAPK als auch PTK sind in die Regulation der Genexpression von Mediatoren involviert. PAF steigert über diese beiden Enzyme die Expression von Protoonkogenen sowie die Produktion von IL-1, IL-3, IL-6 und TNF. PAF steigert außerdem die Expression seines eigenen Rezeptors (Chao & Olson, 1993).

In Abbildung 3 ist ein vereinfachtes Schema der bisher bekannten molekularen Wirkungen von PAF abgebildet.


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Abbildung 3: Rezeptorvermittelte Wirkungen von PAF
(nach Izumi & Shimizu, 1995; PG-Prostaglandine; LT-Leukotriene;
TX-Thromboxane; MAPKK-Mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase;
AC-Adenylatzyklase, PTK-Proteintyrosinkinase)

Bei der Untersuchung der Einwirkung von Nicht-AGEPC auf den Rezeptor wurde keine hohe Spezifität für 1-Azyl-2-azetyl-GPC festgestellt. Auch war die Wirkung 300-fach niedriger als die von AGEPC (Satouchi et al., 1985). Es wurde vermutet, dass die beobachtete Wirkung nicht über den PAF-Rezeptor zustande kommt, da keine direkte Interaktion nachgewiesen werden konnte.

1981 bezeichnete Benveniste die von ihm benannte Substanz als „den derzeit stärksten bekannten Vasokonstriktor“ (Benveniste et al., 1981). Neben der vasokonstriktorischen Wirkung führt PAF zu anaphylaktischer Hypersensibilisierung, Bronchokonstriktion und kataboler Stoffwechsellage (Koltai et al., 1991). Ein Auszug aus den bekannten PAF-Wirkungen ist in Tabelle 2 wiedergegeben.


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Tabelle 2: Wirkungen und Wechselwirkungen von PAF (nach Koltai et al., 1991)

Struktur

PAF-Wirkung

Thrombozyten

-Plättchenaggregation und Erhöhung der [Ca2+]i

-Freisetzung von Histamin, Serotonin und PAF

PMN

-Chemotaxis auf PAF

-Verstärkte Elastase-Ausschüttung aus sauren Granula

-Verbesserte Migration

-PAF-Synthesestimulation, Freisetzung von Arachidonsäure und deren Metaboliten

-Geringe Wirkung von spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten

Eosinophile Granulozyten

-Zellakkumulation in der Bronchialschleimhaut

-Ausschüttung von Arachidonsäure und Leukotrienen

-Verbesserte Chemotaxis

-Geringe Wirkung von spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten

Monozyten/ Makrophagen

-Freisetzung von Thromboxan A2 durch rezeptorfreien Zellkontakt

-Starke, irreversible PAF-Wirkung mit Freisetzung von Arachidonsäure und deren Folgeprodukten sowie PAF-Neusynthese

-Circulus vitiosus durch Effekte intrazellulären PAFs

Endothelzellen

-Erhöhung der Flüssigkeitssequestration in das umliegende Gewebe

-Freisetzung von Entzündungsmediatoren mit vermehrter Plättchenaggregation, Migration von Entzündungszellen

-Starke PAF-Produktion

Gesamt-organismus

-Generalisierte Vasokonstriktion

-Modulation der pulmonalen Hyperreaktivität, Bronchokonstriktion

-Katabole Stoffwechsellage

-In hohen Dosen Ausbildung von Herz-, Nieren-, Darm- und Pankreasinfarkten, ischämischem Insult und respiratorischer Insuffizienz


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1.3 Kardiale Wirkung von PAF

Das Herz ist ein stark durchblutetes Organ. Zirka 90 % des Myokardvolumens besteht aus Herzmuskelzellen, die übrigen 10 % verteilen sich auf Bindegewebe und Gefäße. In akuten inflammatorischen und ischämischen Situationen ist das Herz aufgrund seines stetig hohen Blutbedarfs und seines Gefäßreichtums besonders betroffen.

Eine akute Vasokonstriktion wurde in In-vitro-Studien am isolierten Herzen nachgewiesen (Goldstein et al., 1981; Stewart & Piper, 1986; Stahl & Lefer, 1987; Felix et al., 1990; Abete et al., 1992; Mentz et al., 1992). In sehr niedrigen Dosen wurden sowohl Vasodilatation (Feuerstein et al., 1984) als auch Vasokonstriktion (Jackson et al., 1986; Metha et al., 1986) beobachtet. In diesen Studien konnte aber auch gezeigt werden, dass die Vasodilatation kein direkter PAF-Effekt und thrombozytenabhängig ist.

Bei Ratten, Schweinen und Hunden lässt sich der Effekt von PAF durch Indomethazin, Lipoxygenase-Inhibitoren und PAF-Antagonisten wie BN52021 und Ginkgolid B stark abschwächen. Bei Meerschweinchen dagegen war der PAF-Effekt gegen TXA2-Antagonisten, LT-Antagonisten und Zyklooxygenase-Inhibitoren stabil und nur durch spezifische PAF-Rezeptorantagonisten abzuschwächen. Bei dieser Spezies muss es also einen direkten PAF-Wirkort an der Gefäßmuskulatur geben (Saeki et al., 1985; Tanniere et al., 1989; Stahl et al., 1987).

Braquet & Hosford (1989) untersuchten das Verhalten isolierter Koronararterien-Streifen und fanden heraus, dass unter Hypoxie eine biphasische Reaktion stattfindet: eine schnelle Kontraktion gefolgt von einem lang anhaltend erhöhten Tonus. Dieser Effekt ließ sich durch Präinkubation mit PAF verstärken.

Zur PAF-Wirkung auf das Myokard direkt gibt es in der Literatur unterschiedliche Angaben. Manche Beobachtungen zeigen positive (Kamitani et al., 1984; Nakaya & Tohse, 1986), andere negative (Levi et al., 1984) oder auch bivalente (Camussi et al., 1984; Alloatti et al., 1986; Diez et al., 1990) inotrope Reaktionen des Herzmuskels.

Versuche von Robertson et al. an humanen Myokardstreifen zeigten einen konzentrationsabhängig negativ inotropen Effekt, der im Verlauf von Minuten eintrat (Robertson et al., 1987, 1988).

1.4 Wirkung von PAF auf isolierte Kardiomyozyten

Herzarbeit drückt sich in Pumpleistung pro Zeit oder Anspannungsgeschwindigkeit der Myokardwand aus. Das ist das Ergebnis des Kontrahierens der Kardiomyozyten als kleinster funktioneller Einheit.


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Das Myokard besteht aus einem Geflecht von Zellen, welche durch die Glanzstreifen sowohl voneinander getrennt als auch fest miteinander verbunden sind. Die kontraktionsfähigen Fibrillen in den Muskelzellen sind fest in diesen Scheiben verankert. Kommt es zur elektrischen Erregung des Herzens, werden die Impulse über das Erregungsleitungssystem zu allen Herzmuskelzellen weitergeleitet. Als Folge kontrahieren die Zellen und es kommt zu einer Verkürzung und Verdickung des Myokards. Für die Kontraktion sind zwei intrazelluläre Faktoren wichtig: Kalziumionen und ATP.

Kommt es zur Erregung der Zelle, wird die Membran depolarisiert. Spannungsabhängige Kalziumkanäle öffnen sich, es kommt zu einem Einstrom von Kalziumionen sowohl aus dem Extrazellularraum als auch aus den sarkoplasmatischen Zisternen in das Zytosol (Systole). Hier binden die Ca2+-Ionen an das Tropomyosin. Durch Konfigurationsänderungen werden Bindungsstellen für Myosin auf dem Aktinfilament freigelegt. Unter ATP-Verbrauch kommt es jetzt zu aktiven Bewegungen des Myosinköpfchens und zu Sarkomerverkürzung, bis die Kalziumionen wieder aus der Zelle entfernt sind (normale Kontraktion) oder bis alles ATP verbraucht ist (Ischämie). In der nun folgenden Relaxationsphase (Diastole) kommt es zu einem Zurückgleiten der Filamente und zu einer Regeneration von ATP.

Für die Stärke und Dauer einer Kontraktion ist - ausreichende Energiezufuhr vorausgesetzt - die Stärke des Kalziumeinstromes von entscheidender Bedeutung. Weiterhin bedingt die Affinität der Kalziumionen zu den Bindungsstellen an den kontraktilen Filamenten die Stärke der Kontraktion.

PAF-Effekte auf Kardiomyozyten wurden erstmals von Massey et al., 1991 untersucht. Hier wurde bei neonatalen kultivierten sowie frisch isolierten adulten Kardiomyozyten eine Verringerung der Zellverkürzung festgestellt (Massey et al., 1991). Die beobachteten Effekte erforderten hohe PAF-Konzentrationen (10-8-10-6 M), waren aber konzentrationsabhängig.

Delbridge et al., (1993) stellten an frisch isolierten Kardiomyozyten der adulten Ratte einen konzentrationsabhängig negativen PAF-Effekt auf die Kontraktion fest. Hier lagen die verwendeten PAF-Konzentrationen im Bereich von 10-11-10-7 M. Diese Arbeitsgruppe konnte nachweisen, dass der Einsatz von WEB2086, einem spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten, eine signifikante Reduktion des PAF-Effektes bewirkt (Delbridge et al., 1993). WEB2086 selbst hatte einen positiv inotropen Effekt.

An fetalen humanen und Hühnerkardiomyozyten wurde mittels Voltage-Clamp-Technik eine PAF-induzierte Erhöhung des Kalziumeinstromes festgestellt (Bkaily et al., 1996). Es wurden PAF-Konzentrationen von 10-9-10-7 M verwendet, der Effekt ließ sich durch den Einsatz des spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten WEB2170 inhibieren. Es wurde auch eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration erwähnt, diese unter Anwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes gewonnenen Daten wurden aber noch nicht detailliert veröffentlicht.


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1.5 Problemstellung

Bei der Untersuchung am isolierten Herzen wird es immer Differenzierungsprobleme geben, ob die beobachteten Effekte bestimmter Pharmaka auf einer Beeinflussung der Herzkranzgefäße oder der Herzmuskelzellen beruhen.

Bisher wurden Effekte von PAF an isolierten Herzmuskelzellen nur anhand der Zellverkürzung dargestellt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein System zur simultanen Messung von Zellverkürzung und Kalziumtransient am isolierten Kardiomyozyten zu etablieren. So kann man einerseits die PAF-Wirkung an den Koronararterien ausschließen, andererseits ist es möglich zu differenzieren, ob die bekannte negativ inotrope Wirkung von PAF auf einer Inhibition des Kalziumtransienten beruht oder ob es durch PAF zu einer Desensibilisierung der kontraktilen Filamente kommt.


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Mon Sep 23 10:39:55 2002