Hunger, Thomas: Die Wirkung von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Kontraktilität isolierter adulter Kardiomyozyten der Ratte

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Kontrolle und Modulation des Systems

Zur Charakterisierung des entwickelten Messsystems war es notwendig, die kontrahierenden Zellen auf ihre Funktion und auf ihr Ansprechen auf die externe Verabreichung von Testsubstanzen hin zu untersuchen. Die gute Grundfunktion der Zellen ist per se durch eine stabile Kontraktion über mehr als 10 Minuten nachgewiesen. Als Testsubstanzen wurden Isoprenalin und Verapamil gewählt, weil es zu beiden Medikamenten gut dokumentierte Wirkungsspektren gibt, so dass ein Vergleich der erzielten Ergebnisse mit denen internationaler Arbeitsgruppen möglich ist.

Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient und Zellverkürzung

Isoprenalin entfaltet seine spezifische positiv inotrope Wirkung durch den beta1-Rezeptor. Es kommt zu einem Anstieg intrazellulären cAMPs, dies führt über Zwischenschritte zur Aktivierung der Kalziumkanäle, die während der systolischen Erregung der Zelle mehr und schneller Kalzium einschleusen, dieses dann aber in der Diastole auch wieder schneller aus der Zelle transportieren.

Der Effekt von Isoprenalin auf die isolierte Zelle tritt sofort ein. Unmittelbar nach Beginn der Superfusion stiegen sowohl Kalziumtransient als auch Zellverkürzung an und stabilisierten sich dort nach zirka 40 Sekunden. Erste signifikante Effekte wurden bei einer Konzentration von 10-9 M beobachtet, der gemessene Maximaleffekt erreichte bei 10-7 M Isoprenalin 252 ± 11 % des basalen Kalziumtransienten und 169 ± 10 % der basalen Zellverkürzung. In Abbildung 9 sind die Effekte verschiedener Isoprenalinkonzentrationen, in Tabelle 4 die gemessenen Zahlenwerte dargestellt.

Tabelle 4: Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient und Zellverkürzung (p<0.05)

Konzentration

von Isoprenalin

Veränderungen relativ zum Untersuchungsbeginn

Kalziumtransient

Zellverkürzung

10-9 M

115,0 ± 2,5 % (n=6)

127,3 ± 4,1 % (n=6)

10-8 M

181,1 ± 13,8 % (n=7)

153,7 ± 6,4 % (n=6)

10-7 M

252,2 ± 10,6 % (n=6)

168,9 ± 10,2 % (n=7)


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Abbildung 9: Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient und
Zellverkürzung isolierter Kardiomyozyten
(*: p<0.05 versus Basalwert)

Hier zeigt sich, dass die relative Beeinflussung des Kalziumtransienten fast immer größer ist als die der Zellverkürzung. Das konnte auch bei anderen Messreihen beobachtet werden.

Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient und Zellverkürzung

Verapamil ist ein herzwirksamer Kalziumkanalblocker. Er wirkt von extrazellulär an den Kalziumkanälen und verhindert deren Öffnung. Der systolische Kalziumeinstrom wird also verringert. Da diese Ionen die Freisetzung von Kalzium aus dem sarkoplasmatischen Retikulum triggern, wird hier zusätzlich ein intrazellulärer Effekt erzielt. Das führt zu negativer Inotropie, Chronotropie und Dromotropie.


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Auch der Verapamileffekt setzte sofort ein und erreichte nach zirka 20 Sekunden ein stabiles Niveau. Zur Anwendung kamen Verapamilkonzentrationen von 1, 2, 4 und 6 µM. Signifikante Effekte wurden ab 1 µM Verapamil gemessen, bei 4 µM war ein Effekt von 36 ± 4 % des basalen Kalziumtransienten und 51 ± 2 % der basalen Zellverkürzung erreicht. Der Einsatz von 6 µM Verapamil bewirkte eine vollständige Hemmung der Kontraktion. Auch bei dieser Messreihe - in Abbildung 10 dargestellt - sieht man deutlich, dass der Kalziumtransient relativ mehr von dem Effekt betroffen ist als die Zellverkürzung. In Tabelle 5 sind die Wirkungen von Verapamil in Zahlenwerten aufgelistet.

Tabelle 5: Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient
und Zellverkürzung (p<0.05)

Konzentration

von Verapamil

Veränderungen relativ zum Untersuchungsbeginn

Kalziumtransient

Zellverkürzung

1 µM

72,9 ± 2,2 % (n=7)

78,2 ± 1,5 % (n=6)

2 µM

47,5 ± 2,1 % (n=8)

65,4 ± 4,6 % (n=8)

4 µM

35,5 ± 4,1 % (n=8)

51,0 ± 2,4 % (n=8)

6 µM

0 % (n=7)

0 % (n=7)


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Abbildung 10: Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient und
Zellverkürzung isolierter Kardiomyozyten
(*: p<0.05 versus Basalwert)


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3.2 Effekt von PAF auf Kalziumtransient und Zellverkürzung

Aus der Literatur ist bekannt, dass PAF seine Wirkung an den Kardiomyozyten sehr langsam entfaltet (Massey et al., 1991; Delbridge et al., 1993). In Vorversuchen wurde ermittelt, dass PAF sein Wirkungsmaximum nach 6 - 8 Minuten erreicht hat.

Effekt von PAF auf die Einzelzelle

Bei den Messungen der Wirkung von PAF auf die isolierte Herzmuskelzelle wurden minütlich die [Ca2+]i und zweiminütlich die Zellverkürzung bestimmt. Die Wirkung von PAF erreichte nach 6 - 8 Minuten ein stabiles Niveau. In Abbildung 11 ist der zeitabhängige Effekt von 10-8 M PAF auf eine untersuchte Einzelzelle dargestellt.

Ein Auswaschen des Effektes von PAF durch anhaltende Superfusion mit Versuchspuffer gelang nicht.

Systematische Messung des Effekts von PAF

In Vorversuchen wurde der Konzentrationsbereich ermittelt, in dem PAF eine messbare Wirkung auf die isoliert kontrahierende Einzelzelle hat. Im Ergebnis wurden PAF-Konzentrationen von 10-12 M, 10-10 M und 10-8 M eingesetzt. Höhere Konzentrationen führten bei den Zellen zu Hyperkontraktion oder inhibierten die Erregung, niedrigere Konzentrationen zeigten keine Wirkung. Ab einer Konzentration von 10-12 M PAF wurden signifikante Wirkungen beobachtet, die bei 10-8 M PAF ihr Maximum erreichten. Der dort beobachtete Maximaleffekt nach 8 Minuten betrug 48 ± 6 % des basalen Kalziumtransienten und 50 ± 1 % der basalen Zellverkürzung. In Abbildung 12 ist der Effekt verschiedener PAF-Konzentrationen auf den Kalziumtransienten, in Abbildung 13 auf die Zellverkürzung, dargestellt. Insgesamt wurde eine konzentrationsabhängige negativ inotrope Wirkung beobachtet. Dahingegen sanken in den 8 Minuten der Messung die basale Werte des Kalziumtransienten auf 97 ± 3 % und der Zellverkürzung auf 97 ± 2 %. In Tabelle 6 sind die Werte der nach 8 Minuten erreichten Veränderungen aufgelistet.


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Abbildung 11: Zeitwirkungsverlauf von PAF 10-8 M
auf Kalziumtransient (A) und Zellverkürzung (B) an der Einzelzelle


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Abbildung 12: Zeitwirkungsverlauf von PAF auf den Kalziumtransienten
(*: p<0.05 versus Kontrollkurve)


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Abbildung 13: Zeitwirkungsverlauf von PAF auf die Zellverkürzung
(*: p<0.05 versus Kontrollkurve)


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Tabelle 6: Zeitwirkungsverlauf von PAF auf Kalziumtransient
und Zellverkürzung (p<0.05 versus Basalwerte)

Konzentration

von PAF

Maximaleffekt nach 8 Minuten

relativ zum Untersuchungsbeginn

Kalziumtransient

Zellverkürzung

0 (Basalwert)

96,8 ± 1,3 % (n=6)

96,5 ± 0,7 % (n=6)

10-12 M

82,9 ± 2,5 % (n=5)

89,8 ± 2,1 % (n=5)

10-10 M

58,8 ± 2,2 % (n=6)

67,9 ± 2,3 % (n=6)

10-8 M

48,1 ± 2,8 % (n=5)

49,9 ± 0,5 % (n=5)

3.3 Antagonisierung der PAF-Wirkung durch WEB2170

Ziel weiterer Messungen war es festzustellen, ob durch den Einsatz spezifischer PAF-Rezeptorantagonisten eine Inhibition der PAF-Wirkung möglich ist. Der eingesetzte PAF-Rezeptorantagonist war WEB2170. Durch Vorversuche wurde ermittelt, dass an der isolierten Zelle eine Konzentration von 10-7 M WEB2170 allein geringe Eigenwirkungen zeigt. Diese bestanden in einem leicht negativen Einfluss auf die Entwicklung des Kalziumtransienten (90 ± 5 %) und einem deutlich positiven Einfluss auf die Zellverkürzung (113 ± 5 %). Im Versuchsablauf wurde 30 Sekunden nach Beginn der Superfusion mit WEB2170 die Superfusion mit PAF gestartet. Der Einsatz von 10-7 M WEB2170 konnte die PAF-Wirkung nicht vollständig antagonisieren. Es konnte gezeigt werden, dass es zu einer 65 %igen Reduktion der PAF-Wirkung kommt.

In Abbildung 14 sind die Einflüsse von 10-10 M PAF allein, 10-7 M WEB2170 allein und die der kombinierten Superfusion auf den Kalziumtransienten dargestellt. Zum Vergleich ist die Kontrollkurve mit abgebildet. Dieselbe Kurvenkombination ist in Abbildung 15 für die Einflüsse auf die Zellverkürzung gewählt. In Tabelle 7 sind die nach 8 Minuten erreichten Werte dargestellt.


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Abbildung 14: Zeitwirkungsverlauf von PAF, WEB2170 und PAF+WEB auf
Kalziumtransienten (n=6, *: p<0.05 versus Kontrollkurve)


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Abbildung 15: Zeitwirkungsverlauf von PAF, WEB2170 und PAF+WEB
auf die Zellverkürzung (n=6, *: p<0.05 versus Kontrollkurve)


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Tabelle 7: Wirkung von 10-10 M PAF, 10-7 M WEB2170
und PAF+WEB2170 auf Kalziumtransient und Zellverkürzung
(p<0.05 versus Basalwerte, +: p<0.05 versus 10-10 M PAF)

Wirkstoff

Maximaleffekt nach 8 Minuten

relativ zum Untersuchungsbeginn

Kalziumtransient

Zellverkürzung

0 (Basalwert)

96,8 ± 1,3 % (n=6)

96,5 ± 0,7 % (n=6)

10-10 M PAF

58,8 ± 2,2 % (n=6)

67,9 ± 2,3 % (n=6)

10-7 M WEB2170

89,7 ± 2,2 % (n=6)

112,5 ± 2,0 % (n=6)

PAF+WEB2170

83,5 ± 0,9 % (n=6)+

91,0 ± 1,4 % (n=6)+


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Mon Sep 23 10:39:55 2002