Hunger, Thomas: Die Wirkung von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Kontraktilität isolierter adulter Kardiomyozyten der Ratte

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Kapitel 4. Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Messsystem zur simultanen Bestimmung von Kontraktion und intrazellulärer Kalziumkonzentration isolierter Kardiomyozyten entwickelt. Nach Untersuchungen zur Funktion und Stabilität des Messsystems wurde erstmals gezeigt, dass PAF konzentrationsabhängig die systolische intrazelluläre Kalziumkonzentration senkt. Durch den Einsatz eines diese Wirkung hemmenden spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten wurde nachgewiesen, dass es an der Herzmuskelzelle spezifische PAF-Rezeptoren geben muss.

Die Isolation von Herzmuskelzellen verschiedener Säugetierspezies ist schon seit längerem etabliert (Capogrossi et al., 1986; Down et al., 1981; Jacobson et al., 1989). Die aus der Erfahrung entstandenen Routinen führen dazu, dass heute Richtwerten zur Verfügung stehen, welche auch in der vorliegenden Arbeit einen Vergleich der Resultate zur Zellfunktion mit anderen, internationalen Arbeitsgruppen zulassen.

Natürlich ist bei einem so sensiblen biologischen System wie der isoliert kontrahierenden Herzmuskelzelle kein absoluter Vergleich möglich, weil eine große Anzahl von Faktoren außerhalb der Isolation auf die Zellen einwirkt und eine nach der Isolation intakte Zelle durch das Beladen mit Farbstoff, die lang anhaltende Stimulation oder die Anregung mit dem Laser in Mitleidenschaft gezogen werden kann. Vergleichsdaten gibt es zur Zellausbeute, Zellgröße und -morphologie, zur Größe von Kalziumtransienten und Kontraktionsvermögen sowie zu den Einflüssen verschiedener Standardsubstanzen wie Verapamil und Isoprenalin. Diese Referenzen erlauben es, die entwickelte Methode einzuschätzen und Schlüsse auf den Zustand der isolierten Zellen zu ziehen.

4.1 Zellausbeute

Seit Anfang der 60iger Jahre wurden Versuche unternommen, Herzmuskelzellen zu isolieren. Die erste Methode war die mechanische Disruption (Muir et al., 1965).

Der bessere und bis heute verwendete Ansatz besteht in der enzymatischen Auflösung der Zellverbände (Kono, 1969; Berry et al., 1970). Hier bestehen mehrere Möglichkeiten. Die Auflösung von Gewebeoberflächen durch direkten Kontakt mit den Enzymen führt zwar zur Darstellung von Einzelzellen, die Zellausbeute sowie die Rate funktionsfähiger Zellen sind aber gering. Die enzymatische Perfusion von Gewebe durch die bestehenden Gefäße hingegen ist ein Verfahren, bei dem die Kontrolle vieler Parameter möglich ist. Enzymeinwirkzeit und Perfusionsdruck können exakt festgelegt werden. So ist es möglich, den Stress für die Zellen zu minimieren.


37

In der Literatur gibt es Angaben über eingesetzte Enzymkonzentrationen. Da kommerzielle Enzyme aber in sehr unterschiedlichen Reinheitsgraden und Aktivitäten erhältlich sind, sind Konzentrationsangaben in mg/ml, wie es in den meisten Arbeiten vorkommt, nicht vergleichbar (Vahouny et al., 1970; Berry et al., 1970). Howard et al. (1994) perfundierten mit einer Enzym-kombination über 45 Minuten, Horackova & Mapplebeck (1989) nur über 25 Minuten. In den Experimenten zur vorliegenden Arbeit führten wir eine retrograde Perfusion mit Enzymlösung über eine verhältnismäßig lange Zeit von 50 Minuten durch, es wurde aber eine sehr geringe Enzymkonzentration eingesetzt (50 U/ml). Dies beruht auf der Vorstellung, dass eine niedrige Konzentration eines spezifisch auf die interzellulären Verbindungen gerichteten Enzyms auch auf längere Zeit geringere Nebenwirkungen an der Zelloberfläche und auf die Zellfunktion hat.

Die in der Literatur erhältlichen Zahlen zur Zellausbeute differieren sehr stark. Yu et al., 1994, fanden im Durchschnitt 26 Millionen Zellen pro Rattenherz, wohingegen in anderen Arbeiten von 2 - 7,5 Millionen Zellen die Rede ist (Howard et al., 1994; Hori et al., 1996). In der Promotionsarbeit von Dendorfer (1990) wurden 2 x 107 Kardiomyozyten pro 1 g Ventrikelgewebe gefunden. All diese Angaben gelten für die Herzen erwachsener Ratten. Die Zahlen dieser Arbeit liegen mit 4,9 ± 0,3 Millionen Zellen also durchaus im in der Literatur erwähnten Bereich.

Aus der Literatur sind leider keine Angaben darüber zu gewinnen, wie stark sich die Zahl der morphologisch intakten Zellen in der Zeit nach der Isolation noch ändert. Das sogenannte Kalzium-Paradoxon bezeichnet die Hyperkontraktion von kalziumintoleranten Herzmuskelzellen, wenn sie nach der kalziumfreien Isolation wieder mit extrazellulären Kalziumionen in Kontakt kommen (Zimmerman et al., 1966; Crevey et al., 1978). Die in dieser Arbeit relativ niedrige Quote an kalziumintoleranten Zellen weist auf eine gute Zellfunktion nach der Isolation hin.

4.2 Basale Homöostase

Über die Erregung der Zellen gibt es in der Literatur relative Einstimmigkeit: Man stimuliert die Zellen mit Rechteckimpulsen von 1 - 5 ms Länge bei einer Intensität von 30 - 80 V und einer Frequenz von 0,5 - 2 Hz (Williams et al., 1992; Cheng et al., 1994; Cannell et al., 1994). Wie lange die Zellen unter diesen Bedingungen erregbar sind, wird nicht erwähnt, allerdings sind Protokolle bis 40 Minuten beschrieben. Diesen Vorgaben passt sich die vorliegende Arbeit gut an.

Eine neue Entwicklung intrazellulärer Kalziumfarbstoffe ist FLUO-3. Diese Substanz hat einem entscheidenden Vorteil - die in bestimmten Bereichen ausgesandte Fluoreszenz ist proportional der wirklichen Kalziumkonzentration, die Anregung erfolgt gerastert mit dem Laser und erzeugt keine Eigenfluoreszenz des Farbstoffs. Dadurch vereinfacht sich die Berechnung der intrazellulären Kalziumkonzentration nach der in Kapitel 2.5 genannten Formel (Minta et al., 1989).


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Tabelle 8: Basale Parameter isolierter Kardiomyozyten.
ausgewählte Literaturstellen im Vergleich

Autor

 

[Ca2+]ext. (mM)

[Ca2+]diast. (nM)

[Ca2+]syst. (nM)

Zelllänge (µm)

Zellverkürzung (%)

Spurgeon et al., 1992

1-2

125

200

100

8,5

Failli et al.,

1992

1

2

3,6

117

159

174

 

 

 

Cheng et al.,

1994

1

100

bis 1820

 

 

Williams et al., 1992

 

 

 

41-105

3

Cannell et al., 1994

1

100

1150

65

8,6

Church et al., 1994

 

149

252

 

 

Geerts et al.,

1989

 

152

500-800

 

 

Suetake et al., 1992

1,5

0,5

 

560

250

 

11

4,5

Spurgeon et al., 1990

1

 

 

130

10

Yu et al.,

1994

1,8

80

370

 

 

Tamura et al., 1992

2

 

 

145

6

Diese Arbeit

1,2

123

524

112

5,2

Für die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffes gibt es verschiedene Angaben, so verwenden manche Autoren 1,4 µM FLUO-3 (Suetake et al., 1992), andere 5 µM FLUO-3 (Cannell et al., 1994) und andere wiederum 25 µM FLUO-3 (Williams et al., 1992). Die in dieser Arbeit verwendeten 3 µM des Fluoreszenzfarbstoffes wurden deshalb so niedrig gewählt, weil


39

einerseits bei der Inkubation der Zellen mit dem in DMSO gelösten FLUO-3 allein schon das Lösungsmittel eine große Belastung der Zellen darstellt, andererseits der Farbstoff in höheren Konzentrationen toxisch wirkt.

Im weiteren Protokoll wurden in der vorliegenden Arbeit nun rhythmisch und konstant kontrahierende Zellen ausgewählt. In Tabelle 8 sind Werte aus der Fachliteratur den in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnissen gegenübergestellt.

4.3 Modulierbarkeit des Messsystems

Um die Modulierbarkeit des Systems zu überprüfen, wurden Testsubstanzen mit bekannten Wirkungen eingesetzt.

Die Wirkung von Isoprenalin wird durch den beta1-Rezeptor vermittelt, der sich unter anderem auf der Oberfläche des Kardiomyozyten befindet. Es lag also nahe, die Wirkungsvermittlung dieses Rezeptors zu untersuchen, um eine Aussage über den Zustand der Zelloberfläche nach der enzymatischen Isolation zu machen. In Tabelle 9 sind die Literaturstellen aufgeführt, in denen eine ähnliche Untersuchung erfolgte. Die Zahlen zeigen durchaus vergleichbare Wirkungen von Isoprenalin im Bereich von 1 nM bis 1000 nM.

Deutlich wird, dass in der vorliegenden Arbeit keine großen Abweichungen von den bekannten Wirkungen festgestellt wurden. Fraglich ist, ob die in den Arbeiten von Bell & McDermott (1994) und Yu et al. (1994) aufgeführten Werte eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung widerspiegeln oder Einzelmessungen darstellen.

Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit zeigen deutlich einen konzentrationsabhängigen positiv inotropen Effekt von Isoprenalin. Der Effekt wurde mit in anderen Arbeiten üblichen Konzentrationen erzielt und erreichte ähnliche Dimensionen.


40

Tabelle 9: Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient
und Zellverkürzung, ausgewählte Literaturstellen im Vergleich

Autor

Isoprenalin-Konzentration

Kalziumtransient

(versus Basalwert)

Kontraktion

(versus Basalwert)

Pieper et al.,

1989

1 nM

10 nM

100 nM

1000 nM

 

137%

181%

210%

212%

Bell&McDermott,

1994

100 nM

 

123%

Tamura et al., 1992

10 nM

100 nM

161%

223%

237%

285%

Yu et al., 1994

1 nM

207%

 

Diese Arbeit

1 nM

10 nM

100 nM

115%

181%

252%

127%

153%

169%

Verapamil wirkt direkt an den Kalziumkanälen der Herzmuskelzelle. Auch hier bedeutet eine reproduzierbare Wirkungsvermittlung, dass nach der Isolation eine intakte Zelloberfläche vorhanden sein muss. In Tabelle 10 sind die wenigen Literaturstellen aufgeführt, in denen eine ähnliche Untersuchung erfolgte. Die Zahlen zeigen für den Kalziumtransienten, dass hier durch gleiche Verapamilkonzentrationen ähnliche Wirkungen erzielt wurden.

Auch hier zeigt sich eine vergleichbare Wirkung bei ähnlichen Konzentrationen. Bisher gibt es keine veröffentlichte Arbeit, in der eine Konzentrations-Wirkungsbeziehung von Verapamil am isolierten Kardiomyozyten dargestellt wird.


41

Tabelle 10: Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient
und Zellverkürzung, ausgewählte Literaturstellen im Vergleich

Autor

Verapamil-Konzentration

Kalziumtransient (versus Basalwert)

Kontraktion (versus Basalwert)

Wang et al., 1997

10 µM

47 %

 

Santi et al., 1995

10 µM

33 %

 

Diese Arbeit

1 µM

2 µM

4 µM

6 µM

73 %

48 %

36 %

0 %

78 %

65 %

51 %

0 %

4.4 PAF-Wirkungen an isolierten Kardiomyozyten

PAF ist ein hochpotenter Vasokonstriktor, der sowohl über eigene Rezeptoren als auch über die Induktion der Produktion vasoaktiver Substanzen seine Wirkung entfaltet. Dies geschieht natürlich vorrangig im Gefäßbett selbst, es kommt aber auch auf Organebene zur Wirkungen, die sich nicht allein durch die Gefäßeffekte erklären lassen. Da PAF ein bedeutendes Bindeglied in der Kette Ischämie-Schock-Reperfusionsschaden ist, hat die Forschung zur Unterbrechung dieser Wirkungsbeziehung durch PAF-Rezeptorantagonisten eine besondere Bedeutung. Die vom Schock besonders betroffenen Organe Herz, Lunge, Niere und Gehirn werden hier gesondert untersucht.

Die Effekte von PAF am Herzen sind, wie schon eingangs beschrieben, abhängig von der betrachteten Einheit. Das Herz als Gesamtheit hat mehrere auf PAF vermutlich unterschiedlich reagierende Gewebe, wobei die separaten Effekte nicht ohne weiteres zu differenzieren sind.

Versuche am ganzen Herzen wurden vielfach durchgeführt. Die dabei beschriebenen Wirkungen reichen von positiv inotropen (Kamitani et al., 1984; Nakaya & Tohse, 1986), negativ inotropen (Levi et al., 1984; Felix et al., 1990), biphasischen (Camussi et al., 1984; Alloatti et al., 1986; Diez et al., 1990) bis zu keinen (Kamitani et al., 1984) Effekten. Das macht deutlich, dass exakte Werte nicht nur von der Art der Präparation und dem Arbeitsumfeld der Arbeitsgruppen abhängen, sondern dass auch mit so spezifischen Methoden wie der Langendorff-Perfusion an biologischen Objekten durchaus widersprüchliche Daten gewonnen werden können.


42

Erste spezifischere Ergebnisse erlangten Robertson et al. (1987) durch die Verwendung von humanen Herzmuskelstreifen aus dem Herzohr von Bypass-Operierten. Hier war - nicht zuletzt durch das andere Versuchsobjekt - eine Gefäßperfusion nicht möglich, so dass von außen auf die Muskelstreifen

Tabelle 11: PAF-Effekt auf die Kontraktilität
humaner Herzmuskelstreifen aus dem Herzohr
(aus: Robertson et al., 1987)

PAF-Konzentration

Kontraktilität

(versus Kontrolle)

10-10 M

94 %

10-9 M

82%

10-8 M

66 %

10-7 M

58 %

10-6 M

57 %

Lyso-PAF 10-5 M

98 %

einwirkende PAF-Konzentrationen nur anhand der Kontraktionen in ihrer Wirkung vermessen werden konnten. Robertson et al. zeigten 1987 erstmals einen eindeutig negativ inotropen Effekt durch PAF. Dieser Effekt war reproduzierbar, konzentrationsabhängig und durch Lyso-PAF nicht auslösbar. In Tabelle 11 sind diese Messungen wiedergegeben.In Robertsons Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass der Einsatz spezifischer PAF-Rezeptorantagonisten den PAF-Effekt verhindert, dass der Einsatz von Prostaglandin- und Leukotriensynthesehemmern aber keine Wirkung zeigt. Dies lässt sich durch eine direkte Wirkung von PAF auf das Myokard erklären.

Das einzige Problem an dieser Studie ist die Unreinheit des betrachteten Objekts - denn auch wenn am Herzmuskelstreifen eine genauere Ortung von Effekten möglich ist, so ist immer noch ein Gemisch von Zellen im Experiment vorhanden.

Massey et al. untersuchten 1991 den Effekt von PAF auf adulte Kardiomyozyten der Ratte sowie auf neonatale Rattenherz-Zellkulturen. Letztere wurden einerseits elektrisch stimuliert, andererseits bei spontaner Kontraktion untersucht. Bei den spontan kontrahierenden Zellkulturen wurde bei der Einwirkung von PAF eine Frequenzerhöhung beobachtet.


43

Massey et al. fanden eine konzentrationsabhängige negative Wirkung von PAF auf die Kontraktilität der untersuchten Kardiomyozyten. Auch hier zeigte Lyso-PAF keine Wirkung. Mit dieser Methode wurden die Daten 3 Minuten nach Beginn der PAF-Superfusion erhoben. In Tabelle 12 sind diese Ergebnisse dargestellt.

Tabelle 12: Effekt von PAF auf die Kontraktilität isolierter adulter
und neonataler Kardiomyozyten der Ratte
(aus: Massey et al., 1991)

Zellart

PAF-Konzentration

Kontraktilität nach

3 Minuten

(versus Basalwerte)

adulte Kardiomyozyten

2 x 10-7 M

78 %

neonatale Kardiomyozyten,

spontan kontrahierende Zellkultur

1 x 10-9 M

8 x 10-9 M

2 x 10-8 M

8 x 10-8 M

2 x 10-7 M

Lyso-PAF 1 x 10-7 M

85 %

81 %

86 %

61 %

35 %

kein Effekt

neonatale Kardiomyozyten,

elektrisch stimulierte Zellkultur

2 x 10-8 M

8 x 10-8 M

76 %

68 %

Diese Daten gaben erste Anhaltspunkte für die Größenordnung, in der bei den durchzuführenden Versuchen Ergebnisse zu erwarten waren. Die eingesetzten PAF-Konzentrationen waren erheblich höher - das könnte einerseits an der höheren Temperatur (36 °C in Masseys Arbeit) des Messsystems liegen, andererseits sind dedifferenzierte neonatale Zellen mit einer anderen Rezeptorpopulation besetzt als adulte, frisch isolierte Herzmuskelzellen. Die spontan kontrahierenden, kultivierten Herzmuskelzellen in Masseys Arbeit sind allerdings ein völlig anderes Modell. Strukturelle, metabolische und funktionelle Unterschiede zwischen kultivierten neonatalen Kardiomyozyten und intaktem Gewebe wurden nachgewiesen (Pollack et al., 1991; Woodcock et al., 1992). Ein Vergleich von kultivierten mit frisch isolierten Zellen ist darum nicht ohne weiteres möglich.


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Unterschiede zwischen kultivierten neonatalen Kardiomyozyten und intaktem Gewebe wurden nachgewiesen (Pollack et al., 1991; Woodcock et al., 1992). Ein Vergleich von kultivierten mit frisch isolierten Zellen ist darum nicht ohne weiteres möglich.

Eine weitere Arbeit zu diesem Thema stammt von Delbridge et al., 1993. Hier wurde der Einfluss von PAF auf die Kontraktilität frisch isolierter Kardiomyozyten der Ratte untersucht. Die Isolation war ähnlich der in der vorliegenden Arbeit beschriebenen, das Messprotokoll zeigte als einzige Abweichung eine Arbeitstemperatur von 36 °C. Auch hier fand sich ein konzentrationsabhängig negativ inotroper Effekt. Die PAF-Wirkung konnte durch den spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten WEB2086 verringert werden. In Tabelle 13 sind die von Delbridge et al. nach 9 Minuten gemessenen Effekte dargestellt.

Tabelle 13: Effekt von PAF und WEB2086 auf die Kontraktilität
frisch isolierter Kardiomyozyten der Ratte. Maximalwerte nach 6 Minuten.
(aus: Delbridge et al., 1993)

Wirkstoffkonzentration

Kontraktilität

(versus Kontrolle)

0

96 %

PAF 10-11 M

89 %

PAF 10-9 M

90 %

PAF 10-7 M

77 %

PAF 10-7 M + WEB 2086 10-5 M

89 %

WEB 2086 10-5 M

116 %

In der Arbeit von Delbridge et al. wird deutlich, dass man den negativ inotropen Effekt von PAF durch den Einsatz von WEB2086 verringern kann. Die beschriebenen höheren Wirkstoffkonzentrationen sind sicher auf das andere Versuchsdesign zurückzuführen, auch ist in der Arbeit nicht angegeben, welche Art PAF verwendet wurde.

Eine Frage bleibt aber auch nach dieser Arbeit: Wie wirkt PAF an der Herzmuskelzelle? Die starke Hemmung der PAF-Wirkung durch den Einsatz von WEB2086 könnte einerseits durch einen spezifischen PAF-rezeptorantagonistischen Effekt hervorgerufen sein, andererseits ist auch eine


45

Überlagerung des negativ inotropen PAF-Effekts durch den positiv inotropen WEB2086-Effekt denkbar.

Der direkte Vergleich der vorliegenden Arbeit mit der Literatur ist bei der geringen Auswahl sehr schwierig. Bestätigt werden konnten die Ergebnisse von Delbridge et al. 1993, da das Gesamtbild auffallend übereinstimmt.

Durch den neuen Ansatz der simultanen Messung von Kalziumtransient und Zellverkürzung konnten die Wirkmechanismen sowohl von PAF als auch von WEB2170 besser dargestellt werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit beweisen, dass der negativ inotrope Effekt von PAF an der Herzmuskelzelle durch einen verringerten systolischen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration bedingt ist. Der Nachweis einer simultanen Verringerung von Kalziumtransient und Zellverkürzung unter PAF-Einwirkung ist nicht unerwartet, da mehrere internationale Arbeitsgruppen jeweils eine der beiden Messkomponenten reproduzierbar nachgewiesen haben. In der vorliegenden Arbeit aber gelang erstmals der simultane Vergleich beider Messgrößen. Des Weiteren zeigte sich, dass auch niedrige PAF-Konzentrationen, wie sie zum Beispiel im Verlauf ischämischer Ereignisse auftreten, direkt am Kardiomyozyten eine negative Inotropie bewirken.

Erstmals gelang der Nachweis, dass die positive Wirkung von WEB2170 auf die Zellkontraktion durch eine kalziumsensibilisierende Komponente bedingt ist. So stieg die Zellverkürzung zwar an, es ließ sich aber kein Anstieg der intrazellulären systolischen Kalziumkonzentration darstellen. Durch den Einsatz der simultanen Messung von Kalziumtransient und Zelllänge konnte gezeigt werden, dass WEB2170 zu der Gruppe der Kalziumsensitizer gehört.

Durch Präinkubation der Zellen mit WEB2170 konnte der PAF-Effekt deutlich reduziert werden. Somit wurde nachgewiesen, dass an der Herzmuskelzelle spezifische PAF-Rezeptoren vorhanden sein müssen. Ein reiner Überlagerungseffekt der Kontraktionsbeeinflussungen durch PAF und WEB2170 konnte ausgeschlossen werden, da bei den Messungen deutlich wurde, dass WEB2170 die negative Wirkung von PAF auf den Kalziumtransienten hemmt, ohne selbst einen positiven Effekt auf den Kalziumtransienten zu haben.


46

4.5 Ausblick

In Anknüpfung an die Ergebnisse dieser Arbeit ergeben sich drei wesentliche Fragen: Gibt es an der Herzmuskelzelle auch intrazelluläre Rezeptoren, insbesondere am sarkoplasmatischen Retikulum? Wo sind weitere PAF-Rezeptoren lokalisiert und wie sind sie verteilt? Wirken spezifische PAF-Rezeptorantagonisten auch in der Herzmuskelzelle?

Zur Beantwortung dieser Fragen in besonderer Hinsicht auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration wären vergleichende Versuche an der Zellmembran und am sarkoplasmatischen Retikulum der Herzmuskelzelle erforderlich. Als diesbezüglich weiterführende Methode wäre die Voltage-Clamp-Technik denkbar, welche man sowohl an der Oberfläche als auch am isolierten sarkoplasmatischen Retikulum von Kardiomyozyten anwenden könnte.

Wichtig wäre es, all diese an nichthumanen Spezies erzielten Ergebnisse auch an der adulten menschlichen Herzmuskelzelle nachzuvollziehen. Würden sich die Resultate bestätigen, wäre ein weiterer Schritt zum klinischen Einsatz von PAF-Rezeptorantagonisten vollzogen.


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Mon Sep 23 10:39:55 2002