4. Diskussion

In den letzten Jahren wurden große Fortschritte bei der Verbesserung der Behandlungsbedingungen und Behandlungsstrategien von Patienten mit Diabetes mellitus gemacht. Zusätzlich zu verbesserten Therapien und neuen Insulinanaloga (Bolli, et al., 1999), konzentrierten sich viele Studien auf die Transplantation von Inselzellen (Berney, et al., 2001). Die Inselzelltransplantationen beinhalteten sowohl humane (Alejandro, et al., 1997,Meyer, et al., 1998,Oberholzer, et al., 2000,Shapiro, et al., 2000) als auch xenogene Inselzellen vom Schwein (Groth, et al., 1994,Groth, et al., 1998,Heneine, et al., 1998). Da die meisten erfolgreichen klinischen Inselzelltransplantationen durchschnittlich zwei bis vier humane Donororgane erfordern (Shapiro, et al., 2000), verhindert der zunehmende Mangel an humanen Donororganen die Behandlung von vielen Diabetes-Patienten. Im Gegensatz dazu könnten Inselzellen unbegrenzt verfügbar werden, wenn Strategien wie die Nutzung von xenogenen Inselzellen, technisch veränderten humanen Betazelllinien und in vitro oder in vivo Inselzellexpansionen klinisch anwendbar werden (Groth, et al., 1998,Newgard, et al., 1997,Ramiya, et al., 2000). Viele Fortschritte wurden bei der Anwendung von xenogenen Inselzellen gemacht. Obwohl nicht-humane Primaten dem Menschen genetisch sehr viel näher sind, sind Schweine aus mehreren Gründen als Quelle von Transplantaten geeigneter (Sachs, 1994). Schweine lassen sich schnell und in großer Anzahl züchten, ihre Haltung ist relativ günstig und einfach, und die Physiologie eines porzinen Organs ist der des humanen Organs ähnlich. Des Weiteren werden Schweine bereits genetisch modifiziert und kloniert, um die immunologische Abstossung zu verringern (Costa, et al., 2002,Ramsoondar, et al., 2003). Schließlich unterscheidet sich das porzine Insulin von humanem nur in einer Aminosäure und wurde lange Zeit zur Behandlung von Diabetes-Patienten verwendet. Allerdings wird die Xenotransplantation nur klinische Relevanz erreichen, wenn das Risiko einer Übertragung von pathogenen Mikroorganismen ausgeschlossen werden kann. Bisher konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, die meisten exogenen Mikroorganismen durch Haltung der Schweine unter qualifizierten oder spezifizierten pathogen-freien Bedingungen zu eliminieren (Tucker, et al., 2002). PERVs sind aber in das Genom der Schweine integriert und deshalb wird es schwierig werden, PERV-defiziente Schweine zu züchten oder zu klonieren.

Auf Grund der Tatsache, dass PERVs in der Lage sind, humane Zellen in vitro zu infizieren, in diesen Zellen zu replizieren und einen produktiven Infektionszyklus zu etablieren (Martin, et al., 1998,Patience, et al., 1997,Specke, et al., 2001,Wilson, et al., 1998), wurde intensiv nach Schweinestämmen gesucht, die wenig oder keine viralen Partikel freisetzen (Bosch, et al., 2000,Gorbovitskaia, et al., 2003,Herring, et al., 2001,Lee, et al., 2002,Tacke, et al., 2000). Im Gegensatz zu anderen Schweinestämmen (Clemenceau, et al., 2002) exprimieren Inselzellen der Deutschen Landrasse wenig bis keine PERV-mRNA sowie infektiöse Partikel (Siehe Abb. 10 und 11). Andere Gewebe der Deutschen Landrasse wie Endothelzellen der Aorta hingegen, sind durchaus in der Lage PERV-spezifische mRNA und Partikel zu exprimieren (Martin, et al., 1998). Diese Viren konnten humane Zellen in vitro infizieren, waren aber in vivo nicht übertragbar (Martin, et al., 1998). Andererseits setzen stimulierte PBMC der Deutschen Landrasse keine PERV-Virionen frei (Tacke, et al., 2000,Tacke, et al., 2003). Im Unterschied zu den Ergebnissen dieser Arbeit konnte in einer Studie die Infektion von humanen Neomycin-resistenten 293-Zellen mit PERV aus Inselzellen von LandrasseSchweinen gezeigt werden (van der Laan, et al., 2000). Ein Grund für diese unterschiedlichen Resultate könnte die Verwendung von Inselzellen eines anderen Landrasse-Schweinestamms, zum Beispiel der niederländischen Landrasse, sein. Oder das verwendete Landrasse-Schwein zeigte ein verändertes Expressionsmuster von PERV. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte bei Kokultivierungsexperimenten mit Inselzellen anderer Schweinestämme und humanen Zellen in vitro ebenfalls keine Infektion der humanen Zellen mit PERV nachgewiesen werden (Clemenceau, et al., 2001), obwohl die dort verwendeten Inselzellen PERV-spezifische mRNA exprimierten. Andererseits konnte keine PERVspezifische RT-Aktivität in diesen Inselzellen detektiert werden. Dies deutet darauf hin, dass in der Studie von Clemenceau et al. (2001) ebenfalls keine viralen Proteine synthetisiert und dadurch keine infektiösen Partikel freigesetzt wurden.

Im Unterschied zu den Resultaten dieser Arbeit wurde in einer anderen Studie die Übertragung von PERV aus porzinen Inselzellen auf Nacktmäuse unter Verwendung von Inselzellen von SPF-Schweinen der Large-White-Rasse, die PERV-mRNA exprimierten, beobachtet (Clemenceau, et al., 2002). Allerdings wurden dort unverkapselte Inselzellen transplantiert, so dass ein falsch-positives Ergebnis durch Mikrochimärismus nicht ausgeschlossen werden kann. Zusätzlich konnte zwar die DNA von gag in verschiedenen Mausorganen detektiert werden, aber mRNA von gag wurde in keinem der Organe exprimiert, was auf die Abwesenheit einer produktiven Infektion von PERV in den Nacktmäusen hindeutet. In einer weiteren Untersuchung wurden verkapselte Inselzellen verschiedener Schweinestämme in Nonobese-Diabete-Mäuse (NOD-Mäuse) und Nacktmäuse transplantiert und nach drei Monaten wurden verschiedene Mausorgane hinsichtlich einer Infektion mit PERV untersucht (Elliott, et al., 2000). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnten Elliott et al. keine PERV-spezifische DNA und mRNA in verschiedenen Mausorganen detektieren, obwohl die Alginat-verkapselten Inselzellen in der Lage waren, Insulin zu produzieren und frei zu setzen.

Auf Grund der berichteten Resultate ist es zwingend notwendig, einen intensiven ScreeningTest für Schweinestämme und Schweine innerhalb eines Stammes zur Selektion von nichtPERV-produzierenden Schweinen zu entwickeln. Diese Schweine sollten dann weiter gezüchtet werden. Beispielsweise wurden in einer Inzuchtherde von Miniaturschweinen Tiere gefunden, die keine Freisetzung von humantropen PERVs zeigten (Oldmixon, et al., 2002,Wood, et al., 2004). Obwohl verschiedene Strategien zur Prävention einer PERV-Infektion von humanen Zellen und Geweben, wie die siRNA-Technologie (Karlas, et al., 2004) oder neutralisierende Antikörper als Basis für einen Impfstoff (Fiebig, et al., 2003) entwickelt wurden, wären Knock-out-Schweine die beste Lösung. Andererseits dürfen die Risiken der Rekombination und der Komplementierung von defekten Proteinen durch das Vorhandensein der verschiedensten Gruppen retroviraler Genome im Schwein, nicht unbeachtet bleiben (Bosch, et al., 2000,Herring, et al., 2001,Klymiuk, et al., 2003,Patience, et al., 2001).

Zusammenfassend setzten die verwendeten Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse kein PERV frei und es kam nicht zu einer Infektion von suszeptiblen humanen Nierenzellen in vitro und von BALB/c-Mäusen in vivo. Des Weiteren exprimierten die Inselzellen keine PERV-spezifische mRNA oder Proteine. In Bezug auf diese Ergebnisse stellen Schweine der Deutschen Landrasse eine vielversprechende Quelle für die Zucht von sicheren Schweinen für die Xenotransplantation dar.

Die Tatsache, dass sich humane Zellen in vitro mit PERV infizieren lassen, führte zu einer intensiven Suche nach einem geeigneten Infektionsmodell, um die Pathogenität von PERV abschätzen zu können. Da nicht-humane Primaten und Menschenaffen dem Menschen phylogenetisch sehr änhlich sind, konzentrieren sich die meisten Infektionsstudien bei der Suche nach einem geeigneten Tiermodell zur Untersuchung einer PERV-Zoonose auf diese Spezies. In den bisherigen In vivo-Infektionsstudien kam es bei immunsupprimierten nichthumanen Primaten, denen porzine Zellen, Gewebe und Organe transplantiert wurden, nicht zu einer Infektion mit PERV (Loss, et al., 2001,Martin, et al., 1998,Martin, et al., 2002,Specke, et al., 2002,Switzer, et al., 2001). Da nach neueren Erkenntnissen die Adaptation von PERV an Zellen anderer Spezies eine wichtige Rolle für die Infektiösität spielt (Denner, et al., 2001,Denner, et al., 2003), wurde PERV auf Zellen von Rhesusaffen und Schimpansen passagiert, um für spätere Experimente ein an Affenzellen adaptiertes Virus zur Verfügung zu haben.

Die in dieser Arbeit gezeigte In vitro-Infektion von Rhesusaffen- und Schimpansenzelllinien mit PERV konnte schon in anderen Studien gezeigt werden, in denen primäre Zellen und Zelllinien von verschiedenen nicht-humanen Primaten verwendet wurden (Siehe Tab. 7). Im Unterschied zu diesen Studien, konnte hier jedoch zum ersten Mal die Infektion von lymphoiden Schimpansenzellen gezeigt werden. Diese Unterschiede könnten durch die Verwendung von zellfreiem, human-adaptiertem PERV-A/C und PERV-B zustande gekommen sein. In verschiedenen Studien konnte keine Infektion von RhesusaffenNierenzellen mit PERV beobachtet werden (Takeuchi, et al., 1998,Wilson, et al., 2000), obwohl bei Wilson et al. (2000) auch human-adaptiertes PERV für die Infektion von Rhesuszellen verwendet wurde. Möglicherweise war die verwendete Virusmenge von PERV zu gering, um eine Infektion in diesen Zellen zu etablieren. Für diese Hypothese sprechen die Ergebnisse einer späteren Studie, in der eine schwache Infektion der von Wilson et al. (2000) verwendeten Rhesus-Nierenzelllinie mit PERV beobachtet wurde (Ritzhaupt, et al., 2002). Es handelte sich bei dem in der Studie von Ritzhaupt et al. (2002) verwendeten PERV um die dritte Passage eines ursprünglich von Wilson et al. (1998) isoliertes rekombinantes PERV. Dieses PERV weist einen zehnfach höheren Titer auf als die zweite Passage des Virus (Ritzhaupt, et al., 2002). In dieser Arbeit wurde die fünfte Passage des von Wilson und Kollegen (1998) isolierten PERVs (PERV-A/C genannt) verwendet. Dieses PERV-A/C zeichnet sich durch genetische Veränderungen in der Primerbindungsstelle der LTR und einen dadurch bedingten höheren Titer aus (Denner, et al., 2001,Denner, et al., 2003). Andererseits könnte auch die Verwendung verschiedener Rhesusaffen- und Schimpansenzelllinien für die unterschiedlichen Resultate verantwortlich sein. Denn in einer Studie von Blusch et al. (2000) ließen sich primäre Fibroblasten von Schimpansen mit PERV-envA-Pseudotypen infizieren, während in anderen Studien keine Infektion mit PERV-envA-Pseudotypen in FibroblastenZelllinien von Schimpansen nachweisbar war (Takeuchi, et al., 1998).

Tabelle 7: In vitro-Infektion von nicht-humanen Primatenzellen mit PERV

„Positiv” bedeutet eine produktive Infektion.

Im Unterschied zu anderen Studien (Ritzhaupt, et al., 2002) konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal die Expression der Volllängen-mRNA und der gespleißten mRNA von PERV-A/C in infizierten Rhesusaffen-Nierenzellen und lymphoiden Schimpansenzellen nachgewiesen werden, während die Volllängen-mRNA von PERV-B nur begrenzte Zeit in diesen Zellen nachweisbar war. Die frühe Expression der gespleißten und ungespleißten mRNA von PERVA/C lässt sich nur mit der Verwendung des hochtitrigen PERV-A/C erklären. Die vorübergehende Expression von ungespleißter PERV-B-mRNA stimmt mit anderen Studien nicht überein, die in Rhesus- und Schimpansenzellen keine Infektion mit Pseudotypen detektieren (Blusch, et al., 2000,Takeuchi, et al., 1998). Möglicherweise ist die in diesen Studien verwendete Methode der lacZ-Pseudotypisierung nicht sensitiv genug, da gezeigt werden konnte, dass die Detektion von PERV-spezifischen Antikörpern mittels Western Blot sehr viel sensitiver ist als die lacZ-Pseudotypisierung (Bartosch, et al., 2002). Die Ergebnisse einer Studie, in der primäre Zellen nicht-humaner Primaten laut Pseudotypisierung nur den Rezeptor für PERV-A tragen, sich aber dennoch mit PERV-B und PERV-C infizieren lassen unterstützen diese Hypothese zusätzlich (Blusch, et al., 2000). Allerdings wurde die Pseudotypisierung mit zellfreien Partikeln durchgeführt, während die Infektion durch Kokultivierung getestet wurde. Die zeitlich begrenzte Expression der Volllängen-mRNA von PERV-B korreliert mit der begrenzten Expression proviraler PERV-B Sequenzen. Dies deutet auf einen bisher unbekannten Mechanismus hin, der das Eindringen in die Zielzelle und die Integration des Provirus noch zulässt, aber die Expression gespleißter viraler mRNA unterbindet. Im Gegensatz dazu ist die Blockierung des retroviralen Replikationzyklus zwischen dem noch möglichen Eindringen in die Zielzelle und der nicht mehr möglichen Integration des Provirus als Ursache für den limitierten Tropismus des murinen Leukämievirus (MuLV) schon lange bekannt (Goff, 1996,Lilly, 1970,Pincus, et al., 1971,Pryciak and Varmus, 1992). Die Inhibierung der MuLV-Infektion wird durch das murine Genprodukt Fv1 verursacht. Zusätzlich sind in humanen und nicht-humanen Zellen Fv1-ähnliche Restriktionsfaktoren identifiziert worden (Hofmann, et al., 1999,Towers, et al., 2000). Im Menschen wird dieser Faktor Ref1 (resistance factor 1) und in nicht-humanen Primaten Lv1 (lentivirus susceptibility factor 1 (Cowan, et al., 2002)) genannt. Kürzlich wurde ein zelluläres Protein (TRIM5α) als ein Bestandteil von Lv1 identifiziert, dass in humanen und nichthumanen Primaten exprimiert wird (Stremlau, et al., 2004). In humanen und nicht-humanen Primaten sind diese Faktoren ebenfalls in der Lage, bestimmte Stämme von MuLV zu blockieren (Towers, et al., 2000). Des Weiteren können einige nicht-humane Primaten eine Infektion mit HIV oder SIV blockieren (Hofmann, et al., 1999). Diese Blockade ist aber nicht irreversibel, da sie sich durch die Erhöhung des viralen Titers oder durch Vorinkubation mit dem restringierten Virus überwinden lässt (Besnier, et al., 2002). Die Resultate dieser Studien deuten darauf hin, dass es in den Rhesus- und Schimpansenzellen möglicherweise weitere Faktoren gibt, die nach der Integration des Provirus, also auf der Ebene der Expression viraler mRNA wirksam werden. Allerdings wird in den Studien zur Blockierung von Retroviren die Menge an unintegrierter proviraler DNA gemessen und nicht die Anwesenheit viraler mRNA (Besnier, et al., 2002,Cowan, et al., 2002,Towers, et al., 2000). Es kann also nicht ausgeschlossen werden, dass einige wenige Proviren ins Wirtsgenom integrieren und geringe Mengen an viraler mRNA exprimiert werden. Diese Annahme wird durch eine Studie unterstützt, in der geringe Mengen proviraler Sequenzen in infizierten Zellen nicht-humaner Primaten mittels PCR amplifiziert wurden (Munk, et al., 2002). Möglicherweise spielen noch andere Faktoren, die eine Infektion mit PERV-B verhindern, eine Rolle. Eine fehlerhafte reverse Transkription könnte die SD- und/oder die SA-Stellen verändert haben, so dass die virale mRNA nicht mehr gespleißt werden kann. Die reverse Transkriptase besitzt keine „Proofreading“-Aktivität und die Möglichkeit einer Mutation ist dadurch deutlich erhöht (Burns and Temin, 1994,Dougherty and Temin, 1988). Andererseits konnte trotz wiederholter Zugabe von zellfreiem PERV-B über einen längeren Zeitraum keine produktive Infektion der Rhesusaffen-Nierenzellen oder der lymphoiden Schimpansenzellen erreicht werden. Dies würde also bedeuten, dass die Mutation immer an der gleichen Stelle auftritt, was höchst unwahrscheinlich ist.

Ein weiterer wichtiger Schritt hin zu einem PERV-Infektionsmodell in nicht-humanen Primaten in vivo ist die Untersuchung der Freisetzung von infektiösen Partikeln von infizierten Rhesus- und Schimpansenzellen und die Adaptation dieser PERV-Partikel an Zellen nicht-humaner Primaten. Die Expression der Volllängen-mRNA und der gespleißten mRNA von PERV-A/C in den beiden Zelllinien nicht-humaner Primaten deutet darauf hin, dass infektiöse Partikel aus diesen Zellen freigesetzt werden. Allerdings konnten weder im Western Blot noch in der Durchflusszytometrie PERV-spezifische Proteine nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Diese widersprüchlichen Ergebnisse wurden auch schon in anderern Zelllinien beobachtet (Wilson, et al., 2000). Möglicherweise ist auch die Menge an freigesetzten Viruspartikeln zu gering, um mit den verwendeten Methoden detektiert zu werden. Aus diesem Grund wurden die Zellkulturüberstände der PERV-A/C-infizierten Rhesus- und Schimpansenzellen über einen Zeitraum von zehn Wochen auf die jeweils uninfizierten Primatenzellen sowie auf PERV-suszeptible 293-Zellen gegeben. Im Unterschied zu anderen Studien (Ritzhaupt, et al., 2002), ließen sich in dieser Arbeit Rhesusaffen-Nierenzellen und 293-Zellen mit PERV von Rhesusaffenzellen (LLCMK2/PERV-A/C) infizieren. Des Weiteren konnten lymphoide Schimpansenzellen und 293-Zellen mit PERV von Schimpansenzellen (EB176/PERV-A/C) infiziert werden. Allerdings deutet die geringe Amplifikation von proviraler pol- und envA-DNA auf eine schwache Infektion der Rhesusaffen- und Schimpansenzellen mit dem jeweils adaptierten PERV-A/C hin. Nicht-humane Primaten haben möglicherweise Mechanismen entwickelt, die zwar eine Primärinfektion zulassen, aber die Ausbreitung der Infektion verhindern. So zeigte die Studie von Ritzhaupt et al. (2002) ebenfalls die Expression von viraler DNA und mRNA in neuinfizierten Nieren-, Lungen- und retinalen Endothelzellen von Rhesusaffen, doch eine Passagierung viraler Partikel war nicht möglich. Andererseits waren die Lungen- und retinalen Endothelzellen durchaus in der Lage, humane 293-Nierenzellen zu infizieren (Ritzhaupt, et al., 2002). Dies deutet allerdings eher darauf hin, dass die verwendeten Rhesuszelllinien zu wenig Viruspartikel freisetzen, um eine Infektion zu etablieren. Die Pseudotypisierung mit einem Plasmid bestehend aus VSV-G Sequenzen (Vesikular stromatitis Virus G) und PERV-env führte zwar zu einer Erhöhung des viralen PERV-Titers in den retinalen Endothelzellen, aber dieser reichte nicht aus, um uninfizierte Zellen nichthumaner Primaten zu infizieren (Ritzhaupt, et al., 2002). Die Möglichkeit der Infektion von Rhesusaffenzellen scheint stark vom verwendeten Retrovirus abzuhängen. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass sich Rhesusaffenzellen zwar mit SIV oder MuLV infizieren lassen, aber kaum mit HIV (Hofmann, et al., 1999). Zusätzlich bestehen hinsichtlich der Freisetzung viraler Partikel aus verschiedenen Geweben der Rhesusaffen beträchtliche Unterschiede.

Die schwache Infektion von lymphoiden Schimpansenzellen mit EB176/PERV-A/C zeigt, dass infektiöse Partikel aus den 293/PERV-A/C-infizierten Schimpansenzellen freigesetzt werden. Allerdings deutet die langwierige Infektionsphase von bis zu zehn Wochen darauf hin, dass Schimpansenzellen nur eine geringe Menge an Viruspartikeln freisetzen. Dies liegt möglicherweise daran, dass die EB176-Zellen eine geringere Proliferationsrate haben als 293Zellen. Da PERV zu den einfachen γ-Retroviren gehört, benötigt es zur Vollendung seines Replikationszyklus proliferierende Zellen. Ein weiterer Grund für die geringe Menge freigesetzter EB176/PERV-A/C-Partikel könnte die Methylierung der proviralen DNA darstellen. In Wirbeltieren sind 60 bis 90% der Cytidinreste in allen Cytidin/GuanosinDinukleotiden (CpG) methyliert. Die CpG-Methylierung ist mit einer Unterdrückung der Genexpression verbunden, deren Mechanismen noch nicht völlig aufgeklärt sind (Jones and Takai, 2001). Die Methylierung konzentriert sich hauptsächlich auf die im Genom des Menschen vorkommenden Transposons und Retrotransposons (Yoder, et al., 1997). Transposons und Retrotransposons sind DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, das Genom zu verlassen und an anderer Stelle wieder in das Genom zu integrieren (Smit, 1999). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die provirale DNA in PBMC von Rindern, die mit dem bovinen Leukämievirus (BLV) infiziert sind, und von HTLV-1-infizierten Patienten methyliert wird (Clarke, et al., 1984,Kashmiri, et al., 1985,Kitamura, et al., 1985,Ogawa, et al., 1985). Die Methylierung des Provirus ist auf die Enhancer- und Promotorregionen der LTR konzentiert (Koiwa, et al., 2002). Allerdings konnte für BLV in vivo (Tajima, et al., 2003) und für HIV-1 in vitro (Pion, et al., 2003) keine Korrelation zwischen der Methylierung der LTR und der Unterdrückung der Expression viraler RNA oder viraler Partikel festgestellt werden.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit die In vitro-Infektion von RhesusaffenNierenzellen und lymphoiden Schimpansenzellen mit PERV-A/C und PERV-B gezeigt werden. Die Expression der Volllängen-mRNA der beiden PERV Subtypen war ebenfalls in den beiden infizierten Zelllinien detektierbar. Die Expression gespleißter PERV-mRNA ließ sich dagegen nur in den PERV-A/C-infizierten Zellen beobachten. Die Replikation von PERV-A/C war in den beiden nicht-humanen Zelllinien allerdings nur gering. Auf Grund dieser Ergebnisse stellt die Verwendung eines hochtitrigen und adaptierten PERVs eine vielversprechende Möglichkeit dar, ein In vivo-Infektionsmodell in nicht-humanen Primaten zu etablieren.

Die Verwendung bzw. Etablierung eines Kleintiermodells zur Simulation der Xenotransplantation und zur Untersuchung der Pathogenität von PERV bietet gegenüber nicht-humanen Primaten einige Vorteile: 1. Die für Experimente benötigte Anzahl an Versuchtieren lässt sich beliebig variieren, 2. Die Haltung der Tiere ist relativ kostengünstig und die Umweltbedingungen lassen sich konstant halten und 3. Die Manipulation der Tiere, wie zum Beispiel die Applikation von Immunsuppressiva, ist bei Kleintieren wesentlich einfacher als bei nicht-humanen Primaten. Aus diesen Gründen wurden diverse Versuche unternommen, Kleintiere mit PERV in vivo zu infizieren (Specke, et al., 2002,Specke, et al., 2001). Jedoch schlugen diese Versuche bisher fehl, trotz Immunsuppression und erfolgreicher Infektion von Zellen dieser Spezies in vitro und obwohl die Untersuchung verschiedener Kleintierzelllinien ergab, dass einige davon Rezeptoren für PERV-A, für PERV-B oder für beide Subtypen tragen (Takeuchi, et al., 1998). Allerdings zeigt die Studie von Takeuchi et al. (1998) auch, dass die Suszeptibilität für PERV zwischen verschiedenen Zelllinien derselben Spezies unterschiedlich sein kann. Die Rezeptoren werden also möglicherweise nicht ubiquitär exprimiert und/oder sind polymorph in der Erkennung der Hüllproteine von PERV. Das bedeutet, dass es in einem Organismus Zellen und Gewebe geben könnte, die suszeptibel für eine PERV-Infektion sind. Aus diesem Grund wurden hier zunächst verschiedene murine Zelllinien und primäre Zellen mit einer Mischung aus PERV-A und PERV-B oder mit kloniertem PERV-B inkubiert. In Übereinstimmung mit anderen Studien (Denner, et al., 2001,Takeuchi, et al., 1998) konnte in dieser Arbeit keine Infektion muriner Zellen mit PERV-A beobachtet werden. Selbst dann nicht, wenn hochtitriges PERVA/C für die Inkubation verwendet wurde. Für PERV-B dagegen bleibt die Situation weiterhin unklar, denn in Pseudotypisierungsexperimenten wurden für dieses Virus suszeptible murine Zellen gefunden (Takeuchi, et al., 1998), aber in unseren Experimenten war keine Infektion nach Inkubation mit einem Gemisch aus PERV-A und PERV-B oder kloniertem PERV-B detektierbar. Selbst nach Langzeit-Kokultivierung oder direktem Zellkontakt zur Verbesserung der Infektivität, konnte keine Infektion der murinen Zellen mit PERV-B beobachtet werden. Dieser Unterschied zwischen dem Vorhandensein eines PERV-B Rezeptors und der Abwesenheit einer Infektion in vitro und in vivo wurde auch schon in Infektionsstudien, die an Ratten durchgeführt wurden, beobachtet (Specke, et al., 2001).

Eine Übertragung von PERV in vivo wurde für SCID- und Nacktmäuse beschrieben (Clemenceau, et al., 2002,Deng, et al., 2000,van der Laan, et al., 2000). Bei der Interpretation dieser Ergebnisse ergeben sich jedoch einige Schwierigkeiten, da für die Transplantation PERVproduzierende porzine Inselzellen verwendet wurden und Mikrochimärismus auftrat. In der Studie von van der Laan et al. (2000) wurde zwar die Expression viraler mRNA und Proteine in den Inselzellen nach der Transplantation gezeigt, doch die Anzahl der Kopien porziner DNA war in allen transplantierten SCID-Mäusen wesentlich höher als die PERV-spezifischer DNA. Zusätzlich ließ sich in rund einem Drittel der untersuchten SCID-Mausorgane Mikrochimärismus nachweisen. Des Weiteren waren in der Studie von Clemenceau et al. (2002) in den Mausorganen, die PERV-spezifische Sequenzen enthielten, auch porzine Sequenzen nachweisbar und in keinem der untersuchten Organe konnte PERV-spezifische RNA detektiert werden. Aus den oben genannten Gründen, den hier präsentierten Daten und der Tatsache, dass Mauszellen ein funktionaler Rezeptor für PERV-A fehlt (Ericsson, et al., 2003), deuten die berichteten Infektionen von SCID- und Nacktmäusen darauf hin, dass diese auf Grund von zellulärem Mikrochimärismus nach Applikation von porzinen Inselzellen oder durch Pseudotypisierung mit murinen endogenen Retroviren zustande gekommen sind.

Ein Tiermodell ist nicht nur für die Untersuchung der Infektivität und Pathogenität eines Virus nützlich, sondern auch für die Suche nach antiviral wirkenden Medikamenten und Impfstoffen. Zum Beispiel können Reverse Transkriptase-Inhibitoren wie AZT die Replikation von PERV in vitro hemmen (Powell, et al., 2000,Qari, et al., 2001,Stephan, et al., 2001) und neutralisierende Antikörper, die durch Immunisierung mit dem transmembranen Hüllprotein induziert wurden, könnten als Basis für einen antiviralen Impfstoff dienen (Fiebig, et al., 2003). Um zu bestimmen, ob solch ein Impfstoff in der Lage ist, eine Infektion in vivo zu verhindern, wird ein Tiermodell dringend benötigt. Bisher sind nur Meerschweinchen für solche Experimente geeignet, doch selbst in diesem Modell konnte nur eine transiente Replikation von PERV beobachtet werden, die nach 12 Wochen nicht mehr nachweisbar war (Argaw, et al., 2004). Diese Resultate bestätigen vorangegangene Studien von Onion et al. (2000), die eine begrenzte Infektion kurz nach der Inokulation zeigen (Onion and et al, 2000) und von Specke et al. (2002a), die keine Hinweise auf eine Infektion nach 12 Wochen zeigen (Specke, et al., 2002). Ein anderer Ansatz, ein Tiermodell zu etablieren, könnte die Entwicklung transgener Mäuse sein, die einen normaler Weise auf Mauszellen nicht vorhandenen PERV-spezifischen Rezeptor exprimieren (Ericsson, et al., 2003).

Weltweit wurden bisher etwa 200 Patienten mit Zellen und Geweben vom Schwein oder mit einer Ex vivo-Perfusion unter Zuhilfenahme von porzinen Zellen behandelt (Dinsmore, et al., 2000,Elliott, et al., 2000,Heneine, et al., 1998,Moza, et al., 2001,Paradis, et al., 1999,Patience, et al., 1998,Tacke, et al., 2001,Valdes, 2002). Bei keinem der behandelten Patienten konnte eine Übertragung von PERV festgestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neue Studien analysiert. In der einen wurden Patienten mit akutem Leberversagen ex vivo mit einem Bioreaktor, der porzine Hepatozyten enthielt, behandelt. In der anderen wurden Diabetes-Kranke mit Inselzellen vom Schwein behandelt.

Zu den Hauptursachen eines akuten Leberversagens gehören: Eine akute virale Hepatitis A und B, die Überdosierung einer Medikamentation (z.B Acetaminophen), die Einnahme anderer Toxine (z.B. das Gift des Knollenblätterpilzes) und Stoffwechselerkrankungen (z.B. das Reye-Syndrom). Trotz der Fortschritte in der Intensivmedizin, bleibt die Mortalitätsrate relativ hoch (40-80 %) und hängt zum Teil mit den Begleiterscheinungen des akuten Leberversagens zusammen, die von der Bildung eines Ödems im Gehirn über Sepsis, Hyperglykämie, gastrointenstinale Blutungen bis zu akutem Nierenversagen reichen (Gill and Sterling, 2001). Der Mangel an Spenderorganen und die fehlende sofortige Verfügbarkeit dieser Organe bedeutet, dass viele Patienten sterben, bevor eine orthotrope Lebertransplantation durchgeführt werden kann. Ein effektives, temporäres extrakorporeales Leberunterstützungssystem kann die Überlebenschancen verbessern, unabhängig davon, ob ein Transplantat zur Verfügung steht oder nicht. Der momentane Mangel an humanen Spenderorganen führte zu einer Suche nach alternativen Quellen von Hepatozyten (Riordan and Williams, 1999). Porzine Organe und Gewebe scheinen die vielversprechendste Wahl unter den xenogenen Materialien zu sein. Sie sind fast unbegrenzt verfügbar, die Größenverhältnisse der porzinen Organe zum Menschen sind ideal und die Kenntnis der Pathoimmunologie, der Physiologie und übertragbarer Pathogene ist sehr weit fortgeschritten, da Schweine als mögliche Organspender im letzten Jahrzehnt intensiv untersucht wurden. Die ersten klinischen Studien zur Behandlung des akuten Leberversagens mit extrakorporealen bioartifiziellen Leberunterstützungssystemen zeigten eine erfolgreiche Überbrückung bis zur Lebertransplantation, aber keine Übertragung von PERV (Kuddus, et al., 2002,Levy, et al., 2000,Mazariegos, et al., 2001,Morsiani, et al., 2002,Pitkin and Mullon, 1999). In dieser Arbeit führte die Behandlung von acht Patienten mit einem Bioreaktor basierend auf porzinen Hepatozyten zu einer klinischen Stabilisierung und schließlich zu einer erfolgreichen Lebertransplantation mit einer Überlebensrate von 100% aller acht Patienten. Unsere Ergebnisse stimmen mit anderen Studien überein, in denen keine Übertragung von PERV gezeigt werden konnte, selbst bei Patienten, die bis zu fünf Jahre lang unter immunsuppressiver Therapie standen (Kuddus, et al., 2002,Pitkin and Mullon, 1999). Die Abwesenheit von PERV-Partikeln und -Proteinen könnte eine Konsequenz aus der Verwendung mikroporöser Polyethersulfon-Membranen sein, da gezeigt werden konnte, dass diese Membranen die Freisetzung von PERV-Partikeln verhindern können, wenn sie für Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 400 000 kDa durchlässig sind (Nyberg, et al., 1999). Die in diesen Studien verwendeten Methoden basieren jedoch alle auf der Detektion proviraler DNA oder viraler RNA mittels RT-PCR, PCR und Southern Blot. Um eine Infektion durch diese Methoden bestätigen zu können, muss das infizierte Gewebe oder Organ, aus dem dann DNA isoliert wird, vorher bekannt sein. Wenn zum Beispiel das Virus sich in einem anderen Gewebe außer Blutzellen befindet, muss das relevante Biopsiematerial vom Patienten erhalten werden. Indirekte Analysen basierend auf der Detektion immunologischer Reaktionen gegen PERV im infizierten Individuum sind deshalb wesentlich besser geeignet, um eine Infektion schnell zu detektieren. In dieser Arbeit wurden verbesserte Western Blot-Analysen in Ergänzung zu etablierten Methoden (Tacke, et al., 2001) verwendet. Durch die Verwendung der rekombinanten Proteine p27Gag und p15Env konnten größere Mengen dieser Antigene auf der Blotmembran präsentiert werden, wodurch die Sensitivtät der Western Blot-Analysen erhöht wurde. Trotz dieser Vorteile konnten keine PERV-spezifischen Antikörper in den Seren der Patienten detektiert werden. In den ersten Studien zur Detektion einer PERV-Übertragung auf humane Xenotransplantatempfänger wurde nur ein rekombinantes Protein (p27Gag) oder Lysate von Virus-produzierenden Zellen verwendet (Galbraith, et al., 2000,Paradis, et al., 1999). Aus den erhaltenen Ergebnissen, darunter positive Reaktionen gegen Gag, war es nicht möglich auf die Abwesenheit einer Infektion zu schließen, da die Anwesenheit der Env-Proteine auf dem verwendeten Blot nicht demonstriert wurde bzw. Env-Proteine nicht aufgetragen wurden. Die Verwendung von gereinigten Viruspräparationen und Kontrollseren, die gegen alle viralen Proteine entwickelt wurden, um die Qualität des Western Blots zu evaluieren, sind zwingend notwendig, um eine Unterscheidung zwischen positiven und negativen Ergebnissen zu ermöglichen. Die hier angewandte Kombination aus gereinigtem Virus und rekombinanten Proteinen stellt ein sensitives und wertvolles System dar, das klar gezeigt hat, dass keine Übertragung von PERV stattgefunden hat und dass es eine Verbesserung zu bereits vorhandenen Methoden ist.

Das Fehlen einer PERV-Übertragung bei den sieben untersuchten Patienten könnte an der Inaktivierung des Virus durch natürliche Antikörper gegen Galactosyl-α-1-3-galactose (Galα1-3-Gal) liegen, die im menschlichen Körper zirkulieren. Die effektive Inaktivierung von PERV, das aus porzinen Zellen freigesetzt wurde, durch diese Antikörper konnte in einigen Studien gezeigt werden (Rother, et al., 1995,Takeuchi, et al., 1996). Die Entwicklung von Schweinen, die für den humanen Decay accelerating factor (hDAF) transgen sind, und von Galα1-3-Gal Knock-out-Schweinen könnte das Risiko einer Übertragung von PERV erhöhen, wodurch die Entwicklung sensitiver Nachweismethoden für PERV um so wichtiger wird. Wie auch schon in anderen Studien beobachtet (Baquerizo, et al., 1999,Takahashi, et al., 1993), ist die Zunahme von Anti-Schweine-spezifischen µ- und γ-Immunglobulinen in fünf Patienten, möglicherweise auf die erhöhte Menge an porzinem Albumin und anderen porzinen Antigenen im Plasma der Patienten zurück zu führen. Obwohl bisher noch nicht bekannt ist, ob überhaupt Antikörper gegen das Galα1-3-Gal-Epitop vorhanden waren, so sind doch 1% aller humanen B-Zellen fähig, Antikörper gegen das Blutgruppen-ähnliche Galα1-3-GalEpitop zu generieren (Galili, et al., 1993). Der Nachweis Schweine-spezifischer µ- und γImmunglobuline bis zu vier Jahre nach der Behandlung stimmt mit den Beobachtungen anderer Studien überein (Lindeborg, et al., 2001), in denen Patienten xenoimmune Antikörper zwischen sechs und acht Jahre nach der Transplantation fötaler porziner Inselzell-ähnlicher Zellverbände produzierten. Dabei ist es höchst interessant, dass die Patienten 7 und 8 bereits vor der Therapie µ-Immunglobulin-Reaktionen gegen Schweine-Antigene zeigten und dass bei Patient 8 eine Zunahme der Antikörperreaktion zu beobachten war.

Fasst man die Ergebnisse unter Betrachtung der ersten klinischen Xenotransplantationen im Menschen (Paradis, et al., 1999,Tacke, et al., 2001) und der intensiven Analyse von Seren, die von Schlachtern stammten, die engen Kontakt zu Schweineblut haben, zusammen, dann ist es offensichtlich, dass PERV in vivo nicht einfach auf andere Spezies einschließlich dem Menschen übertragen werden kann. Diese Diskrepanz zwischen den Ergebnissen in vitro und denen in vivo mag infolge der effektiven angeborenen und adaptiven Immunität der untersuchten Spezies zustande kommen.

Auf Grund der immensen Fortschritte, die in Bezug auf die Isolierung porziner Inselzellen, auf die Abschirmung der Inselzellen vor dem Immunsystem des Empfängers und auf die Entwicklung neuer Immunsuppressiva gemacht wurden (O'Connell, 2002), ist die Xenotransplantation porziner Inselzellen in den letzten zehn Jahren schon vielfach durchgeführt worden. Durch die aufgekommenen Bedenken bezüglich einer Übertragung von PERV auf den Menschen, wurden retrospektive Studien hinsichtlich einer PERV-Übertragung durchgeführt. Bisher konnten keine Hinweise auf eine Infektion gefunden werden (Elliott, et al., 2000,Heneine, et al., 1998,Paradis, et al., 1999). In einer neuen Studie, durchgeführt mit Diatranz Ltd., wurden achtzehn Typ I Diabetes-Kranke, die porzine Inselzelltransplantate auf drei verschiedene Arten erhalten hatten, mit einem intensiven virologischen Screening bis zu neun Jahre lang überwacht (Garkavenko, et al., 2004). Die Seren von vierzehn der achtzehn Patienten wurden auf PERV-spezifische Antikörper untersucht. Die Vorteile einer Messung der Antikörperreaktionen sind, erstens der leichte Zugang zu den Seren, zweitens die relativ geringen Kosten dieser Analyse und am wichtigsten drittens die Tatsache, dass positive serologische Analysen die Infektion eines Individuums klar demonstrieren, während direkte Methoden von infiziertem Gewebe abhängig sind. Antikörper-Analysen werden erfolgreich zum Nachweis einer Infektion mit anderen humanen und tierischen Retroviren einschließlich HIV-1 eingesetzt.

In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Antikörper gegen das Hüllprotein gp70 in Xenotransplantationspatienten (Patient 1,2 und 4) nachgewiesen. In den Seren der Patienten 1 und 2 waren diese Antikörper acht bis neun Jahre nach der Xenotransplantation nachweisbar. Zusätzlich konnten nach diesem Zeitraum auch Antikörper gegen porzine Inselzellproteine detektiert werden. Im Serum von Patient 4 waren Antikörper gegen gp70 zwei Jahre nach der Transplantation detektierbar. Da keines der drei Seren mit einem weiteren viralen Protein (p27Gag oder p15Env) reagierte, kann man davon ausgehen, dass diese Patienten nicht mit PERV infiziert sind. Im Allgemeinen sind Reaktionen gegen mindestens zwei verschiedene Proteine (Gag oder Pol und eines der Hüllproteine) notwendig, um eine Infektion mit HIV mittels Western Blot-Analyse zu bestätigen. Zusätzlich kann nicht völlig ausgeschlossen werden, dass die vorhandenen Antikörper gegen gp70 aufgrund von porzinen Inselzellen, die im Organismus der Patienten 1 und 2 zikulierten (Mikrochimärismus), gebildet wurden, da auch Antikörper gegen andere Inselzellproteine nachweisbar waren. PERVs sind im Genom aller Schweine integriert und exprimierte virale Proteine werden auch auf der Zelloberfläche porziner Zellen präsentiert. Andererseits waren die Reaktionen gegen gp70 stärker als die gegen porzine Inselzellproteine. Es bleibt unklar, ob die Reaktionen gegen gp70 auf eine Kreuzreaktion von Antikörpern zurück zu führen ist, die gegen Autoantigene, gegen Antigene anderer Parasiten oder gegen einen verwandten Retrovirus gerichtet sind. Zusätzlich ist bekannt, dass normale humane Seren gegen die glykosylierten Teile viraler Proteine reagieren können und dadurch ein falsch-positives Ergebnis erzeugen (Kurth, et al., 1977). Schließlich zeigten die Patienten 1, 2, 3 und 4, die unverkapselte Inselzellen erhielten, keine provirale DNA und RNA von PERV in PBMC acht bis neun Jahre nach der Behandlung.

Die Seren von drei Patienten (Patient 5, 8 und 11) zeigten Reaktionen gegen p27Gag von PERV. Reaktionen gegen das p27Gag-Protein wurden auch schon in anderen Studien beobachtet (Paradis, et al., 1999,Tacke, et al., 2001). Es ist auffällig, dass alle drei Seren schon vor der Xenotranplantation Antikörper gegen p27Gag enthielten, wobei in einem (Patient 5) zusätzlich Antikörper gegen porzine Inselzellproteine vorhanden waren. Die bereits vorhandenen Antikörper gegen das p27Gag-Protein sind von besonderem wissenschaftlichen Interesse. So zeigten einige Seren (5%) von gesunden Blutspendern auch Reaktionen mit dem Haupt-Capsidprotein p27Gag in Western Blot-Analysen basierend auf viralen Proteinen (Tacke, et al., 2001). Weiterhin reagierten 11% der Seren von Schlachtern in deutschen Schlachthäusern mit p27Gag, was ebenfalls nicht als ein Hinweis auf eine Infektion bewertet werden kann. Immunantworten gegen einzelne virale Proteine, darunter p24Gag von HIV-1, in Abwesenheit einer Infektion wurden schon früher beschrieben (Biggar, et al., 1985,Sayre, et al., 1996). Schließlich konnte in Patient 5, der verkapselte porzine Inselzellxenotransplantate erhielt, keine provirale DNA und RNA von PERV in PBMC bis zu sechs Jahren nach der Transplantation gefunden werden und in den Patienten 8 und 11, die Aggregate aus Sertoli und Inselzellen injiziert in vaskularisierte Kollagenreservoire erhielten, konnten ebenfalls keine Hinweise auf eine PERV-Übertragung über einen Überwachungszeitraum von zwei Jahren gefunden werden. Die Antikörper-Reaktionen gegen porzine Inselzellproteine zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Xenotransplantation konnte auch schon in anderen Studien beobachtet werden (Irgang, et al., 2003,Sauer, et al., 2003). Zusätzlich wurde in einer Studie Schweine-spezifische mitochondriale DNA bis zu einem Jahr nach der Transplantation porziner Inselzellen in den Seren der Empfänger detektiert (Heneine, et al., 1998).

Diese hier erhobenen Daten bestätigen Studien, die untersucht haben, ob eine Übertragung von PERV in Rezipienten von Xenotransplantaten stattfindet (Herring, et al., 2001). Zum Beispiel wurden in zehn Diabetes-Patienten, die einer großen Menge unverkapselter porziner Inselzellen über einen langen Zeitraum ausgesetzt waren (Heneine, et al., 1998), keine Hinweise auf eine PERV-Infektion gefunden. Ebenso in einer Studie von 160 Patienten, die mit verschiedenen porzinen Geweben einen Tag oder bis zu zwölf Jahre lang behandelt wurden, bevor sie analysiert wurden (Paradis, et al., 1999,Tacke, et al., 2001). Auch in einer Studie von 88 Bluterkranken, die den porzinen Gerinnungsfaktor VIII (Hyate C) erhielten, konnte keine Übertragung von PERV beobachtet werden, obwohl in allen Konzentraten des Gerinnungsfaktors PERV-spezifische RNA detektiert werden konnte (Heneine, et al., 2001). In weiteren Studien, in denen Patienten mit fötalen porzinen neuronalen Zellen (Dinsmore, et al., 2000) oder mit porzinen Herzklappen (Moza, et al., 2001) behandelt wurden, konnten wiederum keine Hinweise auf eine Übertragung von PERV gefunden werden.

Das Fehlen von Hinweisen auf eine Infektion zu diesem Zeitpunkt, schließt die Möglichkeit einer Infektion in zukünftigen klinischen Studien nicht aus. Um dies zu verhindern, sollten gut charakterisierte Schweine, die nicht mit bekannten humantropen Viren infiziert sind, verwendet werden (Clark, et al., 2003,Fishman, 1994,Matthews, 2001,Michaels, 2001,O'Rourke, 2000,Tucker, et al., 2003). In Bezug auf PERV, das in allen Schweinestämmen präsent ist, sollten spezifische Strategien einschließlich der Verwendung von Tieren, die kein PERV freisetzten (Oldmixon, et al., 2002,Scobie, et al., 2004) oder der Entwicklung eines Impfstoffes (Fiebig, et al., 2003), entwickelt werden, die eine PERV-Übertragung verhindern.