Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek

• 1. Einleitung

  • 1.1  Xenotransplantation

  • 1.2  Tiere als Organquelle für die Xenotransplantation

  • 1.3  Retroviren

    • 1.3.1 Aufbau retroviraler Viruspartikel

    • 1.3.2 Genomaufbau der Retroviren

    • 1.3.3 Retrovirale Proteine

  • 1.4  Porzine endogene Retroviren

  • 1.5  Zielsetzung

• 2. Material und Methoden

  • 2.1 Zellbiologische Methoden

    • 2.1.1 Primäre Zellen und Zelllinien

  • 2.2  Molekularbiologische Methoden

    • 2.2.1 Proteinisolierung

    • 2.2.2 Rekombinante virale Proteine und Peptide

    • 2.2.3 Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

    • 2.2.4 DNA Isolierung aus Zellen und Geweben

    • 2.2.5 RNA Isolierung aus Zellen und Geweben

    • 2.2.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

    • 2.2.7 Sensitivität der verwendeten Primer

    • 2.2.8 RT-PCR

  • 2.3  Immunologische Methoden

    • 2.3.1 PERV-spezifische Antiseren

    • 2.3.2 Spezies-spezifische Antikörper

    • 2.3.3 Western Blot

    • 2.3.4 Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA)

    • 2.3.5 Durchflusszytometrie

  • 2.4  Virologische Methoden

    • 2.4.1 Virusisolate

    • 2.4.2 Isolierung von Viruspartikeln aus Zellkulturüberständen

    • 2.4.3 Bestimmung der Reversen Transkriptase Aktivität

    • 2.4.4 Infektionsstudien in vitro

    • 2.4.5 Infektionsstudien in vivo

    • 2.4.6 Klinische Studien

• 3. Ergebnisse

  • 3.1  Keine Übertragung von PERV auf humane Zellen nach Kokultivierung mit porzinen Inselzellen der Deutschen Landrasse

  • 3.2  Keine Infektion von BALB/c-Mäusen mit PERV nach Transplantation verkapselter Inselzellen der Deutschen Landrasse

  • 3.3  Analyse der Expression PERV-spezifischer mRNA und Proteine in Inselzellen der Deutschen Landrasse

  • 3.4  Untersuchung der Infektion von Zelllinien nicht-humaner Primaten mit PERV

  • 3.5  Etablierung einer Methode zur Detektion von gespleißter und ungespleißter PERV-spezifischer mRNA

  • 3.6  Analyse der Expression ungespleißter und gespleißter mRNA von PERV in infizierten Zelllinien nicht-humaner Primaten

  • 3.7  Analyse der Replikationsfähigkeit des an Affenzellen adaptierten PERV-A/C

  • 3.8  Keine Übertragung von PERV auf murine Zellen in vitro

  • 3.9  Keine Infektion von SCID-Mäusen mit PERV-A/C in vivo

  • 3.10 Höhere Sensitivität neuer Nachweismethoden durch Verwendung rekombinanter viraler Proteine

  • 3.11 Keine Übertragung von PERV auf Patienten nach extrakorporealer Leberunterstützung

  • 3.12 Antikörper gegen porzine Leberproteine in Patienten, die mit einem extrakorporealen Leberunterstützungssystem behandelt wurden

  • 3.13 Keine Übertragung von PERV auf Patienten nach Transplantation porziner Inselzellen

• 4. Diskussion

  • 4.1  Evaluierung der PERV-Freisetzung aus porzinen Inselzellen der Deutschen Landrasse in vitro und in vivo

  • 4.2  Versuche der Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells mit nichthumanen Primaten

  • 4.3  Versuche zur Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells mit Kleintieren

  • 4.4  Retrospektive Untersuchung von Patienten, die mit porzinen Zellen und Geweben behandelt wurden

• 5. Zusammenfassung

• Literatur

• Abkürzungsverzeichnis

• Danksagung

• Erklärung

• Tabelle 1: Mögliche humanpathogene porzine Viren

• Tabelle 2: Verwendete Zelllinien

• Tabelle 3: PERV-spezifische Proteine und Peptide

• Tabelle 4: Sequenzen und Bezeichnungen der verwendeten Primer

• Tabelle 5: Verwendete Antiseren und Antikörper

• Tabelle 6: Antikörper gegen PERV-Proteine und porzine Inselzellproteine in Xenotransplantationspatienten

• Tabelle 7: In vitro-Infektion von nicht-humanen Primatenzellen mit PERV

• Abbildung 1: Genereller Aufbau eines Retrovirus. Die Virenhülle wird von einer zellulären Lipiddoppelmembran gebildet. SU und TM verkörpern die viralen Hüllproteine. MA, CA und NC sind die viralen Strukturproteine. Die Enzyme PR, RT und IN sind für die Reifung des Viruspartikels und die Integration des Virusgenoms in die Wirtszelle essentiell (Coffin et al., 1997).

• Abbildung 2: Genomische Organisation der retroviralen RNA. R, Redundant; U, Unique; PBS, Primerbindungsstelle; SD, Spleißdonor; SA, Spleißakzeptor; PPT, Polypurintrakt (Coffin, et al., 1997)

• Abbildung 3: Genetische Organisation des Provirus (Coffin, et al., 1997).

• Abbildung 4: Anordnung der retroviralen Proteine, die von den gag, pol und env Genen codiert werden. AUG = Startcodon, UAG = Stopcodon.

• Abbildung 5: Aufbau eines PERV Partikels. SLA I und II, Schweineleukozytenantigen Klasse I und II (Dr. S. Norley, Dr. S. Tacke).

• Abbildung 6: Verwendetes Leberunterstützungssystem(Gerlach, 1997)A) Design des mit porzinen Hepatozyten bestückten Bioreaktors. B) Schema der Perfusion des Bioreaktors mit dem Serum des Patienten.

• Abbildung 7: Insulinfreisetzung der porzinen Inselzellen in den ersten 7 Tagen. Die Insulinkonzentration ist in Mikroinsulineinheiten pro Milliliter (µIU/ml) angegeben. Die internen Kontrollen einer geringen und einer hohen Insulinfreisetzung hatten Werte von 22,9 ± 1,9 µIU/ml und 122,4 ± 22,6 µIU/ml (19,4 ± 3,9 und 87 ± 17 µIU/ml nach den Angaben des Herstellers).

• Abbildung 8: Keine Infektion mit PERV von 293^neo+-Zellen kokultiviert mit porzinen Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse. Der 100 Bp (Basenpaar) Marker zeigt DNA-Fragmente mit Längen zwischen 100 und 2000 Basenpaaren (Invitrogen). Die Amplifikationsprodukte PERV- env A und - env B sind 360 bzw. 263 Bp lang. β-Actin und die porzine COII (Porz. COII) zeigen Amplifikationsprodukte von 528 und 255 Bp-Länge.

• Abbildung 9: Western Blot mit Seren von BALB/c-Mäusen, die Transplantate von verkapselten porzinen Inselzellen enthielten. Der verwendete Western Blot beruhte auf einem viralen Proteinlysat des gesamten PERV als Antigen. Die Kontrollgruppe (Gruppe II) wurde nicht mit Immunsuppressiva behandelt. Der gemischten Gruppe (Gruppe IV) wurden alle drei Immunsuppressiva verabreicht: Zenapax, humanisierter IL-2Rα-Antikörper; ProGraf, Lacton aus Streptomyces tsukubaensis ; Rapamune, Antibiotika aus S. Hygroscopicus . Die angegebenen Molekülgrößen entsprechen denen des Seeblue® Plus2-Markers (Invitrogen).

• Abbildung 10: Analyse der Expression von PERV-spezifischen Sequenzen in Inselzellen der Deutschen Landrasse.A) RT-PCR mit RNA von Insel- und PK15-Zellen unter Verwendung von gag pol und env A Primern. Eins der drei Inselzellisolate ist dargestellt. B) PCR mit DNA aus Insel- und PK15-Zellen. Es sind zwei der drei Inselzellisolate dargestellt.

• Abbildung 11:Proteinexpression von Inselzellen der Deutschen Landrasse in vitro.Bei den jeweiligen Isotyp-Kontrollen handelt es sich um Ziegenseren, die vor der Immmunisierung mit rp15Env bzw. rp27Gag entnommen wurden.

• Abbildung 12: Nachweis von PERV-Proviren in Zelllinien nicht-humaner Primaten. A) Die DNA aus LLCMK2-Zellen wurde 2 bis 3 Wochen nach der Infektion mit PERV isoliert und mittels PCR auf das Vorhandensein von proviralen Sequenzen überprüft. B) PCR mit der DNA aus EB176-Zellen.

• Abbildung 13: Entwicklung einer Methode zur Unterscheidung von ungespleißter und gespleißter mRNA von PERV. A) Lage der ausgewählten Primer im Provirus. SD, Spleißdonor; SA, Spleißakzeptor. B) RT-PCR mit RNA von 293/PERV-A/C-, PK15- und 293-Zellen. Die Amplifikationsprodukte der Volllängen-mRNA von 293/PERV-A/C und PK15 sind 220 Bp lang. Die Amplifikationsprodukte der gespleißten mRNA von 293/PERV A/C und PK15 sind 470 bzw. 380 und 480 Bp lang. Die Amplifikation mit β-Actin Primern diente der Kontrolle gleicher Mengen an RNA. Die Amplifikation ohne Reverse Transkriptase (-RT) diente zur Kontrolle der Abwesenheit zellulärer DNA.

• Abbildung 14: Expression ungespleißter und gespleißter PERV-spezifischer mRNA in PERV-infizierten Zelllinien nicht-humaner Primaten. A) RT-PCR mit RNA von PERV infizierten LLCMK2-Zellen. B) RT-PCR mit RNA von EB176-Zellen. RNA von 293/PERV A/C-Zellen diente als Positivkontrolle. Der 1 Kb ⁺ -Marker zeigte DNA-Fragmente zwischen 100 und 500 Bp-Länge.

• Abbildung 15: Infektion von humanen und nicht-humanen Zellen mit PERV-A/C, das an Affenzellen adaptiert war. A) PCR mit DNA aus LLCMK2- und 293-Zellen nach 10 wöchiger Zugabe von PERV-A/C von LLCMK2-Zellen. B) PCR mit DNA aus EB176- und 293-Zellen nach Zugabe von PERV-A/C von EB176-Zellen.

• Abbildung 16: Reverse Transkriptase Aktivität in Zellkulturüberständen von primären murinen Zellen. A) RT-Aktivität in Überständen von Nierenzellen aus NMRI-Mäusen kultiviert in Abwesenheit oder Anwesenheit von PERV produziert von porzinen PK15-Zellen. B) RT-Aktivität in Überständen von embryonalen Zellen aus BALB/c Mäusen kultiviert in Abwesenheit oder Anwesenheit von PERV produziert von infizierten 293-Zellen. In beiden Fällen wurden frisch präparierte Zellen für 24 Stunden mit PERV enthaltenden Überständen oder nur mit Medium inkubiert.

• Abbildung 17: PCR mit DNA aus verschiedenen SCID-Mausorganen.Es wurden jeweils fünf Tieren PERV-A/C-Zellkulturüberstände bzw. Zellkulturmedium appliziert. Als Positivkontrolle diente DNA aus PERV-A/C-produzierenden 293-Zellen. Als Negativkontrolle wurde DNA von uninfizierten 293-Zellen verwendet.

• Abbildung 18: ELISA zur Bestimmung der Sensitivität der Antiseren gegen rp15Env und rp27Gag. A) Ausverdünnung des Antiserums gegen rp15Env in 96-Well Platten mit 1µg pro Well immobilisiertes rp15Env und PERV-A/C-Proteinlysat. B) Ausverdünnung des Antiserums gegen rp27Gag in 96-Well Platten mit 1µg pro Well immobilisiertes rp27Gag und PERV-A/C-Proteinlysat. In beiden Fällen wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt.

• Abbildung 19: Western Blot zur Untersuchung von Antikörpern gegen PERV in Patienten, die mit einem extrakorporealen Leberunterstützungssystem behandelt wurden. A) Verwendung von gereinigtem PERV-Lysat als Antigen. Kreuzreagierende Antiseren gegen das Hüllprotein gp70 und das Kernprotein p27Gag von FLV und Antiseren gegen das rekombinante transmembrane Hüllprotein p15Env von PERV wurden als Positivkontrollen zur Evaluierung der Qualität des Western Blots verwendet. B) Verwendung des rekombinanten Gag-Proteins als Antigen. Ein Antiserum gegen das rekombinante Gag Protein von PERV-C wurde als Positivkontrolle verwendet. C) Verwendung des rekombinanten p15Env als Antigen. Ein Antiserum gegen das rekombinante p15Env wurde als Positivkontrolle verwendet. LTx, Lebertransplantation; Vorst, Vorstufen.

• Abbildung 20: ELISA zur Untersuchung von Patientenseren, die mit einem extrakorporealen Leberunterstützungssystem behandelt wurden. A) Verwendung eines diagnostischen Peptids (PERV-ido) als Antigen, das der immundominanten Domäne von PERV-p15Env entspricht. B) Verwendung eines Peptids (PERV-isu) als Antigen, das der immunsuppressiven Domäne von p15Env entspricht. Antiseren gegen beide Peptide wurden als Positivkontrollen verwendet, um die Qualität des ELISA zu evaluieren. Die horizontalen Linien verdeutlichen die Schwellenwerte (Durchschnitt plus dreimal Standardabweichung der Negativkontrollen).

• Abbildung 21:Western Blot unter Verwendung von Schweineleberproteinen als Antigen zur Untersuchung von Seren von Patienten, die mit einem extrakorporalen Leberunterstützungssystem behandelt wurden. A) Verwendung von Antiseren gegen humane µ-Ketten-spezifische Immunglobuline als Zweitantikörper. B) Verwendung von Antiseren gegen humane γ-Ketten-spezifische Immunglobuline als Zweitantikörper. LTx, Lebertransplantation.