Hunger, Thomas: Die Wirkung von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Kontraktilität isolierter adulter Kardiomyozyten der Ratte

Aus der medizinischen Klinik und Poliklinik I
mit Schwerpunkt Kardiologie, Angiologie und Pulmologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Die Wirkung von
Plättchenaktivierendem Faktor (PAF)
auf intrazelluläre Kalziumkonzentration
und Kontraktilität
isolierter adulter Kardiomyozyten
der Ratte

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Thomas Hunger,
aus Frankfurt (Oder)

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
1. Prof. Dr. S. B. Felix
2. Prof. Dr. P. Persson
3. Prof. Dr. H. E. Kroemer

Datum der Promotion: 15.Januar 01

Zusammenfassung

Es wurden die Effekte von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF, 1-O-Alkyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Zelllänge isolierter und feldstimulierter Kardiomyozyten der Ratte untersucht. Intrazelluläre Kalziumkonzentration und Zelllänge der feldstimulierten Zellen wurden mittels Laser-Raster-Mikroskopie simultan unter Verwendung des Kalzium-Fluoreszenzfarbstoffes Fluo-3 bestimmt. PAF (0.001nM - 10nM) inhibierte den systolischen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration zeit- und konzentrationsabhängig. Die maximalen Effekte wurden nach einer Inkubationszeit von 6-8 min beobachtet. Es kam zu 17% (0.001nM), 41% (0.1nM) und 52% (10nM PAF) Reduktion des systolischen Kalziumanstiegs. Zusätzlich konnte eine zeit- und konzentrationsabhängige Verringerung der simultan gemessenen Zellverkürzung nachgewiesen werden. Die Zellverkürzung war nach einer Inkubationszeit von 8 min um 10% (0.001nM), 32% (0.1nM) und 50% (10nM PAF) reduziert. Die Wirkungen von PAF konnten durch den Einsatz des spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten WEB 2170 inhibiert werden. Diese Ergebnisse zeigen einen rezeptorvermittelten negativ inotropen Effekt von PAF, hervorgerufen durch eine Verringerung der systolischen intrazellulären Kalziumkonzentration ohne Desensibilisierung der Myofilamente.

Schlagwörter:
Plättchenaktivierender Faktor, Isolierte Kardiomyozyten, Intrazelluläre Kalziumkonzentration, Kontraktilität

Abstract

We investigated the effects of platelet-activating factor (PAF, 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine) on intracellular calciumconcentration and cell length in isolated and field-stimulated rat cardiomyocytes. Intracellular calciumconcentration and cell length of field-stimulated cells were determined simultaneously by confocal laser scan microscopy by using the fluorescent calcium dye Fluo-3. PAF (0.001nM - 10nM) inhibited systolic intracellular calciumconcentration increase in a time- and concentration-dependent manner. Maximal effects were observed after an incubation time of 6-8 min, resulting in a 17% (0.001nM), 41% (0.1nM) and 52% (10nM PAF) inhibiton of systolic calcium increase. A time- and concentration-dependent decrease in simultaneously measured cell shortening also was demonstrated. Cell shortening was inhibited by 10% (0.001nM), 32% (0.1nM) and 50% (10nM PAF) after an incubation time of 8 min. The effects of PAF could be antagonized by the PAF-receptor antagonist WEB 2170. These data demonstrate that PAF receptor-dependently induces a negativ inotropic effect, which is correlated with a decrease in systolic intracellular calciumconcentration and is most likely not due to a decrease in myofilament sensitivity.

Keywords:
Platelet-activating factor, Isolated cardiomyocytes, Intracellular calciumconcentration, contractility


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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDie Wirkung von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Kontraktilität isolierter adulter Kardiomyozyten der Ratte
1 Einleitung
1.1Platelet-activating factor (PAF)
1.2Wirkungen und Wechselwirkungen von PAF
1.3Kardiale Wirkung von PAF
1.4Wirkung von PAF auf isolierte Kardiomyozyten
1.5Problemstellung
2 Material und Methoden
2.1Isolation von Herzmuskelzellen
2.2Beladung der Zellen mit FLUO-3
2.3Aufbau der Perfusionskammer und Feldstimulation
2.4Konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM)
2.5Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration [Ca2+]i
2.6Simultane Bestimmung von Kontraktion und [Ca2+]i
2.7Statistische Auswertung
2.8Reagenzien und Puffer
3 Ergebnisse
3.1Kontrolle und Modulation des Systems
3.2Effekt von PAF auf Kalziumtransient und Zellverkürzung
3.3Antagonisierung der PAF-Wirkung durch WEB2170
4 Diskussion
4.1Zellausbeute
4.2Basale Homöostase
4.3Modulierbarkeit des Messsystems
4.4PAF-Wirkungen an isolierten Kardiomyozyten
4.5Ausblick
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis im Text häufig verwendeter Abkürzungen
Danksagung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Nomenklatur plättchenaktivierender Phospholipide (PAF)
(nach McManus et al., 1993)
Tabelle 2: Wirkungen und Wechselwirkungen von PAF (nach Koltai et al., 1991)
Tabelle 3: Zusammensetzung der verwendeten Puffer
Tabelle 4: Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient und Zellverkürzung (p<0.05)
Tabelle 5: Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient
und Zellverkürzung (p<0.05)
Tabelle 6: Zeitwirkungsverlauf von PAF auf Kalziumtransient
und Zellverkürzung (p<0.05 versus Basalwerte)
Tabelle 7: Wirkung von 10-10 M PAF, 10-7 M WEB2170
und PAF+WEB2170 auf Kalziumtransient und Zellverkürzung
(p<0.05 versus Basalwerte, +: p<0.05 versus 10-10 M PAF)
Tabelle 8: Basale Parameter isolierter Kardiomyozyten.
ausgewählte Literaturstellen im Vergleich
Tabelle 9: Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient
und Zellverkürzung, ausgewählte Literaturstellen im Vergleich
Tabelle 10: Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient
und Zellverkürzung, ausgewählte Literaturstellen im Vergleich
Tabelle 11: PAF-Effekt auf die Kontraktilität
humaner Herzmuskelstreifen aus dem Herzohr
(aus: Robertson et al., 1987)
Tabelle 12: Effekt von PAF auf die Kontraktilität isolierter adulter
und neonataler Kardiomyozyten der Ratte
(aus: Massey et al., 1991)
Tabelle 13: Effekt von PAF und WEB2086 auf die Kontraktilität
frisch isolierter Kardiomyozyten der Ratte. Maximalwerte nach 6 Minuten.
(aus: Delbridge et al., 1993)

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Struktur von
1-O-Alkyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin (PAF)
(nach Benveniste et al., 1977)
Abbildung 2: Metabolismus von PAF
(nach Wykle et al., 1980)
Abbildung 3: Rezeptorvermittelte Wirkungen von PAF
(nach Izumi & Shimizu, 1995; PG-Prostaglandine; LT-Leukotriene;
TX-Thromboxane; MAPKK-Mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase;
AC-Adenylatzyklase, PTK-Proteintyrosinkinase)
Abbildung 4: Perfusionsapparatur zur Isolierung adulter Kardiomyozyten
(modifiziert nach Langendorff, 1895 und Dendorfer, 1990; A-KHP, B-Enzymlösung, BF-Blasenfalle,
C-Hochkaliumpuffer, D-Druckausgleichsbehälter, DK-Druckkontrolle, DR-Druckregulation, E-
Wärmetauscher, F-Flussmessung, G-Gasflasche, K-Konus, RP-Rollenpumpe, T-Trichter, 1,2- Begasungsregler)
Abbildung 5: Relativer Perfusionsfluss während der Isolation (n=47)
Abbildung 6: Perfusionskammer zur Vermessung isolierter
Kardiomyozyten am konfokalen Mikroskop
(E-Elektroden zur Feldstimulation, M-Objektiv des Mikroskops)
Abbildung 7: Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie
(nach Engelhard & Knebel, 1993)
Abbildung 8: Kontinuierliche Fluoreszenzmessung und Eichung
einer Einzelzelle (A), Bild einer Einzelzelle in diastolischer (B),
maximaler (C) und minimaler (D) Fluoreszenz
Abbildung 9: Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient und
Zellverkürzung isolierter Kardiomyozyten
(*: p<0.05 versus Basalwert)
Abbildung 10: Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient und
Zellverkürzung isolierter Kardiomyozyten
(*: p<0.05 versus Basalwert)
Abbildung 11: Zeitwirkungsverlauf von PAF 10-8 M
auf Kalziumtransient (A) und Zellverkürzung (B) an der Einzelzelle
Abbildung 12: Zeitwirkungsverlauf von PAF auf den Kalziumtransienten
(*: p<0.05 versus Kontrollkurve)
Abbildung 13: Zeitwirkungsverlauf von PAF auf die Zellverkürzung
(*: p<0.05 versus Kontrollkurve)
Abbildung 14: Zeitwirkungsverlauf von PAF, WEB2170 und PAF+WEB auf
Kalziumtransienten (n=6, *: p<0.05 versus Kontrollkurve)
Abbildung 15: Zeitwirkungsverlauf von PAF, WEB2170 und PAF+WEB
auf die Zellverkürzung (n=6, *: p<0.05 versus Kontrollkurve)

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Mon Sep 23 10:39:55 2002