3. Ergebnisse

Um die Freisetzung von PERV aus porzinen Inselzellen, die potentiell für die Behandlung von Diabetes mellitus verwendet werden würden, zu evaluieren, wurden Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse zusammen mit 293^neo+-Zellen für 7 Tage kokultiviert. Während dieses Zeitraums waren die Inselzellen lebendig, wie mittels eines TrypanblauAusschluss Tests gezeigt werden konnte, und produzierten Insulin, das mittels eines InsulinELISA nachgewiesen wurde (Abb. 7). Die Inselzellen in den ersten beiden Experimenten produzierten hohe Mengen an Insulin, während die Zellen aus der dritten Isolierung weniger Insulin freisetzten. Ein bis vier Wochen nach der Behandlung der Zellen mit G418, wurde die DNA der 293^neo+-Zellen mit Hilfe von PERV-spezifischen Primern in der PCR auf eine Integration von PERV-Proviren untersucht. Durch die Verwendung Neomycin-resistenter 293^neo+-Zellen und der anschließenden Selektion mit G418 wurden die porzinen Inselzellen eliminiert und ein Mikrochimärismus wurde verhindert. In drei unabhängigen Experimenten mit verschiedenen Inselzellisolaten aus Schweinen der Deutschen Landrasse, die von unterschiedlichen Schlachthäusern und Farmen aus Schleswig-Holstein stammten, konnten bei der Analyse der 293^neo+-Zellen keine Sequenzen von PERV-envA oder -envB amplifiziert werden (Abb. 8), trotz der Kokultivierung und der Verwendung von Polybren zur Erhöhung der Infektion der Zielzellen. Zusätzlich konnten auch bei einer PCR mit PERV-gag und PERV-pol Primern keine proviralen Sequenzen von PERV amplifiziert werden (Daten nicht gezeigt), während aus der DNA von PK15-Zellen PERV-spezifische gag-, pol-, envA- und envB-Sequenzen amplifiziert werden konnten. Des Weiteren war in der isolierten 293^neo+DNA keine DNA porziner Inselzellen mehr vorhanden, wie durch die Abwesenheit von porzinen mitochondrialen COII-Amplifikationsprodukten (Untereinheit II der Cytochromoxidase) bestätigt werden konnte. Die Abwesenheit von Kontaminationen wurde durch die Verwendung von unbehandelten 293^neo+-Zellen und Wasser überprüft. Diese Ergebnisse zeigten keine Virusfreisetzung aus Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse, die lebendig waren und kontinuierlich Insulin produzierten.

	Abbildung 7: Insulinfreisetzung der porzinen Inselzellen in den ersten 7 Tagen. Die Insulinkonzentration ist in Mikroinsulineinheiten pro Milliliter (µIU/ml) angegeben. Die internen Kontrollen einer geringen und einer hohen Insulinfreisetzung hatten Werte von 22,9 ± 1,9 µIU/ml und 122,4 ± 22,6 µIU/ml (19,4 ± 3,9 und 87 ± 17 µIU/ml nach den Angaben des Herstellers).

	Abbildung 8: Keine Infektion mit PERV von 293neo+-Zellen kokultiviert mit porzinen Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse. Der 100 Bp (Basenpaar) Marker zeigt DNA-Fragmente mit Längen zwischen 100 und 2000 Basenpaaren (Invitrogen). Die Amplifikationsprodukte PERV- env A und - env B sind 360 bzw. 263 Bp lang. β-Actin und die porzine COII (Porz. COII) zeigen Amplifikationsprodukte von 528 und 255 Bp-Länge.

Trotz der Abwesenheit einer In vitro-Infektion humaner Zellen mit PERV aus Inselzellen der Deutschen Landrasse, wurden weitere Versuche zur Evaluierung der PERV-Freisetzung durchgeführt. Dazu wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Die Verwendung eines In vivoXenotransplantationsmodells hat den Vorteil, eine größere Auswahl an potentiellen PERVsuszeptiblen Zellen und Geweben erreichen zu können. Zum Schutz der Inselzellen der Deutschen Landrasseschweine vor den Immunreaktionen der Mäuse, wurden den Mäusen Barium-Alginat-verkapselte Inselzellen appliziert. Die Verwendung von Immunsuppressiva 14 Tage vor bzw. nach der Transplantation diente ebenfalls zum Schutz der Inselzellen. Mittels Western Blot und spezifischen Antiseren gegen Hüll- und Capsidproteine von PERV konnten keine PERV-spezifischen Antikörper in männlichen BALB/c-Mäusen, denen für zehn Monate porzine Inselzell-Transplantate appliziert wurden, detektiert werden (Abb. 9). Die Qualität des Western Blots wurde durch die Verwendung tierischer Kontrollseren gegen p27Gag, rekombinantes p15Env von PERV und einem kreuzreagierenden Serum gegen gp70 von FLV evaluiert. Alle Kontrollseren zeigten positive Reaktionen, die das Vorhandensein des korrespondierenden Antigens bestätigten. Die Reaktionen der Kontrollseren gegen gp70 und p15Env waren schwächer als die gegen p27Gag, da in der Viruspräparation weniger EnvProteine vorlagen. Die in den Seren zweier Tiere der gemischten Gruppe IV nachgewiesenen Antikörper (Abb. 9) entsprachen nicht den Molekülgrößen PERV-spezifischer viraler Proteine, waren aber auch nicht gegen porzine Proteine gerichtet, wie durch einen Western Blot mit Proteinlysaten von porzinen Inselzellen als Antigen bestätigt werden konnte (Daten nicht gezeigt). Also waren es mit humanen Proteinen kreuzreagierende Antikörper, da das im Western Blot eingesetzte PERV auf 293-Zellen gezüchtet wurde. Hier konnte gezeigt werden, dass Barium-Alginat-verkapselte porzine Inselzellen keine PERV-Infektion in immunsupprimierten BALB/c-Mäusen etablierten, während in einem Modellversuch mit Barium-Alginat-verkapselten PERV-produzierenden Zellen das Virus die Kapseln passieren konnte (Daten nicht gezeigt).

	Abbildung 9: Western Blot mit Seren von BALB/c-Mäusen, die Transplantate von verkapselten porzinen Inselzellen enthielten. Der verwendete Western Blot beruhte auf einem viralen Proteinlysat des gesamten PERV als Antigen. Die Kontrollgruppe (Gruppe II) wurde nicht mit Immunsuppressiva behandelt. Der gemischten Gruppe (Gruppe IV) wurden alle drei Immunsuppressiva verabreicht: Zenapax, humanisierter IL-2Rα-Antikörper; ProGraf, Lacton aus Streptomyces tsukubaensis ; Rapamune, Antibiotika aus S. Hygroscopicus . Die angegebenen Molekülgrößen entsprechen denen des Seeblue® Plus2-Markers (Invitrogen).

Da weder bei der Kokultivierung von 293^neo+-Zellen mit Inselzellen der Deutschen Landrasse noch bei der Transplantation der Inselzellen in BALB/c-Mäuse eine Freisetzung von infektiösem Virus beobachtet wurde, wurde die Expression von PERV-spezifischer mRNA in den Inselzellen untersucht. Mit Hilfe der RT-PCR und spezifischen Primern für gag, pol und envA konnte keine PERV-spezifische mRNA in den Inselzellen der Deutschen Landrasse detektiert werden (Abb. 10A). Wurde dagegen RNA von der porzinen Nierenzelllinie PK15 als Positivkontrolle verwendet, konnten distinkte und spezifische Amplifikationsprodukte für gag, pol und envA beobachtet werden. Durch die Amplifikation von porzinen COIISequenzen wurde die Verwendung gleicher Mengen an RNA von Insel- und PK15-Zellen bestätigt. Die Abwesenheit von zellulärer DNA wurde durch Weglassen der Reversen Transkriptase und fehlender Amplifikationsprodukte bestätigt. Wie erwartet, wurden PERV-Proviren in der DNA von Inselzellen der Deutschen Landrasse durch PCR-Analyse unter Verwendung von gag, pol und envA Primern detektiert (Abb. 10B). Hier wurde gezeigt, dass in Inselzellen aus drei verschiedenen Schweinen der Deutschen Landrasse keine virale mRNA vorhanden war, trotz der Tatsache, dass Proviren präsent waren.

	Abbildung 10: Analyse der Expression von PERV-spezifischen Sequenzen in Inselzellen der Deutschen Landrasse.A) RT-PCR mit RNA von Insel- und PK15-Zellen unter Verwendung von gag pol und env A Primern. Eins der drei Inselzellisolate ist dargestellt. B) PCR mit DNA aus Insel- und PK15-Zellen. Es sind zwei der drei Inselzellisolate dargestellt.

Um die Ergebnisse aus den RT-PCR Experimenten zu bestätigen und unter Berücksichtigung der Möglichkeit, dass trotz der Abwesenheit von detektierbarer mRNA PERV-spezifische Proteine in den Inselzellen exprimiert werden könnten, wurde eine Analyse mittels Durchflusszytometrie durchgeführt (Abb. 11). Es konnten keine PERV-spezifischen Hüll oder Capsidproteine (Env oder Gag) in permeabilisierten Inselzellen und uninfizierten 293-Zellen unter Verwendung von spezifischen Antiseren detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten PERV-A/C-produzierende 293-Zellen starke Fluoreszenzsignale.

	Abbildung 11:Proteinexpression von Inselzellen der Deutschen Landrasse in vitro.Bei den jeweiligen Isotyp-Kontrollen handelt es sich um Ziegenseren, die vor der Immmunisierung mit rp15Env bzw. rp27Gag entnommen wurden.

Auf Grund der phylogenetischen Nähe nicht-humaner Primaten zum Menschen, könnte die Infektion von Primaten mit PERV zahlreiche Erkenntnisse zur Pathogenität von PERV liefern. Daher wurden schon zahlreiche Versuche unternommen, Primaten in vitro mit PERV zu infizieren (Blusch, et al., 2000,Martin, et al., 1998,Specke, et al., 2001). In diesen Versuchen konnte gezeigt werden, dass sich primäre Zellen und Zelllinien einiger nichthumaner Primaten mit PERV infizieren ließen. In ersten in vivo Versuchen unserer und anderer Arbeitsgruppen konnte keine Übertragung von PERV nach Applikation hoher Dosen in immunsupprimierte Rhesusaffen, Paviane und Schweinsaffen beobachtet werden (Denner, et al., 2001,Martin, et al., 2002,Specke, et al., 2002). PERV wurde deshalb auf Zellen von Rhesusaffen und Schimpansen passagiert, um für spätere Versuche ein auf Affenzellen adaptiertes Virus zu gewinnen.

In der DNA von Zellen der Rhesusaffen-Nierenzelllinie LLCMK2, die mit zellfreiem PERVA/C- oder PERV-B inkubiert wurden, ließen sich zwei bis drei Wochen nach der Inkubation PERV-spezifische provirale Sequenzen (Abb. 12A) nachweisen. Die Infektion von LLCMK2Zellen mit PERV-A/C war mit oder ohne Polybren erfolgreich (Abb. 12A), wie durch die Amplifikation von PERV-pol und PERV-envA Sequenzen erkennbar war. Bei der Verwendung von envA-spezifischen Primern wurden in den LLCMK2-Zellen zusätzlich zelluläre Sequenzen amplifiziert, die möglicherweise verwandte endogene Retroviren darstellen. Bei der Infektion von LLCMK2-Zellen mit PERV-B ohne Zugabe von Polybren, waren sowohl pol-spezifische als auch envB-spezifische Sequenzen amplifizierbar, während bei den Zellen, die mit Polybren behandelt wurden, nur envB-spezifische Sequenzen detektierbar waren. Des Weiteren ließ sich drei Wochen nach der Inkubation mit PERV-B kaum noch envB-spezifische DNA amplifizieren. Schließlich waren die pol-spezifischen Amplifikationsprodukte der PERV-A/C bzw. PERV-B infizierten LLCMK2-Zellen schwächer als die von 293/PERV-A/C- und 293/PERV-B-Zellen, die als Positivkontrollen dienten (Abb. 12A). Die Verwendung gleicher Mengen an LLCMK2-DNA konnte durch die Amplifikation von β-Actin Sequenzen bestätigt werden.

Bei der lymphoiden Schimpansenzelllinie EB176 ließen sich eine Woche nach der Inkubation mit PERV-A/C in der DNA der EB176-Zellen Proviren nachweisen, wie durch die Amplifikation von pol- und envA-spezifischen Sequenzen bestätigt werden konnte (Abb 12B). Auch hier hatte Poybren keinen Einfluss auf die Effektivität der Infektion. Die Verwendung von envA-spezifischen Primern führte ebenfalls zur Amplifikation zusätzlicher zellulärer Sequenzen. Auf Grund der unterschiedlichen Sensitivität der PCR bei der Verwendung der PERV-pol Primer zu den PERV-envB Primern von 1:10³ zu 1:10⁴, ließen sich nach der Inkubation von EB176-Zellen mit PERV-B zunächst nur envB-spezifische Sequenzen detektieren, während pol-spezifische Sequenzen kaum amplifiziert wurden. Zwei Wochen nach der Infektion unter Verwendung von Polybren, konnten schließlich auch polspezifische Sequenzen amplifiziert werden. Allerdings waren die pol und envB-spezifischen Amplifikationsprodukte wiederum schwächer als die von 293/PERV-B-Zellen.

	Abbildung 12: Nachweis von PERV-Proviren in Zelllinien nicht-humaner Primaten. A) Die DNA aus LLCMK2-Zellen wurde 2 bis 3 Wochen nach der Infektion mit PERV isoliert und mittels PCR auf das Vorhandensein von proviralen Sequenzen überprüft. B) PCR mit der DNA aus EB176-Zellen.

Die Verwendung gleicher Mengen an EB176-DNA wurde durch die Amplifikation von βActin Sequenzen bestätigt. In diesen Versuchen konnte die Infektion von Zelllinien von Rhesusaffen und Schimpansen mit verschiedenen PERV-Subtypen gezeigt werden.

Nach der Integration des Provirus ins Wirtsgenom ist ein weiterer wichtiger Schritt zur Vollendung des Replikationszyklus, die Expression der Volllängen und der gespleißten viralen mRNA. Zusätzlich gibt die Expression von gespleißter und ungespleißter viraler mRNA erste Hinweise darauf, ob virale Proteine synthetisiert werden und ob letztendlich Viruspartikel freigesetzt werden können. Aus diesen Gründen wurde eine Methode entwickelt, die es erlaubte, zwischen ungespleißter und gespleißter viraler mRNA unterscheiden zu können. Dazu wurden für die Detektion der Volllängen-mRNA von PERV Primer entwickelt, die links und rechts von der Spleißdonorstelle lagen (Abb. 13A). Für die Detektion gespleißter viraler mRNA wurden Primer entwickelt, die links von der Spleißdonorstelle und rechts von der Spleißakzeptorstelle lagen (Abb. 13A). Um die Spezifität der entwickelten Primer zu überprüfen, wurde die RNA von 293/PERV-A/C-, von PK15- und von 293-Zellen in einer RT-PCR eingesetzt (Abb. 13B). Die Primer zur Amplifikation der Volllängen-mRNA von PERV zeigten Amplifikationsprodukte von circa 220 Bp-Länge bei 293/PERV-A/C- und PK15-Zellen. Das Amplifikationsprodukt der gespleißten mRNA von 293/PERV-A/C hatte eine Länge von circa 470 Bp, während die RTPCR mit PK15-RNA Amplifikationsprodukte von circa 380 und 480 Bp-Länge zeigte. Die unterschiedlichen Produktlängen entstanden durch Sequenzunterschiede der drei Subtypen PERV-A, PERV-B und PERV-C. PERV-A und PERV-B wurden von den PK15-Zellen produziert. PERV-A/C besteht überwiegend aus PERV-C und wurde von den 293/PERVA/CZellen freigesetzt. Die Spezifität der verwendeten Primer wurde durch das Fehlen von Amplifikationsprodukten in der RNA nicht infizierter 293-Zellen bestätigt. Die Qualität der RT-PCR wurde durch fehlende Amplifikationsprodukte in einer Wasserprobe bestätigt. Der Auftrag gleicher Mengen an RNA wurde durch Amplifikation mit β-Actin Primern bestätigt. Durch fehlende Amplifikationsprodukte ohne Reverse Transkriptase wurde die Abwesenheit zellulärer DNA bestätigt. Mit dieser Methode wurde zum ersten Mal die Amplifikation ungespleißter und gespleißter mRNA von PERV gezeigt. Des Weiteren ließen sich unter Verwendung der Primer zur Amplifikation gespleißter mRNA die Subtypen PERV-A, PERVB und PERV-C voneinander unterscheiden.

	Abbildung 13: Entwicklung einer Methode zur Unterscheidung von ungespleißter und gespleißter mRNA von PERV. A) Lage der ausgewählten Primer im Provirus. SD, Spleißdonor; SA, Spleißakzeptor. B) RT-PCR mit RNA von 293/PERV-A/C-, PK15- und 293-Zellen. Die Amplifikationsprodukte der Volllängen-mRNA von 293/PERV-A/C und PK15 sind 220 Bp lang. Die Amplifikationsprodukte der gespleißten mRNA von 293/PERV A/C und PK15 sind 470 bzw. 380 und 480 Bp lang. Die Amplifikation mit β-Actin Primern diente der Kontrolle gleicher Mengen an RNA. Die Amplifikation ohne Reverse Transkriptase (-RT) diente zur Kontrolle der Abwesenheit zellulärer DNA.

Nach der erfolgreichen Infektion von Rhesusaffen- und Schimpansenzelllinien mit PERV sollte im nächsten Schritt die Expression von ungespleißter und gespleißter viraler mRNA in den Zellen analysiert werden, um damit erste Hinweise auf die Synthese viraler Proteine zu erhalten. Dafür wurde mittels RT-PCR und der von uns entwickelten Methode zur Unterscheidung von ungespleißter und gespleißter mRNA zum ersten Mal die Expression der PERV-mRNA in den Zellen der Rhesusaffen- und Schimpansenzelllinien (LLCMK2 und EB176) über mehrere Wochen hinweg untersucht. Die Volllängen-mRNA von PERV-A/C konnte bis zu sieben Wochen nach der Infektion von LLCMK2-Zellen (Abb. 14A) und bis zu acht Wochen nach der Infektion von EB176-Zellen (Abb. 14B) detektiert werden. Zusätzlich wurde die gespleißte mRNA von PERV-A/C zwei Wochen nach der Infektion von LLCMK2Zellen und eine Woche nach der Infektion von EB176-Zellen detektiert (Abb. 14A und B). Die Detektion der Amplifikationprodukte der gespleißten PERV-A/C-mRNA begann in der 2. Woche nach Infektion der LLCMK2-Zellen (Abb. 14A), während die der Amplifikationprodukte der gespleißten PERV-A/C-mRNA in den EB176-Zellen bereits in der 1. Woche nach der Infektion nachgewiesen wurden (Abb. 14B). Die Amplifikationsprodukte der gespleißten PERV-A/C-mRNA waren anschließend bis zu sieben Wochen nach der Infektion von LLCMK2-Zellen und bis zu acht Wochen nach der Infektion von EB176-Zellen nachweisbar (Abb. 14A und B).

Die Volllängen-mRNA von PERV-B war zwei bis vier Wochen nach der Infektion von LLCMK2-Zellen (Abb. 14A) und zwei bis drei Wochen nach der Infektion von EB176-Zellen (Abb. 14B) nachweisbar. Die Amplifikationprodukte der Volllängen-mRNA von PERV-B waren fünf Wochen nach der Infektion der LLCMK2-Zellen kaum noch nachweisbar (Abb. 14A). In der 6. Woche nach der Infektion war die Volllängen-mRNA von PERV-B sowohl in den LLCMK2-Zellen als auch in den EB176-Zellen nicht mehr detektierbar (Abb. 14A und B). Zum gleichen Zeitpunkt waren auch keine proviralen PERV-B-Sequenzen in der DNA der infizierten Zellen nachweisbar. Zu keinem Zeitpunkt nach der Infektion der beiden Zelllinien mit PERV-B konnte gespleißte PERV-B-mRNA detektiert werden. Die Amplifikation mit βActin Primern bestätigte die Verwendung gleicher Mengen an RNA. Die Abwesenheit von zellulärer DNA wurde durch fehlende Amplifikationsprodukte ohne Reverse Transkriptase bestätigt. Hier wurde zum ersten Mal die Expression der Volllängen- und gespleißten mRNA von PERV-A/C in Rhesusaffen- und Schimpansenzelllinien über den gesamten Zeitraum des Experiments gezeigt. Die Expression der Volllängen-mRNA von PERV-B verschwand dagegen nach wenigen Wochen, korrespondierend zum Verlust des PERV-B Provirus.

	Abbildung 14: Expression ungespleißter und gespleißter PERV-spezifischer mRNA in PERV-infizierten Zelllinien nicht-humaner Primaten. A) RT-PCR mit RNA von PERV infizierten LLCMK2-Zellen. B) RT-PCR mit RNA von EB176-Zellen. RNA von 293/PERV A/C-Zellen diente als Positivkontrolle. Der 1 Kb + -Marker zeigte DNA-Fragmente zwischen 100 und 500 Bp-Länge.

Die Expression der Volllängen-mRNA und der gespleißten mRNA von PERV-A/C in den LLCMK2- und EB176-Zellen deutete auf die Synthese viraler Proteine und die Freisetzung von Viruspartikeln hin. Um das zu untersuchen und um zu klären, ob diese Viren in der Lage sind, humane und nicht-humane Zellen zu infizieren, wurden zellfreie Zellkulturüberstände von PERV-A/C-produzierenden LLCMK2- und EB176-Zellen mehrfach über einen Zeitraum von zehn Wochen auf uninfizierte LLCMK2- bzw. EB176-Zellen und humane 293-Zellen gegeben. Mit Hilfe der PCR und den PERV-spezifischen Primern pol und envA konnte eine Woche nach der Zugabe von LLCMK2-adaptiertem PERV-A/C (LLCMK2/PERV-A/C) zu uninfizierten LLCMK2- und 293-Zellen eine Infektion beobachtet werden (Abb. 15A). Auf Grund der unterschiedlichen Sensitivität der PCR bei der Verwendung von pol Primern zu envA Primern von 1:10³ zu 1:10⁴ wurden in den LLCMK2- und 293-Zellen nur provirale envA Sequenzen detektiert. Diese waren jedoch schwächer als die envA Sequenzen der als Positivkontrolle dienenden LLCMK2/PERV-A/C-Zellen. Nach einer Zugabe von zellfreien Virusüberständen zweimal pro Woche über einen Zeitraum von neun Wochen waren in den 293-Zellen pol Sequenzen nachweisbar. Allerdings konnten nach zehn Wochen weder pol noch envA Sequenzen in den 293-Zellen beobachtet werden. Die Amplifikation von β-Actin Sequenzen bestätigte die Verwendung gleicher Mengen an DNA.

Nach einer dreiwöchigen Zugabe von Virusüberständen von EB176-adaptiertem PERV-A/C (EB176/PERV-A/C) konnten in den EB176-Zellen, im Vergleich zu den Positivkontrollen (DNA aus EB176/PERV-A/C-produzierenden Zellen) schwache pol und envA Amplifikationprodukte detektiert werden (Abb. 15B). Diese blieben bis zur zehnten Woche nachweisbar. Nach einer Zugabe von Virusüberständen über einen Zeitraum von ein bis drei Wochen konnten in 293-Zellen schwache provirale pol und envA Amplifikationprodukte detektiert werden. Nach vierwöchiger Zugabe von Virusüberständen zu den 293-Zellen waren starke, distinkte pol und envA Sequenzen nachweisbar, die bis zu zehn Wochen lang detektierbar blieben. Die Schwankungen des Nachweises der pol und envA Sequenzen konnte wiederum auf die unterschiedliche Sensitivität der PCR zurückgeführt werden. Die Verwendung gleicher Mengen an DNA wurde durch die Amplifikation mit β-Actin Primern bestätigt. In diesem Experiment konnte gezeigt werden, dass PERV-A/C von LLCMK2Zellen und PERV-A/C von EB176-Zellen unbehandelte LLCMK2- bzw. EB176-Zellen und PERVsuszeptible humane 293-Zellen in vitro infizierten. Aber die Anzahl der freigesetzten adaptierten PERV-A/C-Partikel nach der ersten Passage auf LLCMK2- bzw. auf EB176Zellen schien relativ gering zu sein.

	Abbildung 15: Infektion von humanen und nicht-humanen Zellen mit PERV-A/C, das an Affenzellen adaptiert war. A) PCR mit DNA aus LLCMK2- und 293-Zellen nach 10 wöchiger Zugabe von PERV-A/C von LLCMK2-Zellen. B) PCR mit DNA aus EB176- und 293-Zellen nach Zugabe von PERV-A/C von EB176-Zellen.

Neben den Versuchen, ein In vivo-Infektionsmodell zur Pathogenität von PERV in nicht-humanen Primaten zu etablieren, wurden Versuche unternommen, solch ein Modell auch in Kleintieren zu entwickeln. Allerdings blieben diese Versuche bisher ohne Erfolg (Specke, et al., 2002,Specke, et al., 2001). Eine Infektion mit PERV wurde jedoch für SCID-Mäuse (Deng, et al., 2000,van der Laan, et al., 2000) und Nacktmäuse (Clemenceau, et al., 2002), denen porzine Inselzellen transplantiert wurden, beschrieben. Da aber Mikrochimärismus in diesen Mausexperimenten nicht ausgeschlossen werden konnte und da kürzlich gezeigt wurde, dass Mäuse keinen Rezeptor für PERV-A haben (Ericsson, et al., 2003), wurden hier Infektionsversuche durchgeführt, bei denen der Mikrochimärismus vermieden werden sollte.

Zunächst wurden verschiedene Mauszelllinien (3T3, 3T6 und CTLL-2) mit Zellkulturüberständen PERV-produzierender Zellen behandelt. Diese Überstände stammten: 1. Von der porzinen Nierenzelllinie PK15, die PERV-A und PERV-B produzierte (PK15/PERV), 2. von der humanen embryonalen Nierenzelllinie 293, die ebenfalls PERV-A und PERV-B produzierte (293/PERV), 3. von PERV-A/C-produzierenden 293-Zellen und 4. von PERV-B-produzierenden 293-Zellen. Keine der Mauszelllinien zeigte eine detektierbare Reverse Transkriptase-Aktivität nach der Behandlung mit den verschiedenen PERVÜberständen, obwohl uninfizierte 293-Zellen, die parallel mit den gleichen Überständen unter identischen Bedingungen inkubiert wurden, produktiv mit PERV-A, PERV-B und PERV-A/C infiziert wurden. Wenn andererseits primäre Zellen von BALB/c- und NMRI-Mäusen mit den verschiedenen Viruspräparationen inkubiert wurden, konnte eine schwache RT-Aktivität in den Zellkulturüberständen der Nierenzellen von NMRI-Mäusen (Abb. 16A) und eine starke RT-Aktivität in den Überständen embryonaler Zellen von BALB/c-Mäusen beobachtet werden (Abb. 16B). Da jedoch in den Überständen der Kontrollzellen, die nicht mit PERV inkubiert wurden, ebenfalls RT-Aktivität detektiert wurde, handelte es sich möglicherweise um murine endogene Retroviren, die von den kultivierten Mauszellen freigesetzt wurden.

Obwohl keine der mit PERV inkubierten murinen Zellkulturen eine produktive Infektion zeigte, wurden die Zellen auf potentiell nicht-produktive Infektion (provirale Integration) durch PCR-Analyse von genomischer DNA mit PERV-spezifischen Primern untersucht. In keiner der murinen Zelllinien und primären Zellkulturen konnte provirale DNA mit Primern spezifisch für pol, envA und envB detektiert werden. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass die in den Überständen der murinen primären Nieren- und Embryozellen detektierten RT-Aktivitäten auf die Freisetzung von murinen endogenen Retroviren zurück zu führen sind. Schließlich wurde unter Verwendung von spezifischen Primern für p15Env vom MoMLV (Moloney murine leukaemia virus), genomische RNA des MoMLV in den Überständen beider muriner primärer Zellkulturen detektier, unabhängig davon, ob die Zellkulturen mit PERV behandelt wurden oder nicht (Daten nicht gezeigt).

	Abbildung 16: Reverse Transkriptase Aktivität in Zellkulturüberständen von primären murinen Zellen. A) RT-Aktivität in Überständen von Nierenzellen aus NMRI-Mäusen kultiviert in Abwesenheit oder Anwesenheit von PERV produziert von porzinen PK15-Zellen. B) RT-Aktivität in Überständen von embryonalen Zellen aus BALB/c Mäusen kultiviert in Abwesenheit oder Anwesenheit von PERV produziert von infizierten 293-Zellen. In beiden Fällen wurden frisch präparierte Zellen für 24 Stunden mit PERV enthaltenden Überständen oder nur mit Medium inkubiert.

Langzeit-Kokultivierungen von PERV-A/C- oder PERV-B-produzierenden 293-Zellen und uninfizierten 3T6-Zellen in Transwell-Platten erlaubte die kontinuierliche Inkubation mit frisch produziertem Virus, aber verhinderte direkten Zellkontakt und dadurch Mikrochimärismus. Keine PERV-Integration konnte in der DNA der murinen Zellen mittels PCR-Analyse mit PERV-spezifischen Primern detektiert werden. Da direkter Zellkontakt möglicherweise die Virusinfektion verbessert, wurden Neomycin-resistente murine 3T6^neo+Zellen mit PERV-A/C-produzierenden 293-Zellen für fünf Tage kokultiviert. Um Mikrochimärismus auszuschließen, wurden die PERV-A/C-produzierenden 293-Zellen durch die Behandlung mit dem Selektionsmedium G418 eliminiert. Keine PERV-spezifischen Sequenzen konnten in den murinen Zielzellen nach Entfernung der Virus-produzierenden Zellen nachgewiesen werden. Die parallele Kokultivierung von Neomycin-resistenten 293^neo+-Zellen mit PERV-A/C- und PERV-B-produzierenden 293-Zellen bei gleicher Selektionsmethode, resultierte stets in der Infektion der Zielzellen.

Hier wurde gezeigt, dass murine Zelllinien und primäre Zellen unter Verwendung verschiedener Infektionsmethoden, verschiedener PERV-Subtypen und Vermeidung von Mikrochimärismus nicht mit PERV infiziert werden konnten.

Obwohl ausgewählte murine Zellen mit PERV-A und PERV-B in vitro nicht infiziert werden konnten, besteht die Möglichkeit, dass andere suszeptible Zellen in vivo vorhanden sind. Da für SCID-Mäuse und Nacktmäuse eine PERV-Infektion nach Inokulation von porzinen Inselzellen beschrieben wurde (Clemenceau, et al., 2002,Deng, et al., 2000,van der Laan, et al., 2000), haben wir SCID-Mäuse für unsere Infektionsversuche mit zellfreiem Virus ausgewählt. Um die Chancen einer Infektion zu erhöhen, wurden hochtitrige Präparationen von PERV-A/C verwendet, ein Virus, das bessere Replikationsraten in vitro erreicht durch multimerisierte Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor NF-Y. Zur Vermeidung eines Mikrochimärismus wurden den SCID-Mäusen zellfreie Zellkulturüberstände von PERV-A/Cproduzierenden 293-Zellen appliziert. Da SCID-Mäuse keine B- und T-Zellen haben, also keine Antikörper produzieren können, wurden nur die Organe der Mäuse hinsichtlich einer PERV-Infektion mittels PCR untersucht. In der DNA der Milz, der Leber und der Niere von SCID-Mäusen konnten keine PERV-spezifischen proviralen Sequenzen drei Wochen nach der Inokulation nachgewiesen werden (Abb. 17). Die Applikation von Zellkulturmedium blieb ohne Auswirkungen auf die Organe der SCID-Mäuse. Die Amplifikation von β-Actin Sequenzen bestätigte die Verwendung gleicher Mengen an DNA. Dieser Versuch zeigte, dass sich SCID-Mäuse nicht mit hochtitrigem PERV-A/C infizieren lassen.

	Abbildung 17: PCR mit DNA aus verschiedenen SCID-Mausorganen.Es wurden jeweils fünf Tieren PERV-A/C-Zellkulturüberstände bzw. Zellkulturmedium appliziert. Als Positivkontrolle diente DNA aus PERV-A/C-produzierenden 293-Zellen. Als Negativkontrolle wurde DNA von uninfizierten 293-Zellen verwendet.

Da eine Infektion mit PERV in vivo zunächst nur einige Zellen und Gewebe betreffen würde, wären potentielle PERV-spezifische Antikörper in nur sehr geringen Mengen im Serum vorhanden. Um also die Möglichkeit zu haben, selbst eine geringe Menge PERV-spezifischer Antikörper zu detektieren, wurden das transmembrane Hüllprotein p15Env und das Capsidprotein p27Gag rekombinant hergestellt. Die Sensitivität des Nachweises dieser rekombinanten Proteine wurde im ELISA überprüft (Abb. 18A und B). Dazu wurden die durch Immunisierung erhaltenen Antiseren gegen das rekombinante p15Env und das p27Gag ausgehend von 1:500 (Anti-rp15Env) und 1:100 (Anti-rp27Gag) Verdünnungen in 1:2 Vedünnungsschritten auf 96-Well Platten, die 1µg pro Well der rekombinanten Proteine oder 1µg PERV-A/C-Proteinlysat enthielten, ausverdünnt.

	Abbildung 18: ELISA zur Bestimmung der Sensitivität der Antiseren gegen rp15Env und rp27Gag. A) Ausverdünnung des Antiserums gegen rp15Env in 96-Well Platten mit 1µg pro Well immobilisiertes rp15Env und PERV-A/C-Proteinlysat. B) Ausverdünnung des Antiserums gegen rp27Gag in 96-Well Platten mit 1µg pro Well immobilisiertes rp27Gag und PERV-A/C-Proteinlysat. In beiden Fällen wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt.

Bis zu einer Verdünnung des Antiserums gegen rp15Env von 1:32000 konnte 1µg des rekombinanten Proteins zuverlässig nachgewiesen werden, während für den Nachweis von p15Env in 1µg eines PERV-A/C-Proteinlysats eine Antiserum-Verdünnung von 1:500 notwendig war (Abb. 18A). Das bedeutet, dass in einem Testserum bis zu 64-mal weniger Antikörper gegen p15Env vorhanden sein können, wenn 1µg rekombinantes p15Env als Antigen verwendet wird. Allerdings muss hier berücksichtigt werden, dass der Anteil von p15Env im PERV-A/C-Proteinlysat geringer ist als 1µg. Der Nachweis von 1µg rp27Gag war bis zu einer Antiserum-Verdünnung von 1:12800 und bei Verwendung von 1µg PERV-A/CProteinlysat bis zu einer Verdünnung von 1:800 möglich (Abb. 18B). In einem Testserum können also 16-mal weniger Antikörper gegen p27Gag vorhanden sein, wenn 1µg rp27Gag als Antigen verwendet wird. Auch hier muss angemerkt werden, dass die Menge an p27Gag im PERV-A/C-Proteinlysat nicht 1µg entspricht.

Die Erhöhung der Sensitivität des Nachweises von Antikörpern, die gegen virale Proteine gerichtet sind, konnte mittels der Verwendung von rekombinanten Proteinen als Antigene erreicht werden.

Da PERVs in der Lage, sind humane Zellen in vitro zu infizieren (Patience, et al., 1997,Specke, et al., 2001,Wilson, et al., 1998) und sich sogar an humane Zellen adaptieren können (Denner, et al., 2001,Denner, et al., 2003), wuchsen die Bedenken, dass die Xenotransplantation von porzinen Geweben mit einer PERV-Infektion verbunden sein könnte (Chapman, et al., 1995). Aus diesen Gründen wurden Patienten aus ersten klinischen Studien retrospektiv hinsichtlich einer Infektion mit PERV untersucht. Zunächst wurden Seren von sieben Patienten, die mit einem Bioreaktor auf der Basis von porzinen Hepatozyten behandelt wurden, sowohl vor der Bioreaktorbehandlung und Lebertransplantation als auch ein halbes bis fünf Jahre nach der Behandlung auf Immunantworten gegen PERV untersucht. In allen Seren konnten keine PERV-spezifischen Antikörper in einem Western Blot basierend auf einem Virusproteinlysat von PERV als Antigen nachgewiesen werden (Abb. 19A). Die Qualität des Western Blots wurde durch die Verwendung von tierischen Kontrollseren gegen p27Gag, rekombinates p15Env von PERV und einem kreuzreagierenden Serum gegen gp70 von FLV evaluiert. Alle Kontrollseren zeigten positive Reaktionen, die das Vorhandensein der korrespondierenden Antigene anzeigten.

	Abbildung 19: Western Blot zur Untersuchung von Antikörpern gegen PERV in Patienten, die mit einem extrakorporealen Leberunterstützungssystem behandelt wurden. A) Verwendung von gereinigtem PERV-Lysat als Antigen. Kreuzreagierende Antiseren gegen das Hüllprotein gp70 und das Kernprotein p27Gag von FLV und Antiseren gegen das rekombinante transmembrane Hüllprotein p15Env von PERV wurden als Positivkontrollen zur Evaluierung der Qualität des Western Blots verwendet. B) Verwendung des rekombinanten Gag-Proteins als Antigen. Ein Antiserum gegen das rekombinante Gag Protein von PERV-C wurde als Positivkontrolle verwendet. C) Verwendung des rekombinanten p15Env als Antigen. Ein Antiserum gegen das rekombinante p15Env wurde als Positivkontrolle verwendet. LTx, Lebertransplantation; Vorst, Vorstufen.

Da einige Antigene im verwendeten Viruslysat nur zu einem geringen Anteil vorhanden waren, wie zum Beispiel p15Env und gp70, wurden neue Detektionsmethoden entwickelt (siehe Abschnitt 3.10), die zum Nachweis rekombinante Proteine nutzten. Obwohl das rekombinante p15Env nur einen Teil des viralen p15Env (AS 481-595) darstellte und möglicherweise einige putative Epitope fehlten, erlaubte die Verwendung von rekombinanten Proteinen den Einsatz größerer Mengen an Antigen. Das rekombinante p27Gag bestand aus dem gesamten Gag-Molekül von PERV-C. Auf Grund der oben genannten Gründe, waren diese Methoden sensitiver im Vergleich zu dem Western Blot mit viralem Proteinlysat. Trotz dieser Vorteile konnten in allen Seren ebenfalls keine Antikörper gegen die rekombinanten Proteine rp15Env und rp27Gag detektiert werden (Abb. 19B und C). Zusätzlich wurden die sieben Seren in einem sensitiven ELISA analysiert, der auf der Verwendung von synthetischen Peptiden korrespondierend zur immundominanten (ido) und immunsuppressiven (isu) Domäne des transmembranen Hüllproteins p15Env von PERV beruhte (Abb. 20A und B). Diese Peptide wurden als wichtiges diagnostisches Mittel angesehen, da im Falle von HIV-1 99,9% der Seren der infizierten Individuen mit einem Peptid, das der immundominanten Domäne von gp41 entsprach, im ELISA reagierten (Denner, et al., 1994). Peptide korrespondierend zur immundominanten Domäne wurden auch bei Untersuchungen von Tumorpatienten auf Antikörper, die spezifisch für das humane endogene Retrovirus HERV-K sind, verwendet (Denner, et al., 1995) und bei Untersuchungen von Xenotransplantationspatienten, Schlachtern und normalen Blutspendern auf PERVspezifische Antikörper (Tacke, et al., 2001). In dem hier verwendeten ELISA waren alle Seren bis auf drei negativ für beide Peptide (Abb. 20A und B), während die tierischen Kontrollseren, die durch Immunisierung mit den korrespondierenden Peptiden von PERVp15Env hergestellt wurden, positive Signale zeigten. Die leicht positiven Seren der Patienten 5, 6 und 7 (Abb. 20A und B) enthielten kreuzreagierende Antikörper, die auch in den Seren von normalen Blutspendern gefunden wurden (Tacke, et al., 2001). Zusammengefasst gaben diese Ergebnisse keinen Hinweis auf eine Infektion der Patienten mit PERV.

	Abbildung 20: ELISA zur Untersuchung von Patientenseren, die mit einem extrakorporealen Leberunterstützungssystem behandelt wurden. A) Verwendung eines diagnostischen Peptids (PERV-ido) als Antigen, das der immundominanten Domäne von PERV-p15Env entspricht. B) Verwendung eines Peptids (PERV-isu) als Antigen, das der immunsuppressiven Domäne von p15Env entspricht. Antiseren gegen beide Peptide wurden als Positivkontrollen verwendet, um die Qualität des ELISA zu evaluieren. Die horizontalen Linien verdeutlichen die Schwellenwerte (Durchschnitt plus dreimal Standardabweichung der Negativkontrollen).

Da in den Seren der Patienten, die ex vivo mit einem Leberunterstützungssystem behandelt wurden, keine PERV-spezifischen Antikörper detektiert werden konnten, wurden die Seren daraufhin untersucht, ob sie Antikörper gegen porzine Proteine entwickelt hatten. Dazu wurden die Seren in einem Western Blot, der Proteinlysate von porzinen Hepatozyten als Antigen verwendete, auf Antikörper gegen Schweine-spezifische Leberproteine getestet (Abb. 21). Patient 1 entwickelte Schweine-spezifische μ-Immunglobuline (Abb. 21A) und γImmunglobuline (Abb. 21B) ein Jahr nach der Behandlung. Fünf Jahre nach der Behandlung waren die Schweine-spezifischen μ-Immunglobuline immer noch nachweisbar, allerdings in geringerer Menge, während die γ-Immunglobuline im Vergleich zum ersten Jahr in gleicher Menge vorhanden waren. Patient 6 entwickelte keine Schweine-spezifischen μImmunglobuline über den gesamten Zeitraum der Behandlung, γ-Immunglobuline konnten allerdings ein halbes bis ein Jahr nach der Behandlung detektiert werden. Vier Jahre nach der Behandlung waren keine Schweine-spezifischen γ-Immunglobuline mehr nachweisbar. Bei den Patienten 7 und 8 konnten sowohl Schweine-spezifische μ-Immunglobuline als auch γImmunglobuline vor der Bioreaktorbehandlung und der Lebertransplantation detektiert werden, es waren jedoch nur sehr wenig γ-Immunglobuline nachweisbar. Ein halbes Jahr nach der Behandlung zeigte Patient 7 ein verändertes Bandenmuster der μ-Immunglobuline und eine starke γ-Immunglobulin-Antwort. Ein und drei Jahre nach der Behandlung konnten keine Schweine-spezifischen μ-Immunglobuline und γ-Immunglobuline mehr nachgewiesen werden. Bei Patient 8 nahm die Bildung von Schweine-spezifischen μ-Immunglobulinen und γ-Immunglobulinen von einem halben bis zu drei Jahren nach der Behandlung stetig zu. Bei den Patienten 3, 4 und 5 konnten nur wenig Schweine-spezifische μ-Immunglobuline und γImmunglobuline detektiert werden. In dieser retrospektiven Studie mit Seren von Patienten, die mit einem extrakorporealen Leberunterstützungssystem als Überbrückung für eine Lebertransplantation behandelt wurden, konnten keine PERV-spezifischen Antikörper detektiert werden, obwohl einige Patienten nach der Behandlung mit den auf porzinen Zellen basierenden Bioreaktoren Schweine-spezifische μ- und γ-Immunglobuline entwickelten.

	Abbildung 21:Western Blot unter Verwendung von Schweineleberproteinen als Antigen zur Untersuchung von Seren von Patienten, die mit einem extrakorporalen Leberunterstützungssystem behandelt wurden. A) Verwendung von Antiseren gegen humane µ-Ketten-spezifische Immunglobuline als Zweitantikörper. B) Verwendung von Antiseren gegen humane γ-Ketten-spezifische Immunglobuline als Zweitantikörper. LTx, Lebertransplantation.

Da porzine endogene Retroviren ein Risiko für den Menschen bei der Transplantation von porzinen Organen, Geweben und Zellen darstellen könnten, war es von besonderer Bedeutung, Patienten, die porzine Inselzelltransplantate erhalten hatten, für einen langen Zeitraum nach der Transplantation regelmäßig auf eine mögliche Übertragung von PERV zu untersuchen. Dafür wurden Seren von vierzehn der achtzehn behandelten Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach der Transplantation mit Hilfe von Western BlotAnalysen auf PERV-spezifische und porzine Antikörperantworten untersucht (Tab. 6). Die Seren von zwei Patienten (Patient 1 und 2) reagierten acht bzw. neun Jahre nach der Transplantation mit dem Oberflächenhüllprotein gp70 von PERV in einem Western Blot, der gereinigtes PERV-A/C als Antigen verwendete. Das Serum von Patient 4 reagierte bis zu drei Jahren nach der Transplantation schwach mit gp70. Nach acht Jahren waren keine Antikörper mehr gegen gp70 nachweisbar. Alle getesteten Seren zeigten keine Reaktion mit dem Capsidprotein p27Gag und dem transmembranen Hüllprotein p15Env im Western Blot mit PERV-A/C als Antigen. Da p15Env nur in geringen Mengen in PERV-A/C-Proteinlysaten vorhanden war, wurde zur Erhöhung der Sensitivtät ein modifizierter Western Blot basierend auf den rekombinanten Proteinen von p15Env und p27Gag als Antigene entwickelt. Alle Seren wurden unter Verwendung des neuen Tests nochmals untersucht und keines zeigte eine Reaktion mit dem rekombinanten p15Env (Tab. 6). Bei drei Patienten (Patient 5, 8 und 11) konnten Antikörper gegen rekombinantes p27Gag detektiert werden. Die Seren dieser Patienten enthielten allerdings schon vor der Transplantation Antikörper gegen p27Gag, jedoch verstärkten sich nach der Transplantation bei den Patienten 5 und 8 die Reaktionen gegen p27Gag. In allen anderen Seren konnten keine Antikörper gegen p27Gag nachgewiesen werden. Neun Seren (Patienten 1, 2, 5 bis 7, 9, 10, 13 und 14) enthielten Antikörper gegen porzine Inselzellproteine.

Zusammengefasst zeigten diese Ergebnisse keine Übertragung von PERV auf Patienten, die bis zu neun Jahre nach einer Transplantation von porzinen Inselzellen untersucht wurden.

Tabelle 6: Antikörper gegen PERV-Proteine und porzine Inselzellproteine in
Xenotransplantationspatienten

Tx, Transplantation. +, schwache Reaktion; ++, mittlere Reaktion; +++, starke Reaktion.