2 Material und Methoden

Alle Chemikalien wurden, soweit nicht anders aufgeführt, von Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma-Aldrich (Steinheim) bezogen.

Tab. 4 : Verwendete Enzyme und Kits

Die in der Arbeit verwendeten Bakterienstämme und deren genotypischen Eigenschaften sind in Tab. 5 dargestellt.

Tab. 5 : Verwendete Bakterienstämme

Die Bakterienstämme wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von: ^a J. Schiemann, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft Braunschweig; ^b Stammsammlung der Technischen Fachhochschule, Berlin

Die in Tab. 6 aufgeführten Vektoren dienten der Klonierung der zu untersuchenden Promotoren (pBin19, pBi101.2, pKK232-8) oder der Klonierung der 5´-RACE Produkte (pLitmus28).

Tab. 6 : Klonierungsvektoren

Die in Tab. 7 aufgeführten Plasmide sind im Rahmen der Diplomarbeit (Jacob, 1997) an der Technischen Fachhochschule zu Berlin entstanden. Sie wurden zur Lumineszenzmessung und für weitergehende Untersuchungen in die Arbeit mit einbezogen.

Tab. 7 : Vorhandene Promotorkonstrukte

Die in Tab. 8 beschriebenen Promotoren wurden entweder mittels PCR und sequenzspezifischen Primern amplifiziert und kloniert oder direkt durch DNA-Restriktion der Promotorderivate gewonnen und in die entsprechenden Vektoren kloniert. Zur Untersuchung der Expressionsstärke der pflanzlichen Promotoren in Bakterien wurden die promotorlosen luxAB-Gene aus V. harveyi als Reportergene eingesetzt.

Tab. 8 : Promotorderivate, Reportergene

Die Plasmide wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von: ^a G. Mönke, Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Gatersleben; ^b M. Ebnet, IPK Gatersleben; ^c N. Weigmann, Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie (MPI-MP) Golm; ^d T. Ehrhardt, MPI-MP Golm; ^e K. Czempinski, MPI-MP Golm; ^f K. Liere, Humboldt Universität Berlin

Die Expressionseigenschaften ausgewählter Promotoren in der Pflanze wurden in N. tabacum cv. Samsun NNüberprüft.

E. coli, Y. enterocolitica, P. putida und Acinetobacter sp. BD413 wurden auf LB-Medium (Sambrook et al., 1989) und A. tumefaciens auf TY-Medium (Beringer, 1974) angezogen. Die Inkubation der mit Yersinien, Pseudomonaden, Acinetobacter und Agrobakterien beimpften Agarplatten erfolgte 24 bis 48 h bei 28 °C, bei E. coli über Nacht bei 37 °C. Flüssigkulturen wurden unter den genannten Bedingungen bei 180 bis 200 rpm geschüttelt.

Zur selektiven Anzucht der Bakterienstämme, die ein Antibiotikumresistenzgen besaßen, wurden folgende Antibiotikumkonzentrationen in die jeweiligen Medien gegeben:

Alle Stämme wurden mit Hilfe des Cryobank™-Systems (Mast Diagnostica) archiviert. Die Bakterienkulturen sind bei diesem System an Keramikkügelchen gebunden und werden bei –20 °C und –75 °C gelagert. Die Archivierung erfolgte entsprechend dem Protokoll der Herstellerfirma. Die Anzucht der Stämme erfolgte durch den Verdünnungsausstrich einer Keramikkugel auf LB- bzw. TY-Agarplatten mit dem entsprechendem Antibiotikumzusatz und deren Kultivierung bei 28 °C bzw. 37 °C.

Die Primer wurden lyophilisiert bezogen und mit Wasser für molekulargenetische Zwecke zu einer Stammlösung gelöst. Von dieser Stammlösung wurden Arbeitsverdünnungenmit 30 ng/µl hergestellt.

Die Primer sind in den Tab. 9 bis Tab. 16 aufgeführt. Vorhandene Restriktionsschnittstellen der Primer wurden in den Sequenzen kursiv dargestellt.

Material und Methoden 34

Tab. 9 : Verwendete Primer zur Herstellung des Nos-, KST1- und KCO1-Promotors. Die Lokalisationen der Primer des Nos-Promotors beziehen sich auf die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365), bei dem KCO1-Promotor auf die DNA-Sequenz mit der Acc. # Y07825 und bei dem KST1-Promotor auf die DNA-Sequenz mit der Acc. # AJ242852 (2-KST1-S) und die DNA-Sequenz des Vektors pBi101 mit der Acc. # U12639 (KST-AS).

Tab. 10 : Verwendete Primer zur Herstellung der Promotoren von npt III und bla . Die Lokalisationen der Primer des NptIII-Promotors beziehen sich auf die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365) und die des Bla-Promotors auf die DNA-Sequenz des Vektors pKK232-8 (Acc. # U13859).

Material und Methoden 35

Tab. 11 : Verw endete Primer zur Herstellung der Chloroplasten Promotoren. Die Lokalisation bezieht sich auf die Chloroplasten-DNA aus N. tabacum (Acc. # Z00044).

Material und Methoden 36

Für die 5´-RACE wurden die im Kit (Life Technologies) mitgelieferten Anker- und `Abridged Universal Amplification Primer´ (AAP, AUAP) verwendet. Die genspezifischen Primer (GSP) sind analog Sequenzabschnitten aus dem luxA-Gens aus V. harveyi und dem cat-Gen des Vektors pKK232-8.

Tab. 12 : Verwendete Primer zur Bestimmung der Transkriptionsstarts mittels 5´-RACE. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961) und des cat-Gens des Vektors pKK232-8 (Acc. # U13859). * I = Inosin. Inosin dient der Erniedrigung der Schmelztemperatur des Primers.

Material und Methoden 37

Tab. 13 : Verwendete Primer zum Einfügen von Basenaustauschen in den ST-LS1-Promotor. Die Lokalisation bezieht sich auf die Promotor-Sequenz des ST-LS1-Gens aus S. tuberosum (Acc. # X04753), sowie die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961) und die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365).

* Basenaustausche gegenüber der Originalsequenz sind rot eingezeichnet.

Die Taq^®Man-Oligonukleotid-Sonde als auch die Primer der Tab. 14 binden auf einem Sequenzabschnitt des luxB-Gens aus V. harveyi und wurden für die quantitative RT-PCR eingesetzt.

Tab. 14 : Verwendete Primer zur Herstellung quantitativer PCR-Produkte. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961). * F : 6-Carboxy-Fluorescein (Fam); T : 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (Tamra = Quencher).

Die Sonde für die Northern Hybridisierung ist einem 400 bp Sequenzabschnitt auf dem luxA-Gen von V. harveyi homolog. Sie wurde mittels PCR und durch die in Tab. 15 aufgelisteten Primern hergestellt.

Tab. 15 : Verwendete Primer zur Sondenherstellung. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961).

Material und Methoden 39

Tab. 16 : Verwendete Primer zur Sequenzierung und für die Direkt-PCR. Die Lokalisation bezieht sich auf die angegebene DNA-Sequenz der Acc. #.

Zur Überprüfung erfolgreicher Klonierungen in E. coli und zur DNA-Sequenzierung wurden Plasmidisolierungen mit dem NucleoSpin®Plus-Kit (Clontech) durchgeführt. Hierfür wurden die zu untersuchenden Zellen in 2 bis 10 ml LB-Medium mit dem jeweiligen Antibiotikum-Zusatz über Nacht bei 37 °C und 200 rpm kultiviert. Entsprechend dem NucleoSpin®Plus-Kit Protokoll wurden dann die Plasmide von den Kulturen isoliert.

Die Plasmidisolierungsmethode mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) wurde bei Benötigung großer Mengen von Plasmid-DNA aus E. coli vorgenommen. Hierfür wurden die Zellen mit den jeweiligen zu isolierenden Plasmiden je nach Kopienzahl in 100 bis 500 ml LB-Medium mit Antibiotikum-Zusatz über Nacht bei 37 °C und 200 rpm kultiviert. Von diesen Flüssigkulturen wurden dann nach den Angaben des Herstellers die Plasmide isoliert.

Die Plasmidisolierung mittels CsCl-Dichtegradientenzentrifugation (Sambrook et al., 1989) wurde angewandt zur Gewinnung hochreiner, konzentrierter Plasmide der ccc-Form. Diese Methode der Plasmidisolierung erfolgte für Plasmide, die für das Partikelbombardement eingesetzt wurden. Die Anzucht der Kulturen erfolgte wie beschrieben bei der Plasmidisolierungsmethode nach QIAGEN.

Die Aufreinigung von Plasmid-DNA z. B. nach Restriktionsverdau erfolgte bei den pBin-Konstrukten mit Phenol-Chloroform und anschließender Fällung mit Isopropanol (Sambrook et al., 1989).

Bei Plasmiden, deren Gesamtgröße kleiner als 10 kbp war, wurde die DNA-Reinigung mit dem Wizard™ DNA Clean-Up System (Promega) durchgeführt. Die Reinigung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers, wobei die DNA nach der Elution in Aqua bidest. vorlag.

Zur Klonierung gezielter DNA-Fragmente wurden Restriktionsverdaus elektrophoretisch im Agarosegel aufgetrennt und die entsprechende DNA-Bande aus dem Gel mit dem QIAquick™ Gel Extraktion Kit (Qiagen) nach den Angaben des Herstellers eluiert. Dieses Kit eignet sich nur zur Eluierung von DNA-Fragmenten der Größe 100 bis 10000 bp. Die DNA lag nach der Elution in Aqua bidest. vor.

DNA-Fragmente der Größe von 100 bis 10000 bp, die mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt wurden, wurden durch das QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers.

Die DNA-Konzentration wurde fluorometrisch mit dem DyNA Quant 200-Fluorometer (Hoefer - Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg) bestimmt. Diese Messung wird weder durch vorhandene RNA- noch Proteinverunreinigungen gestört. Die hochspezifische Erfassung der DNA erfolgt mit einem Farbstoff (Hoechst-Dye Solution 33258 Stammlösung, Frankfurt a. M.), der sich in die kleinen Furchen der DNA-Helix einlagert. Die DNA-Konzentrationsmessung erfolgte, nach Kalibrierung des Gerätes mit einem Standard, nach den Angaben des Herstellers.

Die Agarose-Gelelektrophorese erfolgte in Horizontalelektrophorese-Apparaturen (GIBCO BRL, Life Technologies, Eggenstein; Biometra, Göttingen). Je nach Anforderung wurden 0,8 bis 2,0 %ige Agarosegele eingesetzt. Den Gelen wurde zur Detektion der aufgetrennten DNA-Fragmente 5 µl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) zu 100 ml Agarose-Lösung zugegeben. Als Laufpuffer wurde 1x TBE-Puffer (100 mM Tris-HCl; 100 mM Borsäure; 1 mM EDTA, pH 8,0) verwendet. Die Laufzeit und angelegte Spannung variierte je nach Größe und Konzentration der Agarosegele zwischen 1 bis 3 Stunden bei 70 bis 140 V.

Zur Bestimmung der DNA-Fragmentgrößen wurden folgende DNA-Größenstandards (MBI Fermentas) mitgeführt: 100 bp DNA Ladder (100-1000 bp), 1 kbp DNA Ladder (ab 500 bp) und λ DNA/Eco130I (ab 1000 bp).

Von den Agarosegelen wurden mit Hilfe der Fotodokumentationsanlagen (Polaroid MP4⁺ Instant Camera System, Polaroid, Offenbach; INTAS Modellreihe 95KFE103, Rothhaar & Schroeder) Bilder erstellt.

Die DNA-Restriktionsverdaus wurden nach den von den Herstellern der Enzyme (MBI Fermentas, New England Biolabs) empfohlenen Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchgeführt. Pro Verdau wurde ca. 50 bis 200 ng DNA und 8 bis 12 U der erforderlichen Restriktionsendonuklease eingesetzt. Die optimale Salzkonzentration wurde durch die Zugabe der entsprechenden Menge an 10x Enzympuffer erreicht. Weitere Zusätze wie BSA (Rinderserumalbumin) oder Triton TX-100 waren entweder im Enzympuffer enthalten (MBI Fermentas) oder wurden nach den vom Hersteller empfohlenen Richtlinien eingesetzt (New

England Biolabs). Die Inkubationszeit betrug 1 bis 2 Stunden. Die Inkubationstemperaturen richteten sich nach dem Temperaturoptimum der Restriktionsendonuklease.

Für präparative Zwecke erfolgte ein proportionales Scale-up des Standard-Restriktionsansatzes bis zu 200 µl.

Die Verdaus wurden anschließend mit 0,1 Volumen Bromphenolblau-Lösung (0,25 % Bromphenolblau, 40 % Saccharose in 1x TE pH 8,0) gestoppt.

Für diese Reaktion wurde die `Calf Intestine Alkaline Phosphatase´ (CIAP, MBI Fermentas) verwendet. Das Reaktionsvolumen betrug 50 µl. Die DNA wurde nach der Restriktion sofort zur Phosphatase-Behandlung eingesetzt. Zum Verdau-Ansatz mit maximal 20 pmol DNA-Enden wurden 5 µl 10x Enzympuffer, sowie 1 µl (1 U) CIAP gegeben und ad 50 µl mit Aqua bidest. aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 Minuten. Die Denaturierung der Phosphatase erfolgte durch Erhitzen des Ansatzes bei 75 °C für 10 Minuten mit anschließender zweimaliger Phenolisierung. Danach wurde die DNA gefällt.

Mit Hilfe des Klenow-Enzyms (MBI Fermentas) wurden die nach einer DNA-Restriktion erhaltenen 5´- kohäsiven Enden zu glatten Enden aufgefüllt. Die Auffüllreaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 30 µl mit maximal 1 µg DNA durchgeführt. Die Reaktion erfolgte entweder bei geeigneter Pufferkonzentration durch den Restriktionsansatz direkt nach dem Restriktionsverdau nach Aufreinigung der verdauten DNA durch das Wizard^TM DNA Clean-Up System (Promega GmbH) oder durch Phenol-Chloroform mit anschließender Fällung. Es wurden 1 µl (bei 20 µl Restriktionsverdau) oder 3 µl (nach Fällung) 10x Enzympuffer, 1 µl dNTP (4 mM) und 1 bis 5 U Klenow-Enzym zusammengegeben und auf ein Endvolumen von 30 µl mit Aqua bidest. aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte für 1 Stunde bei 37 °C. Anschließend wurde die Reaktion für 15 Minuten bei 70 °C gestoppt. Nach dem Abkühlen des Ansatzes auf Raumtemperatur erfolgte die Reinigung der DNA (s. o.).

Die Ligase-Ansätze erfolgten in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Es wurden 50 bis 100 ng Insert-DNA eingesetzt. Die Menge an eingesetzter Vektor-DNA richtete sich nach der Anzahl der freien Enden des Inserts und wurde im Verhältnis 1:1 zueinander gegeben. Zum Ansatz wurden weiterhin 2 µl 10x Ligase-Puffer, 2 µl T4-DNA-Ligase (MBI Fermentas) gegeben und mit Aqua bidest. ad 20 µl aufgefüllt. Bei blunt-end Ligationen wurden maximal 5 % PEG 4000 vom Gesamtvolumen zugesetzt.

Blunt-end Ligationsansätze wurden mindestens drei Stunden bei RT und sticky-end Ligationsansätze über Nacht bei 12 °C im Wasserbad durchgeführt. Nach der Inkubation wurde der Ansatz, sofern er nicht sofort transformiert wurde, bei –20 °C gelagert.

Die in dieser Arbeit untersuchten Bakterienstämme wurden auf unterschiedliche Weise transformiert.

Der E. coli K-12 Stamm DH5α wurde mit der Hitzeschock-Methode nach Hanahan (1983) transformiert. Die nach dieser Methode hergestellten kompetenten Zellen wurden entweder direkt mit 10 µl eines Ligationsansatzes oder 10 bis 100 ng eines Plasmids transformiert oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –75 °C mehrere Monate aufbewahrt.

Y. enterocolitica, A. tumefaciens und P. putida wurden durch Elektroporation mit dem Elektroporator Easy jecT (Equi Bio, Angleur, Belgien) transformiert.

Das Protokoll zur Transformation von Y. enterocolitica ist beschrieben in Lewin et al. (1998).

Die elektrokompetenten Zellen von A. tumefaciens wurden nach dem Protokoll von Nagel et al. (1989) hergestellt. Hierfür wurde der Stamm jedoch nicht wie beschrieben in YEP-Medium, sondern in TY-Medium angezogen. Zur Regeneration der elektroporierten Zellen wurde SOC-Medium (Sambrock et al., 1989) statt YEP-Medium eingesetzt.

Die Herstellung elektrokompetenter P. putida-Zellen, sowie deren Elektroporation wurden nach dem Protokoll von Artiguenave et al. (1997) mit den Elektroporationsparametern 12,5 kV cm^-1, 25 µF, 200 Ω und einer Pulszeit von 5 ms durchgeführt.

Die elektrokompetenten Zellen, die nicht sofort transformiert wurden, wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –75 °C mehrere Monate gelagert.

Die Filtertransformation von Acinetobacter sp. BD413 wurde nach der Beschreibung von Nielsen et al. (1997) vorgenommen.

Die PCR (Mullis und Faloona, 1987) ist ein in vitro-Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und Sequenz aus einem Nukleinsäuregemisch.

Bei der Reaktion wird die doppelsträngige DNA der Probe durch Erhitzen auf 95 °C in ihre Einzelstränge getrennt (Denaturierung). Danach wird die Probe auf eine Temperatur abgekühlt, die für die Hybridisierung der Primer an ihrer Zielsequenz optimal ist (Primer Annealing), so daß für die Taq-Polymerase ein doppelsträngiger Startpunkt für die Auffüllreaktion des DNA-Einzelstranges entsteht (Elongation). Eine Temperaturerhöhung auf 72 °C verschafft optimale Bedingungen für die Amplifikation der DNA durch die Taq-Polymerase. Durch Wiederholung des Zyklus von Denaturierung, Primer Annealing und Elongation wird eine exponentielle Vermehrung der Ziel-DNA erreicht.

Die PCR-Amplifikationen erfolgten in den Thermocyclern GeneAmp^® PCR System 2400 und 9700 (PE Applied Biosystems).

Die PCR, deren Reaktionsansatz und Temperaturprofil des Thermocyclers in Tab. 17 dargestellt sind, wurde zur Amplifizierung der Promotorsequenzen von P KST1, P KCO1, P NptIII, P Bla, P PsbA, P RbcL, P AccD, P RpoB, P AtpB und P ClpP eingesetzt. Die jeweiligen Primer enthielten Restriktionsschnittstellen, die ein gezieltes Klonieren der PCR-Produkte in die jeweiligen Vektoren ermöglichte.

Tab. 17 : PCR-Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen zur Amplifikation definierter Promotorsequenzen. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer. ** Der gewählte Zeitraum für die Elongation war abhängig von der Größe des zu amplifizierenden Nukleinsäure-Fragmentes (ca. 1 min/1 kbp zu amplifizierendes Nukleinsäure-Fragment).

Die Direkt-PCR ermöglichte den Nachweis von inserierter DNA richtiger Orientierung in einem Vektor ohne vorherige Isolierung der DNA. Für diesen Zweck wurden Flüssigkulturen der zu überprüfenden Klone über Nacht angezogen. 1 µl dieser Kultur dienten im PCR-Ansatz (siehe Tab. 18) als Template.

Tab. 18 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Direkt-PCR. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer.

Die Methode der Megaprimer PCR ist ein in vitro-Verfahren zur Einführung von Basenaustauschen oder Deletionen in die zu amplifizierenden Nukleinsäure-Sequenzen (Abb. 7; Barik, 1996). Zur Einführung der gewünschten Modifikation werden zwei PCR-Runden benötigt, die mit drei verschiedenen Primern durchgeführt werden. In der ersten PCR-Runde wird ein Primer mit gewünschter Modifikation (Mismatch-Primer) in Kombination mit einem zweiten Primer eingesetzt. Das resultierende Amplifikat enthält den jeweilig gewünschten Basenaustausch oder die Deletion und wird in einer zweiten PCR-Runde in Kombination mit einem dritten Primer als Megaprimer eingesetzt.

	Abb. 7 : Schematische Darstellung der Megaprimer PCR. Primer 1 stellt den Mismatch-Primer dar
	(■ = Mismatch).

Bei der Megaprimer-PCR sollte darauf geachtet werden, dass die eingesetzte Polymerase keine `proof-reading´-Aktivität besitzt. Die Reaktionsansätze und Thermocycler-Bedingungen sind in Tab. 19 dargestellt. Entgegen herkömmlichen PCR-Protokollen wird die Template-DNA in der zweiten PCR-Runde im μg-Bereich eingesetzt. Dieses verhindert ein `selfannealing´ der Megaprimer.

Tab. 19 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Megaprimer PCR. In der 1. PCR-Runde wurden die Megaprimer hergestellt, welche in der 2. PCR-Runde zur Synthese der Promotor-DNA eingesetzt wurden. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer.

Bei bekannter DNA-Sequenz ist die Amplifizierung eines DNA-Fragmentes mit gleichzeitiger Markierung durch fluoreszenzmarkierte Nukleotide möglich. Diese fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente werden als Sonden zur Detektion spezifischer DNA oder RNA mittels Hybridisierung eingesetzt.

Für die Markierung solcher DNA-Fragmente wurde der PCR Fluorescein Labeling Mix (Roche Diagnostics) eingesetzt. Zur Herstellung der Sonden wurden die von der Herstellerfirma empfohlenen PCR-Protokolle verwendet.

Die DNA-Sequenzierung erfolgte nach dem Prinzip des Kettenabbruch- oder Didesoxynukleotidverfahrens nach Sanger et al. (1977).

Die Reaktion wurde nach den in Tab. 20 aufgezeichneten Bedingungen mit dem ABI PRISM^® FS Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems) und den im Kapitel 2.6.7beschriebenen Thermocycler durchgeführt.

Tab. 20 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Sequenzierung. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer. ** Der Hersteller macht keine Angaben über die genaue Zusammensetzung.

Die Reinigung und Fällung der Sequenzieransätze erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Proben wurden auf 4,8 %ige PAGE-Plus-Gele aufgetrennt und mit dem ABI PRISM^® 377 DNA Sequencer (PE Applied Biosystems) analysiert.

Zur Auswertung der Sequenzdaten wurden die Programme Factura^™ 2.2.0 und Auto Assembler^™ 2.1 (PE Applied Biosystems) verwendet. Die Analyse der Sequenzen erfolgte mit dem Programm Mac Vector^™ 6.5.3 (Oxford Molecular Group).

Die RNA-Isolierung erfolgte mit dem SV RNA Isolation System Kit (Promega) und wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Für die Isolierung der RNA aus Bakterien ist es wichtig, dass die Flüssigkulturen in kürzester Zeit auf eine optische Dichte von 0,6 bis 1,0 bei einer Wellenlänge 600 nm (OD₆₀₀) heranwachsen. Weitere wichtige Schritte sind die Inaktivierung endogener RNasen, sowie der DNase-Verdau, welche in dem Kit beinhaltet waren.

Zur Bestimmung der RNA-Konzentration wurde eine 1:50 oder 1:100 Verdünnung der RNA mit Aqua bidest. hergestellt und diese in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge λ = 260 nm gemessen. Eine Absorption A₂₆₀ von 1,0 entspricht einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Zur Untersuchung der Reinheit der RNA wurde diese Verdünnung ebenfalls bei einer Wellenlänge λ = 280 nm gemessen. Das Verhältnis der Absorptionen von A₂₆₀/A₂₈₀ liegt bei einer Protein-, DNA-freien RNA-Präparation zwischen 1,9 und 2,1.

Zur weiteren Untersuchung der RNA mittels Northern Hybridisierung wurden denaturierende Agarosegele mit Formaldehyd erstellt. Hierbei wurde das Protokoll aus Sambrook et al. (1989) optimiert.

Um RNA der Größe von 2000 bis 3000 Basen im Blot nachzuweisen, eignet sich ein 1,3 %iges denaturierendes Agarosegel. Für ein Agarosegel mit z. B. dem Volumen von 110 ml wurden 1,43 g Agarose, 11 ml 10x FA-Gelpuffer (0,2 M MOPS; 50 mM NaAcetat; 10 mM EDTA; pH 7,0 mit NaOH) und 99 ml DEPC-Wasser (0,1 %) zueinander gegeben, aufgekocht und auf 65 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 1,26 ml 37 %iges Formaldehyd polymerisierte das Gel ohne Zusatz von Ethidiumbromid in der vorgesehenen Kammer.

Als Laufpuffer wurde der 10x FA-Gelpuffer mit entsprechender Menge von DEPC-Wasser versetzt. Zusätzlich wurde 37 %iges Formaldehyd in einem Anteil von 1/50 zum Endvolumen des Laufpuffers gegeben.

Vor dem Beladen des Gels mit den RNA-Proben, lief dieses 30 Minuten bei 5 bis 7 V/cm vor. Vier Teile der RNA-Probe (max. 30 µg) sowie 5 µl des RNA-Markers (Promega) wurden mit einem Teil 5x Beladungspuffer (16 µl Bromphenolblau-Lösung; 80 µl 0,5 M EDTA, pH 8,0; 720 µl 37 % Formaldehyd; 2 ml 100 % Glycerol; 3084 µl Formamid; 4 ml 10x FA-Gelpuffer; ad 10 ml DEPEC-Wasser) versetzt, 3 bis 5 Minuten auf 65 °C erhitzt und auf Eis abgekühlt.

Der Gellauf erfolgte ebenfalls bei 5 bis 7 V/cm. Die Puffer der beiden Kammern wurden stündlich durchmischt, um eine Ionenkonzentrierung zu vermeiden.

Nach dem Lauf wurden die Spuren das Markers abgeschnitten und über Nacht im Ethidiumbromid-Bad (5 µl Ethidiumbromidlösung [10 mg/ml] zu 100 ml DEPC-Wasser) gefärbt.

Um das Gel auf eine Membran (Hybond N⁺, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg) zur Hybridisierung zu übertragen, wurde ein Kapillarblot (Sambrook et al., 1989) durchgeführt.

Die Hybridisierungen und Visualisierungen wurden mit dem Renaissance^® Kit (NENLife Science Products) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Hierbei wurden die fluoreszenzmarkierten Sonden mit Hilfe der indirekten Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Dabei schließt sich dem Hybridisierungsschritt eine Inkubation mit einem Antikörperkonjugat an. Die nachfolgende katalytische Reaktion bewirkt eine Lichtemission, welche mit einem Chemilumineszenz-Film (Lumi-Film, Chemiluminescent Detection Film, Boehringer Mannheim) detektiert wurde und die Lage der RNA-Hybridmoleküle zeigt.

Die Methode der `Rapid Amplification of cDNA Ends´ (RACE) dient zur Charakterisierung von mRNA-Enden (Frohman et al., 1988). Dabei wird die Nukleinsäuresequenz einer mRNA-Matrize zwischen einer definierten Sequenz und einer unbekannten Sequenz am 3´- oder 5´-Ende der mRNA amplifiziert (Abb. 8).

Mit Hilfe des 5´-RACE System (Life Technologies)wurden die Transkriptionsstarts in dieser Arbeit charakterisiert. Dabei wurden aus der Gesamt-RNA mit Hilfe des genspezifischen Primers 1 (GSP1) und der Reversen Transkriptase (RT´) komplementäre DNA-Stränge (cDNA) der zu untersuchenden mRNA gebildet. Bei der Auswahl der Nukleotidsequenz des GSP1 sollte darauf geachtet werden, dass die Schmelztemperatur (T_m) des Primers nahe der optimalen Elongationstemperatur der RT´ liegt. Die verwendete SuperScript^™ II RT´ ist nur bis 50 °C hitzestabil. Nach Degradierung der mRNA aus der Heteroduplex mit Hilfe eines RNase Mix, wurde die cDNA gereinigt. Durch die Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) und Zugabe von dCTP´s wurde das 3´-Ende der cDNA mit einem Cytosin-Schwanz (C-Schwanz) versehen (`tailing´). Zur Amplifizierung der getailten cDNA wurde ein weiterer genspezifischer Primer (GSP2) und ein im Kit enthaltener Anker-Primer (AAP) eingesetzt. Der Anker-Primer bindet an dem C-Schwanz der cDNA und beinhaltet zur Erniedrigung der T<sub>m</sub> Inosin statt Guanin, sowie Restriktionsschnittstellen zur Klonierung der amplifizierten Nukleinsäure-Fragmente. Dem kann noch eine Nested-PCR mit einen weiteren genspezifischen Primer (GSP3) und dem `Abridged Universal Amplification Primer´ (AUAP) angeschlossen werden.

	Abb. 8 : Schematische Darstellung der 5´-RACE.

Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit dem PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und konnten hinterher direkt sequenziert oder kloniert werden.

Die einzelnen Reaktionsschritte der 5´-RACE wurden mit den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen und Reaktionsbedingungen durchgeführt. Das Temperaturprofil der PCR der dC-getailten cDNA sowie der Nested-PCR ist in Tab. 21 dargestellt.

Tab. 21 : Temperaturprofil der 5´-RACE-PCR. * Zur Elongation wurde der ELONGase^™ Ezyme Mix (Life Technologies_™ ) eingesetzt, welcher bei einer Temperatur von 68 °C das Aktivitätsoptimum besitzt.

Das TaqMan® System (PE Applied Biosystems) ist eine auf PCR beruhende Methode, bei der die Amplifikationsreaktion durch den Einsatz einer zusätzlichen Fluoreszenz-gekoppelten Oligonukleotid-Sonde verfolgt und quantifiziert werden kann (Abb. 9).

Die sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonde ist am 5´-Ende mit einem Reporterfarbstoff (Fam, 6-Carboxy-Fluorescein) und am 3´-Ende mit einem Quencher-Molekül (Tamra, 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin) versehen. Ihre Sequenz ist so gewählt, dass sie zeitlich vor den PCR-Primern zwischen deren Bindungsstellen auf der Zielsequenz bindet. Solange die Sonde intakt ist, unterdrückt das Quenching-Molekül durch die räumliche Nähe, das durch Anregung entstehende Signal des Reporterfarbstoffes. Bei der Elongation der Primer zerlegt die Taq-Polymerase aufgrund ihrer 5´-3´-Exonuklease die Sonde in ihre Nukleotide. Durch die Trennung von Reporterfarbstoff von dem Quencher-Molekül kommt es zur Detektion des Reporterfarbstoffes. Aus dem Anstieg der freien Reporterkonzentration ergibt sich ein wachsendes Fluoreszenzsignal, das proportional zu der Anzahl des PCR Produkts ist. Der Zeitpunkt, bei dem ein signifikanter Anstieg des Signals erfolgt, erlaubt Rückschlüsse auf die Anfangskonzentration der zu quantifizierenden Nukleinsäure.

	Abb. 9 : Schematische Darstellung der TaqMan® PCR.

Die TaqMan®PCR wurde zur Bestätigung der Ergebnisse der Lumineszenz-Messung herangezogen. Hierbei wurden die nach Isolierung der Gesamt-RNA aus verschiedenen Bakterienstämmen gewonnenen luxAB-mRNA Moleküle quantifiziert.

Die Reaktion des Umschreibens der mRNA in die cDNA durch die Reverse Transkriptase (RT´) und die nachfolgende quantitative PCR wurden in einem Schritt mit dem Titan One Tube RT´-PCR System (Roche) und denen in Tab. 22 aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Zur Konzentrationsberechnung der Proben wurde eine Standardreihe des Plasmids pKKlux mit den Konzentrationen 730 pg/µl (Standard 1) bis 0,073 pg/µl (Standard 5) mitgeführt.

Tab. 22 : Protokoll der quantitativen RT-PCR. * Die genaue Zusammensetzung wurde vom Hersteller nicht angegeben.

Die TaqMan® PCR und deren Auswertung wurde mit dem ABI PRISM^™ 7700 Sequence Detektor (PE Applied Biosystems) durchgeführt.

Die Bakterienkulturen mit den Fusionen aus den zu untersuchenden Promotoren und den promotorlosen luxAB aus V. harveyi wurden zur Ermittlung der Expressionsstärke auf Biolumineszenz untersucht. Die Lumineszenzmessungen wurden mit dem Microlumat LB96P (Berthold GmbH & Co. KG) durchgeführt.

Die zur Lumineszenz-Messung angezogenen Bakterienkulturen wurden in den jeweiligen Flüssigmedien (siehe Kap. 2.3) in einem Schüttelinkubator bei 28 °C und 200 rpm bis zu einer OD₆₀₀= 1,0 bis 1,3 (OD₆₀₀= 1,0 entspricht einer Zellzahl von 10⁹ Zellen/ml) inkubiert. Nach Verdünnung der Kulturen der stationären Phase auf eine Zellzahl von 10⁶ Zellen/ml, wurde die Lumineszenz von 100 µl der verdünnten Kultur über eine Zeitspanne von 10 s bei 28 °C im Luminometer gemessen. Als Substrat wurde zu jeder Probe 50 µl Dekanal-Lösung (2 %iges Dekanal in 50 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,0) injiziert. Von jeder Probenverdünnung wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt.

Die Auswertung der Daten erfolgte mit der am Luminometer angeschlossenen Software (Instrument Software Version 2.01, Programm Win Glow, Berthold GmbH & Co. KG). Von dem aufgezeichneten Kurvenverlauf der Messung wurde mit Hilfe dieser Software das Integral

über den Zeitraum von 10 s gebildet und als Meßergebnis in Relative Lichteinheiten (RLU) dargestellt. Die Werte der Dreifachbestimmung wurden gemittelt.

Als Screening einer erfolgreichen Klonierung mit luxAB und anschließender Transformation des Plasmids in die zu untersuchenden Bakterienzellen, wurden die Lumineszenzen direkt von den unverdünnten stationären ü. N.-Kulturen gemessen.

Kulturen von E. coli mit den Fusionen aus den zu untersuchenden Promotoren und dem promotorlosen cat-Gen des Vektors pKK232-8 wurden auf LB-Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Chloramphenicol (5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml und 30 µg/ml) auf Expressionsstärke untersucht.

Hierfür wurden die Bakterienkulturen in LB flüssig mit Ampicillin (100 µg/ml) in einem Schüttelinkubator bei 37 °C und 200 rpm ü. N. inkubiert. Nach Bestimmung der OD₆₀₀ wurden die Kulturen so verdünnt, dass pro LB-Agarplatte mit Chloramphenicol zwischen 10² bis 10³ Zellen ausplattiert wurden. Zur Berechnung des prozentualen Anteils gewachsener Kolonien mit und ohne Antibiotikum, wurde von derselben Verdünnungsstufe der jeweiligen Kultur eine LB-Agarplatte ohne Chloramphenicol angelegt. Die Kolonien der antibiotikumhaltigen Platten wurden nach 48 h und die der Platten ohne Antibiotikum nach 24 h Inkubation bei 37 °C ausgezählt.

Bei der Transformation von Pflanzen mit Hilfe der Partikelkanone (Klein et al., 1989b) werden kleine mit DNA beschichtete Gold- oder Wolframpartikel (Microcarrier) durch eine Helium getriebene Partikelkanone in intakte Pflanzenzellen hineingeschossen. Bei Eintritt in die Pflanzenzellen wird die DNA von den Partikeln abgestreift. Die Expression der eingeführten rekombinanten DNA beginnt, wenn die DNA in den Zellkern oder in die Plastiden gelangt. Die DNA kann entweder in das Pflanzengenom integriert werden und es kommt zur stabilen Transformation. Häufiger ist jedoch das Verbleiben der DNA im freien Zustand im Zellkern mit anschließendem Abbau durch nukleolytische Enzyme. Hierbei wird eine transiente Expression erzeugt.

Als Microcarrier wurde Goldpuder verwendet. Hierfür wurden 30 mg Goldpuder (1 µm, Bio-Rad Laboratories, München) mit 1 ml 70 %igen EtOH versetzt, 5 min gevortext und nach 1 min absetzen kurz zentrifugiert, damit der Überstand abgehoben werden kann. Anschließend folgt ein dreimaliges Waschen des Goldpellets mit je 1 ml Aqua bidest. Die Suspension wurde 2 min gevortext, der Überstand nach 1 min absetzen kurz zentrifugiert und abgenommen. Das Goldpellet wurde in 500 µl sterilem 50 %igen Glycerin resuspendiert (Endkonzentration 60 mg/ml).

Für drei Schuss werden unter ständigem Rühren 25 µl Gold (60 mg/ml) mit 3 µg Plasmid DNA, 25 µl 2,5 M CaCl₂-Lösung und 10 µl 0,1 M Spermidin-Lösung gemischt, 3 min gevortext und nach 1 min absetzen kurz zentrifugiert. Der Überstand wurde abgehoben und der Coating-Ansatz mit je 140 µl 70 %igen EtOH und absolutem EtOH gewaschen. Nach Zugabe von 24 µl absolutem EtOH zum Coating-Ansatz wurde dieser resuspendiert und je 8 µl des Ansatzes auf je einen Macrocarrier pipettiert und getrocknet.

Für das Partikelbombardement wurden von 1 bis 2 Monate alten sterilen N. tabacum Blättern mit dem `Korkbohrer 5´ Blattscheiben hergestellt. Vier dieser Blattscheiben wurden in eine Petrischale gelegt, mit MS-Medium (Murashige and Skoog Basalmedium, Tomes et al., 1990) mit 2 % Saccharose bedeckt, und über Nacht bei 23 °C unter Licht in Gewebekulturkammern aufbewahrt.

Das Bombardement erfolgte mit dem Modell `PDS 1000/He biolistic particle delivery system´ von Bio-Rad (München). Es wurden 1100 psi `rupture disks´ verwendet. Die Macrocarrier mit dem zu untersuchenden Coating-Ansatz wurden in die Haltevorrichtungen eingebaut. Die Petrischalen mit den Tags zuvor hergestellten Blattscheiben in MS-Medium wurden auf die Plattform in die 2. oder 3. Ebene geschoben. Nachdem das Gerät geschlossen wurde, wurde ein Vakuum mit 26 inch Hg angelegt und der Schuß ausgelöst. Nach dem Beschuß wurde die Kammer wieder belüftet (20 s.) und die Proben entnommen. Die Petrischalen mit den

bombardierten N. tabacum Blattscheiben in MS-Medium wurden wiederum 2 Tage bei 23 °C und Licht in den Gewebekulturkammern aufbewahrt.

Für den transienten Nachweis der β-Glucuronidase wurden die Blattscheiben in eine Petrischale mit GUS-Färbelösung (Mendel et al., 1989) überführt. Die Blattscheiben wurden in der Lösung bei 37 °C über Nacht im Dunkeln inkubiert. Bei einer Expression des gus-Gens wird der Farbstoff 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc) durch die β-Glucuronidase hydrolysiert und es kommt zur Blaufärbung des Pflanzengewebes. Um das Chlorophyll aus den Blättern zu entfernen, wurden die Blattscheiben am darauffolgenden Tag mit 70 % EtOH bei 72 °C über Nacht gewaschen. Die Aufbewahrung der Blattscheiben erfolgte ebenfalls in 70 %igen EtOH im Kühlschrank.