| Hunger, Thomas: Die Wirkung von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Kontraktilität isolierter adulter Kardiomyozyten der Ratte |
Aus der medizinischen Klinik und Poliklinik I
mit Schwerpunkt Kardiologie, Angiologie und Pulmologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix
Gutachter:
1. Prof. Dr. S. B. Felix
2. Prof. Dr. P. Persson
3. Prof. Dr. H. E. Kroemer
Datum der Promotion: 15.Januar 01
Es wurden die Effekte von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF, 1-O-Alkyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Zelllänge isolierter und feldstimulierter Kardiomyozyten der Ratte untersucht. Intrazelluläre Kalziumkonzentration und Zelllänge der feldstimulierten Zellen wurden mittels Laser-Raster-Mikroskopie simultan unter Verwendung des Kalzium-Fluoreszenzfarbstoffes Fluo-3 bestimmt. PAF (0.001nM - 10nM) inhibierte den systolischen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration zeit- und konzentrationsabhängig. Die maximalen Effekte wurden nach einer Inkubationszeit von 6-8 min beobachtet. Es kam zu 17% (0.001nM), 41% (0.1nM) und 52% (10nM PAF) Reduktion des systolischen Kalziumanstiegs. Zusätzlich konnte eine zeit- und konzentrationsabhängige Verringerung der simultan gemessenen Zellverkürzung nachgewiesen werden. Die Zellverkürzung war nach einer Inkubationszeit von 8 min um 10% (0.001nM), 32% (0.1nM) und 50% (10nM PAF) reduziert. Die Wirkungen von PAF konnten durch den Einsatz des spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten WEB 2170 inhibiert werden. Diese Ergebnisse zeigen einen rezeptorvermittelten negativ inotropen Effekt von PAF, hervorgerufen durch eine Verringerung der systolischen intrazellulären Kalziumkonzentration ohne Desensibilisierung der Myofilamente.
Schlagwörter:
Plättchenaktivierender Faktor, Isolierte Kardiomyozyten, Intrazelluläre Kalziumkonzentration, Kontraktilität
We investigated the effects of platelet-activating factor (PAF, 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine) on intracellular calciumconcentration and cell length in isolated and field-stimulated rat cardiomyocytes. Intracellular calciumconcentration and cell length of field-stimulated cells were determined simultaneously by confocal laser scan microscopy by using the fluorescent calcium dye Fluo-3. PAF (0.001nM - 10nM) inhibited systolic intracellular calciumconcentration increase in a time- and concentration-dependent manner. Maximal effects were observed after an incubation time of 6-8 min, resulting in a 17% (0.001nM), 41% (0.1nM) and 52% (10nM PAF) inhibiton of systolic calcium increase. A time- and concentration-dependent decrease in simultaneously measured cell shortening also was demonstrated. Cell shortening was inhibited by 10% (0.001nM), 32% (0.1nM) and 50% (10nM PAF) after an incubation time of 8 min. The effects of PAF could be antagonized by the PAF-receptor antagonist WEB 2170. These data demonstrate that PAF receptor-dependently induces a negativ inotropic effect, which is correlated with a decrease in systolic intracellular calciumconcentration and is most likely not due to a decrease in myofilament sensitivity.
Keywords:
Platelet-activating factor, Isolated cardiomyocytes, Intracellular calciumconcentration, contractility
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Inhaltsverzeichnis | |
| Titelseite | Die Wirkung von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Kontraktilität isolierter adulter Kardiomyozyten der Ratte |
| 1 | Einleitung |
| 1.1 | Platelet-activating factor (PAF) |
| 1.2 | Wirkungen und Wechselwirkungen von PAF |
| 1.3 | Kardiale Wirkung von PAF |
| 1.4 | Wirkung von PAF auf isolierte Kardiomyozyten |
| 1.5 | Problemstellung |
| 2 | Material und Methoden |
| 2.1 | Isolation von Herzmuskelzellen |
| 2.2 | Beladung der Zellen mit FLUO-3 |
| 2.3 | Aufbau der Perfusionskammer und Feldstimulation |
| 2.4 | Konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM) |
| 2.5 | Bestimmung der intrazellulären Kalziumkonzentration [Ca2+]i |
| 2.6 | Simultane Bestimmung von Kontraktion und [Ca2+]i |
| 2.7 | Statistische Auswertung |
| 2.8 | Reagenzien und Puffer |
| 3 | Ergebnisse |
| 3.1 | Kontrolle und Modulation des Systems |
| 3.2 | Effekt von PAF auf Kalziumtransient und Zellverkürzung |
| 3.3 | Antagonisierung der PAF-Wirkung durch WEB2170 |
| 4 | Diskussion |
| 4.1 | Zellausbeute |
| 4.2 | Basale Homöostase |
| 4.3 | Modulierbarkeit des Messsystems |
| 4.4 | PAF-Wirkungen an isolierten Kardiomyozyten |
| 4.5 | Ausblick |
| 5 | Zusammenfassung |
| Bibliographie | Literaturverzeichnis |
| Abkürzungsverzeichnis | Verzeichnis im Text häufig verwendeter Abkürzungen |
| Danksagung | |
Tabellenverzeichnis | |
| Tabelle 1: | Nomenklatur plättchenaktivierender Phospholipide (PAF) (nach McManus et al., 1993) |
| Tabelle 2: | Wirkungen und Wechselwirkungen von PAF (nach Koltai et al., 1991) |
| Tabelle 3: | Zusammensetzung der verwendeten Puffer |
| Tabelle 4: | Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient und Zellverkürzung (p<0.05) |
| Tabelle 5: | Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient und Zellverkürzung (p<0.05) |
| Tabelle 6: | Zeitwirkungsverlauf von PAF auf Kalziumtransient und Zellverkürzung (p<0.05 versus Basalwerte) |
| Tabelle 7: | Wirkung von 10-10 M PAF, 10-7 M WEB2170 und PAF+WEB2170 auf Kalziumtransient und Zellverkürzung (p<0.05 versus Basalwerte, +: p<0.05 versus 10-10 M PAF) |
| Tabelle 8: | Basale Parameter isolierter Kardiomyozyten. ausgewählte Literaturstellen im Vergleich |
| Tabelle 9: | Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient und Zellverkürzung, ausgewählte Literaturstellen im Vergleich |
| Tabelle 10: | Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient und Zellverkürzung, ausgewählte Literaturstellen im Vergleich |
| Tabelle 11: | PAF-Effekt auf die Kontraktilität humaner Herzmuskelstreifen aus dem Herzohr (aus: Robertson et al., 1987) |
| Tabelle 12: | Effekt von PAF auf die Kontraktilität isolierter adulter und neonataler Kardiomyozyten der Ratte (aus: Massey et al., 1991) |
| Tabelle 13: | Effekt von PAF und WEB2086 auf die Kontraktilität frisch isolierter Kardiomyozyten der Ratte. Maximalwerte nach 6 Minuten. (aus: Delbridge et al., 1993) |
Abbildungsverzeichnis | |
| Abbildung 1: | Struktur von 1-O-Alkyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin (PAF) (nach Benveniste et al., 1977) |
| Abbildung 2: | Metabolismus von PAF (nach Wykle et al., 1980) |
| Abbildung 3: | Rezeptorvermittelte Wirkungen von PAF (nach Izumi & Shimizu, 1995; PG-Prostaglandine; LT-Leukotriene; TX-Thromboxane; MAPKK-Mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase; AC-Adenylatzyklase, PTK-Proteintyrosinkinase) |
| Abbildung 4: | Perfusionsapparatur zur Isolierung adulter Kardiomyozyten (modifiziert nach Langendorff, 1895 und Dendorfer, 1990; A-KHP, B-Enzymlösung, BF-Blasenfalle, C-Hochkaliumpuffer, D-Druckausgleichsbehälter, DK-Druckkontrolle, DR-Druckregulation, E- Wärmetauscher, F-Flussmessung, G-Gasflasche, K-Konus, RP-Rollenpumpe, T-Trichter, 1,2- Begasungsregler) |
| Abbildung 5: | Relativer Perfusionsfluss während der Isolation (n=47) |
| Abbildung 6: | Perfusionskammer zur Vermessung isolierter Kardiomyozyten am konfokalen Mikroskop (E-Elektroden zur Feldstimulation, M-Objektiv des Mikroskops) |
| Abbildung 7: | Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie (nach Engelhard & Knebel, 1993) |
| Abbildung 8: | Kontinuierliche Fluoreszenzmessung und Eichung einer Einzelzelle (A), Bild einer Einzelzelle in diastolischer (B), maximaler (C) und minimaler (D) Fluoreszenz |
| Abbildung 9: | Wirkung von Isoprenalin auf Kalziumtransient und Zellverkürzung isolierter Kardiomyozyten (*: p<0.05 versus Basalwert) |
| Abbildung 10: | Wirkung von Verapamil auf Kalziumtransient und Zellverkürzung isolierter Kardiomyozyten (*: p<0.05 versus Basalwert) |
| Abbildung 11: | Zeitwirkungsverlauf von PAF 10-8 M auf Kalziumtransient (A) und Zellverkürzung (B) an der Einzelzelle |
| Abbildung 12: | Zeitwirkungsverlauf von PAF auf den Kalziumtransienten (*: p<0.05 versus Kontrollkurve) |
| Abbildung 13: | Zeitwirkungsverlauf von PAF auf die Zellverkürzung (*: p<0.05 versus Kontrollkurve) |
| Abbildung 14: | Zeitwirkungsverlauf von PAF, WEB2170 und PAF+WEB auf Kalziumtransienten (n=6, *: p<0.05 versus Kontrollkurve) |
| Abbildung 15: | Zeitwirkungsverlauf von PAF, WEB2170 und PAF+WEB auf die Zellverkürzung (n=6, *: p<0.05 versus Kontrollkurve) |
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HTML - Version erstellt am: Mon Sep 23 10:39:55 2002 |