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4  Diskussion

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Messung der NK-Zellzahlen und der NK-Aktivität bei gestillten und nicht gestillten Kindern und die Untersuchung möglicher Unterschiede dieser Parameter aufgrund unterschiedlicher Belastung mit persistenten organischen Schadstoffen. Die Umsetzung dieses Studienkonzeptes verlief weitgehend problemlos. Die 66 untersuchten Kinder der vorliegenden Arbeit waren ein Teilkollektiv der oben genannten Dioxin-Studie (n = 101). Da diese Untersuchungen länger dauerten als ursprünglich geplant, mussten nach 558 Tagen die Untersuchungen für die vorliegende Arbeit abgebrochen werden. Die Messungen selbst konnten bei einer gewissen Aufwändigkeit der durchflusszytometrischen Methode problemlos durchgeführt werden. Die Analyse der erhobenen Daten war durch die fehlende zeitliche Stabilität der Werte des Zytotoxizitäts-Assays erschwert, deren genaue Ursache ungeklärt blieb.

4.1 Leukozyten und Lymphozyten

Da die NK-Zellen eine Subpopulation der Lymphozyten darstellen, sind zur Interpretation der absoluten NK-Zellzahlen Messungen des weißen Blutbildes nötig und Auffälligkeiten dieser zellulären Parameter von Interesse. Bei den 66 untersuchten Kindern fanden sich im Mittel 9,2 Leukozyten/nl und 5,4 Lymphozyten/nl (relativ 59 %). Diese Kinder sind eine Teilgruppe des Kollektivs der oben erwähnten Dioxin-Studie, welches bei insgesamt 101 Kindern im Mittel Werte von 9,1 ± 2,4 Leukozyten/nl (Median 8,7) und 5,3 ± 1,7 Lymphozyten/nl (Median 5,0; relativ 58,0 ± 10,8 %) aufwies [Abraham 2000]. Die Ergebnisse der Teilgruppe waren erwartungsgemäß vergleichbar mit denen des Gesamtkollektivs.
Es existieren keine Referenzwerte für genau 11 Monate alte Kinder, sondern häufig nur Normalwerte für das gesamte erste Lebensjahr. Da sich aber in diesem Zeitraum große physiologische Veränderungen der Lymphozytenzahlen abspielen [De Vries et al. 1999], macht ein Vergleich mit solchen Referenzwerten nur begrenzt Sinn. Eine Veröffentlichung von Comans-Bitter et al. gab für den am ehesten vergleichbaren Alterszeitraum von 9 bis 15 Monaten einen Normalwert im Median von 5,5 Lymphozyten/nl (2,6–10,4; 5.–95. Perzentil) an [Comans-Bitter et al. 1997], womit die beim vorliegenden Kollektiv gefundenen Lymphozytenwerte gut übereinstimmen. Zudem ist zu beachten, dass diese Studien Confounder wie Stress und leichte Infekte [Seite 73↓]vermutlich weniger beachtet und demzufolge nicht kontrolliert hatten. Die Dioxin-Studie ist die einzige Arbeit, die für den Alterszeitpunkt des vorliegenden Kollektivs Blutbild-Werte unter optimalen Bedingungen erhoben hat. Dabei wurde nicht nur hinsichtlich der Auswahl von allgemein gesunden und weitgehend infektfreien Probanden, sondern auch bei der Schaffung von bestmöglichen Bedingungen bei der Blutentnahme mit größter Sorgfalt gearbeitet. Diese wurde immer nach Anwendung eines Lokalanästhetika-Pflasters parallel zum ersten Frühstück des Kindes zu Hause durchgeführt. Dadurch konnte bei 88/101 (87 %) Kindern aus der Dioxin-Studie ein längeres Schreien aufgrund der Blutentnahme vermieden werden. Bei 13/101 (13 %) Kindern bestanden wahrscheinlich aufgrund von Schreien höhere Leukozytenwerte [Abraham 2000], im Sinne einer so genannten Stress-Leukozytose.

Durch die angewandte Standardmethode zur Isolation von mononukleären Zellen aus Vollblut musste vor den durchflusszytometrischen Messungen keine Lyse zur Entfernung der Erythrozyten durchgeführt werden. Es kam zu einer Steigerung des Lymphozyten-Anteils von durchschnittlich 59 % (Vollblut) auf 86 % (PBMC-Zellsuspension).

4.2 Natürliche Killerzellen

Bei den 66 Kindern fanden sich im Mittel 0,35 CD3CD16/56+-Zellen/nl, die somit einen Anteil von 6,4 % an den Lymphozyten besaßen. Die 101 Kinder der Dioxin-Studie wiesen gemittelt 0,30 CD3CD16/56+-Zellen/nl und anteilsmäßig 5,8 % der Lymphozyten auf [Abraham 2000]. Bei dem Vergleich dieser Ergebnisse mit anderen Veröffentlichungen sind wiederum obige Anmerkungen bezüglich der Normwerte zu beachten. Comans-Bitter et al. gaben für CD3CD16/56+-Zellen im Lebensalter von 9 bis 15 Monaten (n = 70) einen Normalwert im Median von 0,4 Zellen/nl (0,2–1,2; 5.–95. Perzentil) an [Comans-Bitter et al. 1997]. De Vries et al. hatten bei einer Längsschnitt-Studie CD3CD16/56+-Zellzahlen von Kindern (n = 10) untersucht und im 12. Lebensmonat Medianwerte von 0,4 Zellen/nl (Spannweite 0,3–0,9) sowie einen Anteil von 5 % (Spannweite 3–11) an den Lymphozyten gefunden [De Vries et al. 2000]. Hawkes et al. hatten in einer Studie die NK-Zellzahlen von gestillten (n = 79) und nicht gestillten (n = 69) Kindern im 6. Lebensmonat verglichen. Dabei wiesen gestillte Kinder im Median 0,5 CD3CD16/56+-Zellen/nl (0,1–1,5; 5.–95. Perzentil) und einen Anteil im Median von 9,7 % (4,0–20,0; 5.–95. Perzentil) der Lymphozyten auf. Nicht gestillte [Seite 74↓]Kinder besaßen ebenfalls im Median 0,5 CD3CD16/56+-Zellen/nl (0,2–1,0; 5.–95. Perzentil). Deren relativer NK-Zell-Anteil war mit im Median 7,1 % (3,0–15,0; 5.–95. Perzentil) der Lymphozyten signifikant niedriger (p < 0,001) [Hawkes et al. 1999]. Carver et al. konnten hingegen bei gestillten (n = 7) und nicht gestillten (n = 11) Kindern im 6. Lebensmonat keinen signifikanten Unterschied der relativen NK-Zellzahlen (CD3CD16+) beobachten, wobei die Fallzahl relativ klein war [Carver et al. 1991b].
Wie bei den Leukozyten- und Lymphozyten-Werten lagen die NK-Zellzahlen der für die vorliegende Arbeit untersuchten Kinder im unteren Bereich der veröffentlichten Normalwerte von obigen Arbeitsgruppen [Comans-Bitter et al. 1997] [De Vries et al. 2000]. In der statistischen Analyse bestanden bei dem vorliegenden Untersuchungskollektiv im Gruppenvergleich mittels t-Test zwischen gestillten und nicht gestillten Kindern keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der absoluten und relativen NK-Zellzahlen (Gesamt- und Subpopulationen). Auch bei der Korrelationsanalyse der Zellzahlen mit der äquivalenten Vollstillzeit bestanden keine signifikanten Assoziationen. Das vorliegende Untersuchungskollektiv wurde im Vergleich zu den oben erwähnten Studien nicht während der (Voll-)Stillperiode untersucht, aufgrund des Studiendesigns waren die Probanden zum Untersuchungszeitpunkt teilgestillt oder bereits abgestillt. Falls es sich bei den oben zitierten Zellzahl-Unterschieden nur um einen transitorischen Effekt während der Vollstillzeit handeln sollte, konnte dieser somit nicht erfasst werden.

Einige wenige Arbeitsgruppen haben NK-Zellzahlen bei erwachsenen Männern und Frauen verglichen, wobei zum Teil keine geschlechtsspezifischen Unterschiede gefunden wurden [Tollerud et al. 1989] [Yovel et al. 2001] und zum Teil Männer signifikant höhere NK-Zellzahlen als Frauen aufwiesen [Lee 1996] [Reichert et al. 1991]. Da es keine Veröffentlichungen über geschlechtsspezifische Variationen im Altersbereich der untersuchten Kinder gibt, kann über eine Übertragbarkeit der obigen Ergebnisse auf Kinder und Säuglinge nur spekuliert werden. Eine Assoziation der NK-Zellzahlen mit dem Geschlecht ließ sich bei dem vorliegenden Studienkollektiv nicht nachweisen.

Die Reproduzierbarkeit der NK-Zellzahlen konnte bei 14 von 66 Probanden durch Wiederholungsuntersuchungen evaluiert werden. Bei einem Untersuchungsabstand von durchschnittlich 29 Tagen waren die absoluten NK-Zellzahlen besser als die relativen [Seite 75↓]NK-Zellzahlen reproduzierbar, wobei nur die größte NK-Zell-Subpopulation – wie auch die absolute Lymphozytenzahl – eine gute Reproduzierbarkeit im Sinne der oben genannten Kriterien aufwies (siehe 2.12 und 3.5).

Die prozentualen Anteile der NK-Subpopulationen zeigten vor und nach PBMC-Isolation im t-Test signifikante Unterschiede. Hier kam es anscheinend durch die Standardmethode zur Isolation von mononukleären Zellen aus Vollblut zu einem geringen selektiven Zellverlust der CD3CD56+CD16+-Subpopulation mit entsprechendem relativen Zugewinn der anderen beiden Subpopulationen. Diese Veränderung ist als geringfügig einzustufen, zeigt aber, dass das PBMC-Untersuchungsmaterial des in-vitro Zytotoxizitäts-Assays signifikante Unterschiede zum ursprünglichen Vollblut-Untersuchungsmaterial hinsichtlich der Häufigkeitsverteilung der NK-Subpopulationen aufwies. Eine direkte Messung der NK-Aktivität aus Vollblut wäre hier zwar wünschenswert, aber alle diesbezüglichen Methoden weisen praktische Probleme durch den geringen relativen Anteil der NK-Zellen im Vollblut auf.

4.3 Natürliche Killerzellen und POPs

Bei der Korrelationsanalyse der einzelnen NK-Subpopulationen mit den persistenten organischen Schadstoffen waren zum Teil signifikante negative Assoziationen ersichtlich. Bei Betrachtung der NK-Gesamtpopulation bestanden hingegen keine signifikante Korrelationen. Auch bei dem Gesamtkollektiv der Dioxin-Studie ließen sich keine signifikanten Korrelationen zwischen NK-Gesamtpopulation und POPs nachweisen. In der weitergehenden statistischen Analyse mittels multivariater linearer Regression ließen sich signifikante negative Assoziationen von ß-HCH mit den relativen und absoluten Zellzahlen der CD3CD56CD16+-Zellen nachweisen. Auch mit HCB bestanden hier signifikante Assoziationen, die im Gegensatz zu der Korrelationsanalyse allerdings positiv waren.
Wie in der Einleitung bereits erwähnt, existiert nur eine geringe Anzahl an Veröffentlichungen über Einflüsse von POPs auf NK-Zellzahlen. Dabei hatten zwei Arbeitsgruppen signifikant niedrigere Zellzahlen in Bezug auf Exposition mit PCBs und DDT bzw. Dioxin-artigen PHAHs gefunden [Svensson et al. 1994] [Van Den Heuvel et al. 2002], während weitere Studien keinen signifikanten Effekt einer POP-Belastung auf NK-Zellzahlen beobachten konnten. Insbesondere die Veröffentlichung von Weisglas-Kuperus et al., welche vom Studienkollektiv der vorliegenden Arbeit am nächsten kam, [Seite 76↓]konnte keine signifikanten Dioxin/PCB-Effekte auf die NK-Zellzahlen gestillter Kinder beobachten [Weisglas-Kuperus et al. 1995]. Bei Erwachsenen beschrieb eine weitere Arbeitsgruppe eine signifikante negative Assoziation der NK-Zellzahlen mit dem Chlorakne-Status belasteter Arbeiter, nicht aber mit der TCDD-Exposition [Ott et al. 1994]. Eine andere Arbeitsgruppe fand bei TCDD-Exponierten signifikant höhere Zahlen von CD57+-Zellen, die zu ungefähr 60 % NK-Zellen sind, aber auch zu T-Lymphozyten-Subpopulationen gehören können [Jennings et al. 1988]. Die Interpretation der Ergebnisse dieser Arbeiten ist dabei durch verschiedene Faktoren erschwert. Es lagen sehr unterschiedliche individuelle Dosierungen und Arten der Exposition vor, wobei es sich zudem meist um Mischexpositionen mit verschiedenen POPs und zum Teil auch anderen chemischen Substanzen handelte. Im Rahmen der epidemiologischen Studien am Menschen können keine Aussagen über kausale Effekte von POPs gemacht werden, demzufolge ist für eine einzelne Substanz keine Aussage bezüglich ihrer Wirkung z. B. auf NK-Zellzahlen möglich. Ferner haben zwar einige Arbeitsgruppen Confounder wie Lebensalter, Krankheiten und Alkoholkonsum kontrolliert, häufig sind aber andere wichtige Einflussfaktoren wie das Zigarettenrauchen im Studiendesign nicht berücksichtigt worden.
Zusammenfassend gesehen liegen keine Berichte über konsistente POP-Effekte auf NK-Zellzahlen beim Menschen vor. Einflüsse auf einzelne NK-Subpopulationen wurden nicht untersucht. Bei dem vorliegenden Kollektiv war ein kausaler signifikanter Zusammenhang zwischen der POP-Exposition und einer Veränderung der NK-Zellzahlen nicht ersichtlich. Die oben genannten signifikanten Assoziationen zweier NK-Subpopulationen waren teilweise inkonsistent und möglicherweise zufallsbedingt. Dabei lagen die beobachteten mittleren Konzentrationen im Hintergrundbereich. Ausgehend von der Annahme einer dosis-abhängigen Wirkung, lagen die POPs hier möglicherweise nicht in einem ausreichend hohen Konzentrationsbereich vor, um messbare Unterschiede hervorzurufen. Es kann nicht ausgeschlossen werde, dass es im Bereich höherer Konzentrationen doch zu signifikanten Effekten kommen kann. Da es in Deutschland aber aufgrund der bereits erwähnten gesetzlichen Regelungen insgesamt zu einer rückläufigen Hintergrundbelastung kommt, erscheint eine Entwarnung bezüglich potenzieller Effekte der vorliegenden POPs auf NK-Zellzahlen gerechtfertigt.


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4.4  Zytotoxische Aktivität

Die Zytotoxizitäts-Messungen erbrachten für die 66 Probanden im Mittel Lyseraten der PSL 50/1 von 12,5 %, der PSL 25/1 von 7,5 % und der PSL 12,5/1 von 4,2 %. Die PSLs wiesen untereinander erwartungsgemäß einen hohen Grad an Korrelation auf und entsprachen auch dem erwarteten Konzentrations-abhängigen Wertemuster der eingesetzten Effektorzell-zu-Targetzell-Ratios. Die drei unterschiedlichen E:T-Ratios dienten dabei vor allem zur testinternen Kontrolle, während die höchste E:T-Ratio (PSL 50/1) Unterschiede zwischen den Probanden am deutlichsten abbildete und somit als wichtigster Parameter anzusehen war. Die eingesetzte durchflusszytometrische Methode zur Messung der zytotoxischen NK-Aktivität erwies sich als relativ schnell durchführbar, innerhalb von 8 Stunden lagen jeweils die ersten Messergebnisse vor. Allerdings zeigte sich im Laufe des Untersuchungszeitraumes von über eineinhalb Jahren eine fehlende zeitliche Stabilität der Messergebnisse. In der daraufhin durchgeführten weitergehenden statistischen Analyse zeigte sich eine signifikante Korrelation (r s = 0,747, p < 0,01) zwischen den Lyseraten und dem Untersuchungstag. Auch die äquivalente Vollstillzeit wies in der Spearman-Korrelationsanalyse eine signifikante Assoziation mit dem Untersuchungstag auf (r s = –0,280, p < 0,05). Im t-Test für unabhängige Stichproben zeigte sich dagegen kein signifikanter Unterschied nach Testung des Untersuchungstages gegen die Gruppenvariable Stillen. Dies bedeutet, dass die gestillten und nicht gestillten Kinder im Untersuchungszeitraum nicht signifikant unterschiedlich verteilt waren, aber Kinder mit einer längeren Vollstillzeit eher zu Anfang des Untersuchungszeitraumes untersucht wurden. Da es allerdings keine signifikanten Korrelationen zwischen der äquivalenten Vollstillzeit und den Lyseraten gab, war ein diesbezüglicher kausaler Einfluss unwahrscheinlich.
Fünf der sechs gemessenen POPs bzw. POP-Verbindungsgruppen wiesen signifikante negative Assoziationen in der Spearman-Korrelationsanalyse mit dem Untersuchungstag auf: I-TEq (r s = –0,256, p < 0,05), WHO-TEq (r s = –0,317, p < 0,05), Σ PCB 138, 153, 180 (r s = –0,344, p < 0,01), ß-HCH (r s = –0,292, p < 0,05) und HCB (r s = –0,246, p < 0,05). Ferner waren alle POPs in der Spearman-Rho-Korrelationsanalyse erwartungsgemäß hoch signifikant mit der äquivalenten Vollstillzeit assoziiert (p < 0,001). In der multivariaten Regressionsanalyse wurde dann die Assoziation der einzelnen POPs mit dem Untersuchungstag und der äquivalenten Vollstillzeit untersucht. Hier ergaben sich jeweils hoch signifikante negative [Seite 78↓]Assoziationen mit der äquivalente Vollstillzeit (p < 0,001), während sich nur bei Σ PCB 138, 153, 180 eine signifikante Assoziation mit dem Untersuchungstag fand (p < 0,05). Ein kausaler Einfluss der POPs auf den beobachteten Anstieg der Lyseraten im Untersuchungszeitraum erscheint somit unwahrscheinlich (siehe auch 3.4).
Bei der Suche nach möglichen Ursachen für die ansteigenden Lyseraten wurden alle denkbaren Confounder überprüft. Dabei zeigte sich, dass anscheinend weder ein Selektions-Bias bezüglich des Kollektives vorlag, noch ein systematischer Messfehler aufgrund der benutzten Geräte. Möglicherweise kam es im Rahmen des routinemäßigen Austausches der in Langzeit-Kultur befindlichen K562-Targetzellen zu einer gesteigerten Sensitivität gegenüber der zytotoxischen NK-Aktivität der Effektorzellen. Die jeweils eingesetzten Targetzellen wiesen allerdings weder morphologische Auffälligkeiten (am Phasenkontrastmikroskop) noch einen geringeren Vitalitätsgrad (in der Trypanblau-Färbung) im Vergleich zum Beginn der Untersuchung auf. Auch die spontane Lyserate, die als Neigung der eingesetzten Targetzellen eine Membranschädigung ohne äußere Einwirkung zu erleiden angesehen werden kann, zeigte keine signifikante Änderung im Untersuchungszeitraum. Alle anderen eingesetzten Materialien konnten als Bestandteile eines systematischen Fehlers ausgeschlossen werden. Die genaue Ursache dieses Anstiegs der Messwerte war letztlich trotz genauer Prüfung der jeweiligen Testbedingungen nicht ermittelbar.
Gegenüber Funktionstests anderer Leukozyten-Fraktionen, wie z. B. einem Proliferationstest der T-Lymphozyten nach Mitogen/Antigen-Stimulation, ist man bei der Messung der zytotoxischen Aktivität von NK-Zellen oder auch von zytotoxischen T-Lymphozyten auf die Verwendung von Targetzellen angewiesen. Da sich diese zumeist in Langzeit-Kultur befinden, können sie keine stabilen bzw. zeit-unabhängigen Eigenschaften besitzen. Dies kann sich vor allem bei längeren Studienzeiträumen und Längsschnitt-Beobachtungen negativ als Confounder auswirken. Dementsprechend müsste man optimalerweise alle Untersuchungen an einem Tag durchführen, dies war jedoch Methoden- und Ressourcen-abhängig nicht möglich. Aufgrund dieser Problematik der Störanfälligkeit waren mit der in der vorliegenden Arbeit eingesetzten durchflusszytometrischen Methode zur NK-Aktivitäts-Messung vor allem qualitative oder semiquantitative Aussagen möglich.


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Nur wenige veröffentlichte Studien befassten sich mit der zytotoxischen Aktivität von NK-Zellen bei gesunden Kindern. Da die jeweiligen Ergebnisse zudem stark methodenabhängig sind, ist es hier grundsätzlich nicht möglich, Referenzwerte anzugeben. Das für die vorliegende Arbeit parallel untersuchte Kollektiv von erwachsenen Probanden (n = 10) wies im Mittel Lyseraten der PSL 50/1 von 27,4 %, der PSL 25/1 von 14,4 % und der PSL 12,5/1 von 7,4 % auf. Diese Werte lagen 14,9 %, 6,9 % bzw. 3,2 % höher als die Mittelwerte der untersuchten Kinder. Dabei ist zu beachten, dass die Erwachsenen niedrigere absolute NK-Zell-Zahlen im Vergleich zu den Kindern besaßen. Hierzu stehen die höheren Lyseraten nicht unbedingt im Widerspruch, denn eine Altersabhängigkeit der NK-Aktivität wurde beschrieben. Noble und Warren berichteten, dass bei ihren Untersuchungen die NK-Aktivität von bis zu 4jährigen Kindern (n = 19) im Vergleich zu 21- bis 39jährigen Erwachsenen (n = 38) signifikant niedriger war. Dabei waren Alter und Höhe der NK-Zytotoxizität in den ersten fünf Lebensjahren direkt miteinander korreliert. Die Höhe der entsprechenden NK-Zellzahlen wurde dabei nicht mitgeteilt [Noble/Warren 1985]. Yabuhara et al. beschrieben, dass trotz sehr niedriger NK-Aktivität in der Neonatalperiode fast das Erwachsenen-Niveau im 1. bis 5. Lebensmonat erreicht wurde. Bei Messungen der NK-Aktivität betrug die PSL 20/1 von Kindern zur Geburt 15 ± 6 % (MW± SD; n = 26), am 1.–3. Lebenstag 22 ± 8 % (n = 7), im 1.–5. Lebensmonat 36 ± 12 % (n = 7), im 6.–12. Lebensmonat 42 ± 9 % (n = 12), im 1.–4. Lebensjahr 41 ± 8 % (n = 23), im 5.–8. Lebensjahr 40 ± 8 % (n = 13), im 9.–13. Lebensjahr 38 ± 8 % (n = 19) und bei Erwachsenen 38 ± 8 % (n = 42). Hierbei wurden folgende NK-Zellzahlen angegeben: Geburt 1,2 ± 0,5 CD3CD16/56+-Zellen/nl (n = 11), 1.–5. Lebensmonat 1,4 ± 0,7 Zellen/nl (n = 6), 6.–12. Lebensmonat 1,4 ± 0,6 Zellen/nl (n = 7), 1.–4. Lebensjahr 1,2 ± 0,6 Zellen/nl (n = 8), 5.–8. Lebensjahr 0,9 ± 0,3 Zellen/nl (n = 6), 9.–13. Lebensjahr 0,9 ± 0,4 Zellen/nl (n = 7) und Erwachsene 0,7 ± 0,4 Zellen/nl (n = 12). Es zeigte sich somit eine mit dem Lebensalter ansteigende NK-Aktivität bei gleichzeitig abfallenden absoluten NK-Zellzahlen [Yabuhara et al. 1990]. Das vorliegende Kollektiv wies im Mittel deutlich niedrigere Lyseraten der PSL 50/1 und PSL 25/1 im Alter von 11 Monaten im Vergleich zu den von Yabuhara et al. beobachteten Werten der PSL 20/1 in jedem untersuchten Lebensalter auf.


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Eine Arbeitsgruppe teilte Normalwerte der NK-Aktivität bei gesunden erwachsenen Probanden (n = 46) mit, die mittels eines durchflusszytometrischen Assays erhoben wurden. Bei einer E:T-Ratio von 40:1 wurden im Median eine Aktivität von 77,4 ± 2,6 % (65,2–85,3; 25.–75. Perzentil), bei 20:1 eine Aktivität von 62,7 ± 3,9 % (46,9–70,7), bei 10:1 eine Aktivität von 43,1 ± 4,2 % (24,0–51,3) und bei 5:1 eine Aktivität von 22,8 ± 3,1 % (11,8–31,5) gemessen [Donnerstag et al. 1993].
Diese Ergebnisse sind aufgrund der oben angeführten Abhängigkeit von Methoden und Lebensalter nicht übertragbar, während die Messwerte von Yabuhara et al. aufgrund der geringen Fallzahlen und der japanischen Abstammung der Probanden nicht vorbehaltlos auf das vorliegende Kollektiv übertragbar sind. Oft ist die Interpretation der Ergebnisse wegen der meist kleinen Fallzahl im Kleinkindalter erschwert. Viele Arbeitsgruppen geben bei der Untersuchung der NK-Aktivität leider keine NK-Zellzahlen an. Obwohl es keine eindeutigen Hinweise auf einen strengen Zusammenhang zwischen Anzahl und Aktivität der NK-Zellen gibt, ist eine genaue Kenntniss der eingesetzten Effektorzellen bei der Auswertung vonnöten. Letztlich war ein quantitativer Vergleich mit anderen veröffentlichten Werten auch aufgrund des vorliegenden Bias der Lyseraten nicht möglich.

Wegen grundsätzlicher biologischer Überlegungen bezüglich der lytischen Aktivität der einzelnen NK-Zelle, war ein Einfluss der Höhe der NK-Zellzahlen auf die Gesamt-NK-Aktivität zu erwarten. Whiteside und Herberman schrieben in einem Review, dass bei einem von ihnen untersuchten Kollektiv von gesunden Erwachsenen eine entsprechende signifikante positive Korrelation zwischen relativem Anteil und zytolytischer Gesamtaktivität der NK-Zellen bestehe. Möglicherweise aufgrund sich ändernder Aktivitäts-Stadien der NK-Zellen sei diese Beziehung aber nicht sehr robust, wobei keine nähere Definition dieses Begriffes gegeben wird [Whiteside/Herberman 1989].
Bei dem vorliegenden Kollektiv wies in der Korrelationsanalyse nur eine NK-Zell-Subpopulation mit der PSL 50/1 einen signifikanten positiven Zusammenhang auf. In der multivariaten Regressionsanalyse unter Einschluss der Kovariablen Untersuchungstag war dieser Effekt hingegen nicht mehr nachweisbar.

Carver et al. berichteten über NK-Aktivität bei gestillten und nicht gestillten Kindern im Rahmen einer Untersuchung über Effekte von Nukleotiden, die natürlicherweise in der Muttermilch vorkommen und Säuglingsanfangs- sowie Folgenahrungen zugefügt sind. [Seite 81↓]Sie beobachteten dabei eine höhere NK-Aktivität bei Säuglingen im 2. Lebensmonat, die gestillt wurden (41,7 ± 4,8 %, E:T-Ratio 50:1; n = 9) bzw. deren Nahrung mit Nukleotiden ergänzt wurde (32,2 ± 3,4 %, E:T-Ratio 50:1; n = 13) im Vergleich zu nicht gestillten Kindern ohne entsprechende Nahrungsergänzung (21,7 ± 2,2 %, E:T-Ratio 50:1; n = 15). Diese Aktivitäts-Erhöhung war bei den E:T-Ratios 50:1 und 25:1 signifikant, nicht jedoch bei 12,5:1. Im 4. Lebensmonat war ein signifikanter Effekt nur noch zwischen gestillten und Nukleotid-frei ernährten Säuglingen bei den E:T-Ratios 50:1 und 25:1 nachweisbar [Carver et al. 1991a]. Dies scheint auf eine externe Einflussmöglichkeit auf die NK-Aktivität bei Säuglingen hinzuweisen, wobei das Ausmaß des Effektes verwunderlich ist.
Die Höhe der NK-Aktivität der für die eigene Arbeit untersuchten Probanden wies keine signifikante Assoziation mit der äquivalenten Vollstillzeit auf. Auch im Gruppenvergleich bestanden keine signifikanten Unterschiede der NK-Aktivität bei gestillten und nicht gestillten Probanden.

Es gibt Arbeitsgruppen, die über eine Assoziation der zytotoxischen NK-Aktivität zum Geschlecht berichten. Horikoshi beobachtete, dass die NK-Aktivität bei Mädchen primär hoch war und mit höherem Lebensalter abfiel, während bei Jungen die höchste NK-Aktivität ab dem 20. Lebensjahr erreicht wurde. Dabei hatten z. B. 1 bis 9 Jahre alte Mädchen eine höhere NK-Aktivität als 10 bis 19 Jahre alte Mädchen und 1 bis 9 Jahre alte Jungen [Horikoshi 1985]. Die spontane zell-vermittelte Zytotoxizität wurde von Santoli et al. bei Männer als annähernd doppelt so hoch wie bei Frauen beschrieben [Santoli et al. 1976] während Pross und Baines eine geringfügig höhere NK-Aktivität bei Männern beobachteten, wobei dies bereits im Nabelschnurblut nachweisbar war [Pross/Baines 1982].
In der statistischen Analyse ließen sich bei dem untersuchten Kollektiv jedoch keine signifikanten Assoziationen der zytotoxischen NK-Aktivität mit dem Geschlecht nachweisen.

Durch Wiederholungsuntersuchungen bei 14 Probanden konnte die Reproduzierbarkeit der NK-Aktivität untersucht werden. Dabei war die PSL 25/1 besser als die PSL 50/1 und PSL 12,5/1 reproduzierbar. Dabei kann nur die PSL 25/1 als gut reproduzierbar im Sinne des benutzten statistischen Verfahrens bezeichnet werden. Im Vergleich zu anderen gemessenen Parametern waren die NK-Aktivitätswerte schlechter als die absolute Lymphozytenzahl und besser als die relative Lymphozytenzahl reproduzierbar. [Seite 82↓]Die biologische Variabilität der NK-Aktivität bei diesen Probanden blieb im Rahmen der anderen gemessenen Parameter. Die schlechtere Reproduzierbarkeit der PSL 50/1 im Vergleich zur PSL 25/1 konnte erwartet werden, da wie oben erwähnt Unterschiede der lytischen Aktivität von der PSL 50/1 am deutlichsten abgebildet wurden.
Horikoshi führte in einem mittleren Abstand von 5,6 Monaten zwei Messungen der NK-Aktivität bei bis zu 10jährigen Kindern (n = 12) durch. Dabei bestanden im t-Test für abhängige Stichproben keine signifikanten Unterschiede der individuellen NK-Aktivitäten [Horikoshi 1985].
In ihrem Review berichten Whiteside et al., dass durch Wiederholungsmessungen der NK-Aktivität bei gesunden Erwachsenen (n = 93) so genannte „low“ und „high responder“ definiert werden konnten. Dass heisst es wurden Individuen identifiziert, die über einen längeren Zeitraum ein niedrigere bzw. höherer NK-Aktivität aufwiesen. Die Höhe der Aktivität könne aber auch von Alter, Geschlecht, zirkadianer Rhythmik, körperlicher Aktivität und anderen generellen Gesundheitsfaktoren beeinflusst werden. Unter den Vorraussetzungen, dass ein Individuum keine Infektion habe, nicht unter starkem Stress leide und keine Medikamente wie Kortikosteroide oder andere Hormone einnehme, sei die Höhe der intraindividuellen NK-Aktivität allerdings stabil über die Zeit. In diesem Review wurden allerdings keine Zahlenwerte oder Ergebnisse statistischer Verfahren angegeben [Whiteside et al. 1990]. Pross und Baines hatten bei gesunden erwachsenen Probanden (n = 539) über einen Zeitraum von 7 Jahren die NK-Aktivität bis zu 213-mal gemessen. Dabei schrieben auch sie von einer möglichen Untergruppierung von Individuen in beständige „low“ und „high NK donors“. Diese Beständigkeit der individuellen NK-Aktivität bleibe über Jahre erhalten, obwohl die Aktivität der einzelnen Assays in Abhängigkeit von der Sensitivität der Targetzellen erheblich schwanken könne [Pross/Baines 1982]. Zu diesen Feststellungen passt die Beobachtung von Moretta et. al, dass die Dichte der vor kurzem entdeckten aktivierenden NK-Zell-Rezeptoren (NCRs) auf der Zelloberfläche direkt mit der Höhe der NK-Aktivität korreliert. Dabei kann man zwischen Individuen unterscheiden, die konsistent eine hohe bzw. eine niedrige Dichte an NCRs aufweisen, was in einer deutlich differenten Zytotoxizität resultiert [Moretta et al. 2001]. Zusammenfassend lassen sich die Ergebnisse obiger Studien so beurteilen, dass die NK-Aktivität relativ gut reproduzierbar ist, wobei in der Interpretation einflussnehmende individuelle Faktoren und eine Methodenvariation von Tag zu Tag zu beachten sind.


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Die für die vorliegende Arbeit eingesetzte durchflusszytometrische Methode in Anlehnung an Methoden von drei Arbeitsgruppen [Slezak/Horan 1989], [Hatam et al. 1994] [Lötzerich/Hirt 1997] ist als Test z. B. geeignet um bei klinisch auffälligen Kindern mit Verdacht auf Immundefekt eine deutliche Minderfunktion bzw. einen Mangel der NK-Aktivität zu erkennen. Wie bereits mehrfach weiter oben angeführt, ist höchstwahrscheinlich methodenbedingt ein direkter Vergleich der Messwerte, welche zu verschiedenen Zeitpunkten erhoben wurden, erschwert. Trotz dieser Schlussfolgerung muss weiterhin auf die Vorteile der durchflusszytometrischen Methoden gegenüber dem klassischen Chrome-Release-Assay hingewiesen werden (siehe 1.3). Als mögliche methodische Alternative zur Quantifizierung der zytotoxischen Aktivität von NK-Zellen könnte in der Laborroutine ein kommerzielles Test-Kit dienen (NKTEST®, ORPEGEN Pharma, Heidelberg). Dieses Kit enthält kryokonservierte membrangefärbte K562-Targetzellen und eine DNA-Färbelösung und arbeitet mit einer der vorliegenden Arbeit vergleichbaren durchflusszytometrischen Methode. Die benötigten Targetzellen werden kurz vor Durchführung des Zytotoxizitäts-Assays aufgetaut und sofort zur Messung der NK-Aktivität eingesetzt. Trotz Bedenken bezüglich einer erhöhten Empfindlichkeit der Targetzellen gegenüber der zytotoxischen Aktivität der Effektorzellen durch den Auftauprozess und die nicht vorhandene Erholungszeit der Zellen in einer Kultur, könnte dieser Test aufgrund von möglicherweise stabileren intratest-spezifischen Bedingungen von Vorteil sein. Mittlerweile wird dieser kommerzielle Test im Labor der Klinik für Pädiatrie mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie der Charité zur Bestimmung der zytotoxischen NK-Aktivität eingesetzt.
Neben den vorwiegend eingesetzten DNA-Farbstoffen gibt es auch neuere Entwicklungen wie z. B. Farbstoff-konjugierte monoklonale Antikörper, welche an frühe Apoptose-Marker auf der Zelloberfläche binden. In diesem Bereich bestehen fortdauernde rege Forschungsaktivitäten, wobei eine Ablösung des Chrome-Release-Assays als „Goldstandard“ durch eine bestimmte durchflusszytometrische Methode nicht in unmittelbarer Zukunft stattzufinden scheint.


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4.5  Zytotoxische Aktivität und POPs

Bei der Korrelationsanalyse nach Spearman-Rho bestanden keine signifikanten Korrelationen der Ergebnisse der Zytotoxizitäts-Assays mit der Belastung durch persistente organische Schadstoffe. Eine multivariate statistische Analyse wurde durchgeführt, um mögliche signifikante Assoziationen aufzudecken, die durch die signifikante Abhängigkeit der Lyseraten vom Untersuchungszeitpunkt verdeckt worden sein konnten. Mit dieser Regressionsanalyse wurde die Abhängigkeit der Ergebnisse des Zytotoxizitäts-Assays von den POP-Konzentrationen unter Einbeziehung der Kovariablen Geschlecht, Stillen, Infektanamnese und Untersuchungstag untersucht. Neben der erwarteten hoch signifikanten Abhängigkeit aller PSL-Raten vom Untersuchungstag konnte für die POPs sowie die oben genannten Kovariablen kein signifikanter Einfluss auf die NK-Aktivität gezeigt werden.

Generell lagen bezüglich der Wirkung von persistenten organischen Schadstoffen auf die NK-Aktivität des Menschen wenig Informationen vor (siehe 1.4). Eine Veröffentlichung berichtete über eine Steigerung der NK-Aktivität, die signifikant mit der TCDD-Belastung exponierter Arbeiter korrelierte [Kitamura et al. 2000], während eine Studie mit über Nahrungsmittel mit POPs exponierten Erwachsenen keinen Effekt auf die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen nachweisen konnte [Lovik et al. 1996]. Die Interpretation dieser Ergebnisse wurde wiederum durch die vorliegenden Mischexpositionen und andere Faktoren, wie den langen zeitlichen Abstand zwischen Exposition und Untersuchung, erschwert. Die Ergebnisse von tierexperimentellen Studien erbrachten kein durchgängiges Muster der toxischen POP-Wirkung auf die NK-Aktivität. Hier bestanden erhebliche Unterschiede zwischen verschiedenen Spezies mit supprimierenden, aktivierenden oder nicht beobachteten POP-Effekten, bei Einsatz von zum Teil sehr hohen POP-Dosen. Zusammenfassend lässt sich für das vorliegende Kollektiv sagen, dass im Rahmen der Hintergrundbelastung gestillter Kinder mit POPs keine signifikanten kausalen Assoziationen mit der NK-Aktivität beobachtet wurden.


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4.6  Erwachsene

Die zusätzlichen Untersuchungen bei Erwachsenen wurden durchgeführt, da hier die Möglichkeit bestand, die NK-Zellzahlen und NK-Aktivität zweier sehr hoch mit TCDD belasteter Personen zu untersuchen. Im Folgenden werden die Ergebnisse zusammengefasst, welche bereits in Tabelle 3.10 präsentiert wurden, und mit den Werten einer Erwachsenengruppe von 10 gesunden nicht hochbelasteten Personen verglichen. Person 1 war bei zwei Messungen mit 89.800 bzw. 65.000 pg TCDD/g Fett belastet und hatte deutlich erhöhte Leukozytenzahlen (19,7 bzw. 16,9/nl), deutlich erhöhte absolute Lymphozytenzahlen (6,6 bzw. 5,1/nl), normale relative Lymphozytenwerte (33,5 bzw. 29,9 %), normale absolute NK-Zellzahlen (0,32 bzw. 0,30/nl) und grenzwertig niedrige relative NK-Zellzahlen (4,9 bzw. 5,9 %). Person 2 war mit 19.700 bzw. 17.200 pg TCDD/g Fett belastet und wies grenzwertig erhöhte Leukozytenzahlen (10,6 bzw. 7,5/nl), grenzwertig erhöhte absolute Lymphozytenzahlen (3,2 bzw. 2,8/nl), normale relative Lymphozytenwerte (30,2 bzw. 37,8 %) sowie normale absolute (0,23 bzw. 0,17/nl) und relative (7,1 bzw. 6,1 %) NK-Zellzahlen auf. Eine statistische Analyse entfiel wegen der geringen Fallzahl.
Die laboreigenen Referenzwerte für CD3CD16/56+-Zellen bei Erwachsenen (n = 80) betragen 0,22 ± 0,11/nl (0,08–0,44; 5.–95. Perzentil) und 12,4 ± 6 % (4,9–22,4; 5.–95. Perzentil) der Lymphozyten (PD Dr. med. A. Lun, Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie der Charité, persönliche Mitteilung). Für CD3CD16/CD56+-Zellen wurde von Reichert et al. bei Erwachsenen (n = 271) ein Mittelwert von 14,2 ± 6,1 % (Median 13,0 %, 5,8–29,3 %, 5.–95. Perzentil) mitgeteilt [Reichert et al. 1991]. Die folgenden Referenzwerte sind nicht vorbehaltlos auf die untersuchten Probanden zu übertragen, da nicht die gleichen Lymphozyten-Subpopulationen als NK-Zellen definiert waren. Hulstaert et al. gaben für CD3CD16+CD56+-Zellen bei Erwachsenen (n = 85) Median-Werte von 0,17 /nl (0,13–0,25; 25.–75. Perzentil) und 11 % (8–15) an [Hulstaert et al. 1994]. Friberg et al. gaben mittlere Werte von 0,28 ± 0,25 /nl und 13 ± 6 % für CD3CD56+-Zellen bei Erwachsenen an (n = 107) [Friberg et al. 1996].
Zusammenfassend bedeutete dies, dass die relativen NK-Zell-Werte der Person 1 im unteren Normbereich lagen, während die anderen zellulären Werte der Personen 1 und 2 und die der zum Vergleich untersuchten Erwachsenengruppe im Normbereich lagen. Ob die relativ niedrigen Zellwerte von Person 1 im Zusammenhang mit der TCDD-[Seite 86↓]Exposition stehen, ist im Rahmen dieser Einzelbeobachtungen nicht zu klären, ein Einfluss kann allerdings auch nicht ausgeschlossen werden. Bei den weiter oben erwähnten elf Studien konnte nur in einem Fall ein signifikanter negativer Einfluss von POPs auf NK-Zellzahlen beobachtet werden (siehe 1.4). Ferner muss hier die Korikosteroid-Therapie der Person 1 beachtet werden, denn Steroid-Effekte auf das Blutbild im Sinne einer Neutrophilie und relativen Lymphopenie sind bekannt. Zwei Arbeitsgruppen berichten von supprimierten NK-Zellzahlen bei Steroid-Therapie [Alamartine 1994] [Pountain 1993].
Wie bereits ebenfalls in Tabelle 3.10 präsentiert, wies Person 1 eine deutlich verminderte NK-Aktivität (PSL 50/1 3,9 bzw. 6,4 %) im Vergleich zu der Erwachsenengruppe auf. Bei Person 2 lag die NK-Aktivität im Bereich der Werte der Erwachsenengruppe (PSL 50/1 18,7 bzw. 13,2 %). Der oben erwähnte Bias des Untersuchungszeitpunktes auf die Lyseraten der Kinder besaß im Untersuchungszeitraum der Erwachsenen keinen statistisch signifikanten Einfluss. Die NK-Aktivität der extrem hoch TCDD-belasteten Person 1 war zwar vermindert, dies kann aber wegen der zum Untersuchungszeitpunkt durchgeführten Kortikosteroid-Therapie nicht als alleiniger TCDD-Effekt angesehen werden. Eine inhibierende Wirkung von Kortikosteroiden auf die NK-Aktivität mit einer Dosis-Wirkungs-Beziehung wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen in-vitro beschrieben [Gatti et al. 1987] [Nair/Schwartz 1984] [Pedersen/Beyer 1986]. Auf den möglichen Zusammenhang zwischen NK-Zellzahlen und NK-Aktivität wurde bereits weiter oben eingegangen (siehe 4.4). Ob die leicht verminderten NK-Zellzahlen der Person 1 kausal mit der niedrigen NK-Aktivität zu tun haben, ist letztlich nicht eindeutig geklärt.
Einflüsse von POPs auf die NK-Aktivität bei Erwachsenen wurden in zwei Veröffentlichungen untersucht, welche bereits weiter oben zitiert wurden. Dabei konnten Lovik et al. keinen Zusammenhang zwischen Gesamt-NK-Aktivität und POP-Belastung beobachten [Lovik et al. 1996], während Kitamura et al. eine signifikante positive Korrelation der POP-Belastung mit der Gesamt-NK-Aktivität beschrieben (siehe 1.4). Die hier beobachtete TCDD-Belastung bewegte sich in einem Bereich, der deutlich über der Letaldosis für Meerschweinchen, dem TCDD-empfindlichsten Tier (siehe auch 1.1.2), lag (Person 1 ca. 25 µg/kg KG; Person 2 ca. 6 µg/kg KG) [Abraham 2002]. Trotz dieser extrem hohen TCDD-Belastung ließen sich im Rahmen dieser Einzelbeobachtungen keine eindeutigen Effekte auf NK-Zellen nachweisen. Die relativ niedrigen NK-Aktivitäten waren möglicherweise durch andere Faktoren, wie z. B. die [Seite 87↓]Steroid-Applikation, bedingt. Leider lagen hier keine präexpositionellen Ausgangswerte vor, welche die Bewertung der Messergebnisse erleichtert hätten. Ein ursächlicher Effekt kann hier allerdings nicht ausgeschlossen werden. Die weitergehenden Untersuchungen der belasteten Probanden durch Abraham erbrachten keine eindeutigen Effekte auf das Immunsystem. Die bisherige Nachbeobachtung ergab auch keinen Anhalt für eine Beeinträchtigung des Immunsystems [Abraham 2001]. Zusammenfassend kann man aufgrund der umfassenden Untersuchungsergebnisse der beiden hoch belasteten Probanden folgern, dass das Immunsystem des Menschen nicht als besonders TCDD-empfindlich gelten kann.

4.7 Schlussfolgerung

Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war, ob es durch Belastung mit persistenten organischen Schadstoffen über die Muttermilch zu messbaren Veränderungen der Zellzahlen sowie der zytotoxischen Aktivität der natürlichen Killerzellen bei (höherbelasteten) gestillten im Vergleich zu (niedrigerbelasteten) nicht gestillten Kindern kommt.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen keine statistisch signifikanten Effekte von persistenten organischen Schadstoffen in der Muttermilch auf NK-Zellen und deren Aktivität bei gestillten Kindern erkennen. Auch bei anderen untersuchten Parametern der oben genannten Dioxin-Studie ließen sich keine signifikanten Einflüsse von POPs auf das Immunsystem nachweisen. In verschiedenen weiter oben zitierten Veröffentlichungen konnten keine konsistenten kausalen Wirkungen auf Zellzahl und Aktivität der natürlichen Killerzellen berichtet werden. Daher kann die bestehende Stillempfehlung der Nationalen Stillkommission bekräftigt werden. Diese Empfehlung besagt, dass für vier bis sechs Monate voll gestillt und anschließend aus ernährungsphysiologischen Gründen mit der Einführung von Beikost begonnen werden sollte. Auch danach könne trotz gewisser Rückstände in der Frauenmilch ohne gesundheitliches Risiko für den Säugling weiter gestillt werden [Nationale Stillkommission 1996]. Obwohl die von der WHO veröffentlichte zulässige tägliche Aufnahmemenge (TDI) an Dioxinen von gestillten Säuglingen überschritten wird, empfiehlt auch diese das Stillen, da der TDI-Wert für eine lebenslange Aufnahme gilt. Trotz der Unterstützung dieser Empfehlung, die auch auf einer Risikobewertung nach Informationen über den Rückgang der POP-Belastung über die Nahrungsmittelkette in [Seite 88↓]den letzten Jahren beruht, sollte weiter aktiv daran gearbeitet werden, den Eintrag dieser Substanzen in die Umwelt zu reduzieren und damit die Schadstoff-Körperlast zu vermindern. Denn im günstigsten Falle sind die persistenten organischen Schadstoffe nur ohne Nutzen im menschlichen Organismus, während einige Veröffentlichungen über entwicklungsneurologische Defizite nach pränataler PCB-Exposition berichten. Mögliche Langzeiteffekte dieser Verbindungen wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht untersucht. Diese sollten aber für eine abschließende Risikobewertung in Betracht gezogen werden und könnten Untersuchungsziel von weiteren Studien sein.

Die Messwerte der NK-Aktivität wiesen in der vorliegenden Arbeit eine fehlende zeitliche Beständigkeit auf. Dieser Bias war möglicherweise auf die eingesetzten Targetzellen zurückzuführen. Da man im Vergleich zu Funktionstests der B- und T-Lymphozyten bei Zytotoxizitäts-Assays der NK-Zellen auf Targetzellen angewiesen ist, die natürlicherweise keine neutralen Eigenschaften besitzen, sind diese als möglicher Störparameter immer Bestandteil eines Zytotoxizitäts-Assays.

Die bei zusätzlichen Untersuchungen an zwei hochbelasteten Erwachsenen beobachteten leichten Veränderungen der NK-Zellzahlen und NK-Aktivität konnten kausal nicht eindeutig der TCDD-Exposition zugeordnet werden. Zusammen mit anderen weitergehenden Untersuchungen, wiesen diese Ergebnisse nicht auf eine starke Empfindlichkeit des menschlichen Immunsystems, selbst bei extrem hohen TCDD-Belastungen, hin.


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04.08.2004