1 Einleitung

1.1 Bedeutung der Übertragung heterologer Regulationssequenzen für die Risikobewertung gentechnisch veränderter Organismen

Die Bedeutung des horizontalen Gentransfers (HGT) ist eine der meist untersuchten Fragestellungen in den Biowissenschaften. Unter HGT versteht man die asexuelle Übertragung von genetischem Material zwischen verwandten und nicht-verwandten Organismen. Voraussetzung für einen HGT ist die Aufnahme und stabile Integration von DNA in die Erbsubstanz eines Empfänger-Organismus zur Weitergabe an die nachfolgenden Generationen. Folgen für den Phänotyp des Empfängers ergeben sich nur, wenn die übertragene DNA exprimiert wird. Die Expression der inserierten DNA setzt eine Transkription und Translation voraus.

Der Austausch genetischen Materials zwischen Bakterien ist ein in der Natur vorkommendes Phänomen (Veal et al., 1992). Zwischen Bakterien erfolgt der HGT durch Transduktion, Konjugation oder Transformation. Die Möglichkeit des Gentransfers zwischen z. B. Pflanzen und Bakterien im Erdboden wird ebenfalls diskutiert (Nielsen et al., 1998; Dröge et al., 1998). Bei der Herstellung von gentechnisch veränderten Organismen (GVOs) kommt es durch die Übertragung von DNA zwischen verschiedenen Organismen ebenfalls zum HGT.

Bevor GVOs in Deutschland und in der Europäischen Union freigesetzt und in Verkehr gebracht werden können, wird nach dem Gentechnikrecht eine Risikobewertung des jeweiligen GVOs vorgenommen. Bei diesen Risikobewertungen werden im Wesentlichen die Auswirkungen des neuen Genprodukts auf das Verhalten und die Eigenschaften der gentechnisch veränderten Organismen bewertet. Sie basieren daneben häufig auf der Annahme, dass die für eine Organismengruppe typischen Regulationssequenzen in heterologen Organismengruppen aufgrund der unterschiedlichen Regulationsmechanismen nicht erkannt werden und somit eine Expression übertragener Gene ohne gleichzeitige Übertragung der passenden Regulationssequenzen nicht zu erwarten wäre.

In Deutschland wurden bisher 129 Freisetzungsanträge für GVOs gestellt (Internet-Seite des Robert Koch-Instituts: www.rki.de/Gentec/Freisetzungen/Versuch.htm; Stand 13.09.2002), wobei im Wesentlichen Freisetzungen gentechnisch veränderter Pflanzen beantragt wurden. Das Ziel der genetischen Veränderung bei Pflanzen ist häufig das Einführen einer Herbizid- oder Schädlingsresistenz (Delannay et al., 1989; Quinn, 1990; Cheng et al., 1992) sowie genetische Veränderungen, welche zu veränderten Inhaltsstoffen

von Ertragspflanzen wie z. B. die Stärkezusammensetzung in der Kartoffel führen (Sonnewald, 1992).

In der Zukunft werden gentechnisch veränderte Pflanzen neben der Herstellung von Lebensmitteln und Tierfutter auch für die Produktion von Therapeutika und Impfstoffen eingesetzt werden (Tacket und Mason, 1999; Brandt, 2000). Erste Versuche zum Einsatz von Vaccinen auf pflanzlicher Basis werden an Versuchstieren schon vorgenommen. So wurden orale Immunisierungen von Mäusen und Kaninchen mittels transgener Kartoffeln mit dem Oberflächen-Antigen von Hepatitis B (HBsAg; Kong et al., 2000; Richter et al., 2000), sowie der Untereinheit B des Enterotoxins aus Escherichia coli (recLT-B; Lauterslager et al., 2001), dem VP60 des Virus des hämorrhagischen Fiebers bei Kaninchen (RHDV; Castanón et al., 1999) und dem Glykoprotein S des Schweinevirus verantwortlich für transmissible Gastroenterotiden (TGEV; Escribano und Borca, 2000) durchgeführt. Weiterhin wurde in gentechnisch verändertem Mais recLT-B und das Spike Protein des TGEV (Streatfield et al., 2001) exprimiert und Mäusen zur oralen Immunisierung verabreicht.

Das Ziel der gentechnischen Veränderung ist also die Herstellung eines spezifischen Proteins. Bei der Risikobewertung gentechnisch veränderter Pflanzen geht man in der Regel davon aus, dass Gene, die unter der Kontrolle bakterieller Promotoren stehen, nicht in Pflanzen exprimiert werden können und umgekehrt. Dies wurde jedoch bisher nicht systematisch untersucht und/oder in der Literatur beschrieben.

Expressionsvektoren sollten so konstruiert sein, dass eine Expression der übertragenen Gene nur spezifisch in dem Zielorganismus erfolgt. Es gibt jedoch Beispiele dafür, dass heterologe Promotor-Empfängersysteme eine Expression übertragener Gene zulassen. Hierbei wurden als Empfängersysteme diejenigen Organismengruppen bezeichnet, denen die heterologe Promotor- bzw. Regulationssequenz übertragen wurde. Einer der am häufigsten verwendeten Promotoren in transgenen Pflanzen ist der 35S Promotor aus Cauliflower Mosaic Virus (CaMV), welcher die Sequenz einer typischen pflanzlichen Promotorregion aufweist (Odell et al., 1985; Benfay und Chua, 1990). Dieser Promotor ist in der Lage, sowohl in E. coli (Assaad und Signer, 1990) als auch in Schizosaccharomyces pombe (Gmünder und Kohli, 1989; Pobjecky et al., 1990; Hirt et al., 1990) eine Expression nachgeschalteter Gene zu bewirken. Weiterhin wurde für den Promotor des Adenin-Methyltransferase Gens (amt) des Chlorella Virus eine Expression in den transgenen Pflanzen von Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Zea mays und Sorghum Zellen als auch in verschiedenen Bakterienarten wie E. coli, Erwinia stewartii, Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae und Xanthomonas campestris beschrieben (Mitra et al., 1994).

Weitere Beispiele, bei denen eine Expression in heterologen Promotor-Empfängersystemen für die Risikobewertung von GVO von Interesse sein dürften, gilt es zu untersuchen.

Zur Transformation dikotyler Pflanzen wird häufig das natürliche Transformationssystem des Gram-negativen Bodenbakteriums Agrobacterium tumefaciens genutzt. Hierbei wird die zu inserierende DNA durch Vektorsysteme (binäre Vektoren), basierend auf dem Ti-Plasmid (`tumor inducing plasmid´) aus A. tumefaciens in das pflanzliche Genom eingeschleust (Klee et al., 1987; Zambryski, 1988). Diese Fremd-DNA, welche unter der Kontrolle pflanzlicher oder pflanzenspezifischer Regulationssequenzen steht, wird durch die T-DNA (`transfer DNA´) des Vektors flankiert von den repetitiven Sequenzen der rechten und linken Grenze (RB, LB) stabil in das Chromosom der Pflanze integriert. Die T-DNA des zur Transformation von Pflanzen oft genutzten Vektors pBin19 oder dessen Derivate (Bevan, 1984; Jefferson et al., 1987) beinhaltet jedoch auch die lacZ´-Region mit der `multiple cloning site´ (MCS) aus M13mp19. Die Expression der lacZ´-Region wird durch den bakteriellen Lac-Promotor reguliert und mit in das Pflanzengenom integriert. Weiterhin wird das bakterielle Gen, welches für die Neomycin-Phosphotransferase II (nptII) kodiert, unter der Kontrolle des Nopalin-Synthase (nos) Promotors und der DNA-Sequenz für die Polyadenylierung des Octopin-Synthase Gens (ocs) für die Selektionierung der Pflanzen auf Kanamycin genutzt.

Mehrere Arbeitsgruppen haben die Transkription pflanzenspezifischer T-DNA Gene von A. tumefaciens u. a. auch ausgehend von dem Nos-Promotor in Agrobacterium beschrieben (Gelvin et al., 1981; Schröder et al., 1983; 1984; Janssens et al., 1984). Vancanneyt et al. (1990) beschrieben die Beobachtung, dass die zur Beurteilung der Expression in Pflanzen eingebrachten bakteriellen Reportergene, welche unter der Kontrolle eukaryontischer Promotoren stehen, in Agrobakterienexprimiert wurden.

Desweiteren ist bei der Erzeugung transgener Pflanzen auch im Einzelfall nicht auszuschließen, dass eine Übertragung von DNA-Sequenzen jenseits der LB und RB stattfinden kann (Fray et al., 1994; Martineau et al., 1994; Ramanathan und Veluthambi, 1995). Die Gene außerhalb der T-DNA, vor allem die Antibiotikumresistenzgene, stehen unter der Kontrolle bakterieller Promotoren.

Bei monokotylen Pflanzen wird die gentechnische Veränderung häufig mittels Partikelbombardement vorgenommen (Klein et al., 1989a). Hierbei werden oft pUC-Derivate zur Herstellung transgener Pflanzen eingesetzt. Bei einem erfolgreichen Gentransfer kommt es zur vollständigen, möglicherweise mehrfachen Integration des eingesetzten Plasmides in das Pflanzengenom. Auch bei diesen Plasmiden wird die lacZ´-Region mit der MCS für die in das Pflanzengenom zu inserierende DNA durch den bakteriellen Lac-Promotor reguliert.

Desweiteren werden auf diese Weise die Markergene zur Selektion in Bakterien, wie im Falle der pUC-Derivate das Antibiotikumresistenzgen für Ampicillin (bla), mit dem für die Expression in Bakterien benötigten Promotor in das Pflanzengenom integriert. So wurde z. B. für die Transformation von Mais zur Herstellung der insektenresistenten Maislinie CG00526-176 pUC18 eingesetzt. Dies führte zur Integration des bla-Gens in das Pflanzengenom dieser Linie (Duggan et al., 2000).

Weiterhin scheint die Beurteilung der Genexpression ausgehend von heterologen Promotoren von Bedeutung, da das Persistieren der zur Transformation verwendeten gentechnisch veränderten Agrobakterien in den gentechnisch veränderten Pflanzen beobachtet werden konnte. Diese wurden auf der Oberfläche und im Gewebe von gentechnisch veränderten Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum), nicht jedoch in den Blüten oder ausgereiften Samen der Pflanzen nachgewiesen (Matzk et al., 1996). Agrobakterien werden nach der Transformation der Pflanze durch Antibiotikumzusatz entfernt. Bei der Verwendung von Samen zur Vermehrung gentechnisch veränderter Pflanzen, wie es bei der Zuckerrübe (Beta vulgaris) der Fall ist, stellt das Persistieren der Agrobakterien kein Problem dar. Werden gentechnisch veränderte Pflanzen vegetativ vermehrt, wie im Falle der Kartoffel (S. tuberosum), würden Agrobakterien, die in den gentechnisch veränderten Pflanzen persistieren, mit freigesetzt werden. Durch Konjugation könnten die Plasmide der Agrobakterien zwischen ihnen und dem zum konjugativen Transfer befähigten Bakterien ausgetauscht werden.

Desweiteren muß bei der Risikobewertung die Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers von gentechnisch veränderten Pflanzen auf Bakterien berücksichtigt werden. Bis heute sind die meisten Transformationsexperimente natürlich kompetenter Bakterien mit Pflanzen-DNA erfolglos geblieben (Becker et al., 1994; Schlüter et al., 1995; Broer et al., 1996; Nielsen et al., 1997; Bertolla et al., 1999a). Sowohl Gebhard und Smalla (1998) als auch die Arbeitgruppe um de Vries (1998, 2001) konnten jedoch unter Laborbedingungen zeigen, dass Acinetobacter sp. und Pseudomonas stutzeri, welche ein nptII-Gen mit einer Deletion besaßen, DNA von transgenen Pflanzen mit einem vollständigen nptII-Gen mit einer geringen Frequenz aufnehmen und daraufhin exprimieren konnten. Nielsen et al. (2000) erweiterten das Experiment von Gebhard und Smalla (1998), indem sie die Untersuchungen in steriler Erde nach Zugabe von Nährstoffen durchführten. Auch hierbei konnte der oben beschriebene Acinetobacter sp. Stamm das nptII-Gen aus der DNA transgener Zuckerrüben aufnehmen und exprimieren. Somit sind kompetente Bakterien in der Lage DNA von transgenen Pflanzen unter der Voraussetzung aufzunehmen, dass homologe bakterielle DNA-

Sequenzen vorhanden sind. Wie eingehend beschrieben, beinhalten gentechnisch veränderte Pflanzen bakterielle Sequenzen wie Antibiotikumresistenzgene, bakterielle Promotoren und andere Sequenzen von Klonierungsvektoren, welche Möglichkeiten darstellen, durch homologe Rekombination in bakterielle Genome integriert zu werden (Gebhard und Smalla, 1998; Bertolla et al., 2000; de Vries et al., 2001; Mercer et al., 2001).

Der Fall eines horizontalen Gentransfers unter natürlichen Bedingungen wird hingegen als sehr gering eingeschätzt (Nap et al., 1992; Schlüter et al., 1995; Nielsen et al., 1998; de Vries et al., 2001). Der Fragestellung, ob ein horizontaler Gentransfer von gentechnisch veränderten Pflanzen, welche ein Antibiotikumresistenzgen unter der Kontrolle bakterieller Regulationssequenzen in das Pflanzengenom integriert haben, auf Bakterien stattfinden kann, wird in den letzten Jahren mit immer optimierteren Bedingungen nachgegangen (Duggan et al., 2000; Chambers et al., 2002). Chambers et al.(2002)führten Fütterungsversuche mit Hühnern durch, denen gentechnisch veränderter Mais, welcher das Antibiotikumresistenzgen bla enthielt, verabreicht wurde. bla konnte im Kropf und im Magen der Hühner nachgewiesen werden, jedoch nicht im Darm. Durch die Degradierung der DNA wird ein Gentransfer zwischen der DNA des gentechnisch veränderten Mais und der Mikroflora des Darms für unwahrscheinlich gehalten.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass es sowohl bei einem natürlichen horizontalen Gentransfer als auch bei der Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen zum Austausch von regulatorischen DNA-Sequenzen zwischen nicht-verwandten Organismen kommt und es von großer Bedeutung für die Bewertung gentechnisch veränderter Organismen ist, die häufig verwendeten Regulationssequenzen, insbesondere Promotoren, auf ihre Expression in heterologen Organismen zu untersuchen.

1.2 Regulationssequenzen der Transkriptionsinitiation

Genexpression ist ein komplexer Prozess aus Transkription und Translation, wobei die Transkriptionsinitiation der entscheidende Schritt für die Regulation der Genexpression ist. Der Transkriptionsapparat von Eubakterien, Archaebakterien und Eukaryonten weist große Unterschiede aber auch Gemeinsamkeiten auf. Allen gemein ist, dass für die Expression von Genen die jeweilige RNA-Polymerase (RNAP) u. a. mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren spezifische Erkennungs- und Bindungsstellen auf der DNA, sogenannte Promotoren, benötigt. Promotoren sind ein wesentlicher Bestandteil der Regulation der Genexpression. Die Expressionsrate eines Gens ist abhängig von der Stärke eines Promotors, d. h. der Affinität der RNAP zu der Promotorsequenz. Biochemisch gesehen beinhaltet der Promotor die DNA-

Sequenzen, welche für eine basale und nicht maximale Transkription verantwortlich sind (Fassler und Gussin, 1996).

Die Struktur der Promotoren ist für die einzelnen Organismengruppen spezifisch, obwohl es Hinweise dafür gibt, dass sich die RNAP von Eubakterien, Archaebakterien und Eukaryonten aus einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. Es wurden Homologien der Untereinheiten (UEs) der bakteriellen RNAP, der archealen RNAP und der eukaryontischen RNAP I, RNAP II und RNAP III festgestellt (Tab. 1), welche Mitglieder einer konservierten Protein-Familie, der sogenannten `multisubunit RNAP family´ sind (Sentenac et al., 1992; Soppa, 1999; Ebright, 2000; Minakhin et al., 2001).

Tab. 1 : Multisubunit RNA-Polymerasen. Konservierte UEs der bakteriellen RNAP, archealen RNAP und eukaryontischen RNAP I, II und III (Ebright, 2000).

Bakterielle RNAP

β ´

β

αI

αII

ω

 

Archeale RNAP

A´/A´´

B

D

L

K

+ 6 UE

Eukaryontische RNAP I

RPA1

RPA2

RPC5

RCP9

RPB6

+ 9 UE

Eukaryontische RNAP II

RPB1

RPB2

RPB3

RPB11

RPB6

+ 7 UE

Eukaryontische RNAP III

RPC1

RPC2

RPC5

RPC9

RPB6

+ 11 UE

Ein wesentlicher Unterschied zwischen Prokaryonten und Eukaryonten ist, dass prokaryontische Gene häufig in Form von Operons angeordnet sind. Bei der Expression der Gene wird ausgehend von einem Promotor eine polycistronische RNA gebildet, die für die Synthese mehrerer Proteine verantwortlich ist. Bei eukaryontischen Genen ist jeweils ein Promotor für die Expression eines Gens verantwortlich. Das gebildete Primärtranskript enthält Exon- und Intronbereiche, wobei die Intronbereiche durch Spleißvorgänge aus dem Primärtranskript geschnitten werden, da in der Regel nur die Exonbereiche für die Synthese von Proteinen kodieren.

1.2.1 Transkriptionsinitiation in Prokaryonten

Burgess und Travers sowie Dunn und Bautz haben 1969 erstmalig beschrieben, dass sich die bakterielle RNAP aus zwei Komponenten zusammensetzt, dem Core-Enzym (α2ββ´) und dem sigma Faktor (σ-Faktor). Die Erkennung der Promotorstrukturen der DNA durch die RNAP und somit die Initiation der Transkription wird durch σ-Faktoren vermittelt. Nur das Holo-Enzym der RNAP (α2ββ´σ) kann spezifisch an die DNA binden und die Transkription initiieren.

Die meisten Bakterienarten synthetisieren mehrere verschiedene σ-Faktoren, welche unterschiedliche Promotorsequenzen erkennen. Momentan sind 14 verschiedene Klassen von σ-Faktoren bekannt, die in zwei Familien, die σ70- und σ54-Familie, unterteilt werden (Wösten, 1998a). Der primäre σ-Faktor, welcher in allen bekannten Eubakterien vorhanden ist (Gruber und Bryant, 1997), ist für Expression der Gene des Zellwachstums und die Expression der Haushaltsgene verantwortlich. In E. coli,wie auch in den meisten anderen Gram-negativen Bakterien, ist dieser primäre σ-Faktor bekannt als σ70 und in Bacillus subtilis bzw. Gram-positiven Bakterien als σA (Helmann und Chamberlain, 1988).

Die Promotorsequenz der DNA, welche von dem RNAP Holo-Enzym mit σ70 oder σA erkannt wird, beinhaltet zwei konservierte Sequenzen mit jeweils sechs Nukleotiden (nt), die –10-Region und die –35-Region (Pribnow, 1975a; 1975b; Schaller et al., 1975). Die stark konservierte –10-Region hat die Konsensus Sequenz TATAAT und erstreckt sich häufig von Position –12 bis –7 bezogen auf die Transkriptionsinitiationsstelle. Stromaufwärts der –10-Region mit einen optimalen Abstand von 16 bis 18 nt befindet sich die weniger stark konservierte –35-Region mit der Konsensus Sequenz TTGACA, meist positioniert von –35 bis –30. Der optimale Abstand der –10-Region zur Transkriptionsinitiationsstelle (+1) beträgt fünf bis neun Nukleotide. In den meisten der untersuchten Sequenzen wird die Transkriptionsinitiationsstelle von einer Purinbase gebildet (siehe Abb. 1a; Rosenberg und Court, 1979; Hawley und McClure, 1983; Harley und Reynolds, 1987; Lisser und Margalit, 1993; Helman, 1995; Ozoline et al., 1997).

Der prozentuale Anteil der jeweiligen Nukleotide in den beiden Konsensus Hexameren der –35- und –10-Regionen in den E. coli- und B. subtilis–Promotoren hängt von der Zusammenstellung und der Anzahl, sowie denangewandten Methoden bzw. Algorithmen beim Vergleich der jeweiligen Promotoren ab (Tab. 2).

Tab. 2 : Vergleich des prozentualen Anteils der aufgeführten Nukleotide der –35- und –10-Regionen in den untersuchten Promotoren.

Referenz

Spezies

Anzahl der Promotoren

-35-Region

T T G A C A

-10-Region

T A T A A T

Hawley und McClure, 1983

E. coli

112

82 84 79 64 54 45

79 95 44 59 51 96

Harley und Reynolds, 1987

E. coli

263

78 82 68 58 52 54

82 89 52 59 49 89

Lisser und Margalit, 1993

E. coli

298

69 79 61 56 54 54

77 76 60 61 56 82

Helmann, 1995

B. subtilis

236

88 84 77 64 52 55

94 96 60 77 74 93

In der Konsensus Sequenz der –35-Region sind bei allen Untersuchungen die ersten beiden Nukleotide des Hexamers (TTGACA) am stärksten konserviert. In der –10-Region sind die Nukleotide an den Positionen 2 und 6 (TATAAT) nach den Promotoranalysen von Hawley und McClure (1983), Harley und Reynolds (1987) und Helmann (1995) am stärksten konserviert. Hingegen weist die Analyse von Lisser und Margalit (1993) auf die starke Konservierung des Nukleotids an Position 6 der –10-Region hin, die Nukleotide der Positionen 1 und 2 weisen mit 77 % bzw. 76 % eine ähnlich starke Konservierung auf.

Zusätzlich wurde bei einigen Promotoren an Position –15/-14 ein TG-Motiv festgestellt, welches zu einer `extended –10-Region´ mit der Konsensus Sequenz TGNTATAAT führt (siehe Abb. 1a, Keilty und Rosenberg, 1987; Kumar et al., 1993). Bei Vorhandensein der `extended –10-Region´ konnte auch bei fehlender Konsensus Sequenz für die –35-Region eine Genexpression nachgewiesen werden (Kumar et al., 1993; Bown et al., 1997; Dombroski, 1997). Sind beide Konsensus Hexamere in einer Promotorstruktur vorhanden, so führte das TG-Motiv zu einer Erhöhung der Genexpression (Chan und Busby, 1989).

Besonders stark exprimierte Gene weisen außerdem in ihrer Promotor-DNA stromaufwärts der –35-Region eine konservierte AT-reiche Region auf (Estrem et al., 1998; Ross et al., 1998). Für den Promotor P1 des rrnB konnte gezeigt werden, dass die C-terminale Region der α-UEs der RNAP an das sogenannte UP-Element, welches den Bereich von –40 bis –60 in bezug auf die Transkriptionsinitiationsstelle umfasst, bindet (siehe Abb. 1a; Ross et al., 1993; Blatter et al., 1994; Rao et al., 1994).

Durch Sequenzvergleiche der Proteine der σ70-Familie in Eubakterien wurden vier hoch konservierte Aminosäureregionen (σ70-Regionen 1-4; siehe Abb. 1b) identifiziert, welche für die Bindung des σ70–Faktors an das Core-Enzym, die Erkennung der Promotorregion, die Bindung an die Promotorregion, für das Aufschmelzen der Promotor-DNA und somit für die Bildung des offenen Promotor-Komplexes verantwortlich sind (Helmann und Chamberlain, 1988; Lonetto et al., 1992). Zwei Subregionen der Proteine sind hierbei wichtig für die Erkennung und Bindung an die Promotorsequenz der DNA. Die Subregion 2.4 erkennt die -10-Region und die Subregion 4.2 die –35-Region. Mutationen in den Regionen 2.4 und 4.2 führten zu der Änderung der spezifischen Interaktionen des RNAP Holo-Enzyms mit den –10- und –35-Konsensus Sequenzen (Gardella et al., 1989; Siegele et al., 1989; Zuber et al., 1989; Daniels et al., 1990; Waldburger et al., 1990).

Abb. 1 : Schematische Darstellung einer prokaryontischen Promotorregion, welche von dem σ70 -Faktor des Holo-Enzyms der RNAP erkannt wird. a Aufbau der Promotorregion mit den –35- und –10-Konsensus Sequenzen sowie dem UP-Element, welches nur in stark exprimierenden Promotoren vorhanden ist. Der Transkriptionsstart (Pfeil) wird häufig von einer Purinbase gebildet. Bei Vorhandensein einer `extended –10-Region´ ist die –35-Region entbehrlich. b Struktureller Aufbau des σ70 -Faktors mit den vier Regionen und den dazugehörigen Subregionen mit den entsprechenden Funktionen (modifiziert nach Wösten, 1998a).

Der genaue Hergang zwischen der Protein-Protein-Interaktion des σ70-Faktors mit dem Core-Enzym, sowie der Protein-Nukleinsäure-Interaktionen zwischen dem σ70 als Bestandteil des Holo-Enzyms und der Promotorsequenz, ist noch nicht vollständig geklärt und wird wie folgt formuliert (Abb. 2):

Durch die Subregionen 2.1 und 2.2 des σ70-Faktors wird dieser an die β- und β´-UEs an das Core-Enzym der RNAP (α2ββ´) gebunden, wobei die Hauptbindungsstelle von der N-terminalen Region der β´-UE ausgeht (Arthur und Burgess, 1998; Burgess und Anthony, 2001). Die Assoziation des Core-Enzyms mit dem σ70–Faktor führt zu einer Konformationsänderung des σ70–Faktors (Young et al., 2001). Dies wiederum verändert den Abstand zwischen den σ70-Regionen 2.4 und 4.2. Kuznedelov et al. (2002) konnten zeigen, dass eine sogenannte `flexible flap´-Domäne der β-UE der RNAP mit der Region 4 von σ38, welcher mit σ70 nahe verwandt ist, interagiert. Somit wird eine weitere Konformationsänderung ausgelöst, die zur korrekten Positionierung der σ-Regionen 4 und 2 zu den –35- und –10-Promotorsequenzen der DNA führt. Die DNA ist dabei teilweise um die

RNAP gewunden (Zinkel und Crothers, 1991; Perez-Martin et al., 1994). Die σ70-Regionen 4.2 und 2.4 können nun mit der doppelsträngigen –35-Region und –10-Region der Promotor-DNA interagieren (Dombroski et al., 1992; 1996) und bilden den geschlossenen Promotor-Komplex. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass nur die doppelsträngige DNA der –10-Region stromaufwärts der Position –10 wichtig für die Bindung an die σ70 -Region 2.4 ist (Dombroski, 1997). Die Region 2.5 des σ70-Faktors der RNAP aus E. coli ist für die Erkennung des `extended –10-Motivs´ verantwortlich (Barne et al., 1997; Bown et al., 1999).

Wiederum andere Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass die σ70-Region 2 auch an der Bindung der –10-Sequenz der einzelsträngigen DNA des kodierenden Stranges beteiligt ist, um somit den offenen Promotor-Komplex zu stabilisieren (Roberts und Roberts, 1996; Marr und Roberts, 1997; Huang et al., 1997; Qiu und Helmann, 1999; Young et al., 2001).

Abb. 2 : Vereinfachtes Modell der Transkriptionsinitiation in Prokaryonten. Das Core-Enzym (α2ββ ´) der RNAP bildet mit dem σ -Faktor das Holo-Enzym, welches an die Promotorregion binden kann. Nach erfolgreicher Transkriptionsinitiation dissoziiert der σ -Faktor vom Holo-Enzym und das Core-Enzym geht in die Elongation und damit zur RNA-Synthese über. Nähere Erläuterungen siehe Text.

Weiterhin ist die σ70-Subregion 2.3 im Holo-Enzym-Komplex für das Aufschmelzen der DNA im Bereich –11 bis +1 und somit für Bildung des offenen Promotor-Komplexes verantwortlich (Juang und Helmann, 1994; Rong und Helmann, 1994; Guo und Gralla, 1998; Panaghie et al., 2000). Die Region 1 des σ70-Faktors aus E. coli ist beteiligt an einem Isomerisierungsvorgang, der benötigt wird für den Übergang des geschlossenen Promotor-Komplex zu dem offenen Promotor-Komplex (Wilson und Dombroski, 1997). Das Aufschmelzen der DNA ist mit einer Konformationsänderung der RNAP verbunden, die die Bildung einer Transkriptionsblase zur Folge hat (Roe et al., 1985). Der Template-Strang wird in das aktive Zentrum des Core-Enzyms gedrängt, welches von den β- und β´-UE der RNAP gebildet wird. Nach der Bindung des ersten Nukleosidtriphosphats für die Bildung der RNA folgen weitere Phosphodiesterbindungen. Erst werden kurze abortive RNA-Transkripte gebildet (< 10 Nukleotide), die aus dem `ternary Komplex´ entlassen werden (Gralla et al., 1980; Munson und Reznikoff, 1981). In diesem Zustand verweilt das Holo-Enzym an der Promotor-DNA. Nach erfolgreicher Transkriptionsinitiation dissoziiert der σ-Faktor aus dem Komplex (Hansen und McClure, 1980; Krummel und Chamberlin, 1989) und das Core-Enzym (α2ββ´) verlässt für die Elongation den Promotor.

1.2.2 Transkriptionsinitiation in Eukaryonten

Eukaryonten besitzen drei verschiedene RNA Polymerasen (RNAP), die die Transkription der DNA in RNA katalysieren. Die RNAP I transkribiert die Gene, welche für die rRNA kodieren, die RNAP II transkribiert die Gene der mRNA als auch bestimmte snRNAs, und die RNAP III transkribiert die Gene der tRNAs sowie 5S RNA (Zawel und Reinberg, 1995; Fassler und Gussin, 1996).

Die RNAP II, welche die Gene der mRNA transkribiert und auf die ich mich bei der Beschreibung der Transkriptionsinitiation in Eukaryonten beschränken möchte, besteht in phylogenetisch sehr unterschiedlichen Organismen meistens aus zwölf UEs (Woychik, 1998). Sie kann nur durch die Bindung von allgemeinen Transkriptionsfaktoren (`general transcription factors´, GTFs) unter Bildung des Prä-Initiationskomplexes (PIC) die spezifische Transkription initiieren. Hierzu gehören die GTFs TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF und TFIIH. Die Rolle des TFIIA als GTF wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Diese einzelnen GTFs, mit Ausnahme des TFIIB, setzen sich wiederum aus UEs zusammen (Zawel und Reinberg, 1995; Orphanides et al., 1996; Roeder, 1996; Hampsey, 1998; Woychik und Hampsey, 2002).

In Eukaryonten gibt es drei verschiedene Familien von cis-regulierenden DNA-Sequenzelementen zur Transkriptionsinitiation durch die RNAP II. Hierzu gehört die Familie des Core-Promotors, die `promoter-proximal elements´ und die `promoter-distal elements´ oder auch Enhancer genannt (Orphanides et al., 1996). Die cis-regulierenden DNA-Sequenzelemente, welche nicht zu dem Core-Promotor gehören, werden oft auch als `upstream activating sequences´ (UAS) bezeichnet.

Der Core-Promotor ist für die Bindung der GTFs und damit der RNAP II verantwortlich und kontrolliert die Lage der Transkriptionsinitiationsstelle. Er kann mehrere Sequenzelemente beinhalten (Abb. 3). Ein Sequenzelement des Core-Promotor ist die AT-reiche TATA-Box mit der Konsensus Sequenz TATA(A/T)A(A/T) (Breathnach und Chambon, 1981; Bucher und Trifonov, 1986; Bucher, 1990). Sie ist in den meisten Eukaryonten konserviert und liegt 25 bis 30 nt stromaufwärts von der Transkriptionsinitiationsstelle, wobei die exakte Lokalisation der ersten Base T (TATAAAA) je nach Gen von Position –34 bis –26 variiert (Breathnach und Chambon, 1981). Die Vergleiche der Konsensus Sequenzen der TATA-Box ergaben die stärkste Konservierung der Basen an den Positionen zwei, drei, vier und sechs (TATAAAA; Bucher, 1990). Mutationsanalysen bestätigten die Konservierung dieser Basen (Myers et al., 1986; Huang et al., 1988; Giangrande et al., 1989; Wobbe und Struhl, 1990). Klassischerweise nimmt man an, dass an die TATA-Box eine UE des TFIID bindet, welche als TBP (TATA-Bindungsprotein) bekannt ist (Hernandez, 1993; Burley und Roeder, 1996). TFIID umfasst außerdem noch eine Anzahl von TBP assoziierten Faktoren oder TAFs (Burley und Roeder, 1996; Verrijzer und Tijan, 1996; Tansey und Herr, 1997; Albright und Tjian, 2000). In in vitro-Experimenten konnte jedoch gezeigt werden, dass unter bestimmten Umständen auch Transkriptionsinitiation ohne TBP nachgewiesen werden konnte (Usheva und Shenk, 1994; Wieczorek, 1998). In Drosophila hat man neben dem TBP einen sogenannten `TBP-related factor´ (TRF1) gefunden, welcher dem TBP homolog ist. In diesem Falle erkennt der TRF1 in Analogie zur TATA-Box eine sogenannte TC-Box. Diese Sequenz ist TC-reich und liegt ca. 25 nt stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle. Der TRF1 gehört zu einem Proteinkomplex (`TBP-free TAFII–containing complex´; TFTC), welcher Transkriptionsfaktoren beinhaltet, die sich von denen des TFIID-Komplexes unterscheiden (Crowley et al., 1993; Hansen et al., 1997; Holmes und Tjian, 2000). Außerdem wurden in Metazoa neben dem TBP noch weitere TBP-ähnliche Faktoren (`TBP-like factors´; TLFs) identifiziert, welche für die Erkennung der Promotor-DNA unabhängig von der TATA-Box

verantwortlich sind. Man nimmt an, dass TLFs an der Expression spezifischer Gene beteiligt sind (Dantonel et al., 1999).

Direkt stromaufwärts der TATA-Box befindet sich in dem humanen Transkriptionsapparat der RNAP II ein weiteres Core-Promotor-Element, das `IIB recognition element´ (BRE). An diesem Element mit der Konsensus Sequenz (G/C)(G/C)(G/A)CGCC bindet der Faktor TFIIB (Lagrange et al., 1996; 1998; Qureshi und Jackson, 1998).

Wieder andere Core-Promotoren werden als TATA-less bezeichnet und beinhalten den sogenannten Initiator (Inr), der für die korrekte Transkriptionsinitiation verantwortlich ist (Smale und Baltimore, 1989; Zenzie-Gregory et al., 1992; Smale, 1997). Die Konsensus Sequenz des Inr wird durch PyPyA+1N(A/T)PyPy (A+1 = Transkriptionsinitiationsstelle) in den Promotorsequenzen von Säugergenen (Bucher, 1990; Javahery et al., 1994) und durch TCA+1(G/T)TPy in den TATA-less Promotorsequenzen von Drosophila Genen (Arkhipova, 1995) beschrieben, sie ist weniger stark konserviert und umgibt als Sequenz die Transkriptionsinitiationsstelle. Mutationsanalysen des Inr aus Genen von Säugetieren ergaben, dass innerhalb der Konsensus Sequenz das A an Position +1, ein A oder T an Position +3 und eine Pyrimidinbase an Position –1 bezogen auf die Transkriptionsinitiationsstelle für die Stärke des Inr-Elements am wichtigsten sind (Bucher, 1990; Javahery et al., 1994). Das Inr-Element kann ebenfalls in Promotoren vorhanden sein, welche eine TATA-Box beinhalten. Hierbei führt es oft zu einer Erhöhung der Expressionsstärke des Promotors (Javahery et al., 1994; Lo und Smale, 1996). An der Bindung an den Inr sind die TAFs des TFIID-Komplexes oder andere Transkriptionsfaktoren wie TFII-I oder YY1 beteiligt (Martinez et al., 1994; Smale, 1997; Chalkley und Verrijzer, 1999; Albright und Tjian, 2000).

Desweiteren wurde ein Promotorelement in Drosophila und in humaner DNA entdeckt, welches bisher nur in TATA-less aber Inr-haltigen Promotoren nachgewiesen wurde. Dieses sogenannte `downstream promoter element´ (DPE) erstreckt sich typischerweise von Position +28 bis +34 bezogen auf die Transkriptionsinitiationsstelle mit der Konsensus Sequenz PuG(A/T)CGTG und ist mitverantwortlich für die präzise Transkriptionsinitiation durch das Inr-Element. Das DPE wird durch die TAFs erkannt (Burke und Kadonaga, 1996; 1997; Albright und Tjian, 2000).

Für die Transkription in vivo werden neben dem Core-Promotor, welcher für die basale Transkription verantwortlich ist, noch wie einleitend beschrieben die `promoter-proximal elements´ und/oder Enhancer benötigt. Dies sind kurze regulatorisch wirkende Sequenzen.

Abb. 3 : Schematische Darstellung möglicher eukaryontischer Promotorregionen. Die TATA-Box ist am häufigsten in eukaryontischen Promotoren vertreten. Sie liegt ca. 25 bis 30 nt stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle (Pfeil). Im humanen Transkriptionsapparat befindet sich teilweise direkt stromaufwärts der TATA-Box das `IIB recognition element´ (BRE). Neben der TATA-Box beinhalten einige Promotoren das Inr-Element. Die Transkriptionsinitiation geht häufig von einem Adenin aus. TATA-less Promotoren beinhalten nur das Inr-Element. In TATA-less Promotoren wurde in Drosophila und in humanen Zellen das `downstream promoter element´ (DPE) nachgewiesen. Cis -regulierende DNA-Sequenzelemente, die nicht zum Core-Promotor gehören, wurden als UAS dargestellt.

Die `promoter-proximal elements´ sind Sequenzen, die an den Core-Promotor grenzen, wohingegen Enhancer bis zu einige kbp stromaufwärts oder stromabwärts des Core-Promotors liegen können. Beide Elementestellen Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren (TF) dar, welche die basale Transkription ausgehend von dem Core-Promotor verstärken, abschwächen und regulieren können (Johnson und McKnight, 1989; Mitchell und Tjian, 1989; Zawel und Reinberg, 1995; Fassler und Gussin, 1996; Orphanides et al., 1996; Hampsey, 1998). Zu den `promoter-proximal elements´ gehören z. B. die CAAT- und GC-Box. Sowohl CAAT- als auch GC-Box können in beiden Orientierungen in der Promotor-DNA vorkommen (Bucher, 1990). Zu jedem eukaryotischen Gen gehören für Bindung von TFs meistens mehrere Sequenzelemente, welche die Transkription des Gens kontrollieren. Sie sind u. a. dafür verantwortlich, dass bestimmte Gene nur in bestimmten Zelltypen und in bestimmten Entwicklungsstadien der Organismen exprimiert werden. Einige Gene hingegen, wie z. B. Haushaltsgene werden mehr oder weniger konstitutiv in allen Zelltypen exprimiert. Hierbei nehmen die TAFs des TFIID-Komplexes die Rolle von zellspezifische Coaktivatoren ein, welche zwischen der Core-Maschinerie und den Transkriptionsaktivatoren interagieren (Flanagan et al., 1991; Verrijzer und Tjian, 1996; Freiman et al., 2001). Des weiteren wurde ein Proteinkomplex, welcher als Mediator bezeichnet wird, identifiziert. Der Mediator wird benötigt, um die Informationen

genspezifischer Aktivatoren oder Repressoren dem Core-Promotor zu vermitteln. Der Komplex ist variabel und besteht aus mehreren UEs und verschiedenen Domänen. Mediatoren binden nicht spezifisch an die DNA, sondern interagieren physikalisch zwischen den Proteinen (Flanagan et al., 1991; Kim et al., 1994; Myers und Komberg, 2000; Gustafsson und Samuelsson, 2001).

Ein Modell, welches die GTFs und RNAP II in einer bestimmten Reihenfolge an der Promotor-Sequenz der DNA versammelt, vereinfacht die Beschreibung der Aufgaben der einzelnen Komponenten bei der Bildung des PICs (Abb. 4b; Orphanides et al., 1996).

Abb. 4 : Modell für die Transkriptionsinitiation durch die RNAP II (modifiziert nach Orphanides et al. , 1996). a Beispiel für ein Holo-Enzym-Modell. b In vitro -Modell des PICs bei dem sich die GTFs und die RNAP II in einer bestimmten Reihenfolge an der Promotorsequenz der DNA versammeln. Nähere Erläuterungen siehe Text.

Die Zusammensetzung des PICs variiert in Abhängigkeit von den Core-Promotor-Elementen und ist deswegen nur vereinfacht dargestellt worden. So wurde bei dieser Beschreibung nur auf den TFIID-Komplex eingegangen, dabei wurden weitere Möglichkeiten der Promotorerkennung durch TRF oder TLF vernachlässigt.

Der TFIID-Komplex bestehend aus TBP und TAFs ist für die Erkennung des Promotors verantwortlich (Hernandez, 1993; Burley und Roeder, 1996; Verrijzer und Tjian, 1996; Albright und Tjian, 2000). Die Bindung an die TATA-Box erfolgt durch die Carboxy-terminale Domäne (CTD) des TBP. Die TAFs interagieren mit den angrenzenden Sequenzen wie dem Inr oder dem DPE. Das TBP bindet an die TATA-Box in der kleinen Furche der DNA (Lee et al., 1991; Starr und Hawley, 1991) und nimmt eine sattelähnliche Struktur über die gekrümmte Form der DNA an (Nikolov et al., 1992; 1996). Dies verursacht eine Verzerrung und damit ein geringfügiges Entwinden der DNA im Bereich der TATA-Box und ermöglicht dadurch eine bessere Interaktion des TFIIA, des TFIIB, der TAFs und anderer regulatorischer Proteine mit der DNA. Danach kann die Bindung des TFIIA durch Interaktion mit dem TBP und der DNA stromaufwärts der TATA-Box erfolgen, welche den TBP-DNA-Komplex stabilisiert (Lagrange et al., 1996; Orphanides et al., 1996; Hampsey, 1998). Die Bindung des TFIIB erfolgt durch direkte Interaktion mit dem TBP. In humanen Zellen interagiert der TFIIB mit dem BRE stromaufwärts der TATA-Box, aber auch mit Sequenzen stromabwärts der TATA-Box. TFIIB stabilisiert einerseits den TBP-TATA-Komplex und ist außerdem wichtig bei der Definition der Transkriptionsrichtung (Nikolov et al., 1995; 1996; Lagrange et al., 1996; 1998; Tsaiund Sigler, 2000). Unterschiedliche Mutationsstudien des TFIIB haben Auswirkungen auf die Zusammensetzung des PICs hervorgebracht sowie Veränderungen in der Transkriptionsinitiationsstelle gezeigt (Li et al., 1994; Cho und Buratowski, 1999; Hawkes und Roberts, 1999; Faitar et al., 2001). Es wird angenommen, dass TFIIB verantwortlich ist für den korrekten Abstand zwischen der TATA-Box und dem Transkriptionsstart (Leuther et al., 1996). TFIIB ist weiterhin beteiligt an der Bindung des Komplexes aus RNAP II und TFIIF an das TBP, wobei er sowohl mit der RNAP II als auch dem TFIIF interagiert (Ha et al., 1993; Tan et al., 1994; Sun und Hempsey, 1995; Fang und Burton, 1996; Leuther et al., 1996). Der Faktor TFIIF ist in humanen Zellen ein Heterotetramer, bestehend aus zwei großen UEs (TFIIFα/RAP74) und zwei kleinen UEs (TFIIFβ/RAP30), welche verschiedene Domänen besitzen. Er stellt mit den kleinen UEs den Kontakt zu der nicht phosphorylierten RNAP II (RNAP IIA) her und führt sie zu dem Komplex an der DNA (Sopta et al., 1985; Flores et al., 1988; Lu et al., 1991). Die Bindung der RNAPII und des TFIIF stabilisiert den Komplex aus DNA, TBP und TFIIB. Dabei

interagiert RAP30 mit der DNA auf beiden Seiten der TATA-Box, wohingegen für RAP74 in unterschiedlichen Experimenten die Interaktion mit der stromabwärtsliegenden DNA-Sequenz der TATA-Box als auch die Interaktion mit der DNA auf beiden Seiten der TATA-Box nachgewiesen wurde (Kim et al., 1997; Forget et al., 1997). Die humane RNAP II weist die Interaktion von drei UEs u. a. der größten und der zweitgrößten UE über 60 bp (Position –53 bis +9) mit der DNA auf. Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass nach der Bindung des TFIIF und der RNAP II an den Komplex die Promotor-DNA um die RNAP II gewunden ist (Kim et al., 1997; Forget et al., 1997). TFIIF ist außerdem als Elongationsfaktor an der Transkription (Reines et al., 1996) und mit TFIIB an der Regulation der CTD-Phosphatase-Aktivität der RNAP II beteiligt (Kim et al., 1994; Chambers et al., 1995; Kobor et al., 2000; Kamada et al., 2001). Die Bindung der RNAP II durch den Faktor TFIIF an den TFIID-TFIIB-Promotor-Komplex führt nur durch die Bindung von zwei weiteren GTFs TFIIE und TFIIH zum PIC zur Initiation der RNA-Synthese. Hierbei wird TFIIE durch direkte Interaktion mit der RNAP IIA an den Komplex gebunden (Maxon et al., 1994; Leuther et al., 1996). TFIIE humaner Zellen ist ebenfalls ein Heterotetramer, bestehend aus je zwei großen und zwei kleinen UEs (TFIIEα, TFIIEβ; Ohkuma et al., 1990; Inostroza et al., 1991). Die UEs sind beteiligt am unspezifischen Kontakt des TFIIE zur DNA direkt stromabwärts der Transkriptionsblase und somit nahe dem aktiven Zentrums der RNAP II (Leuther et al., 1996; Robert et al., 1996; Kim et al., 2000). Weiterhin vermittelt TFIIE die Bindung von TFIIH (Flores et al., 1992; Maxon et al., 1994), wodurch der PIC vervollständigt wird. TFIIH ist mit neun UEs der größte und der komplexeste GTF. Er ist der einzige GTF mit definierter Enzymaktivität, die als ATP-abhängige DNA-Helikase- und Cyclin-abhängige Proteinkinase-Aktivität beschrieben wird (Schaeffer et al., 1993; Feaver et al., 1994; Serizawa et al., 1995; Svejstrup et al., 1996; Tirode et al., 1999). Damit ist TFIIH verantwortlich für das Aufschmelzen der Promotor-DNA und ist beteiligt an der Phosphorylierung der CTD der RNAP II. Es wurden zwei verschiedene Modelle erstellt wie eine der beiden Helikasen, die TFIIH beinhaltet, das Aufschmelzen der Promotor-DNA katalysiert (Douziech et al., 2000; Kim et al., 2000). In beiden Fällen interagiert die UE des TFIIH, welche diese Helikase beinhaltet, mit der DNA und führt zu einer ATP-abhängigen Bildung des offenen Promotor-Komplexes. Das Aufschmelzen der DNA erfolgt zwischen den Nukleotiden der Positionen –9 bis +2 im PIC (Holstege et al., 1997; Yan und Gralla, 1997). Auch TFIIE ist mitverantwortlich für das Aufschmelzen der Promotor-DNA, indem er die aufgeschmolzene Promotor-DNA stabilisiert (Holstege et al., 1995; Kuldell und Buratowski, 1997). Die RNAP II bildet mit ihren beiden größten UEs das aktive Zentrum, welche nun

durch Phosphodiesterbindungen der NTPs die RNA-Synthese katalysiert. Hierbei werden erst abortive RNAs synthetisiert bevor die RNAP II zur produktiven RNA-Synthese übergeht. Die größte UE der RNAP II enthält eine CTD, die je nach genomischer Komplexität des Organismus 26 bis 52 Wiederholungen von einem Heptapeptid mit der Konsensus Sequenz Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser (Corden, 1990) beinhaltet. Die Phosphorylierung der CTD der RNAP II ist ATP-abhängig und findet beim Übergang des PICs in den Elongationskomplex statt. Hierbei wird bevorzugt Serin der Konsenus CTD phosphoryliert. Die Phosphorylierung der CTD ist ein komplexer Mechanismus, wobei unklar ist, ob TFIIH die einzige Proteinkinase beinhaltet, die die CTD nach Bildung des PICs phosphoryliert (Dahmus, 1996; Trigon et al., 1998). In Saccharomyces cerevisiae wurden bisher vier Cyclin-abhängige Proteinkinasen identifiziert, die während der Transkription an der Phosphorylierung der CTD beteiligt sind (Murray et al., 2001). Eine dieser Proteinkinasen ist für das Recyclen der phoshorylierten Form der RNAP II verantwortlich. Jedoch kann nur die phosphorylierte RNAP II (RNAP IIO) den Promotor verlassen (Dahmus, 1996). Nach der Promotor Clearance werden die GTFs TFIIB, TFIIE und TFIIH aus der Bindung des Komplexes entlassen und die RNAP II mit TFIIF kann in die Phase der Elongation übergehen, wobei die GTFs TFIID und TFIIA an dem Promotor-DNA verweilen (Orphanides et al., 1996; Roeder, 1996). Die Phosphorylierung der CTD der RNAP II durch TFIIH wird durch TFIIE (Lu et al., 1992; Ohkuma et al., 1995) und durch den Mediator-Komplex stimuliert, wobei der Mediator mit der CTD der RNAP II interagiert (Kim et al., 1994; Myers et al., 1998). Dies führt in einigen Arbeitsgruppen zu der Interpretation, dass der Mediator zu der basalen Transkriptionsmaschinerie der RNAP II gehört (Gustafsson und Samuelsson, 2001; Woychik und Hampsey, 2002).

In vivo nimmt man an, dass ein Holo-Enzym-Komplex (Abb. 4a), welcher in Abhängigkeit der Reinigungsmethoden die RNAP II, TFIIF bzw. TFIIB, TFIIF und TFIIH sowie den Mediator-Komplex als auch weitere Coaktivatoren beinhaltet in einem Schritt an die Promotor-DNA bindet (Kim et al., 1994; Thompson und Young, 1995; Halle und Meisterernst, 1996; Greenblatt, 1997; Myer und Young, 1998; Myers et al., 1998; Ranish et al., 1999). Hierbei bindet erst TFIID an der Promotor DNA und dann erfolgt die Bindung des Holo-Enzyms, die durch Aktivatoren stimuliert wird.

1.2.2.1 Der Core-Promotor der RNA-Polymerase II in Pflanzen

Die in dem Abschnitt 1.2.2 beschriebene basale Transkriptionsmaschinerie ist auch wesentlicher Bestandteil der Transkription der mRNA-Gene durch die RNAP II pflanzlicher

Zellen, die im Vergleich zu anderen eukaryontischen Zellen wie Hefe-, tierischen oder humanen Zellen eher selten untersucht worden sind (Kuhlemeier, 1992; Sugiura, 1997; Singh, 1998). Die große Sequenzhomologie der UEs der RNAP II verschiedener eukaryontischer Organismen (Woychik, 1998) als auch die funktionale Konservierung der TATA-Box, untersucht in N. tabacum, Drosophila melanogaster und in HeLa in vitro-Systemen, weisen auf evolutionäre Konservierung der basalen Transkriptionsmaschinerie der RNAP II in Eukaryonten hin (Yamaguchi et al., 1998). Ackerman et al. (1987) ist es gelungen verschiedene Proteinfraktionen aus Weizenkeimen zu isolieren, die GTFs enthielten. So konnte für TFIIA aus Weizen die gleiche Funktion wie für die des humanen TFIIA an pflanzlichen und viralen Promotoren gezeigt werden (Burke et al., 1990). Außerdem wurde u. a. die Kristallstruktur des TBP aus A. thaliana, sowie die Bildung des Komplexes aus dem humanen TFIIB mit dem TBP aus A. thaliana, gebunden an die TATA-Box des Adenovirus Major Late Promotor (AdMLP), durch Röntgenstrukturanalysen untersucht (Nikolov et al., 1992; 1995). Schon Gasch et al. (1990) haben bei der Entdeckung zweier Gene für das TBP aus A. thaliana nachweisen können, dass beide Proteine an die Promotor-DNA des AdMLP binden und damit dass humane TBP ersetzen können, um die basale Transkription in vitro zu aktivieren. Auch in Mais wurden zwei Gene, welche für TBPs kodieren, entdeckt. Diese TBPs führten zu unterschiedlichen Expressionsmustern und regulieren vermutlich unterschiedliche zellspezifische Funktionen (Haass und Feix, 1992; Vogel et al., 1993). Die Arbeitsgruppen stellten eine starke Konservierung der CTD der TBPs aus Hefe und A. thaliana bzw. Z. mays fest. Weiterhin konnte in Untersuchungen mit verschiedenen 5´-upstream-Fragmenten des Phenylalanin-Ammonium-Lyase Promotors aus Reis gezeigt werden, dass ein Minimalpromotor, welcher die TATA-Box und den Inr beinhaltet, für die korrekte basale Transkription verantwortlich ist (Zhu et al., 1995).

Die Konsensus Sequenzen der pflanzlichen Promotor-Regionen wurden durch den Vergleich von 79 publizierten genomischen DNA-Sequenzen höherer Pflanzen ermittelt (Joshi, 1987). Hierbei lag die TATA-Box mit der Konsensus Sequenz TATATATA 32 ± 7 nt stromaufwärts von der Transkriptionsinitiationsstelle, wobei die ersten vier Nukleotide und das Adenin an Position sechs mit 90 – 97 % am stärksten konserviert waren. Die Konsensus Sequenz des Inr wurde mit TCA+1TCA beschrieben. Ein Adenin war in 85 % der untersuchten pflanzlichen Promotoren Transkriptionsinitiationsstelle. Die Analyse der Konsensus Sequenz der pflanzlichen TATA-Box unterscheidet sich nicht von der vorher beschriebenen TATA-Box mit der Konsensus Sequenz TATA(A/T)A(A/T) (Breathnach und Chambon, 1981; Bucher und Trifonov, 1986; Bucher, 1990). Die pflanzliche Konsensus Sequenz des Inr zeigt

eine weniger starke Homologie zu der Konsensus Sequenz PyPyA+1N(A/T)PyPy aus Säugerzellen (Javahery et al., 1994).

Auch in Pflanzen sind in vivo weitere cis-regulierende Elemente notwendig, die Bindungsstellen für Aktivatoren als auch Repressoren darstellen und somit die basale Transkription ausgehend von dem Core-Promotor verstärken, abschwächen und regulieren können.

1.2.3 Transkriptionsinitiation in Plastiden

An der Transkription in den Plastiden höherer, photosynthetischer Pflanzen sind zwei verschiedene RNA-Polymerasen, die PEP (`plastid-encoded plastid RNA polymerase´) und die NEP (`nuclear-encoded plastid RNA polymerase´) beteiligt (Maliga, 1998; Hess und Börner, 1999).

Die PEP, welche der RNAP aus Eubakterien sehr ähnlich ist, initiiert die Transkription an einem demσ70-Typ ähnlichen Promotor (Allison, 2000). Das PEP Core-Enzym setzt sich aus den UEs zusammen, die von den Genen rpoA (α-UE), rpoB (β-UE), rpoC1 (β´-UE) und rpoC2 (β´´-UE) des Plastidgenoms exprimiert werden. Es wird als α2ββ´β´´ beschrieben, wobei die β´- und die β´´-UE äquivalent dem N- und C-Terminus der β´-UE des Core-Enzyms der bakteriellen RNAP sind (Hu und Bogorad, 1990; Hu et al., 1991; Igloi und Kössel, 1992; Suguira, 1992). In Plastiden aus Sinapis alba L. hat man neben der eben beschriebenen PEP (PEP-B) eine komplexere Form mit mindestens 13 Polypeptiden der PEP (PEP-A) nachweisen können. Hierbei konnte PEP-B in Etioplasten von im Dunkeln gewachsenen Senf-Sämlingen und PEP-A in Chloroplasten von grünen Senf-Sämlingen nachgewiesen werden. Beide Enzyme binden in vitro unter verschiedenen Voraussetzungen an identische Promotorstrukturen und transkribieren dieselben Gene (Pfannschmidt und Link, 1994; 1997). Durch Sequenzierung der N-Termini der beiden größten UEs der PEP-A (110 kDa, 141 kDa) konnte festgestellt werden, dass diese identisch mit den Genprodukten von rpoB und rpoC2 der PEP-B aus S. alba sind (Pfannschmidt et al., 2000). Somit wird angenommen, dass PEP-A und PEP-B das gleiche Core-Enzym besitzen, jedoch in Etioplasten bzw. Chloroplasten zusätzlich unterschiedliche Komponenten binden. Die Komplexität des Core-Enzyms hängt wahrscheinlich von dem Entwicklungsstadium des Chloroplasten ab (Link, 1996, Pfannschmidt et al., 2000). Eine PEP, welche in Abhängigkeit von dem Entwicklungsstadium in bezug auf Promotorselektivität und Lichtabhängigkeit variiert, konnte außerdem in Weizen nachgewiesen werden (Satoh et al., 1999).

Für die Promotorerkennung der PEP sind höchstwahrscheinlich sogenannte σ-ähnliche Faktoren (`sigma-like factors´, SLF) verantwortlich (Allison, 2000; Hakimi et al., 2000). Aus den Etioplasten und Chloroplasten von Senf konnten drei SLFs mit Größen von 67, 52 und 29 kDa isoliert werden (Tiller et al., 1991; Tiller und Link, 1993). Nachdem sich die Annahme bestätigte, dass die SLFs im Zellkern kodiert werden, fand man Sequenzen mit Homologien zu den bakteriellen σ-Faktoren, welche als cDNAs kloniert wurden. Somit sind heutzutage die Sequenzen einer großen Anzahl von SLFs aus z. B. Arabidopsis (Isono et al., 1997; Tanaka et al., 1997; Yao uns Allison, 1998; Kanamaru et al., 1999; Fujiwara et al., 2000), Mais (Tan und Troxler, 1999; Lahiri et al., 1999), Reis (Tozawa et al., 1998) und Senf (Kestermann et al., 1998) bekannt.

Die Promotorstruktur, welche von dem PEP Holo-Enzym erkannt wird, beinhaltet die für die Eubakterien bekannten –35- (TTGACA) und –10- (TATAAT) Konsensus Sequenz Elemente (Abb. 5a). Allerdings ist in den PEP Promotoren das TTG des –35-Sequenz Elements hochkonserviert, wo hingegen das –10-Sequenz Element mit TANNNT weniger stark konserviert ist. Der optimale Abstand der beiden Konsensus Sequenzen voneinander liegt hier bei 18 ± 1 nt, der optimale Abstand der –10-Region zum Transkriptionsstart liegt bei 6 ± 1 nt (Gruissem und Tonkyn, 1993; Link, 1994). Die Transkriptionsaktivität einiger PEPs ist von im Zellkern gebildeten Transkriptionsfaktoren abhängig, welche mit upstream-Elementen des Promotors interagieren (Sun et al., 1989; Iratni et al., 1994; Allison und Maliga, 1995; Kim und Mullet, 1995).

Die zweite RNA-Polymerase, die NEP wurde erstmalig von Morden et al. im Jahre 1991 beschrieben. Bei der Sequenzierung des Plastoms des nicht-photosynthetischen Organismus Epifagus virginiana konnten keine funktionalen rpo-Geneidentifiziert werden. Die NEP wird im Zellkern der Pflanzenzellen kodiert und besteht aus einer einzigen UE, welche für ein T7 Bakteriophagen-ähnliches Enzym kodiert (Lerbs-Mache, 1993). Das Gen, welche für diese RNAP kodiert, wurde bisher in Chenopodium album (Weihe et al., 1997), A. thaliana (Hedtke et al., 1997; 1999), N. tabacum (Hedtke et al., 2002), Z. mays (Young et al., 1998; Chang et al., 1999) und Triticum aestivum (Ikeda und Gray, 1999) identifiziert. Das nukleäre Genom von A. thaliana enthält drei Gene, welche für Bakteriophagen-ähnliche RNAPs (RpoT;1, RpoT;2, RpoT;3) kodieren (Hedtke et al., 1997; 1999; 2000) und in N. tabacum liegen sogar zwei orthologe Sets dieser drei Gene vor (Hedtke et al., 2002). RpoT;1 kodiert hierbei für die RNAP, welche in den Mitochondrien aktiv ist und das RpoT;3-Genprodukt ist in den Chloroplasten aktiv (Hedtke et al., 1997; 1999). Für das RpoT;2-Genprodukt aus A. thaliana und N. tabacum konnte festgestellt werden, dass dieses sowohl in Mitochondrien als auch in

Chloroplasten zu finden ist und vermutlich die Gene beider Genome transkribiert (Hedtke et al., 2000; 2002). Somit wurden für die Plastiden von A. thaliana und N. tabacum zwei verschiedene nukleär kodierte Bakteriophagen-ähnliche RNAPs beschrieben.

Der Sequenzvergleich von NEP-Promotoren aus den Plastomen von Monokotyledonen ergab zwei konservierte Boxen (Abb. 5b). Eine Box (YRT-Box) erstreckt sich um die Transkriptionsinitiationsstelle mit der Konsensus-Sequenz YATAGAATAA, wobei das YATA-Motiv am stärksten konserviert ist. Eine weitere Box (GAA-Box) mit demselben verkürzten Motiv ATAGAAT, jedoch mit der stärksten Konservierung der Sequenz GAAT, befindet sich 9-12 nt stromaufwärts der YRT-Box (Silhavy und Maliga, 1998; Hübschmann und Börner, 1998; Hess und Börner, 1999; Weihe und Börner, 1999). Der Sequenzvergleich von NEP-Promotoren aus dem Plastom von N. tabacum weist ein ähnliches Boxen-Motiv auf. Die Konsensus Sequenz der YRT-Box wird mit der Sequenz ATAGAATRAA um die Transkriptionsinitiationsstelle beschrieben (Hajdukiewicz et al., 1997; Miyagi et al., 1998; Hess und Börner, 1999; Weihe und Börner, 1999; Kapoor und Sugiura, 1999). Die GAA-Box mit der Sequenz ATAWGAA liegt hier ca. 20 nt stromaufwärts der YRT-Box. Die Analyse des rpoB Promotors aus N. tabacum ergab, dass die Funktion und Stärke des Promotors von einer Sequenz 15 nt stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle (-14 bis +1) abhängt. Diese Sequenz beinhaltet ebenfalls ein YATA-Motiv (-8 bis –5), wobei die Nukleotide CAT an den Positionen -8 bis –6 am stärksten konserviert sind (Liere und Maliga, 1999a). Eine Sequenz mit dem GAAT-Motiv (-21 bis -18) liegt nur 9 nt stromaufwärts des YATA-Motivs des rpoB Promotors und beeinflusst nach der Analyse von Liere und Maliga (1999a) die RNAP-Aktivität nur sehr gering. Die Funktion und Stärke des accD Promotors wiederum hängt von einer Sequenz mit 19 nt (–17 bis +2) ab. Auch dieser Promotor beinhaltet das YATA-Motiv (-9 bis –6) mit TAT an den Positionen –9 bis –7 (Liere und Maliga, 1999a; 1999b), jedoch keine GAA-Box. Die analysierten Promotorregionen des rpoB als auch der accD Promotor aus N. tabacum weisen auf keine weiteren cis-regulatorischen Elemente hin (Liere und Maliga, 1999a; 1999b). Andere NEP-Promotoren wie der rpoB Promotor aus dem Mais (Silhavy und Maliga, 1998) und der clpP-511 Promotor aus dem Tabak (Hajdukiewicz et al., 1997)weisen auch nur die YRT-Box auf (Abb. 5b). Weiterhin wurden auch NEP-Promotoren beschrieben wie der clpP-53 Promotor aus Tabak, deren Sequenzaufbau sich vollkommen von den ermittelten Konsensus Sequenzen unterscheidet (Abb. 5b; Sriraman et al., 1998). Hier stellt sich die Frage, ob dieser Promotor nur von einer modifizierten Form der NEP oder nicht doch von einer anderen RNAP erkannt wird (Kapoor und Sugiura, 1999). Für die Transkription der Gene des rrn-Operons in den Plastiden von Spinat wird sogar

angenommen, dass neben den beiden beschriebenen Polymerasen (PEP, NEP) noch eine weitere nukleär kodierte RNAP verantwortlich ist (Iratni et al., 1997; Bligny et al., 2000).

Abb. 5 : Schematische Darstellung der Promotorregionen, welche von den verschiedenen Plastiden Polymerasen zur Transkriptionsinitiation genutzt werden (modifiziert nach Weihe und Börner, 1999). a σ70 -Typ ähnlicher Promotor der PEP mit den –35- und –10-Konsensus Sequenzen. b Drei Typen von Promotorregionen, die von den verschiedenen NEPs zur Transkriptionsinitiation genutzt werden (Weihe und Börner, 1999). Eine Promotorregion weist das charakteristische YRT-Motiv innerhalb einer AT-reichen Sequenz auf. Daneben gibt es NEP-Promotoren, welche sowohl die YRT-Box als auch 9 bis 20 nt stromaufwärts eine weitere Box mit dem hochkonserviertem GAA-Motiv enthalten. Andere NEP-Promotoren weisen keine der beiden beschriebenen Motive auf. Der Transkriptionsstart wurde durch einen Pfeil dargestellt.

In den Plastid-Genen oder –Operons werden drei Gen-Klassen unterschieden: Zur Gen-Klasse I gehören Gene oder Operons, welche von PEP Promotoren aus transkribiert werden. Dies sind vor allem die Plastid-Gene des Photosystem I und II. Die Gene oder Operons der Gen-Klassen II besitzen sowohl PEP als auch NEP Promotoren. Hierzu gehören Operons, welche Haushaltsgene mit Genen der Photosynthese vereinen oder auch nur Haushaltsgene beinhalten. Die Gene oder Operons der Gen-Klasse III, die nur NEP Promotoren zur Transkription der Haushaltsgene besitzen sind eher selten (Hajdukiewicz et al., 1997).

Allgemein anerkannt ist die Meinung, dass PEP und NEP in bestimmten Wachstumsphasen der Plastiden aktiv sind. Die NEP ist hierbei aktiv bei der Expression der Haushaltsgene in den nicht differenzierten Proplastiden. Bei der Weiterentwicklung zu Chloroplasten übernimmt dann überwiegend die PEP die Expression der Haushaltsgene und exprimiert weiterhin die Gene, welche für den photosynthetischen Apparat benötigt werden

(Hajdukiewicz et al., 1997; Maliga, 1998). Desweiteren transkribiert die NEP Gene der Plastiden in nicht-grünem Gewebe und Gene, welche in metabolischen Synthesewegen involviert sind wie z. B. die Gene der Biosynthese von Aminosäuren und Fettsäuren (Hess und Börner, 1999). Ein Beispiel des Zusammenspiels von NEP und PEP ist in der Abb. 6 dargestellt. Die unterschiedlichen Promotoren der NEP und PEP, welche durch die entsprechenden Enzyme erkannt werden, ermöglichen die Abgrenzung der Aufgaben der jeweiligen RNAP.

Abb. 6 : Spezifität und Funktion der NEP bzw. PEP (Hess und Börner, 1999). Die NEP, welche aus einer einzigen UE besteht, transkribiert mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren (TF) z. B. die Gene rpo A, rpo B, rpo C1 und rpo C2 der PEP. Die PEP wiederum erkennt mit Hilfe des σ-Faktors die für Eubakterien-ähnlichen –35- und –10-Konsensus Sequenzen der Promotoren der Gene rbc L und psb A.

1.3 In der vorliegenden Arbeit untersuchte Promotoren

In dieser Arbeit wurden zwölf pflanzenspezifische Promotoren (Tab. 3) auf ihre Expression in Eubakterien untersucht. Diese pflanzenspezifischen Promotoren werden zur Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen genutzt und stammten aus den Arbeitgruppen von Prof. Dr. U. Sonnewald (Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben) und Prof. Dr. B. Müller-Röber (Max-Plank-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Golm).

Weiterhin wurden drei bakterielle und sechs Plastiden Promotoren (Tab. 3) auf ihre Expression in N. tabacum untersucht. Die untersuchten bakteriellen Promotoren werden bei der Herstellung transgener Pflanzen in das Pflanzengenom integriert. Die Untersuchung der Plastiden Promotoren in Eukaryonten ist aus evolutionsbiologischer Sicht interessant, da sich nach heutigem Kenntnisstand Plastiden wie auch Mitochondrien aus Eubakterien-ähnlichem Endosymbionten entwickelten (Gray, 1993; 1999). Die Plastiden Promotoren wurden von Dr. K. Liere (Humboldt Universität, Berlin) zur Verfügung gestellt.

Tab. 3 : Untersuchte pflanzenspezifische, bakterielle und Plastiden Promotoren.

Promotor (P)

Herkunft und Eigenschaften

P 35S

35S Promotor des CaMV (Frank et al., 1980; Odell et al., 1985). Pflanzenspezifischer Promotor mit konstitutiver bzw. gewebsspezifischer Wirkung in Blättern und Wurzeln (Benfay und Chua, 1990).

P B33

Klasse 1 Patatin-Gen aus S. tuberosum var. Berolina (Rocha-Sosa et al., 1989). Der Promotor vermittelt eine knollenspezifische Expression, die durch Saccharose induzierbar ist (Liu et al., 1990).

P ST-LS1

Das ST-LS1-Gen ist ein `single copy´ Gen aus S. tuberosum. Das 10 kDa große Protein wird als Komponente des Sauerstoff-bildenden Komplexes des Photosystems II in Chloroplasten-haltigen Zellen gebildet (Eckes et al., 1986; Stockhaus et al., 1989a). Der Core-Promotor (-130 bis +11) führt zu keiner detektierbaren Expression des fusionierten Reportergens in Tabak. Hingegen führt die Promotorregion von –334 bis +11 zu einer blatt-, stammspezifischen und lichtinduzierbaren Expression, jedoch mit einem Drittel des Expressionsniveaus des vollständigen Promotors (-1600 bis +11). Dies ist auf das Vorhandensein von positiv regulierenden Elementen in der Region von –530 bis –261 zurückzuführen (Stockhaus et al., 1987; 1989b).

P RolC

Das rolC-Gen stammt aus dem Ri-Plasmid von Agrobacterium rhizogenes und induziert mit den weiteren Genen des `root locus´ (rol) in Pflanzen die `hairy root desease´ (White et al., 1985; Slightom et al., 1986). Der pflanzenspezifische Promotor führt in transgenem Tabak und Reis zu einer Expression in Phloemzellen (Schmülling et al., 1989; Matsuki et al., 1989; Sugaya und Uchimaya, 1992). In transgenen Kartoffeln führt der Promotor neben der Expression in Phloemzellen auch zu einer Expression im vaskulärem Parenchym (Graham et al., 1997). Die Expression wird in transgenen Tabakpflanzen durch Saccharose induziert (Yokoyama et al., 1994).

P 130

Alkoholdehydrogenase-Gen aus N. tabacum var. Samsum. Der Promotor wird im Leitgewebe induziert (persönliche Mitteilung G. Mönke, IPK Gatersleben).

P 247

Gen kodiert für ein caldomulin-ähnliches Protein in N. tabacum zur Calcium-Bindung und wird im Cytosol von spezifischen Mesophyllzellen exprimiert (persönliche Mitteilung G. Mönke, IPK Gatersleben).

P FBP

Gen, welches für die cytoplasmatische Fruktose-1,6-bisphosphatase in S. tuberosum (L. cv. Désirée) kodiert. Expression in Mesophyllzellen, jedoch nicht an Chloroplasten gebunden. Untersuchung von zwei verschieden großen Promotorfragmenten mit 1,7 und 1,1 kbp, welche sich wahrscheinlich durch die Anwesenheit eines gewebsspezifischen Enhancers unterscheiden (persönliche Mitteilung M. Ebnet, IPK Gatersleben).

P Nos

Nopalin-Synthase Gen aus dem Ti-Plasmid aus A. tumefaciens. Für die maximale Genexpression werden 88 bp des Promotors benötigt, welche die CAAT- und die TATA-Box beinhalten (Shaw et al., 1984). Die Expressionseigenschaft des Promotors wird unterschiedlich als konstitutiv (Herrera-Estrella et al., 1984) bzw. temporal, organspezifisch vor allem im Wurzelsystem von Pflanzen (Ha und An, 1989) beschrieben.

P SKT2

Gen kodiert für einen einwärts gleichrichtenden Kaliumkanal in S. tuberosum (L. cv. Désirée; Erhardt et al. , 1997). Der Promotor vermittelt selektive Expression in Xylem-Parenchymzellen (persönliche Mitteilung N. Weigmann, MPI-MP Golm).

P KST1

Gen kodiert für einen einwärts gleichrichtenden Kaliumkanal in S. tuberosum (Müller-Röber et al., 1995; Zimmermann et al., 2001). Der Promotor vermittelt selektive Expression in Schließzellen und in der Blütenbasis (Plesch et al., 2001).

P KCO1

Gen kodiert für einen auswärts gleichrichtenden Kaliumkanal in A. thaliana (Czempinski et al., 1997; Schönknecht et al., 2002). Der Promotor vermittelt Expression in verschiedenen Geweben der Pflanze, einschließlich Blättern, Schließzellen, Blüten und Wurzeln (persönliche Mitteilung K. Czempinski, MPI-MP Golm).

P Lac

Promotor des lac -Operons aus E. coli (Jacob et al. , 1964; Dickson et al. , 1975). Die Expression des lac-Operons wird durch Laktose induziert. Das Operon unterliegt einer positiven und negativen Kontrolle. Die negative Kontrolle erfolgt durch die Bindung des Repressorproteins an den Operator. Die Transkription erfolgt jedoch nur nach Bindung des CRP (`Cyclic AMP Receptor Protein´) an den Promotor (positive Kontrolle).

P NptIII

Das nptIII-Gen stammt aus pJH1 aus Streptococcus faecalis und verleiht Kanamycinresistenz (Trieu-Cout und Courvalin, 1983).

P Bla

Promotor der Tem1 β-Lactamase (bla) des Tn3 aus E. coli. Das Gen verleiht Ampicillinresistenz (Wishart et al., 1983).

P RbcL

Gen kodiert für die große UE der Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase (Shinozaki und Sugiura, 1982a; 1982b). Der Promotor stammt aus dem Chloroplasten von N. tabacum und wird von der PEP erkannt. Für die volle Promotoraktivität wird nur der Core-Promotor benötigt. Die Transkriptmenge ist lichtunabhängig (Allison et al., 1996; Shiina et al., 1998).

P PsbA

Gen kodiert für das 32 kDa D1 Polypeptid des reaktiven Zentrums des Photosystems II (Shinozaki et al., 1986). Der Promotor stammt aus dem Chloroplasten von N. tabacum, ist lichtinduzierbar und wird von der PEP erkannt (Staub und Maliga, 1994; Allison et al., 1996). Die Sequenz beinhaltet eine `extended -10-Region´, welche in den höheren Pflanzen hochkonserviert ist (Satoh et al., 1999).

P ClpP

Gen kodiert für die proteolytische UE der ATP-abhängigen Clp Protease (Maurizi et al., 1990; Shikanai et al., 2001). Der Promotor stammt aus dem Chloroplasten von N. tabacum und wird sowohl von der PEP (PclpP-95) als auch von der NEP (PclpP-53) zur Transkriptionsinitiation genutzt (Hajdukiewicz et al., 1997; Sriraman et al., 1998).

P AtpB

Gen kodiert für die β-UE der ATPase (Shinozaki et al., 1986; Orozco et al., 1990). Der Promotor stammt aus dem Chloroplasten von N. tabacum und wird sowohl von der PEP als auch von der NEP erkannt (Hajdukiewicz et al., 1997; Kapoor et al., 1997; Kapoor und Sugiura, 1999).

P AccD

Gen kodiert für eine UE der Acetyl-CoA Carboxylase (Sasaki et al., 1993). Der Promotor stammt aus dem Chloroplasten von N. tabacum und wird von der NEP erkannt (Hajdukiewicz et al., 1997; Liere und Maliga, 1999b).

P RpoB

Gen kodiert für die β-UE der PEP (Shinozaki et al., 1986; Ohme et al., 1986). Der Promotor stammt aus dem Chloroplasten von N. tabacum und wird von der NEP erkannt (Allison et al., 1996; Serino und Maliga, 1998; Liere und Maliga, 1999a).

1.4 Ziel der Arbeit

Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Spezifität von Promotorsequenzen untersucht werden. Hierfür sollte eine Auswahl von pflanzenspezifischen Promotoren, die in der Gentechnik zur Herstellung von transgenen Pflanzen eingesetzt werden, auf Genexpression in Bakterien untersucht werden. Desweiteren sollten bakterielle und Plastiden Promotoren auf Expression in Pflanzen untersucht werden. Neben der Fragestellung, welche Promotoren zu einer Expression nachgeschalteter Gene führen können, sollte untersucht werden, welches Ausmaß diese Genexpression annehmen kann.

Weiterhin sollte der Fragestellung nachgegangen werden, ob mit einer Computer-gestützten Suche nach potentiellen eukaryontischen bzw. prokaryontischen Konsensus Sequenzen in den Sequenzen der verwendeten Promotoren eine Aussage darüber getroffen werden kann, ob und mit welchen Ausmaß die heterologe Expression der nachgeschalteten Gene erfolgt.

Im Falle einer Genexpression sollten die Transkripte der jeweiligen Promotoren durch Transkriptionsstartanalyse und Northern Hybridisierung näher charakterisiert werden. Es sollte die Möglichkeit geprüft werden, ob optimierte Vektoren mit Promotoren, welche nur in dem Zielorganismus zu der gewünschten Expression führen, hergestellt werden können.

Diese Ergebnisse sollen einen Beitrag zur Bewertung der biologischen Sicherheit beim Einsatz gentechnisch veränderter Organismen liefern, da sie einen Aspekt der Risikobewertung, nämlich die Möglichkeit der Expression der übertragenen Gene in andere Organismengruppen, beleuchten.


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16.02.2004