Hunger, Thomas: Die Wirkung von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Kontraktilität isolierter adulter Kardiomyozyten der Ratte

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Isolation von Herzmuskelzellen

Zur Gewinnung isolierter Kardiomyozyten wurde eine retrograde enzymatische Perfusion von Rattenherzen durchgeführt. Dies geschah mit einer sogenannten Langendorff-Anlage (Abbildung 4, verändert nach Langendorff, 1895).

Aufbau und Vorbereitung der Anlage

Abbildung 4: Perfusionsapparatur zur Isolierung adulter Kardiomyozyten
(modifiziert nach Langendorff, 1895 und Dendorfer, 1990; A-KHP, B-Enzymlösung, BF-Blasenfalle,
C-Hochkaliumpuffer, D-Druckausgleichsbehälter, DK-Druckkontrolle, DR-Druckregulation, E-
Wärmetauscher, F-Flussmessung, G-Gasflasche, K-Konus, RP-Rollenpumpe, T-Trichter, 1,2- Begasungsregler)

Die Anlage wurde wie abgebildet mit geschlossenen Klemmen aufgebaut. Erster Schritt war die Füllung des Schlauches vom Gefäß C zum Konus K. Danach begann die Begasung mit Carbogengas (95% O2 und 5% CO2) über den Druckausgleichsbehälter D, so dass sich in den Gefäßen A und B ein Druck aufbaute. Nun wurden erst der Schlauch von Gefäß B und dann der von Gefäß A zum Erwärmer E gefüllt. Anschließend wurden aus dem Gefäß A noch der ganze Erwärmer und die Blasenfalle BF gefüllt. Der Umwälzthermostat wurde bei 37 °C aktiviert. Anschließend wurde in den Gefäßen A und B eine gleichmäßige Begasung über die Klemmen 1 und 2 eingestellt. Nach einer Begasung von 30 Minuten war die Anlage betriebsbereit.


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Enzymatische Isolation von Kardiomyozyten

Für die Versuche wurden 200 - 250 g schwere, weibliche Wistar-Ratten aus der Zucht des Tierstalls der Charité verwendet. Die Tiere wurden durch Nackenschlag getötet. Nach Eröffnung des Thorax wurde das Herz bis zum Stillstand mit auf 4 ºC temperierter physiologischer Kochsalzlösung umspült, weiträumig exzidiert und in ein Glas mit 4 ºC physiologischer Kochsalzlösung gebracht. Die Aorta wurde schonend freipräpariert, unterhalb des Abgangs des Truncus brachiocephalicus durchtrennt und mit einem Faden an dem PE-Konus der Perfusionsapparatur angebracht. Nun begann die Perfusion mit 37 ºC Krebs-Henseleit-Puffer (KHP), wobei es nach zirka 1 Minute zur Kardioplegie kam. Die Zusammensetzung der Puffer wird in Kapitel 2.6 erläutert. Der Perfusionsdruck wurde während der gesamten Versuchsdauer auf 50 mbar gehalten. Das abtropfende Perfusat wurde verworfen. Nach 8-minütiger Perfusion mit KHP wurde auf die Kollagenaselösung umgeschaltet.

Während der 50-minütigen Enzymperfusion wurde über den Trichter T das Perfusat gesammelt und mit Hilfe der Pumpe P in das Gefäß B rezirkuliert. Dabei musste die Pumpleistung der steigenden Perfusionsrate bei Bedarf angepasst werden.

Nach der Enzymperfusion schloss sich ein Waschschritt an. Dazu wurde die Enzymlösung aus dem Herzen bei 25 °C mittels Hochkaliumpuffer ausgewaschen. Nach 5 Minuten war dieser Schritt abgeschlossen.

Das Herz wurde nun in eine Petrischale überführt, mit einem Skalpell von Vorhöfen, großen Gefäßen und Bindegewebe freipräpariert und in zirka 1 mm große Stücke zerschnitten. Dieser Gewebebrei wurde in 10 ml Hochkaliumpuffer bei Raumtemperatur in einem Trichter mit Luft umgewirbelt. Nach 5 Minuten wirbeln wurden die stark dissoziierten Zellen durch ein Netz mit einer Maschenweite von 200 µm gefiltert und bei 4 ºC aufbewahrt.

Mit der beschriebenen Perfusionsapparatur konnten aus Rattenherzen in 90 Minuten Präparate mit hoher Muskelzelldichte gewonnen werden. Dabei zeigte sich die Verwendung der Kollagenase als am wirkungsvollsten. Der Einsatz von Albumin und die Zugabe von 10 mM K+-Ionen zum KHP verbesserten die Zellausbeute und machten die Ergebnisse reproduzierbar. In 47 Isolationen konnten je 4,9 ± 0,3 x 106 Zellen pro Herz gewonnen werden.


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Abbildung 5: Relativer Perfusionsfluss während der Isolation (n=47)

Während der Isolation wurde der Fluss der Enzymlösung fortlaufend registriert. In den ersten 10 Minuten der Perfusion mit Enzymlösung kommt es zu einer relativen Abnahme des Flusses, was vermutlich auf ein Ödem des Endothels, Koronarkonstriktion und auf extravasale Sequestration von Flüssigkeit zurückzuführen ist. Die nachfolgende Phase ist durch eine ansteigende Perfusion aufgrund der zunehmenden Gewebszerstörung gekennzeichnet.

In Abbildung 5 sind die unter der Perfusion gemessenen relativen Koronarflusswerte dargestellt.

2.2 Beladung der Zellen mit FLUO-3

Nach einer Stunde Ruhe bei 4 ºC konnten die Zellen in die Experimentierkammern (Nalgene Nunc Int. Corp., Naperville, IL, U.S.A.) überführt werden. Diese wurde zuvor eine Stunde lang mit 6 µg pro cm2 Laminin (Harbor Bio-Products, Norwood, MA, U.S.A.) inkubiert. Es wurden zirka 600 Zellen pro cm2 eingesetzt und mit Hochkaliumpuffer ein Kammervolumen von 600 µl eingestellt. Die Zellen wurden nun für 30 Minuten mit FLUO-3 AM (Azetomethylester), einem Kalzium-Fluoreszenzfarbstoff, in einer Konzentration von 4 µM im Dunkeln inkubiert. In dieser Zeit drang der Farbstoffester in die Zellen ein und wurde dort von Esterasen gespalten. Die polaren Spaltprodukte konnten nun nicht mehr aus der Zelle herausdiffundieren. Danach wurde die Flüssigkeit aus der Kammer abgesaugt und mit dem Versuchspuffer erneut ein Badvolumen von 600 µl eingestellt. Nach weiteren 30 Minuten Inkubationszeit konnten die Zellen für Versuche benutzt werden.


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2.3 Aufbau der Perfusionskammer und Feldstimulation

Abbildung 6: Perfusionskammer zur Vermessung isolierter
Kardiomyozyten am konfokalen Mikroskop
(E-Elektroden zur Feldstimulation, M-Objektiv des Mikroskops)

Für die Versuche wurde eine Perfusionskammer benutzt, wie sie in Abbildung 6 dargestellt ist. Der Zufluss erfolgte verwirblungsarm unter der Flüssigkeitsoberfläche, durch die Höhe der Abflusskanüle wurde ein Kammervolumen von 600 µl eingestellt. Die elektrische Stimulation der Zellen erfolgte über die Elektroden mit einer Spannung von 10 - 30 V, einer Frequenz von 0.5 Hz und einer Pulsdauer von 2 ms. Die Spannung lag jeweils 5 V über der minimalen Erregungsspannung. Die Myozyten wurden mit 1 ml Versuchspuffer pro Minute bei 25 °C superfundiert. Diesem System wurden nun die zu untersuchenden Substanzen zugesetzt.

Durch das beschriebene Isolationsprotokoll wurde eine so reine Herzmuskelzellfraktion gewonnen, dass störende Effekte anderer Zellen in der Messkammer ausgeschlossen werden konnten.


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2.4 Konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM)

Ziel des Messaufbaus sollte es sein, die in der isolierten Zelle vorliegende intrazelluläre Kalziumkonzentration ([Ca2+]i) simultan zur Zellverkürzung zu bestimmen. Dafür bietet sich das Verfahren der konfokalen Mikroskopie an, welches in Abbildung 7 illustriert ist.

Abbildung 7: Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie
(nach Engelhard & Knebel, 1993)

In der Fluoreszenzmikroskopie werden solche Objekte abgebildet, die sich spezifisch anregen lassen. Streulicht aus verschiedenen Ebenen führt zu Unschärfe. Das konfokale Verfahren der mikroskopischen Abbildung schaltet diese Probleme aus: das aus der Fokusebene emittierte Licht wird durch einen Strahlteiler in Richtung des Punktlichtdetektors umgeleitet. Bei exakter Einstellung der Ebenen wird hier nur noch das direkt aus der Brennebene stammende Licht nachgewiesen, alle anderen Strahlen werden ausgeblendet. Die Rasterung des Objekts ermöglicht eine schonendere Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes, die Verwendung monochromatischen Lichtes verringert die benötigte Lichtstärke. Die Verwendung eines akusto-optischen Detektors (AOD) ermöglicht eine vergleichsweise gute zeitliche Auflösung. Letztendlich hängt die Schichtdicke nur von der Wellenlänge des verwendeten Lichtes und der Größe der Blenden ab.


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Bei den Experimenten zur vorliegenden Arbeit kam ein Odyssey XL konfokales Laserrastermikroskop (Noran Instruments, Middleton, WI, U.S.A.) zur Anwendung. Die Experimentalkammern wurden auf einem Nicon Diaphot TDM Mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) angebracht und mit einem 40-fach Immersionsölobjektiv (plan apo X40, NA 1.0) betrachtet und vermessen. Die Messdaten wurden auf der Festplatte einer Indy-Workstation (Silicon Graphics, Mt. View, CA, U.S.A.) gespeichert und ausgewertet (XMGR-Tool und 2D-Aquisition-Tool, Silicon Graphics). Die Zellen wurden mit der 488 nm-Linie eines Argonlaser angeregt, die Fluoreszenzemission wurde bei Wellenlängen von mehr als 515 nm mit einer Frequenz von 30 Bildern pro Sekunde detektiert.

In der Perfusionskammer waren die isolierten Zellen unter Feldstimulation bis zu 20 Minuten anregbar und zeigten eine gleichbleibende Kontraktion, wohingegen der Kalziumtransient geringfügig abnahm. Letzteres war bei erhöhter Laserintensität vermehrt zu beobachten, so dass es sich hier um Bleicheffekte handeln musste. Bei Anwendung einer konstanten Laserleistung von 13 % der maximalen Energie waren diese Effekte minimal und reproduzierbar. Als Kriteritum für den Beginn eines Messvorgangs wurde definiert, dass die avisierte Zelle 80 Sekunden lang konstant stimulierbar sein musste und in dieser Zeit keine Veränderungen des Kalziumtransienten auftreten durften. Dann war davon auszugehen, dass die Zelle über weitere 10 Minuten konstant stimulierbar sein würde.

2.5 Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration [Ca2+]i

Die vorbereiteten Zellen - wie in Kapitel 2.2 beschrieben - wurden in den Strahlengang des Mikroskops eingebracht und fokussiert. Nach Einbringen der Elektroden begann die Stimulation. Die Kontrolle der Kontraktionen erfolgte mittels konventioneller Durchlichtmikroskopie. Unmittelbar vor Beginn der Registrierungen wurde der Strahlengang des CLSM eingekoppelt.

Die intrazelluläre Kalziumkonzentration ([Ca2+]i) konnte aus den fortlaufend bestimmten Fluoreszenzwerten errechnet werden. Dazu musste die Zelle am Ende der Messung zur maximalen [Ca2+]i gebracht werden. Das gelang über den Einsatz von 1 µM 4-Bromo-Kalziumionophor (A23187). Diese Substanz ermöglicht einen maximalen Einstrom von Kalzium in die Zelle. Zum Erreichen einer minimalen [Ca2+]i wurden Konzentrationen von 100 mM Manganchlorid und 0,128 mM Digitonin verwendet. Die Registrierung der Fluoreszenzwerte eines Kontrollversuchs mit anschließender Eichung sowie Einzelbilder der observierten Zelle in den einzelnen Fluoreszenzzuständen sind in Abbildung 8 wiedergegeben.


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Abbildung 8: Kontinuierliche Fluoreszenzmessung und Eichung
einer Einzelzelle (A), Bild einer Einzelzelle in diastolischer (B),
maximaler (C) und minimaler (D) Fluoreszenz


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Der verwendete Farbstoff FLUO-3 hat im Komplex mit Ca2+ eine Gleichgewichtskonstante Kd von 400 nM (Minta et al., 1989). Man kann die intrazelluläre Kalziumkonzentration aus

[Ca2+]i = Kd x (F - Fmin) / (Fmax - F)

errechnen, wobei F die am zu errechnenden Zeitpunkt vorkommende Fluoreszenz ist, Fmax die maximal erreichte Fluoreszenz und Fmin die minimale Fluoreszenz (Minta et al., 1989; Cannell et al., 1994).

Aus der Differenz zwischen systolischer und diastolischer intrazellulärer Kalziumkonzentration wurde der Kalziumtransient errechnet, der somit die Änderung der [Ca2+]i während der Kontraktion darstellt.

Bei den von uns durchgeführten Untersuchungen waren die basalen intrazellulären Kalziumkonzentrationen systolisch 524 ± 33 nM und diastolisch 123 ± 16 nM (jeweils n=30). Bei den basalen Untersuchungen wurde eine konstante periodische Schwankung des Kalziumtransienten festgestellt. Hier handelt es sich um eine mit der Periodendauer von 41 Sekunden sinusförmige Veränderung der Amplitude des Kalziumtransienten. Diese war in allen Zellen reproduzierbar, allerdings in unterschiedlich starker Ausprägung. Aufgrund dieser Beobachtung wurde die Messung des Kalziumtransienten immer im Gipfelpunkt der Schwingung durchgeführt. In Abbildung 8 ist diese Schwingung zu erkennen.

2.6 Simultane Bestimmung von Kontraktion und [Ca2+]i

Für die gleichzeitige Bestimmung von [Ca2+]i und Zellverkürzung wurden aus der fortlaufenden Registrierung alle zwei Minuten digitale Bildsequenzen von je 120 Bildern (640 x 480 Pixel) von der zu vermessenden Zelle angefertigt. Die Bestimmung der Zellverkürzung erfolgte mittels der 2D-Software von Silicon Graphics (2D-Aquisition-Tools). Die basale Zelllänge war 112 ± 2 µm, die Zellverkürzung 5,2 ± 0,2 % (jeweils n=30).

Die zeitgleichen Änderungen der [Ca2+]i konnten aus der Bildsequenz wie in Kapitel 2.5 beschrieben errechnet werden.

Die Datensätze der Kontraktionen konnten aufgrund der technischen Gegebenheiten nur alle 2 Minuten erhoben werden, dazwischen wurde aus der fortlaufenden Registrierung noch die minütliche [Ca2+]i berechnet.


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2.7 Statistische Auswertung

Um die individuellen Zellunterschiede in basaler [Ca2+]i und Zelllänge bei der Auswertung zu nivellieren, wurden alle Daten als relative Werte angegeben. Dazu wurde jeweils die Differenz aus systolischem und diastolischem Wert (Kalziumtransient bzw. Zellverkürzung) gebildet und als Prozent des am Messbeginn ermittelten Ausgangswertes wiedergegeben. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler wiedergegeben. Die Signifikanztestung erfolgte mit dem One Way ANOVA-Test, wobei alle Werte p<0.05 als signifikant gewertet wurden.

2.8 Reagenzien und Puffer

In Tabelle 3 sind alle verwendeten Puffer in ihrer Zusammensetzung aufgezeigt. Soweit nicht anders erwähnt, wurden die Substanzen von SIGMA Chemicals, Deisenhofen, Deutschland bezogen.

Tabelle 3: Zusammensetzung der verwendeten Puffer

Substanzen

( in mM )

modifizierter Krebs-Henseleit-Puffer (KHP)

Hochkaliumpuffer

Versuchspuffer

NaCl

120

 

117

Natriumpyruvat

 

5

 

KCl

8,8

115

2,8

MgSO4

1,1

 

 

MgCl2

 

4

0,6

KH2PO4

1,2

5

1,2

Glukose

8,3

20

20

Taurin

20

20

 

NaHCO3

24,8

 

 

Creatin

10

 

 

Ribose

4

 

 

Adenin

0,01

 

 

Allopurinol

0,1

 

 

EGTA

 

0,5

 

HEPES

 

20

10

CaCl2

 

 

1,2

Eingestellter pH-Wert

7,4 mit HCl

7,3 mit KOH

7,3 mit NaOH


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Als Digestionslösung wurde 50 U/ml Kollagenase Typ CLS II (Worthington, Freehold, NJ, U.S.A.) in KHP verwendet. Der Enzymlösung wurde 0,23 Vol.% Rinderalbumin (BSA) zugesetzt.

Die Beschichtung der Messkammern erfolgte mit Maus-Laminin (Harbor Bio-Products, Norwood, MA, U.S.A.).

4 µM FLUO-3 AM in Hochkaliumpuffer wurde zur Farbstoffbeladung der Zellen verwendet. Eine Stammlösung von 1 mM Fluo-3 AM wurden in DMSO aliquotiert.

1 µM 4-Bromo-Kalziumionophore (A23187) wurde zum Erreichen der maximalen Fluoreszenz verwendet, 100 mM Manganchlorid und 0,128 mM Digitonin wurden zum Erreichen der minimalen Fluoreszenz verwendet (siehe auch Abbildung 8).

Als Testsubstanzen kamen Isoprenalin und Verapamilhydrochlorid zur Anwendung.

Effektorsubstanz war PAF 16:0-AGEPC. Eine Stammlösung von 10 mM PAF wurden in DMSO aliquotiert und bei -80 °C gelagert.

Als spezifischer PAF-Antagonist wurde WEB 2170 (5 - ( 2 - chlorophenyl ) - 3,4 -dihydro - 10 - methyl - 3 - ( ( 4-morpholinyl ) karbonyl ) - 2H,7H - zyklopenta ( 4,5 ) thieno [3,2-f] [1,2,4] triazolo - [4,3-a] [1,4] diazepin) eingesetzt (Boehringer Ingelheim, Heidelberg, Germany).


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Mon Sep 23 10:39:55 2002