[Seite 33↓]

2  Methodik

2.1 Studienkonzept und Probandenauswahl

Ausgehend von der Annahme dosis-abhängiger Effekte von POPs auf das menschliche Immunsystem, bestand die Notwendigkeit, Probanden zu rekrutierten, die voraussichtlich vergleichsweise hohe bzw. niedrige POP-Belastungen aufweisen. Die POP-Konzentrationen beim Kind wird vor allem durch die Stilldauer und POP-Konzentrationen in der Muttermilch bestimmt, wobei ältere Mütter höhere Konzentrationen gegenüber jüngeren aufweisen [Abraham et al. 1996]. Deshalb wäre ein Kind mit erwarteter relativ hoher POP-Belastung das erste gestillte Kind einer Mutter mit relativ hohem Lebensalter oder das Kind einer Mutter aus einer Region mit bekanntermaßen erhöhter Exposition [Abraham et al. 1998a]. Üblicherweise kommt es durch lokale Emissionsquellen von POPs kaum zu erhöhten POP-Werten bei Anwohnern, denn die Hauptaufnahme von POPs im Hintergrundbereich erfolgt, wie bereits genannt, über Nahrungsmittel. Die relativ geringe Streuung von gemessenen POP-Konzentrationen bei Erwachsenen erklärt sich durch die derzeit in Deutschland überwiegende Nahrungsmittelversorgung durch Supermarktketten (weite Verteilung der Lebensmittel), hohe überregionale Mobilität (kein lebenslanges Wohnen an einem Ort) und lange Halbwertszeiten der Verbindungen [Abraham 2002]. Eine Sondersituation besteht in der Region Ilsenburg/Sachsen-Anhalt, in der eine hohe Bodenkontamination durch eine Industrieanlage vorliegt und es eine hohe Selbstversorger-Rate bei geringer überregionaler Mobilität gab. Die erhebliche Emission von PCDDs/PCDFs erfolgte beim Kupfer-Recycling (durch PVC-Verbrennung ohne Filteranlagen) in der Kupferhütte Ilsenburg, welche nach Bekanntwerden dieser Situation 1990 stillgelegt wurde. Aufgrund dieser Überlegungen wurden möglichst lange gestillte Kinder aus der Region Ilsenburg in die Untersuchung einbezogen. Demgegenüber wurden kürzer gestillte Kinder aus Berlin und Umgebung gesucht, deren Mütter bereits andere Kinder gestillt hatten. Bei diesen Kindern wurden relativ niedrigere POP-Konzentrationen erwartet [Abraham et al. 1998b]. Zusätzlich wurden nicht gestillte Kinder aus Berlin rekrutiert, die nur im Rahmen der allgemeinen Hintergrundbelastung mit Dioxinen exponiert waren.

Die Teilnahme von geeigneten Probanden erfolgte freiwillig, die Blutentnahme und weitere Untersuchungen wurden nur nach Zustimmung beider Elternteile durchgeführt. [Seite 34↓]Die Ethik-Kommission der Charité hatte zuvor ein positives Votum zu der geplanten Studie abgegeben.

Um neben Unterschieden aufgrund der Stilldauer über ein möglichst homogenes Kollektiv zu verfügen, wurde die Probandenrekrutierung nach den folgenden Kriterien eingeschränkt:

Allgemeine Auswahlkriterien:

Allgemeine Ausschlusskriterien:


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2.2  Studienkollektiv

Insgesamt wurden für die oben genannte Studie 101 Kinder rekrutiert. Bei 70/101 (69 %) Kinder war es möglich, einen Zytotoxizitäts-Assay durchzuführen. In die vorliegende Auswertung wurden 66/70 (94 %) Kinder aufgenommen.

Vier der durchgeführten Zytotoxizitäts-Assays mussten aufgrund nicht verwertbarer Daten verworfen werden (siehe 2.9).
Der Untersuchungszeitraum betrug insgesamt 558 Tage (inklusive Wiederholungsuntersuchungen, siehe 2.2.4), wobei entsprechend dem Mess-Tag den einzelnen Messungen im folgenden Untersuchungstag 1 bis 559 zugewiesen wurden.

2.2.1 Alters- und Geschlechtsverteilung, regionale Herkunft

Das mittlere Alter zum Zeitpunkt der Untersuchung war 352 ± 7 Tage (Mittelwert ± Standardabweichung) bzw. 11,5 Monate (Median 350 Tage, Spannweite 341–369 Tage).
Männlichen Geschlechtes waren 33/66 (50 %) der Kinder.
Aus Berlin stammten 50/66 (76 %) Kinder, aus der Region Ilsenburg/Sachsen-Anhalt 13/66 (20 %) und aus anderen Orten in der ehemaligen DDR 3/66 (5 %).

2.2.2  Ernährung

Gestillt waren 50/66 (76 %) Kinder, wobei die Stilldauer im Mittel 32 ± 6 Wochen betrug (Median 33 Wochen, Spannweite 18–42 Wochen).
Nach obiger Definition waren 16/66 (24 %) Kinder nicht gestillt. Diese wurden im Mittel 2,6 ± 3,9 Tage gestillt (Median 0,5 Tage, Spannweite 0–12 Tage).

2.2.3 Infekte und Zigarettenrauch-Exposition

Alle Kinder waren gemäß den Auswahlkriterien nach allgemeinen Gesichtspunkten gesund, das heißt es bestanden bisher nur banale Infekte vorwiegend der Atemwege. Die Anzahl der bisherigen Infekte der Kinder lagen im Mittel bei 4,6 ± 2,3 (Median 4, Spannweite 1–10) und damit im üblichen Rahmen. Davon waren im Mittel 1,8 ± 1,4 fieberhaft (Median 2, Spannweite 0–6) und der letzte Infekt lag im Mittel 6 ± 8 Wochen zurück (Median 3 Wochen, Spannweite 2–34 Wochen).


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Minimale Infektzeichen im Sinne einer leicht behinderten Nasenatmung oder von zweimaligem leichtem Husten während der Blutentnahme wiesen 25/66 (38 %) Kinder auf.
Mit Zigarettenrauch waren 8/66 (12 %) nicht gestillte Kinder passiv exponiert.

2.2.4  Wiederholungsuntersuchung

Bei 36/101 (36 %) Kindern der Dioxin-Studie wurde zur Überprüfung auffälliger (nicht immunologisch relevanter) Laborparameter eine zweite Blutentnahme durchgeführt. Dabei war am häufigsten die Enzymaktivität der Alkalischen Phosphatase im Plasma über die Norm (> 700 U/l) erhöht. Die zweite Probengewinnung wurde bei 14/66 (21 %) Kindern der vorliegenden Arbeit durchschnittlich 29 ± 12 Tage nach der ersten Blutentnahme durchgeführt (Spannweite 14–52 Tage), sodass die intraindividuelle Variation der untersuchten Parameter ermittelt werden konnte. Zum Zeitpunkt der zweiten Blutentnahme bestanden minimale Infektzeichen bei 5/14 (36 %) Kindern.

2.3 Gewinnung des Untersuchungsmaterials

Den Kindern wurde in der eigenen Wohnung morgens zur individuellen Aufwachzeit ein Lokalanästhetika-Pflaster (EMLA®-Pflaster, Astra, Wedel) auf beide Handrücken geklebt. Nach einer Wartezeit von 45 Minuten, in der das Kind untersucht und die Eltern zu Anamnese, Schwangerschaft, Geburt und Kindesentwicklung befragt wurden, erfolgte eine venöse Blutentnahme von 0,5 ml EDTA-Blut und 15 ml Heparinblut. Diese wurde meistens parallel zum Frühstück einer Milchmahlzeit durchgeführt, um das Kind abzulenken. Anamneseerhebung, klinische Untersuchung und Blutentnahme wurden vom Leiter der Dioxin-Studie durchgeführt. Die Weiterverarbeitung des Untersuchungsmaterials erfolgte spätestens 4 Stunden nach der Probengewinnung. Im Folgenden wurden alle Arbeitsschritte – soweit nötig – unter sterilen Bedingungen an einem Laminar-Air-Flow-Arbeitsplatz ausgeführt.

2.4 Bestimmung zellulärer Parameter

Die Leukozyten- und Lymphozytenzahl wurde mit einem automatisierten Zellzähler (Cell Dyn® 3500, Abbot Diagnostics, Abbot Park, USA) in EDTA-Blut und in der Suspension von isolierten Lymphozyten/Monozyten (siehe 2.7.1) bestimmt.


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2.5  Durchflusszytometrie

Alle durchflusszytometrischen Messungen wurden mit einem FACScanTM-Durchflusszytometer (Becton Dickinson, Heidelberg) durchgeführt.
Ein Durchflusszytometer ist ein optisches Mess-System für Zellen unterschiedlicher Art, welches zwei Streulichtsignale und bis zu drei Fluoreszenzsignale einzelner Zellen registriert. Dazu müssen die zu analysierenden Zellen in einer Suspension vorliegen, um nach Erzeugung einer laminaren Strömung einzeln an einem Messpunkt vorbeigeführt zu werden. Hier trifft ein fokussierter monochromatischer Lichtstrahl auf die Zelle, die dabei entstehenden Streulicht- und Fluoreszenzsignale werden durch Photodetektoren gemessen.
Hierbei wird zum einen ein Vorwärtsstreulicht (forward angle light scatter, FSC) im Bereich von 0–10° erfasst, welches Auskunft über die Zellgröße gibt und zum anderen ein Seitwärtsstreulicht (side angle light scatter, SSC) im Bereich von 90°, welches Informationen über Granularität, Membranfaltung und äußere Form der Zelle liefert. Dadurch lassen sich Lymphozyten, Monozyten und neutrophile Granulozyten unterscheiden.
Zusätzlich werden Fluoreszenzsignale von drei Fluoreszenzdetektoren (FL1, FL2, FL3) erfasst. Nach Anfärbung der Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorochrom) und Absorption der energiereichen Laserstrahlung kommt es durch Exzitation zu einer rasch abklingenden Lichtemission, der so genannten Fluoreszenz. Diese Lichtemission hat eine höhere Wellenlänge als die Exzitationswellenlänge. Dieses Phänomen wird zum Nachweis von Differenzierungsantigenen von Leukozyten benutzt. Dazu werden die Oberflächenantigene von Leukozyten mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) markiert, die mit den Fluorochromen Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythin (PE) oder Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP) konjugiert sind. Diese spezifisch an Differenzierungsantigene konjugierte Fluorochrome werden durch den Argonlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt und weisen spezifische Emissionsspektra mit Maxima bei 525 nm (FITC), 578 nm (PE) und 680 nm (PerCP) auf, die von den entsprechenden Detektoren FL1 (grün), FL2 (rot) bzw. FL3 (dunkelrot) registriert werden [Raffael et al. 1994]. Durch Kombination der verschiedenen mAbs können die Zellen in ihrer Antigen-Expression nach CD-Nomenklatur unterschieden werden.


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Zur Gewährleistung der Messgenauigkeit und zur Justierung der Geräteeinstellungen des FACScanTM -Durchflusszytometers wurde vor den Messungen eine Kalibrierung mit CaliBRITETM Beads (BD Biosciences, San Jose, USA) vorgenommen.

2.6  Immunphänotypisierung

Zur Zelltypisierung wurden der Lymphozyten-Marker CD3, der Monozyten-Marker CD14, der Panleukozyten-Marker CD45 und die NK-Zell-Marker CD16 und CD56 eingesetzt. Eine Kombination von Anti-CD45 FITC und Anti-CD14 PE (SimultestTM LeucoGATETM, BD Biosciences) wurde benutzt um Zelltrümmer, Monozyten und Granulozyten zu identifizieren und ein optimales Analyse-Fenster (Gate) für Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer zu setzen. Die Fluorochrome Anti-CD3 PerCP, Anti-CD16 FITC und Anti-CD56 PE (alle von BD Biosciences) wurden in Kombination zur Identifikation der NK-Zellen eingesetzt.

Es wurden jeweils 25 µl heparinisiertes Vollblut in Röhrchen (Falcon 2053, BD Labware Europe, Le Pont De Claix, France) gegeben, in welche 4 µl LeucoGATETM bzw. 3 µl CD3 PerCP-, 4 µl CD16 FITC- und 4 µl CD56 PE-Antikörper vorpipettiert waren. Die einzelnen Ansätze wurden mit einem Vortexer (Laborgerät zur Mischung von z. B. Suspensionen) gemischt und für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, um eine stabile Fixation der Antikörper an die Zellen zu erreichen. Dann wurde zur Lysierung von Erythrozyten jeweils 2 ml Lyse-Reagenz (Ortho-mune®, Ortho-Clinical-Diagnostics, Neckargemünd) hinzugegeben und sofort gemischt. Es folgte eine Inkubationszeit von 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Anschließend wurden die Ansätze bei 500 g für 10 min mit Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und die Zellpellets mit dem Vortexer gemischt. Im Anschluss wurde jeweils 4 ml PBS (Phosphate Buffered Saline, PAA Laboratories, Linz, Österreich) dazugegeben und die Ansätze nochmals gewaschen. Bis zur Messung wurden die Proben bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt. Auch nach der in Kapitel 2.7.1 beschriebenen Isolation mononukleärer Zellen aus Vollblut wurde analog eine Immunphänotypisierung durchgeführt, wobei auf den Einsatz des Lyse-Reagenz verzichtet werden konnte.


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2.7  Zytotoxizitäts-Assay

In der vorliegenden Arbeit wurde eine modifizierte Version der bereits beschriebenen Zytotoxizitäts-Assays von Slezak und Horan [Slezak/Horan 1989], Hatam et al. [Hatam et al. 1994] und Lötzerich und Hirt [Lötzerich/Hirt 1997] eingesetzt. Dabei wurde die Fähigkeit einer bestimmten Anzahl von NK-Zellen, innerhalb eines bestimmten Zeitraumes eine bestimmte Anzahl von NK-sensitiven Targetzellen zu lysieren, gemessen. NK-Zellen (Effektorzellen) wurden mit K562-Zellen (Targetzellen) inkubiert und anschließend der Anteil der lysierten Targetzellen durchflusszytometrisch bestimmt. Um eine Zellsuspension mit einem relativ hohen Anteil an NK-Zellen einsetzen zu können, wurden die Erythrozyten, Granulozyten und Thrombozyten von dem Vollblut-Untersuchungsmaterial getrennt. Diese Separation wurde nach dem Dichtegradienten-Verfahren durchgeführt [Böyum 1968] (siehe 2.7.1). Als Effektorzellen kamen somit mononukleäre Zellen (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) zur Anwendung, die vor allem aus Lymphozyten und Monozyten bestehen und einen NK-Zellanteil von ca. 10 bis 20 % haben. Die K562-Zelllinie wurde freundlicherweise von dem Labor der Klinik für Hämatologie/Onkologie der Kinderklinik der Charité zur Verfügung gestellt. Zur Markierung der Targetzellen wurde der grünfluoreszierende Farbstoff PKH2-GL (Sigma BioSciences, St.Louis, USA) eingesetzt, der in die Lipide der Zellmembran stabil aufgenommen und bewahrt wird [Horan et al. 1990], und der ein Emissionsmaximum von 504 nm aufweist. Im Anschluss an die Präparation der beiden Zellarten wurden für den Assay unterschiedliche Mischungsverhältnisse von Effektorzellen zu Targetzellen (E:T-Ratios) hergestellt. Nach einer zweistündigen Inkubationszeit wurde der rotfluoreszierende DNA-Farbstoff Propidiumjodid (PI) hinzugefügt, um die durch die Effektorzellen lysierten Targetzellen zu identifizieren. PI kann nur in Zellen eindringen, deren Zytoplasmamembran geschädigt ist, bindet dann spezifisch an die DNA und führt nach Exzitation zu einer messbaren Fluoreszenz mit einer Wellenlänge von 585 nm [Yeh et al. 1981].

2.7.1  Isolation der Effektorzellen

Zur Gewinnung der PBMC wurde das Heparinblut mit dem Kulturmedium AIM V (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Großbritannien) 1:1 verdünnt. AIM V hatte dabei je 500 ml als Zusatz 5 ml Glutamin (L-Glutamin, Seromed®, Biochrom, Berlin) sowie 2,5 ml Fungizone® (Amphoterecin B 250 µg/ml und Sodiumdesoxycholate 205 µg/ml, Gibco [Seite 40↓]BRL). Zur Separation der mononukleären Zellen durch Dichteunterschiede wurden 3 ml Ficoll (Dichte 1,077; Lymphoprep, Nycomed Pharma, Oslo, Norwegen) in Röhrchen (Cellstar®, Greiner Labortechnik, Frickenhausen) vorsichtig mit 3 ml dieser Blutverdünnung mit sterilen Pasteur-Einmalpipetten (Transferpipetten, 3,5 ml, Sarstedt, Nümbrecht) überschichtet. Anschließend wurde bei 700 g für 20 min ohne Bremse zentrifugiert. Mit Pasteur-Pipetten wurde der Lymphozytenring, der sich nach der Zentrifugation zwischen Plasma und Ficoll befindet, vorsichtig abpipettiert und in Röhrchen mit AIM V aufgefüllt. Anschließend wurde bei 500 g für 15 min mit Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Zellpellet mit einem Vortexer gemischt. Es folgte ein weiterer Waschschritt mit Zentrifugation. Der Überstand wurde nun mit einer Pipette abgezogen, es wurde mit 1000 µl AIM V aufgefüllt und wiederum mit dem Vortexer gemischt. Zur Einstellung der Zellzahl wurden 50 µl entnommen, in ein Eppendorf-Gefäß (safe-lock 1,5 ml, Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg) gegeben und 200 µl AIM V hinzugefügt. Die Zellzahl wurde mit einem automatisierten Zellzähler (Cell Dyn® 3500, Abbot Diagnostics) bestimmt und auf eine Konzentration von 5×106 PBMC/ml eingestellt, wobei mit AIM V aufgefüllt wurde.

2.7.2 Langzeit-Kultur und Präparation der Targetzellen

Die K562-Zellen wurden in einem Brutschrank (BB 6220/02, Heraeus Instruments, Hanau) bei 37 °C, 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 in Langzeit-Kultur gehalten. Als Komplettmedium wurde RPMI 1640 (Gibco BRL) mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FKS, Gibco BRL), 1 % L-Glutamin (Seromed®) und 1 % Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ 10.000 µg/ml, Seromed®) benutzt. Es wurden jeweils 20 ml K562-Zellsuspension in Zellkulturflaschen (250 ml tissue culture flask, Falcon, BD Labware Europe) in einer Konzentration von 3×105 K562-Zellen/ml angesetzt. Die Vitalität der Zellen wurde regelmäßig am Phasenkontrastmikroskop (Axiovert 10, Carl Zeiss, Oberkochen) und mit Trypanblau (0,5 %, Seromed®) am Lichtmikroskop überprüft. Bei Trypanblau handelt es sich um einen Farbstoff, der nur über eine defekte Zellmembran in das Zellinnere vordringen kann.

Für den Zytotoxizitäts-Assay wurden pro Proband 10 ml K562-Zellsuspension aus den Zellkulturflaschen entnommen, in zwei Röhrchen (Cellstar®, Greiner Labortechnik) gegeben und mit auf 30 °C vorgewärmtem RPMI 1640 aufgefüllt. Anschließend wurde mit 400 g für 10 min mit Bremse zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und [Seite 41↓]das Zellpellet mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig verwirbelt. Danach wurde noch zweimal mit RPMI 1640 gewaschen, da FKS-Reste die Membranfärbung behindern würden. Zur Zellzählung wurde das Zellpellet in 1 ml RPMI 1640 resuspendiert, davon wurden 20 µl entnommen und in ein Eppendorf-Gefäß gegeben, in das 80 µl Trypanblau vorpipettiert war. In einer Neubauer-Zählkammer wurde der Anteil der vitalen, nicht blau angefärbten K562-Zellen bestimmt, der mindestens 85 % betragen musste. Anschließend wurde für den Testansatz eine Konzentration von 1,0×106 K562-Zellen/ml mit Komplettmedium eingestellt.

2.7.3 Kryokonservierung und Auftauen der Targetzellen

Um optimale Bedingungen für den Zytotoxizitäts-Assay zu schaffen, wurden die in einer kontinuierlichen Wachstumsphase gehalten K562-Zellen alle 5 Wochen ausgetauscht. K562-Zellen besitzen die Fähigkeit zur spontanen Differenzierung in erythrozytäre, granulozytäre und monozytäre Vorläuferzellen [Lozzio et al. 1981]. Dadurch kann die Sensitivität für die lytische NK-Aktivität herabgesetzt werden. Deshalb wurden gut wachsende Zellen aus der Kultur eingefroren und zum routinemäßigen Austausch wieder aufgetaut. Dies war auch bei mangelnder Vitalität oder bakterieller Kontamination erforderlich. Dazu wurden aus den Kulturflaschen 80 ml Zellsuspension entnommen, gewaschen, mit RPMI 1640 resuspendiert und die Zellen auf eine Konzentration von 1×108 Zellen/ml eingestellt. Anschließend wurden 0,1 ml dieser Zellsuspension in eisgekühlte 1 ml Kryoröhrchen (Nunc, Wiesbaden) gegeben, mit 0,9 ml Einfriermedium aufgefüllt, gemischt und sofort in einem Styroporkästchen bei –80 °C eingefroren. Das Einfriermedium bestand zu 90 % aus FKS und zu 10 % aus DMSO (Dimethylsulfoxid, PAA Laboratories). Nach einem Tag wurden die Kryoröhrchen mit den Zellen in flüssigen Stickstoff übergeführt. Dort können sie bei Bedarf jahrelang gelagert werden.
Zum Auftauen der Zellen wurden diese sofort nach Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff bei 37 °C im Wasserbad aufgetaut und anschließend in 9 ml RPMI 1640 übergeführt. Dann wurde bei 400 g für 5 min zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Zellpellet mit Komplettmedium resuspendiert. Nach nochmaligem Waschen mit RPMI 1640 wurde die K562-Zellsuspension wieder in Zellkulturflaschen in einer Konzentration von 3×105 K562-Zellen/ml angesetzt.


[Seite 42↓]

2.7.4  Färbung der Targetzellen

Zur Herstellung der Targetzell-Färbelösung wurden 1 µl PKH2-GL zu 1 ml PBS in ein Reagenzröhrchen (Polypropylen Reagenzröhrchen, Falcon, BD Labware Europe) gegeben und der Färbeansatz mit dem Vortexer gemischt. Nun wurden 106 Targetzellen (1 ml) zu der Färbelösung gegeben, mit der Pipette gut gemischt und im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Auch im Folgenden wurden die angefärbten Targetzellen lichtgeschützt weiterverarbeitet. Nach 5 min wurde die Färbereaktion durch Zugabe von 2 ml FKS abgestoppt und 1 min inkubiert. Es wurde mit RPMI 1640 aufgefüllt und mit 400 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, das Zellpellet mit RPMI 1640 resuspendiert und die markierten Targetzellen in ein neues Reagenzröhrchen überführt, um das Einwirken von etwaigen Färbelösungsresten zu verhindern. Danach wurde noch dreimal mit RPMI 1640 gewaschen und eine Konzentration von 1,0×105 K562-Zellen/ml mit Komplettmedium eingestellt.

2.7.5 Testansatz und Inkubation

Je 100 µl Targetzellen in einer Konzentration von 1,0×105/ml wurden in 11 Reagenzröhrchen pipettiert. Röhrchen # 1 enthielt zur Überprüfung von Autofluoreszenz, d. h. ein Vorhandensein von Fluoreszenz ohne Markierung mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, nur Targetzellen. In Röhrchen # 2 und # 3 wurden zur Überprüfung der so genannten spontanen Lyse zum Zeitpunkt Null (t0), d. h. Zelltod ohne Einwirkung von Effektorzellen, Targetzellen mit 20 µl Propidiumjodid (PI, BD Labware) versetzt. Diese wurden auf dem Vortexer gemischt, in ein Eiswasserbad gestellt und vor der Messung 10 min lichtgeschützt inkubiert. Röhrchen # 4 und # 5 wurden zur Überprüfung der spontanen Lyse nach zweistündiger Inkubation mit PI versetzt. Somit wurde der Zelltod ohne Einwirkung von Effektorzellen nach zweistündiger Inkubation (t2) gemessen. Zur Bestimmung der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen wurden zu den Targetzellen in je zwei Röhrchen (# 6 – # 11) 100 µl, 50 µl bzw. 25 µl Effektorzellen in einer Konzentration von 5×106/ml gegeben, um Effektorzell-zu-Targetzell-Verhältnisse (E:T-Ratios) von 50/1, 25/1 und 12,5/1 herzustellen. Mit Komplettmedium wurde anschließend aufgefüllt, sodass alle Reagenzröhrchen einen Inhalt von 200 µl hatten. Die Röhrchen #4–#11 wurden 3 min bei 120 g zur Erleichterung der Konjugatbildung von Effektor- und Targetzellen zentrifugiert und 2 Stunden im Brutschrank inkubiert.


[Seite 43↓]

Tabelle 2.1 gibt eine Übersicht über das Pipettierschema. Insgesamt kamen 1,75×106 Effektorzellen und 1,1×105 Targetzellen zum Einsatz.

Tabelle 2.1:Pipettierschema Zytotoxizitäts-Assay

#

Ansatz/
E:T-Ratio

Effektorzellen
(µl)

Targetzellen
(µl)

Medium
(µl)

PI
(µl)

Inkubationszeit
(Stunden)

1

Autofluoreszenz

0

100

100

0

0

2

Spontane Lyse t0

0

100

100

20

0

3

Spontane Lyse t0

0

100

100

20

0

4

Spontane Lyse t2

0

100

100

20

2

5

Spontane Lyse t2

0

100

100

20

2

6

50/1

100

100

0

20

2

7

50/1

100

100

0

20

2

8

25/1

50

100

50

20

2

9

25/1

50

100

50

20

2

10

12,5/1

25

100

75

20

2

11

12,5/1

25

100

75

20

2

2.8 Durchführung und Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen

Die durchflusszytometrischen Daten wurden mit der Software CellQuestTM (Becton Dickinson) auf dem Computersystem Macintosh® Quadra 650 (Apple Computers, Cupertino, USA) erfasst und analysiert. Unmittelbar vor Messung am Durchflusszytometer wurde das jeweilige Röhrchen mit dem Vortexer kurz gemischt, um Zellkonjugate zu lösen und wieder eine Zellsuspension zu erhalten. Zum Ausschluss von Zelltrümmern von der Analyse wurde bei der anschließenden durchflusszytometrischen Messung in der korrelierten Zweiparameterdarstellung (FSC/SSC) individuell ein elektronischer Schwellenwert (Threshold) im Vorwärtsstreulichtkanal gesetzt, oberhalb dessen der Messvorgang ausgelöst wurde. [Seite 44↓]Zur Immunfluoreszenzmessung wurden pro Röhrchen 50.000–75.000 Zellen erfasst. Durch Setzen eines Gates in der FSC/SSC-Zweiparameterdarstellung und anschließende Kontrolle der weitgehenden CD45-Positivität (Panleukozyten-Marker) und CD14-Negativität (Monozyten-Marker) mittels des LeucoGATETM-Kombinationsfarbstoffes im Einparameter-Histogramm wurde ein optimales Lymphozyten-Auswertefenster gewählt. Unter Beibehaltung dieses Gates wurden die Anti-CD3/CD16/CD56-gefärbten Zellen analysiert. In der Einparameter-Histogrammdarstellung wurden durch Setzen eines Gates CD3-Zellen ausgewählt, die dann im Punktewolkenhistogramm nach Setzen von Marken auf CD16- und/oder CD56-Positivität hin quantifiziert wurden. Die Anzahl dieser Ereignisse wurde dann anteilsmäßig auf die Lymphozytenanzahl bezogen. Die Werte der CD3CD56/16+-Zellen wurden durch Addition der Werte der Untergruppen CD3CD56+CD16, CD3CD56+CD16+ und CD3CD56CD16+ errechnet. Die absolute Zahl der CD3CD56/16+-Zellen wurde aus der Leukozytenzahl berechnet.
Zur Zytotoxizitätsmessung wurden pro Röhrchen 100.000–500.000 Zellen erfasst. In der Einparameter-Histogrammdarstellung wurden im FL1-Kanal mindestens 5.000 Zellen mit starker Grünfluoreszenz (K562-Zellen) durch Setzen eines Gates ausgewählt und anschließend im FL3-Kanal der Anteil der Zellen mit starker Rotfluoreszenz (lysierte K562-Zellen) bestimmt. Diese Lyserate, die den prozentualen Anteil der lysierten Targetzellen im Röhrchen repräsentierte, wurde jeweils doppelt bestimmt und gemittelt. Anschließend wurde der Prozentwert der ohne Einwirkung von Effektorzellen lysierten Targetzellen (Mittelwert Röhrchen #4 und #5) – die so genannte spontane Lyse – abgezogen, um die spezifische Lyserate zu ermitteln. Nachdem dies bei den drei E:T-Ratios 50/1, 25/1 und 12,5/1 erfolgte, wurden die Ergebnisse des Zytotoxizitäts-Assays mit PSL 50/1, PSL 25/1 und PSL 12,5/1 (Prozent der spezifischen Lyse) präsentiert.
Neben der Veröffentlichung von Rohdaten, wie bei der vorliegenden Arbeit, wird die Aktivität von zytotoxischen Zellen von einigen Arbeitsgruppen mittels so genannter Lytischer Einheiten (LU, lytic units) [Pross et al. 1981] angegeben. Hierbei wird z. B. nach Bryant et al. per Formel aus den verschiedenen PSLs ein Score errechnet, um das Ergebnis von Zytotoxizitäts-Assays mit einem einzigen numerischen Wert mitteilen zu können [Bryant et al. 1992]. Diese Vorgehensweise hat substanzielle Kritik erfahren, da die eingesetzten Rechenverfahren von der Annahme einer nicht-linearen Dosis-Wirkungsbeziehung ausgehen, die in einer inakkuraten Zytotoxizität im Vergleich zu [Seite 45↓]den tatsächlich beobachteten zytotoxischen Daten resultieren kann [Pollock et al. 1990]. Deshalb wurde bei der vorliegenden Arbeit auf die Verwendung von Lytischen Einheiten zur Datenanalyse und Ergebnisdarstellung verzichtet.

2.9  Assay-Ausschlussgründe

Erhöhte Werte der spontane Lyserate sprechen für eine gestörte Vitalität der Targetzellen und haben möglicherweise falsch hohe Lyseraten im NK-Assay zur Folge. Die spontane Lyserate der K562-Zellen muss deshalb unter 12 % liegen. Ein Wert in dieser Größenordnung wird auch von anderen Arbeitsgruppen als Grenzparameter angesehen [Hatam et al. 1994] [Whiteside et al. 1990].
Friberg et al. fordern für ein gültiges Testergebnis eines in-vitro NK-Assays eine ansteigende Dosis-Wirk-Beziehung zwischen PSL und ansteigender E:T-Ratio [Friberg et al. 1996]. Eine höhere Lyserate der Targetzellen bei einer niedrigeren eingesetzten Effektorzellzahl widerspricht dem Dosis-Wirkungs-Prinzip und somit einem nachvollziehbaren Effekt.

Als Ausschlusskriterien für die Ergebnisse des NK-Assays galten somit:

2.10  Analyse der persistenten organischen Schadstoffe

Im Rahmen der oben erwähnten Dioxin-Studie wurden zur Erfassung der individuellen Belastung POP-Analysen aus dem Plasma der Probanden von der ERGO Forschungsgesellschaft (Hamburg) durchgeführt. Aufgrund der nur im begrenzten Rahmen zur Verfügung stehenden Probenmenge musste die bisher gebräuchliche Isotopenverdünnungsmethode neu entwickelt werden [Päpke 1997]. Die davon abgewandelte Methode wird im Folgenden kurz beschrieben:
Aus dem Plasma der Probanden erfolgte durch mehrfache Extraktionsschritte die Elution der Fette, welche die Dioxine und andere unpolare Kontaminaten enthielten. Anschließend wurden planare (PCDDs/PCDFs und dioxinähnliche Moleküle) von nicht-planaren Molekülen getrennt. PCDDs/PCDFs wurden getrennt von mono- und di-ortho PCBs und anderen Chlorkohlenwasserstoffen weiterverarbeitet, d. h. eluiert und über spezielle Säulensysteme zur Adsorption gegeben. Hiernach erfolgte die [Seite 46↓]POP-Messung mittels gekoppelter High Resolution Gas Chromatography und High Resolution Mass Spectrometry (HRGC/HRMS). Die Analytik wurde von einem umfassenden Qualitätssicherungsprogramm begleitet. Die mitgeteilten POP-Werte sind auf das Gesamt-Fett im Plasma bezogen, welches mittels Formel [Phillips et al. 1989] aus den Cholesterin- und Triglycerid-Werten im Plasma berechnet wurde.

Von den insgesamt 37 analysierten Verbindungen waren für die vorliegende Arbeit 3 Verbindungsgruppen sowie 3 Einzelsubstanzen relevant. Das Hauptinteresse lag aufgrund obiger Überlegungen auf PCDDs und PCDFs, die zur Beurteilung wie oben beschrieben als Verbindungsgruppe in I-TEqs angegeben wurden (siehe auch 1.1). Die drei PCB-Kongenere 138, 153 und 180 geben als so genannte Indikator-PCBs, mit einem Anteil von ungefähr 60 % an den PCBs, einen Hinweis auf die Gesamt-PCB-Exposition. Die Konzentrationen der drei Kongenere wurden addiert und als Summe wiedergegeben (Σ PCB 138, 153, 180; ng/g Fett). PCDD-, PCDF- und PCB-Konzentrationen wurden ferner nach der ebenfalls oben beschriebenen WHO-Methode zusammengefasst und in WHO-TEFs angegeben. Die Einzelsubstanzen ß-HCH, HCB und pp-DDE wurden aufgrund der höchsten gemessenen Einzelkonzentrationen ausgewählt.

Im Einzelnen wurden für die vorliegende Arbeit folgende Substanzen gemessenen:

Diese Verbindungen waren bei allen gestillten Kindern messbar.


[Seite 47↓]

2.11  Zusätzliche Untersuchungen bei Erwachsenen

Unabhängig von den Untersuchungen der vorgenannten Probanden konnten zwei erwachsene Personen untersucht werden, die aus unbekannten Gründen extrem hoch mit TCDD belastet waren. Die 30 (Person 1) bzw. 27 Jahre (Person 2) alten Frauen wurden durch eine Chlorakne auffällig und arbeiteten beide in einem Büroraum eines Textilforschungs-Instituts in Österreich. Möglicherweise kam es dort zu einer akzidentellen enteralen TCDD-Exposition, das aus 2,4,5-Trichlorphenol stammen könnte, mit welchem in dem Instituts-Labor gearbeitet wurde. Ein krimineller Hintergrund ist nicht ausgeschlossen. Person 1 hatte eine schwere Chlorakne, palmoplantare Hyperkeratosen, gastrointestinalen Symptome und eine sekundäre Amenorrhoe. Sie wurde unter anderem mit Methylprednisolon (4 – 40 mg täglich), Analgetika und Antibiotika behandelt. Bei Person 2 traten neben einer milden Chlorakne ebenfalls gastrointestinale Symptome auf, sie wurde mit einem topischen Retinoid behandelt. Beide Personen waren Nichtraucherinnen. Person 1 hatte mit maximal 144.000 pg TCDD/g Fett den höchsten jemals aufgezeichneten individuellen TCDD-Wert eines erwachsenen Menschen, während Person 2 einen Wert von maximal 26.000 pg TCDD/g Fett aufwies [Abraham 2002] [Geusau et al. 2001]. Durch die Untersuchung dieser Personen war es möglich, die Auswirkungen einer TCDD-Belastung, welche weit über der üblichen Hintergrundbelastung lag, auf die NK-Zytotoxizität zu untersuchen.
Neben diesen beiden Personen wurden aus Vergleichsgründen zehn nach allgemeinen Gesichtspunkten gesunde erwachsene Probanden untersucht. Die im Folgenden als „Erwachsenengruppe“ bezeichneten erwachsenen Probanden waren im Mittel 34 ± 8 Jahre alt, 6/10 (60 %) waren männlich, 4/10 (40 %) weiblich und 9/10 (90 %) waren Nichtraucher.

2.12  Berechnungen und statistische Verfahren

Zur Prüfung möglicher linearer Zusammenhänge wurde in der bivariaten Korrelationsanalyse der Spearman Rho-Korrelationskoeffizient r s mit zweiseitigem Signifikanzniveau p errechnet.
Im Falle des Vorliegens von Kovariablen wurden mit der multivariaten linearen Regressionsanalyse die standardisierten Regressionskoeffizienten ß mit dem Einschlussverfahren berechnet.
[Seite 48↓]Beim Vergleich zweier Merkmale der Gesamtgruppe wurde der t-Test für abhängige Stichproben und zum Vergleich zweier Gruppen anhand eines Merkmales der t-Test für unabhängige Stichproben verwandt.
Von einem statistisch signifikanten Ergebnis der oben genannten Testverfahren wurde bei p-Werten unterhalb von 0,05 ausgegangen.

Zur Ermittlung der intraindividuellen Reproduzierbarkeit y R bei Wiederholungsuntersuchungen wurde der Mittelwert der durchschnittlichen Abweichung der zu zwei Zeitpunkten bestimmten Parameter durch die Anzahl der Probanden des Gesamtkollektivs geteilt und dies in Relation zur Standardabweichung des Gesamtkollektivs gesetzt:

2.13 Datenverarbeitung

Zur Speicherung, statistischen Analyse und tabellarischen bzw. grafischen Darstellung der während der Studie gewonnenen Daten wurde die Computersoftware Word und Excel 97/2000 (Microsoft®, Redmond, USA) und SPSS® für Windows 10 (SPSS, Chicago, USA) benutzt.

2.14 Grafische Darstellung

Zur Darstellung der Verteilung einzelner Variablen wurden Histogramme mit Normalverteilungskurve und Kreisdiagramme erstellt.
Bei der Prüfung von Assoziationen und zur Darstellung von zwei Variablen wurden Streudiagramme verwandt.
Zur Veranschaulichung mehrerer Variablen wurden Boxplots mit Median, Interquartilbereich und Ausreißern erstellt. Hierbei wurden Ausreißer durch einen Kreis markiert und als die Werte definiert, die 1,5 bis 3 Interquartilsabstände vom oberen oder unteren Quartil entfernt waren.


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