2. Material und Methoden

Die Isolierung von primären porzinen Langerhanschen Inselzellen wurde nach Zhang et al. durchgeführt (Zhang, et al., 2001). Die Bauchspeicheldrüsen von ausgewachsenen Schweinen wurden aus lokalen Schlachthäusern bezogen. Nach der Schlachtung wurden die Organe sofort entnommen, um die warme Ischämie auf weniger als 10 Minuten zu reduzieren. Das Hauptblutgefäß der Bauchspeicheldrüse wurde mit einer Kanüle verbunden, mit einer 0,6%igen Kollagenase-Lösung (Serva, Heidelberg) perfundiert und in einem speziell entworfenen Restriktions-Filtrations-Gerät kontinuierlich bei 37°C für 18 bis 20 Minuten inkubiert. Das enzymatisch zerkleinerte Gewebe wurde anschließend durch ein Sieb mit einer Porengröße von 350 µm gepresst, um unverdaute größere Gewebestücke zu entfernen. Nach einem Zentrifugationsschritt wurde der Überstand verworfen und das Sediment wurde in einem kontinuierlichen Nycodenz-Dichtegradienten (Nycodenz® Pulver, Gibco BRL, Karlsruhe), mit einer Dichte von 1,055 bis 1,095 g/ml zentrifugiert. Ein Cobe 2991 Zellseparierer wurde verwendet, um freie Inselzellen von exokrinem Gewebe zu trennen. Die angereicherte Inselzellfraktion wurde anschließend durch ein Sieb mit einer Porengröße von 45 µm gepresst, um einzelne Zellen und Inselzellfragmente zu entfernen. Die aufgereinigten Inselzellen wurden für Infektionsstudien mittels Kokultivierung verwendet. Dafür wurden die Inselzellen in Gewebekulturflaschen (TPP, Schweiz) in DMEM (Dulbecco’s Modified Essential Medium mit 4,5 g/l D-Glucose; Biochrom KG, Berlin), 10% inaktiviertem, fötalem Kälberserum (FKS; Biochrom KG, Berlin), 2 mM L-Glutamin, (Biochrom), 100 U/ml Penicillin (Biochrom), 100 µg/ml Streptomycin (Biochrom) und 15 mM HEPES (Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure, Biochrom) bei 37°C und 95% Luftfeuchtigkeit (Brutschrank BBD 6220, Kendro, Langenselbold) kultiviert. Die Isolierung primärer muriner Zellen wurde nach Specke et al. durchgeführt (Specke, et al., 2001). Nieren und Embryos von NMRI- bzw. BALB/c-Mäusen (Charles River Laboratories, Sulzfeld) wurden aseptisch entfernt, zerkleinert und mit 1 ml 0,25%igem Trypsin, gelöst in PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung; 10 mM Na-Phosphat, pH 7.5, 130 mM NaCl (Merck, Darmstadt)), pro 5mg Gewebe unter Verwendung eines Magnetrührers bei 37°C inkubiert. Die Einzelzellsuspensionen wurden in DMEM und 10% FKS kultiviert.

Die verwendeten Zelllinien sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die humane embryonale Nierenzelllinie 293 (ATCC No. CRL-1573), die sich als hochsuszeptibel für eine Infektion mit PERV gezeigt hat, wurde mit einer Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin ausgestattet. Dafür wurden die 293-Zellen mit dem Neomycin-Resistenzgen tragenden pcDNA3.1+ Vektor (Invitrogen) unter Verwendung des TransFast Transfektionsreagenz (Promega, Mannheim, Germany) transfiziert und durch die anschließende Behandlung mit G418 (Gibco BRL, Karlsruhe, Germany) auf stabil-transfizierte 293-Zellen hin selektioniert (293^neo+). Die Zelllinien 293, 293^neo+, PK15, 293/PERV, 293/PERV-A/C, 293/PERV-B, 3T3 und 3T6 wurden in Gewebekulturflaschen versetzt mit DMEM, FKS, L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin und HEPES bei 37°C unter 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Die Rhesusaffen-Zelllinie LLCMK2 wurde in DMEM versetzt mit 5% FKS und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (Sigma, Taufkirchen) kultiviert, während die Schimpansen-Zelllinie EB176 in RPMI-1640 Medium (Biochrom KG, Berlin), mit 15% FKS und 4 mM L-Glutamin kultiviert wurde. Schließlich wurde die murine T-Zelllinie CTLL-2 in RPMI-1640 Medium vesetzt mit 10% FKS und 100 IU/ml Interleukin-2 (IL-2) kultiviert.

Tabelle 2: Verwendete Zelllinien

Die PERV-produzierenden Zelllinien PK15, 293/PERV, 293/PERV-A/C und 293/PERV-B wurden für die Virusproduktion und als Effektoren in Infektionsstudien verwendet. Die Zelllinien 293, 293^neo+, LLCMK2 und EB176 sowie die murinen Zelllinien 3T3, 3T6 und CTLL-2 dienten als Zielzellen in Infektionsstudien.

Zur Herstellung von Proteinlysaten aus Geweben und Organen wurden je 200 bis 300 mg in einem Mörser (Roth, Karlsruhe) unter Zugabe von flüssigem Stickstoff (Linde, Berlin) zu einer homogenen Masse zerkleinert, in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß (Eppendorf, Hamburg) überführt, mit 1 ml RIPA-Puffer (25 mM Tris-HCl, pH 8.0 (Roth); 150 mM NaCl (Merck); 2% Triton-X 100 (Roth), 0,5% Natriumdeoxycholat (Merck) und 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat, Merck)) versetzt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das Proteinlysat bei 20000 x g (Eppendorf 5403; Eppendorf, Hamburg) für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert, der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die Proteinkonzentration wurde nach Bradford bestimmt. Dazu wurde ein Proteinstandard mit 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 und 1,0 mg/ml BSA aus einer 2mg/ml BSA-Stammlösung (bovines Serumalbumin Fraktion V, Roth) hergestellt und je 10 µl der verschiedenen Standards wurden in eine 96-Well Mikrotiterplatte (Falcon™, Becton Dickinson, Heidelberg) pipettiert. Von den zu messenden Proteinproben wurden 10-100 µl eingesetzt. Die Proteinstandards und die Proben wurden anschließend mit 90 µl Bradford-Reagenz (1:5 verdünnt; Bio-Rad, München) versetzt und für 10 Min. inkubiert. Danach wurde die Absorption bei 595 nm im UVSpektrometer (Tecan Spectra, Crailsheim) gemessen und anschließend die Proteinkonzentration bestimmt. Der statistische Fehler der BSA-Standards und der Proteinproben wurde durch Dreifachbestimmung ermittelt.

Zwei rekombinante Proteine wurden generiert, das transmembrane Hüllprotein p15Env und das Capsidprotein p27Gag. Zur Herstellung von p15Env wurden die Vorwärtsprimer 5‘GTACGTACGTGGATCCCTAATCACAGGACCGCAACA und die Rückwärtsprimer 5‘ACGTACGTACGAATTCTCAGTTGAACCATCCTTAAAACCA für die Amplifikation einer Sequenz aus PK15 Zellen verwendet. Die amplifizierte Sequenz, die der Ectodomäne des transmembranen Hüllproteins p15Env (Aminosäuren 488-597) entspricht, wurde in den pCAL-n-Vektor (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) kloniert und in E.coli exprimiert. Die Sequenzierung dieses Klons zeigte, dass das transmembrane Hüllprotein von PERV-A exprimiert wurde (Fiebig, et al., 2003). Für die Herstellung des Capsidproteins p27Gag von PERV-C wurde die Sequenz des gesamten gag-Gens amplifiziert, in den pQ-n-Vektor kloniert und in E.coli exprimiert (QIAgen, Hilden). Das exprimierte Protein wurde durch Affinitätschromatographie mittels einer Ni-NTA Säule (QIAgen) und 8 Molar Harnstoff (Sigma) bei pH 4.0 aufgereinigt.

Peptide, die der immundominanten und immunsuppressiven Domäne von p15Env entsprechen (Tab. 3) wurden für ELISA Tests verwendet (Tacke, et al., 2001).

Tabelle 3: PERV-spezifische Proteine und Peptide

Um Proteinlysate in ihre einzelnen Bestandteile aufzutrennen, wurde eine diskontinuierliche SDS-PAGE durchgeführt. Dafür wurden zwei je 1 mm dicke 12%ige SDS-PAGE Trenngele, bestehend aus 4,2 ml einer 30%igen Mischung aus Acrylamid und N,N`Methylenbisacrylamid (37,5:1, Roth, Rotiphorese Gel 30), 3,5 ml Gelpuffer (3 M Tris-Base (Roth), 0,3% SDS), 2,8 ml H<sub>2</sub>O (Bidest.), 70 µl einer 10%igen Ammoniumpersulfatlösung (APS, Bio-Rad) und 7 µl TEMED (N, N, N‘, N‘-Tetramethylethylendiamin, Invitrogen), verwendet. Die flüssige Trenngel-Lösung wurde zwischen zwei Glasplatten (Bio-Rad) gegossen, bis zu einem Zentimeter unter den oberen Rand. Anschließend wurden die Trenngele mit Isopropanol (Roth) überschichtet. Nachdem die Trenngele vollständig auspolymerisiert waren (nach ca. 30 min.), wurde das Isopropanol entfernt und es wurden für 4%ige Sammelgele 560 µl 30%iges Acrylamid/N,N`-Methylenbisacrylamid, mit 1,4 ml Gelpuffer, mit 2,24 ml H₂O (Bidest.), mit 70 µl 10%igem APS und mit 7 µl TEMED gemischt, diese Lösung wurde auf die Trenngele gegossen und in die noch flüssige Lösung wurden präparative Kämme gesteckt. Nach dem Erhärten der Sammelgele wurden die Gele senkrecht in eine Gelkammer (Bio-Rad Mini-System) gespannt, die innere Kammer mit 1x Kathodenpuffer (0,1 M Tris-Base, 0,1 M Tricin (Sigma), 0,1% SDS) und die äußere Kammer mit 1x Anodenpuffer (0,2 M Tris-Base) gefüllt. Die Proteinlysate wurden vor dem Auftragen mit 1x Laemmli- Probenpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8; 4% SDS; 12% Glycerol (Sigma); 0,01% Bromphenolblau (Bio-Rad); 5% 2-Mercaptoethanol (Sigma)) versetzt und für 5 Minuten bei 95°C gekocht (Eppendorf comfort). Zur Bestimmung der Größe der Banden wurde ein vorgefärbter Größenstandard (Seeblue® Plus2-Marker, Invitrogen) mitgeführt. Die Elektrophorese (PowerPac 300, Bio-Rad) wurde anhand der Bromphenolblau Bande verfolgt und lief bei 100 Volt für 1 bis 1,5 Stunden.

Für die Isolierung der DNA wurden adhärente Zellen für 15 Minuten bei 37°C mit 2 ml einer 0,25%igen Trypsin/EDTA-Lösung inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit einem Zellschaber (TPP) vom Boden der Gewebekulturflasche gelöst, mit 8 ml frischem Medium versetzt, vereinzelt und mit 470 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Megafuge 1.0 R, Kendro). Anschließend wurden die Zellen 1x mit 10 ml sterilem PBS gewaschen (470 x g, 10 Minuten, Raumtemperatur), mit 5 ml Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4 (Roth); 1 mM EDTA (Merck,), 100 mM NaCl (Merck); 100 µg/ml Proteinase K (20 mg/ml, Invitrogen), 0,5% SDS (10%)) versetzt und für 2 Stunden bei 60°C im Wasserbad inkubiert (Fa. Memmert über Neolab Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Berlin).

Zur Phenolextraktion wurde das Zelllysat mit einem halben Volumen Phenol (Roti-Phenol, Roth) versetzt, gemischt und bei circa 3200 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Falconröhrchen (TPP) überführt und die Phenolextraktion wiederholt. Zur Phenol/Chloroform-Extraktion wurde die wässrige Phase in ein neues Falconröhrchen überführt, mit 1 Volumen Phenol/Chloroform (Roth) versetzt und zentrifugiert. Anschließend wurde die Phenol/Chloroform-Extraktion wiederholt. Schließlich wurde die wässrige Phase in ein neues Falconröhrchen überführt, mit einem zehntel Volumen einer 3M NaAcetat-Lösung, pH6.5 (Merck) und dem zweifachen Volumen aus eiskaltem absolutem Ethanol (Roth) versetzt und die DNA wurde über Nacht bei -80°C gefällt. Anschließend wurde die DNA bei 4°C abzentrifugiert, 1x mit 70%igem Ethanol gewaschen und das DNA-Pellet wurde getrocknet. Zuletzt wurde die DNA in 50 bis 100 µl TE-Puffer, pH 8.0 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) gelöst und bei -20°C aufbewahrt.

Für die DNA-Isolierung aus Geweben und Organen wurden 25 bis 35 mg Gewebe in einem sterilen Mörser mit flüssigem Stickstoff versetzt, zerkleinert und in einen mit 5 ml Lysepuffer (300 µg/ml Proteinase K) gefüllten, eisgekühlten Homogenisator überführt. Das zerkleinerte Gewebe wurde für 10 Minuten homogenisiert, in ein 15 ml-Falconröhrchen dekantiert und anschließend 2 Stunden bei 60°C inkubiert. Zur Fällung der DNA wurde eine Phenol- und Phenol/Chloroform-Extraktion durchgeführt.

Um aus 1x10⁷ Zellen pro ml die RNA zu isolieren, wurde 1 ml TRI-Reagenz (Sigma) zu den in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführten Zellen gegeben, homogenisiert und die Lösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur unter dem Abzug inkubiert. Anschließend wurden 200 µl Chloroform (Roth) dazugegeben, gemischt und für 15 Minuten inkubiert. Zur Phasentrennung wurde das Gemisch bei 12000 x g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit einem Volumen 70%igem Ethanol (hergestellt mit DEPC-Wasser: 0,1% Diethylpyrocarbonat (Sigma)) gelöst in H₂O (Bidest.) und anschließend autoklaviert) versetzt. Für die Fällung und Elution der RNA wurde die alkoholische Lösung nach den Angaben des RNeasy Mini Kits (QIAgen) behandelt. Die RNA wurde bei -80°C aufbewahrt.

Die Methode der PCR wurde verwandt, um provirale Sequenzen in zellulärer genomischer DNA nachzuweisen. Dafür wurden maximal 1 µg genomische DNA in einem Reaktionsansatz von 20 µl für die Amplifikation eingesetzt. Der Reaktionsansatz enthielt außerdem je 250 µM der vier Desoxyribonucleotidtriphosphate ATP, CTP, GTP und TTP (Applied Biosystems), 1,5 mM MgCl₂ (Applied Biosystems), 0,5 µM Primer, 2 µl 10x PCRPuffer (Applied Biosystems) und eine Einheit Taq DNA-Polymerase (‚Ampli-Taq‘ Gold, Applied Biosystems). Die für die Amplifikation der PERV-spezifischen Sequenzen verwendeten Primer sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Bedingungen für die Amplifikation waren: 1 Zyklus mit 10 Minuten bei 95°C; danach 35 Zyklen mit je 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C; sowie 1 Zyklus mit 7 Minuten bei 72°C (Multicycler PTC-200, MJ Research, Waltham, MA, USA). Zur Kontrolle gleicher Mengen an aufgetragener DNA wurden β-Actin Primer (Tab. 4) verwendet. Nach der Amplifikation wurden die Amplifikate mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und durch die Verwendung von Ethidiumbromid (Sigma) mit anschließender UV-Bestrahlung (Gel-Doc, Bio-Rad) sichtbar gemacht.

Tabelle 4: Sequenzen und Bezeichnungen der verwendeten Primer

Die Bestimmung der Sensitivität der Primer in der PCR gibt einen Hinweis darauf, wie spezifisch das jeweilige Primerpaar ist. Zur Bestimmung der Sensitivität der PERVspezifischen Primer PERV-gag, -pol, -envA und -envB wurden je 1x10⁶ 293-Zellen mit Verdünnungen von 293/PERV-A/C-, 293/PERV-B- und PK15-Zellen beginnend mit 1x10⁶ bis 1x10⁰ gemischt. Anschließend wurde die DNA der Zellgemische mit Hilfe des DNA Blood Mini Kits (QIAgen) isoliert und die Konzentration photometrisch bestimmt (Biospec1601; Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg). Die Konzentration der jeweiligen DNAGemische wurde mit TE-Puffer auf 100 ng/µl eingestellt. Für die anschließende PCR wurden 100 ng DNA pro Reaktionsansatz eingesetzt.

Für das Umschreiben von mRNA in cDNA wurde der One-Step RT-PCR Kit (Invitrogen) verwendet. Diese Methode ermöglicht die reverse Transkription von mRNA in cDNA und eine anschließende PCR mit spezifischen Primern in einem Schritt. Für die RT-PCR wurden 100 ng mRNA in einem Reaktionsansatz von 20 µl eingesetzt. Die verwendeten Primer waren:

5‘- TGCTGTTTGCATCAAGACCGC (vor SD; Vorwärtsprimer),
5‘- ACAGACACTCAGAACAGAGAC (hinter SD; Rückwärtsprimer) und
5‘- ATGGAGGCGAAGCTTAAGGGGA (hinter SA; Rückwärtsprimer). Die aufgetragene Menge an RNA wurde durch Verwendung von β-Actin Primern (Tab. 4) überprüft. Zur Kontrolle von DNA-Kontaminationen wurden parallel Reaktionsansätze ohne RT mitgeführt. Die Bedingungen für die Amplifikation waren: 1 Zyklus mit 30 Minuten bei 50°C; gefolgt von 1 Zyklus mit 2 Minuten bei 94°C; danach 35 Zyklen mit je 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C; sowie 1 Zyklus mit 7 Minuten bei 72°C. Nach der Amplifikation wurden die Fragmente auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.

Es wurden verschiedene PERV-spezifische Antiseren generiert, die in Tabelle 5 zusammengefasst sind. Einige Kontroll-Seren wie Anti-PERV-ido und Anti-PERV-isu wurden schon von Tacke et al. beschrieben (Tacke, et al., 2001). Für die Evaluierung der neu etablierten Methoden wurde ein Ziegenserum gegen das rekombinante transmembrane Hüllprotein p15Env entwickelt (Fiebig, et al., 2003). Zusätzlich wurde ein Antiserum gegen das rekombinante Capsidprotein p27Gag durch Immunisierung einer Ziege mit dem rekombinanten Protein generiert. Beide Seren reagierten in ELISA Tests, Western Blots und Immunfluoreszenztests. Schließlich wurden kreuzreagierende Antiseren gegen p30Gag und gp70Env des murinen Friend-Leukämievirus (FLV) verwendet.

Tabelle 5: Verwendete Antiseren und Antikörper

Die in den immunologischen Untersuchungen verwendeten sekundären Antikörper sind ebenfalls in Tabelle 5 zusammengefasst.

Für die Untersuchung von Seren verschiedener Spezies auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper, wurden entsprechende Antigene mittels SDS-PAGE in ihre Bestandteile getrennt und auf PVDF-Membranen (Immobilon™-psq, Millipore, Eschborn) übertragen. Dazu wurden die PVDF-Membran und zwei 3-Millimeter dicke Whatman-Filterpapiere (Bio-Rad) auf Gelgröße zurecht geschnitten, die PVDF-Membran in absolutem Methanol (Roth) angefeuchtet und zusammen mit den Filterpapieren und Gelen in Transferpuffer (48 mM TrisBase; 39 mM Glycin (Sigma); 3,75 ml 10%iges SDS; 200 ml Methanol; mit H₂O (Bidest.) auf einen Liter aufgefüllt) für circa 20 Minuten equilibriert. Anschließend wurde der Blot wie folgt zusammengesetzt: Auf die untere Platin-Anode einer Semi Dry Transferzelle (Bio-Rad) wurde ein Whatman-Filterpapier luftblasenfrei aufgelegt. Die PVDF-Membran und das Gel wurden nacheinander auf das Filterpapier gelegt und die Luftblasen entfernt. Schließlich wurde auf das Gel das zweite Filterpapier ebenfalls luftblasenfrei aufgebracht. Die Transferzelle wurde mit der Kathode verschlossen und die Proteine wurden 1 Stunde lang bei 15 Volt auf die PVDF-Membran transferiert.

Vor dem Auftragen der jeweiligen Seren wurde die PVDF-Membran viermal je 5 Minuten mit 1x PBS auf einem Schüttler gewaschen und zur Absättigung unspezifischer Bindungen mit PBS/3% BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde die Membran in eine Multiscreen-Kammer (Mini-Protean II; Bio-Rad) eingespannt und die Seren wurden in 1:100 Verdünnungen mit PBS/0,3% BSA aufgetragen. Nach der Inkubation für 16 Stunden bei 4°C wurde die Membran mit PBS/0,05% Tween 20 (PBST; Serva, Heidelberg) gewaschen und mit einer 1:1000 Verdünnung der jeweiligen speziesspezifischen Antikörper (Tab. 4) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde die Membran fünfmal mit PBST gewaschen und die Bindung der Antikörper wurde durch die Verwendung einer DAB-Lösung (10 mg 3,3‘-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid Dihydrat (Pierce, Sankt Augustin, Deutschland) gelöst in 25 ml 25 mM Tris, pH 8.0) und Peroxid (3 µl einer 30%igen H₂O₂-Lösung (Merck)) visualisiert.

Synthetische, von PERV abgeleitete, Peptide (siehe Tab. 3) wurden mit 1 µg pro Well in 96Well Platten über Nacht bei 37°C immobilisiert. Die Platten wurden einmal mit PBST gewaschen und für 1 Stunde mit 100 µl pro Well PBST/3% BSA bei Raumtemperatur inkubiert. Je 50 µl Testserum pro Well wurden als 1:100 Verdünnungen und in dreifacher Ausführung nach dem waschen der Platten mit PBST aufgetragen und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt mit PBST, wurden die Platten für eine weitere Stunde mit 1:1000 Verdünnungen von Peroxidase-gekoppelten, anti-humanen und anti-kaninchen γImmunglobulin-Antikörpern (IgG; Sigma) inkubiert. Die Bindung der Antikörper wurde durch die Verwendung von 30 mg o-Phenylendiamin (Sigma) gelöst in 100 ml H₂O (Bidest.) und der Zugabe von 30 µl Peroxid-Lösung visualisiert. Die Farbentwicklung wurde durch die Zugabe von 2,5 M Schwefelsäure (Roth) gestoppt und bei 492 nm im UV-Spektrometer, mit 620 nm als Referenzwellenlänge, photometrisch gemessen. Platten ohne Peptide dienten als Kontrollen. Die Absorption der Negativkontrollen (Platten ohne Peptide) wurde von den mit Peptiden beschichteten Platten abgezogen. Die Ergebnisse wurden als Positiv bewertet, wenn sie größer als der Durchschnitt plus dreimal die Standardabweichung der Negativkontrollen waren.
Die Bestimmung der Konzentration des aus porzinen Langerhans’schen Inselzellen freigesetzten Insulins wurde mit einem kommerziellen Insulin-ELISA Test nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (BioSource Europe S.A., Nivelles, Belgien).

Um die Expression der PERV-spezifischen Proteine p15Env und p27Gag zu überprüfen, wurden 1x10⁶ Zellen mit 500 µl 3,7%igem Formalin (Formaldehyd-Lösung (Merck) in PBS) versetzt und für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS/2% FKS bei 500 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand abgenommen und für 15 Minuten mit 500 µl 0,5% Triton X-100 (Roth) inkubiert. Nach zweimaliger Zentrifugation mit PBS/2% FKS bei 2300 UpM, wurden die Zellen für 20 Minuten mit PBS/5% Magermilchpulver inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal zentrifugiert und für 1 Stunde mit 1:1000 Verdünnungen der Primärantikörper Anti-rp15Env, Antirp27Gag und den jeweiligen Isotyp-Kontrollen (Tab. 5) inkubiert. Nach zwei Zentrifugationsschritten wurden die Zellen für eine weitere Stunde mit einer 1:6000 Verdünnung des FITCgekoppelten Sekundärantikörpers Anti-Ziege IgG inkubiert, zentrifugiert und in 300 µl FACS-Lysingsolution (BD Biosciences, Erembodegem-Aalst, Belgien) resuspendiert. Die Messung erfolgte am FACScalibur (BD Biosciences).

Für die Infektionsstudien wurden sterilfiltrierte Zellkulturüberstände von der porzinen Nierenzelllinie PK15, die PERV-A und PERV-B produzierte (PK15/PERV), und von der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293, die ebenfalls PERV-A und PERV-B produzierte (293/PERV; zur Verfügung gestellt von Dr. R. Weiss, London, England), verwendet. Zusätzlich wurden die Isolate von PERV-B und des rekombinanten PERV-A/C (PERV/5°) verwendet. Dazu wurden Zellkulturüberständen der mit PERV-B bzw. PERV-A/C produktiv infizierten humanen Nierenzelllinie 293 verwendet. Bei PERV-B handelt es sich um einen molekularen Klon, der von Dr. D. Onion (Glasgow, England) zur Verfügung gestellt wurde. PERV-A/C wurde ursprünglich aus stimulierten primären PBMC von Mikroschweinen isoliert (Wilson, et al., 1998,Wilson, et al., 2000). Die Passagierung von PERV-A/C auf 293Zellen führte zu einer Erhöhung des viralen Titers, die durch genetische Veränderungen in der viralen LTR bedingt war (Denner, et al., 2003). In den hier beschriebenen Experimenten wurde die 5. Passage des PERV-A/C verwendet. Die Titer der sterilfiltierten Zellkulturüberstände von PK15/PERV, von 293/PERV, von PERV-B und von PERV-A/C betrugen 1x10^1,3, 1x10^2,2, 1x10^1,7 und 1x10⁴ TCID₅₀/ml (Tissue culture infectivity dose) wie durch Endpunkt-Titration auf humanen 293-Zellen bestimmt werden konnte.

In 12 ml-Zentrifugationsröhrchen (Beckmann GmbH, München) wurden 2 ml einer 20%igen Saccharose Lösung vorgelegt und mit 10 ml Zellkulturüberstand PERV produzierender 293Zellen überschichtet. Es wurde in einen swing-out-Rotor (SW-41, Beckmann) für 3 Stunden bei 25000 UpM und 4°C ultrazentrifugiert (Beckmann L8-70). Anschließend wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und das Viruspellet wurde zur Proteinisolierung in RIPAPuffer resuspendiert.

Für die Bestimmung der Aktivität viraler Reverser Transkriptase, wurde der C-type-RT™ Activity Assay (Cavidi Tech, Uppsala, Schweden) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.

Die Infektion der Zelllinien 293^neo+, 293, LLCMK2 und EB176 fand auf zwei unterschiedliche Arten statt. Einerseits wurden 293^neo+-Zellen für 7 Tage mit der gleichen Menge porziner Inselzellen, mit und ohne Zugabe von 8 µg/ml Polybren (Sigma) während der ersten 16 Stunden, inkubiert. Polybren erleichtert das Eindringen von Viruspartikeln in die Zielzelle. Nach sieben Tagen Kokultivierung wurden die Zellen mit 400 µg/ml G418 behandelt, um die porzinen Inselzellen zu entfernen. Ein bis vier Wochen nach der Behandlung mit G418 wurden die 293-Zellen lysiert und die DNA isoliert.

Andererseits wurden 2x10⁶ 293-, LLCMK2- und EB176-Zellen mit je 10 ml zentrifugiertem (3200 x g für 10 Minuten) und sterilfiltriertem (Sterilfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm; Schleicher & Schuell) Zellkulturüberstand PERV-produzierender Zellen versetzt. Nach einer Infektionszeit von mindestens einer Woche, wurden die Zellen lysiert und die DNA isoliert.

Die Infektion von murinen Zelllinien und primären Zellen erfolgte auf drei unterschiedliche Arten: 1. 10 ml zellfreies Virus wurden zu 5x10⁶ Zellen in Anwesenheit von 6 bis 16 µg/ml Polybren (Sigma) gegeben. 2. 1x10⁵ PERV-A/C-produzierende 293-Zellen, die sich in den oberen Wells einer 6-Well Transwell-Platte (Costar®, Vitaris AG, Baar) befanden, wurden für fünf Tage mit 1x10⁵ unifizierten murinen Zellen, die sich in den unteren Wells der Transwell-Platte befanden, inkubiert. Die RT-Aktivität in den Transwell-Platten betrug 500 mU/ml. 3. Die Mauszelllinie 3T6 wurde mit dem Neomycinresistenzgen transfiziert durch Transfektion mit dem pcDNA3.1-Vektor (Invitrogen) unter Verwendung des Transfast Transfektionsreagenz (Promega) und anschließender Selektion mit G418 (Gibco BRL). 1x10⁵ 3T6-Zellen wurden dann für fünf Tage mit der gleichen Anzahl an PERV-A/Cproduzierenden 293-Zellen inkubiert, in An- bzw. Abwesenheit von 8 µg/ml Polybren während der ersten 16 Stunden. Alle Zellen wurden anschließend mit 400 µg/ml G418 behandelt, um die Virusproduzierenden Zellen zu eliminieren und am Tag 6, 10 und 15 wurden die Zellen gesplittet. Die Zellen wurden am Tag 20 mit Proteinase K bei 56°C für drei Stunden lysiert und die DNA wurde für PCR-Analysen mit Hilfe des QIAgen Blood Mini Kits isoliert.

Die in vivo Untersuchungen lassen sich in Mausmodelle und erste klinische Studien im Menschen unterteilen. Für die Infektion mit PERVs in vivo wurden zunächst männlichen BALB/c-Mäusen Barium-Alginat-verkapselte porzine Inselzellen (Gaumann, et al., 2000) in die Peritonealhöhle injiziert. Die Mäuse wurden 14 Tage vor der Applikation der Inselzellen mit drei verschiedenen Immunsuppressiva (Zenapax, ProGraf und Rapamune) nach dem sogenannten Edmonton Protokoll (Shapiro, et al., 2000) behandelt. Die Behandlung mit den Immunsuppressiva wurde noch 14 Tage nach der Injektion der verkapselten Inselzellen fortgeführt. Nach circa 10 Monaten wurden die Inselzellen wieder entfernt und den Mäusen wurde Blut zur Serumgewinnung entnommen. Um Effekte der Immunsuppressiva unterscheiden zu können, wurde eine Kontrollgruppe mitgeführt, die keine Immunsuppression erhielt.
In einem weiteren In vivo-Infektionsmodell wurden SCID-Mäusen (severe combined immunodeficiency; männliche SCID-Mäuse, 10 bis 12 Wochen alt und 20 bis 25 g schwer, Charles River Laboratories, Sulzfeld) zellfreie Zellkulturüberstände PERV-A/Cproduzierender 293-Zellen appliziert. Um die Überstände von Zellen und Zellresten zu befreien, wurden sie zentrifugiert und sterilfiltriert. Die Applikation zellfreier Lösungen verhindert auftretende Komplikationen durch Mikrochimärismus. Den SCID-Mäusen wurden je 1 ml zellfreier Zellkulturüberstand intra peritonial, intra muskulär und subcutan appliziert. Nach circa 3 Wochen wurden den Mäusen die Leber, die Milz und die Nieren entnommmen und die DNA aus den Organen isoliert. Um mögliche Effekte, die durch das Zellkulturmedium ausgelöst wurden unterscheiden zu können, wurde einer Kontrollgruppe nur Zellkulturmedium verabreicht.

Bei den klinischen Studien handelte es sich zunächst um acht Patienten, die mit einem extrakorporalen Leberunterstützungssystem behandelt wurden, bevor sie ein humanes Lebertransplantat erhielten (Irgang, et al., 2003,Sauer, et al., 2003). Das Leberunterstützungssystem war mit porzinen Hepatozyten bestückt, die sich in einem speziell entwickelten Bioreaktor (Abb. 6 (Gerlach, 1997)) befanden. Die für den Bioreaktor verwendeten Hohlfasern bildeten ein dreidimensionales Netzwerk, in dessen Hohlräume 1,8 x 10¹⁰ bis 4,4 x 10¹⁰ porzine Hepatozyten in Kokultur mit nicht-parenchymalen Zellen kokultiviert wurden. Die Hepatozyten stammten von spezifizierten pathogen-freien Schweinen der Deutschen Landrasse. Die Tiere waren frei von Zoonosen-verursachenden Mikroorganismen, wie durch Serologie gezeigt werden konnte. Die Hepatozyten wurden durch eine Leberperfusion mit Collagenase in fünf Schritten erhalten (Gerlach, et al., 1994). Die Zugabe von tierischer Biomatrix und FKS wurde vermieden. Die Viabilität der in den Bioreaktor verbrachten Hepatozyten wurde durch das Trypanblau-Ausschluss Verfahren bestimmt und variierte zwischen 91 und 98%. Während der Ruhephase von 1 bis 14 Tagen vor der therapeutischen Anwendung, wurden die Bioreaktoren täglich auf Stoffwechselaktivität hin überprüft. Das Leberunterstützungssystem bestand aus einem Blutkreislauf mit einer kontinuierlichen Plasmaseparationseinheit (CRRT, B. Braun, Melsung) und einem zweiten Kreislauf zur Plasmaperfusion der Bioreaktoren (Hybrid Organ, Berlin). Der venöse Zugang wurde durch die Verwendung eines doppelwandigen Dialysekatheters (Arrow International, Reading, PA, USA) in die interne juguläre oder femorale Vene erreicht. Um die Koagulation zu verhindern, wurde eine kontinuierliche Infusion von Heparin durchgeführt. Das behandelte Plasma wurde mit der Blutzellfraktion wieder vereinigt und in den Patienten zurückgeleitet.

	Abbildung 6: Verwendetes Leberunterstützungssystem(Gerlach, 1997)A) Design des mit porzinen Hepatozyten bestückten Bioreaktors. B) Schema der Perfusion des Bioreaktors mit dem Serum des Patienten.

Acht Patienten mit akutem oder akutem bis chronischem Leberversagen, die für eine Lebertransplantation mit hoher Dringlichkeit vorgesehen waren, wurden in die Studie aufgenommen. Das Alter der Patienten lag zwischen 26 und 58 Jahren. Die Therapie wurde initiiert, um eine weitere Verschlechterung der klinischen Konditionen der Patienten, auf Grund des Mangels eines passenden Spenderorgans, zu vermeiden und endete, sobald ein passendes Organ für die Transplantation zur Verfügung stand. Die Erlaubnis für die Therapie wurde von den relevanten öffentlichen Authoritäten und ethischen Kommissionen eingeholt. Alle Patienten wurden in einer ausgewiesenen Intensivstation für Transplantationen behandelt. Sofort nach der Aufnahme ins Krankenhaus wurden die Patienten für eine Lebertransplantation mit hoher Dringlichkeit eingestuft und für eine Transplantation bei EUROTRANSPLANT (Leiden, Niederlande) registriert. Alle Behandlungen wurden in voller Übereinstimmung mit der Helsinki-Erklärung von 1975 durchgeführt. Die Dauer der Behandlung lag zwischen 8 und 46 Stunden. Serumproben der Patienten wurden vor der Bioreaktorbehandlung und vor der Lebertransplantation entnommen. Von sieben der acht Patienten wurden zusätzlich ein halbes, ein und drei bis fünf Jahre nach der Behandlung Serumproben entnommen. Ein Patient verweigerte die Teilnahme an serologischen Untersuchungen.

In einer weiteren retrospektiven klinischen Studie (Diatranz, Auckland, Neuseeland), wurden 18 Typ I Diabetes Patienten porzine Inselzellen auf drei unterschiedliche Arten transplantiert: Erstens, als verkapselte Inselzellen; zweitens, als ein Gemisch aus Sertoli- und Inselzellen in einem speziell entworfenen Behältnis und drittens, als freie Inselzellen. Die porzinen Inselzellen wurden aus den Schweinerassen Large White und Camrough isoliert. Diese Schweine wurden intensiv auf konventionelle Mikroorganismen und Viren, die relevant für die Xenotransplantation sind (PLHV, PCMV und PCV), untersucht. Alle Patienten erhielten circa 10000 Inselzelläquivalente pro Kilogramm Körpergewicht. Die SertoliInselzellstrukturen bestanden aus 20 bis 100 Sertolizellen pro Inselzelläquivalent. Die Patienten wurden bis zu neun Jahre lang regelmäßig auf pathogene Veränderungen untersucht. Von 14 Patienten wurde das Serum vor der Transplantation und zu bestimmten Zeitpunkten nach der Transplantation für die PERV-Serologie entnommen.