2 Material und Methoden

2.1 Chemikalien, Enzyme und Kits

2.1.1 Chemikalien

Alle Chemikalien wurden, soweit nicht anders aufgeführt, von Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) und Sigma-Aldrich (Steinheim) bezogen.

2.1.2 Enzyme und Kits

Tab. 4 : Verwendete Enzyme und Kits

Substanz / Kit

Hersteller

5´-RACE System for Rapid

Amplification of cDNA Ends

Life Technologies, Eggenstein

ABI PRISM® FS Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit

PE Applied Biosystems, Weitersheim

Calf Intestine Alkaline Phosphatase

MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Cryobank™

Mast Diagnostica, Reinfeld

DNA-Größenstandards

MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Elongase™ Enzym Mix

Life Technologies, Eggenstein

Primer

TIP MOLBIOL, Berlin

Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg

Metabion,Martinsried

Restriktionsendonukleasen

MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

New England Biolabs GmbH, Frankfurt a. M.

Klenow-Enzym

MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

NucleoSpin®Plus-Kit

Clontech Laboratories Inc., Heidelberg

PCR Fluorescein Labeling Mix

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

QIAGEN Plasmid Maxi Kit

Qiagen GmbH, Hilden

QIAquick™ Gel Extraktion Kit

Qiagen GmbH, Hilden

QIAquick PCR Purification Kit

Qiagen GmbH, Hilden

Renaissance® Kit

NENLife Science Products, Zaventem, Belgien

SV RNA Isolation System Kit

Promega GmbH, Mannheim

T4 DNA-Ligase

MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Taq DNA-Polymerase

MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot

Titan One Tube RT PCR System

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Wizard™ DNA Clean-Up System

Promega GmbH, Mannheim

2.2 Bakterienstämme, Plasmide und Pflanzen

2.2.1 Verwendete Bakterienstämme

Die in der Arbeit verwendeten Bakterienstämme und deren genotypischen Eigenschaften sind in Tab. 5 dargestellt.

Tab. 5 : Verwendete Bakterienstämme

Bakterienstamm

Charakteristika

E. coli K-12 Stamm DH5α

(Hanahan, 1983)

supE 44 ΔlacU 169 (φ 80 lacZΔ M15) hsdR 17

recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1

E. coli K-12 Stamm CC118(λpir)

(Herrero et al., 1990)

Δ(ara-leu) araD ΔlacX74 galE galK pho20A

thi-1 rpsE rpoB argE(Am) recA1;

Infektion mit dem Phagenlysat λpir von E. coli SY327(λpir)

Y. enterocolitica Stamm 78

(Lewin et al. , 1996)

Serovar O:13,7; Biovar 1A; der Stamm enthält ein Plasmid der Größe 52 kbp

A. tumefaciens Stamm ATHVa

Modifizierter A. tumefaciens Stamm A281 (Hood et al., 1986); in pEHA101 wurde das Kanamycin-resistenz Gen deletiert; chromosomaler Hintergrund von A. tumefaciens Stamm C58; rifR

P. putidab

Umweltisolat

Acinetobacter species Stamm BD413

(Nielsen et al., 1997)

Mutante des Stammes BD4; rifR

Die Bakterienstämme wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von: a J. Schiemann, Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft Braunschweig; b Stammsammlung der Technischen Fachhochschule, Berlin

2.2.2 Klonierungsvektoren

Die in Tab. 6 aufgeführten Vektoren dienten der Klonierung der zu untersuchenden Promotoren (pBin19, pBi101.2, pKK232-8) oder der Klonierung der 5´-RACE Produkte (pLitmus28).

Tab. 6 : Klonierungsvektoren

Plasmid

Charakteristika

pBin19 (Bevan, 1984)

Binärer Vektor zur Transformation von Pflanzen mit A. tumefaciens; RK2 origin; kmR; T-DNA mit nmR und lacZ´-Region aus M13mp19; 11777 bp

pBi101.2 (Jefferson et al. , 1987)

Binärer Vektor zur Transformation von Pflanzen mit A. tumefaciens; Derivat von pBin19 mit promotorlosem gus als Reportergen; 12200 bp

pKK232-8 (Brosius, 1984)

Promotorstudien-Vektor mit promotorlosem cat als Reportergen; Transkriptionsstop rrnB vor der MCS; Derivat von pBR322; ampR; 5094 bp

pLitmus28 (Evans et al. , 1995)

Klonierungsvektor; pUC Derivat; ampR; M13 origin; ColE1 origin; lacZ´-Region mit MCS; 2823 bp

2.2.3 Vorhandene Promotorkonstrukte

Die in Tab. 7 aufgeführten Plasmide sind im Rahmen der Diplomarbeit (Jacob, 1997) an der Technischen Fachhochschule zu Berlin entstanden. Sie wurden zur Lumineszenzmessung und für weitergehende Untersuchungen in die Arbeit mit einbezogen.

Tab. 7 : Vorhandene Promotorkonstrukte

Plasmid

Charakteristika

pBinlux-SalI/pKKlux

pBin19/pKK232-8 fusioniert mit den promotorlosen luxAB-Genen aus Vibrio harveyi

p35Slux/pKK35lux

(Lewin et al. , 1998)

pBin19/pKK232-8 mit der Fusion des 35S- Promotors (540bp) aus CaMV und den luxAB-Genen; Promotorursprung: pBinAR (Höfgen and Willmitzer, 1990)

pB33lux/pKKB33lux

(Lewin et al. , 1998)

pBin19/pKK232-8 mit der Fusion des Promotors (1500 bp) des Klasse I B33-Patatin Gens aus S. tuberosum und den luxAB-Genen; Promotorursprung: pB33-pBin19 (Rocha-Sosa et al., 1989)

pST-LS1lux/pKKST-LS1lux

(Lewin et al. , 1998)

pBin19/pKK232-8 mit der Fusion des Promotors (1600 bp) des ST-LS1-Gens aus S. tuberosum und den luxAB-Genen; Promotorursprung: pBin-L700 (Eckes et al., 1986)

pRolClux/pKKRolClux

(Lewin et al. , 1998)

pBin19/pKK232-8 mit der Fusion des Promotors (1150 bp) des rolC Gens aus A. rhizogenes und den luxAB-Genen; Promotorursprung: pBin19-RolC (Yokoyama et al., 1994)

2.2.4 Promotorderivate, Reportergene

Die in Tab. 8 beschriebenen Promotoren wurden entweder mittels PCR und sequenzspezifischen Primern amplifiziert und kloniert oder direkt durch DNA-Restriktion der Promotorderivate gewonnen und in die entsprechenden Vektoren kloniert. Zur Untersuchung der Expressionsstärke der pflanzlichen Promotoren in Bakterien wurden die promotorlosen luxAB-Gene aus V. harveyi als Reportergene eingesetzt.

Tab. 8 : Promotorderivate, Reportergene

Plasmid

Charakteristika, Beschreibung des Promotors

Mini-Tn5 lux AB

(De Lorenzo et al. , 1990)

Vektor pUT mit Mini-Tn5 luxAB und tcR als XbaI/EcoRI-Fragment; enthält die promotorlosen luxAB-Gene aus V. harveyi

pBinG130a

pBin19 fusioniert mit dem Promotor (P 130, 1400 bp) des Alkoholdehydrogenase Gens aus N. tabacum (var. Samsum)

pBinG247a

pBin19 fusioniert mit dem Promotor (P 247, 1200 bp) eines Gens aus N. tabacum, welches für ein calmodulin-ähnliches Protein codiert

pME1b

pBi101.1 fusioniert mit dem FBP1,7-Promotor (1700 bp) des Gens der cytoplasmatischen Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) aus S. tuberosum (L. cv. Désirée)

pFBPase1,1b

pBin19 fusioniert mit dem EcoRI-Fragment des FBP1,1-Promotors (1100 bp), welcher am 5´-Ende um 600 bp gegenüber dem Promotor aus pME1 verkürzt ist

pBi101-SKT2c

pBi101 fusioniert mit dem SKT2-Promotor (3100 bp) des Gens aus S. tuberosum (L. cv. Désirée), welches für einen einwärts gleichrichtenden Kaliumkanal kodiert

pDKP3d

pBi101 fusioniert mit dem KST1-Promotor (1500 bp) des Gens aus S. tuberosum, welches für einen einwärts gleichrichtenden Kaliumkanal kodiert

pPK-Gus-4e

pGPTV-HPT (Becker, 1990) fusioniert mit dem KCO1-Promotor (870 bp) des Gens aus A. thaliana, welches für einen auswärts gleichrichtenden Kaliumkanal kodiert

pKL12f

pBluescript-Derivat mit dem Promotor (P RbcL, 207 bp) des Gens für die große UE der Ribulose-1,6-bisphosphat Carboxylase aus dem Chloroplasten von N. tabacum (Acc. # Z00044, von Position 57328 bis 57534)

pKL13f

pBluescript-Derivat mit dem Promotor (P PsbA, 227 bp) des Gens für das D1-Protein des Photosystem II aus dem Chloroplasten von N. tabacum (Acc. # Z00044, von Position 1822 bis 1596)

pKL14f

pBluescript-Derivat mit dem Promotor (P ClpP, 306 bp) des Gens für die proteolytische UE der Clp-ATP-abhängigen Protease aus dem Chloroplasten von N. tabacum (Acc. # Z00044, von Position 74712 bis 74407)

pKL18f

pBluescript-Derivat mit dem Promotor (P AtpB, 315 bp) des Gens für die β-UE der ATPase aus dem Chloroplasten von N. tabacum (Acc. # Z00044, von Position 57139 bis 5682)

pKL43f

pBluescript-Derivat mit dem Promotor (P AccD, 376 bp) des Gens für eine UE der Acetyl-CoA Carboxylase aus den Chloroplastem von N. tabacum (Acc. # Z00044, von Position 59385 bis 59760)

pKL44f

pBluescript-Derivat mit dem Promotor (P RpoB, 323 bp) des Gens für die β-UE der PEP aus dem Chloroplasten von N. tabacum (Acc. # Z00044, von Position 28050 bis 27728)

Die Plasmide wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von: a G. Mönke, Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Gatersleben; b M. Ebnet, IPK Gatersleben; c N. Weigmann, Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie (MPI-MP) Golm; d T. Ehrhardt, MPI-MP Golm; e K. Czempinski, MPI-MP Golm; f K. Liere, Humboldt Universität Berlin

2.2.5 Pflanzen

Die Expressionseigenschaften ausgewählter Promotoren in der Pflanze wurden in N. tabacum cv. Samsun NNüberprüft.

2.3 Nährmedien und Kulturbedingungen

E. coli, Y. enterocolitica, P. putida und Acinetobacter sp. BD413 wurden auf LB-Medium (Sambrook et al., 1989) und A. tumefaciens auf TY-Medium (Beringer, 1974) angezogen. Die Inkubation der mit Yersinien, Pseudomonaden, Acinetobacter und Agrobakterien beimpften Agarplatten erfolgte 24 bis 48 h bei 28 °C, bei E. coli über Nacht bei 37 °C. Flüssigkulturen wurden unter den genannten Bedingungen bei 180 bis 200 rpm geschüttelt.

Zur selektiven Anzucht der Bakterienstämme, die ein Antibiotikumresistenzgen besaßen, wurden folgende Antibiotikumkonzentrationen in die jeweiligen Medien gegeben:

Ampicillin

100 µg/ml

Rifampicin

50 µg/ml

Chloramphenicol

25 µg/ml

Tetracyclin

10 µg/ml

Neomycin

100 µg/ml

  

2.4 Stammhaltung

Alle Stämme wurden mit Hilfe des Cryobank™-Systems (Mast Diagnostica) archiviert. Die Bakterienkulturen sind bei diesem System an Keramikkügelchen gebunden und werden bei –20 °C und –75 °C gelagert. Die Archivierung erfolgte entsprechend dem Protokoll der Herstellerfirma. Die Anzucht der Stämme erfolgte durch den Verdünnungsausstrich einer Keramikkugel auf LB- bzw. TY-Agarplatten mit dem entsprechendem Antibiotikumzusatz und deren Kultivierung bei 28 °C bzw. 37 °C.

2.5 Primer

Die Primer wurden lyophilisiert bezogen und mit Wasser für molekulargenetische Zwecke zu einer Stammlösung gelöst. Von dieser Stammlösung wurden Arbeitsverdünnungenmit 30 ng/µl hergestellt.

Die Primer sind in den Tab. 9 bis Tab. 16 aufgeführt. Vorhandene Restriktionsschnittstellen der Primer wurden in den Sequenzen kursiv dargestellt.

Material und Methoden 34

Tab. 9 : Verwendete Primer zur Herstellung des Nos-, KST1- und KCO1-Promotors. Die Lokalisationen der Primer des Nos-Promotors beziehen sich auf die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365), bei dem KCO1-Promotor auf die DNA-Sequenz mit der Acc. # Y07825 und bei dem KST1-Promotor auf die DNA-Sequenz mit der Acc. # AJ242852 (2-KST1-S) und die DNA-Sequenz des Vektors pBi101 mit der Acc. # U12639 (KST-AS).

Primer

Sequenz 5´→ 3´

Lokalisation

Region

Restriktions-

schnittstelle

Annealing

Temp. [°C]

Nos-S1

GCG TCG ACC TGC GTG CAA TCC ATC TTG

8909-8931

5´UTR nos

SalI

54

Nos-AS1

CGC CCG GG A ACG GAT AAA CCT TTT CAC G

9391-9371

5´UTR nos

SmaI

54

2-KCO1-S

CGC CCG GGC TCG AG T GGT TGA ATG

241-256

5´UTR KCO1-Gen

SmaI, XhoI

46

KCO1-AS

CGC CCG GGT CTA GAC TCA AAC CAG

1223-1208

5´UTR KCO1-Gen

SmaI, XbaI

46

2-KST1-S

CGC CCG GGA TCG TCA TCA GAA GAG GTG G

4-23

5´UTR KST1-Gen

SmaI

60

KST-AS

CAT AAG GGA CTG ACC ACC CGG G

2553-2532

MCS pBi101

SmaI

60

2.5.1 Primer zur Herstellung der bakteriellen Promotoren

Tab. 10 : Verwendete Primer zur Herstellung der Promotoren von npt III und bla . Die Lokalisationen der Primer des NptIII-Promotors beziehen sich auf die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365) und die des Bla-Promotors auf die DNA-Sequenz des Vektors pKK232-8 (Acc. # U13859).

Primer

Sequenz 5´→ 3´

Lokalisation

Region

Restriktions-

schnittstelle

Annealing

Temp. [°C]

NPTIII-Sma-S

GCG CCC GGG CAT AAT TGT GGT TTC AAA ATC GGC

2085-2108

5´UTR nptIII

SmaI

55

NPTIII-AS

GCG CCC GGG TTA TTA TTT CCT TCC TCT TTT C

2275-2254

5´UTR nptIII

SmaI

55

Amp-Sma-S

GCG CCC GGG CGT CAG GTG GCA CTT TTC G

5020-5002

5´UTR bla

SmaI

50

Amp-AS

GCG CCC GGG ACT CTT CCT TTT TCA ATA TTA TTG

4887-4910

5´UTR bla

SmaI

50

Material und Methoden 35

Tab. 11 : Verw endete Primer zur Herstellung der Chloroplasten Promotoren. Die Lokalisation bezieht sich auf die Chloroplasten-DNA aus N. tabacum (Acc. # Z00044).

Primer

Sequenz 5´→ 3´

Lokalisation

Region

Restriktions-

schnittstelle

Annealing

Temp. [°C]

psbA-S

GCG AAG CTT CCC GGG CAA CCC ACT AGC

1822-1805

5´ UTR psbA

HindIII/SmaI

60

psbA-AS

GCG CCC GGG TAA AAT CTT GGT TTA TTT AAT C

1596-1619

5´ UTR psbA

SmaI

60

rbcL-Sma-S

GCG CCC GGG AGT CAG GTA TTT CCA TTT C

57328-57356

5´UTR rbcL

SmaI,

52

rbcL-AS3

CGC CCG GGA ATT CCG TGT TAA TGA AAC

57534-57515

5´UTR rbcL

SmaI, EcoRI

52

accD-Sma-S

GCG CCC GGG GAG CTC TTT CCT ACC CAT C

59385-59400

5´UTR accD

SmaI, SacI

54

accD-AS

GCG CCC GGG AAT TCC TAT CAG ACT AAG C

59760-59744

5´UTR accD

SmaI, EcoRI

54

rpoB-Sma-S

GCG CCC GGG AGC TCT CTC TTC TCT AC

28050-28036

5´UTR rpoB

SmaI

54

rpoB-AS

GCG CCC GGG AAT TCA ACA GAT ACA AAT GG

27728-27745

5´UTR rpoB

SmaI, EcoRI

54

atpB-Sma-S

GCG CCC GGG AGC CAA TTA GAT ACA AAT AAT GAA TCG

57139-57117

5´UTR atpB

SmaI

65

atpB-AS3

CGC CCG GGA ATT CAA AAT AAA TGT CCG C

56825-56845

5´UTR atpB

SmaI, EcoRI

65

clpP-Sma-S

CGC CCC GGG AAT GAG TCC ATA CTT ATT TAT C

74712-74689

5´UTR clpP

SmaI

60

clpP-AS

CGC CCC GGG ATA TGA CCC AAT ATA TCT GAC AAG

74407-74420

5´UTR clpP

SmaI

60

Material und Methoden 36

Für die 5´-RACE wurden die im Kit (Life Technologies) mitgelieferten Anker- und `Abridged Universal Amplification Primer´ (AAP, AUAP) verwendet. Die genspezifischen Primer (GSP) sind analog Sequenzabschnitten aus dem luxA-Gens aus V. harveyi und dem cat-Gen des Vektors pKK232-8.

Tab. 12 : Verwendete Primer zur Bestimmung der Transkriptionsstarts mittels 5´-RACE. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961) und des cat-Gens des Vektors pKK232-8 (Acc. # U13859). * I = Inosin. Inosin dient der Erniedrigung der Schmelztemperatur des Primers.

Primer

Sequenz 5´→ 3´

Lokalisation

Region

Restriktions-

schnittstelle

Annealing

Temp. [°C]

AAP

GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG*

/

/

MluI/SalI/SpeI

65

AUAP

GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC

/

/

MluI/SalI/SpeI

65

GSP1/luxA-3

CAA CAT AAG GAT TCC C

882-864

luxA

/

42

GSP2/luxA

GCG TAC TAG T CA GTG AAG TGG TGC TCT AGC AAC C

849-825

luxA

SpeI

65

GSP3/luxA

GCG TAC TAG TCC ACA ACC TTC AGA CGC TTT GC

810-788

luxA

SpeI

65

GSP1/Cat

GAT GAG CAT TCA TCA G

479-464

cat

/

42

GSP2/Cat

GCA CTA GTG CAA GAA TGT GAA TAA AGG CCG

459-437

cat

SpeI

65

Material und Methoden 37

Tab. 13 : Verwendete Primer zum Einfügen von Basenaustauschen in den ST-LS1-Promotor. Die Lokalisation bezieht sich auf die Promotor-Sequenz des ST-LS1-Gens aus S. tuberosum (Acc. # X04753), sowie die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961) und die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365).

Primer

Sequenz 5´→ 3´

Lokalisation

Region

Annealing

Temp. [°C]

pBin19 6847

CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC

6867-6848

lacZ

60

pBin19 6746

CAC GAC GTT GTA AAA CGA CGG

6746-6766

lacZ

60/56

luxA/AS2

GAT AGC TCA GGT GGC TGA TAA G

753-732

luxA

60

ST-LS1/1530/OM

GCA AAG TGA AAA TAA ATA ATT CAT AC

1530-1555

5´UTR ST-LS1-Gen

60

1530-D-TATAAT

GCA AAG TGA AAA TAA ATA AGT TAT AAT AAG*

1530-1559

5´UTR ST-LS1-Gen

56

1530-TGNTAT

GCA AAG TGA AAA TAA ATA TGT TAT AAT AAG*

1530-1559

5´UTR ST-LS1-Gen

56

1530-TATAAT

GCA AAG TGA AAA TAA ATA ATT TAT AAT AAG*

1530-1559

5´UTR ST-LS1-Gen

56

1530-CGTACG

GCA AAG TGA AAA TAA ATA ATT C GT AC G AAG*

1530-1559

5´UTR ST-LS1-Gen

60

1530-CCTACC

GCA AAG TGA AAA TAA ATA ATT C CT AC C AAG*

1530-1559

5´UTR ST-LS1-Gen

60

1530-CACGCT

GCA AAG TGA AAA TAA ATA ATT CAC G CT AAG*

1530-1559

5´UTR ST-LS1-Gen

60

* Basenaustausche gegenüber der Originalsequenz sind rot eingezeichnet.

Die Taq®Man-Oligonukleotid-Sonde als auch die Primer der Tab. 14 binden auf einem Sequenzabschnitt des luxB-Gens aus V. harveyi und wurden für die quantitative RT-PCR eingesetzt.

Tab. 14 : Verwendete Primer zur Herstellung quantitativer PCR-Produkte. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961). * F : 6-Carboxy-Fluorescein (Fam); T : 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (Tamra = Quencher).

Primer

Sequenz 5´→ 3´

Lokalisation

Region

Annealing

Temp. [°C]

lux2270F

CCG TTA ACC CAC ACG CGT

2270-2287

luxB

60

lux2329R

TGC TCG TCG CAT TCA CAA A

2329-2311

luxB

60

Fam-Sonde-Tamra

F – CAC TGA AGG CGG TCC TGC GCA – T*

2289-2309

luxB

60

2.5.2 Primer zur Sondenherstellung für die Northern Hybridisierung

Die Sonde für die Northern Hybridisierung ist einem 400 bp Sequenzabschnitt auf dem luxA-Gen von V. harveyi homolog. Sie wurde mittels PCR und durch die in Tab. 15 aufgelisteten Primern hergestellt.

Tab. 15 : Verwendete Primer zur Sondenherstellung. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961).

Primer

Sequenz 5´→ 3´

Lokalisation

Region

Annealing

Temp. [°C]

luxA/S1

AAT CCA ACT GAA TCC ATC GGC

1171-1191

luxA

57

luxA/AS1

GGC GAT TGG TGT CTT TGT GG

1577-1558

luxA

57

Material und Methoden 39

Tab. 16 : Verwendete Primer zur Sequenzierung und für die Direkt-PCR. Die Lokalisation bezieht sich auf die angegebene DNA-Sequenz der Acc. #.

Primer

Sequenz 5´→ 3´

Acc. #

Lokalisation

Region

Annealing

Temp. [°C]

luxA/AS2

GAT AGC TCA GGT GGC TGA TAA G

M10961

753-732

luxA

53

Bi-2052/7273

TGA TTC TGT CGC TAC TGA TTA CGG

U12668

2053-2076

pBi101.2, Vektor-DNA

58

Gus-2583-AS

TTC ACG GGT TGG GGT TTC TAC

U12668

2585-2565

gus

58

LacZ/S1

GAG TTA GCT CAC TCA TTA GG

U09365

6949-6930

lac

43

Bin19S

CTC TTC GCT ATT ACG CCA G

U09365

6666-6684

lac

58

ST-LS1305

CAA GTC AAT CTC TTG GGT CCC

X04753

1305-1325

5´UTR ST-LS1-Gen

58

L700-1

CAA GGA TTA GTT GAA TCG GG

X04753

282-263

5´UTR ST-LS1-Gen

55

L700-2

CAT TCC CAC AAG AAA GAC G

X04753

887-869

5´UTR ST-LS1-Gen

55

L700-3

TTG TTG CCT GTT GGA GAC

X04753

1205-1188

5´UTR ST-LS1-Gen

55

pKK232-8/S1

TGA ACG CTC TCC TGA GTA

U13859

73-90

pKK232-8, Vektor-DNA

55

pKK232-8/AS1

GTT CTT TAC GAT GCG ATT

U13859

329-312

cat

55

LitF

CAT GAT TAC GCC AAG CTA CG

/

/

pLitmus28, MCS

55

LitR

GTA AAA CGA CGG CCA GTC CG

/

/

pLitmus28, MCS

60

KCO113S

GGG GAT GTT TTG AAG TAT GC

Y07825

353-372

5´UTR KCO1-Gen

60

KCO632S

GAA GAA CAA TTG CGA GAT CCG

Y07825

862-882

5´UTR KCO1-Gen

60

KCO311AS

GCC AAA ATA TCC AGC ATG ACG

Y07825

551-531

5´UTR KCO1-Gen

58

KCO618AS

GAT GAT GTT CTC ACA AGT TGG C

Y07825

858-838

5´UTR KCO1-Gen

60

KST438S

CAA ACA TCA AGC ACA TGG AAC C

AJ242852

442-463

5´UTR KST1-Gen

58

KST914S

CCT ATT TGG GAT TTG TTG GTC

AJ242852

918-938

5´UTR KST1-Gen

60

KST1340S

GTA GGC AAG TAG CAA TGT CAC G

AJ242852

1344-1365

5´UTR KST1-Gen

60

KST304AS

GGC CCA CAT GCA TGA AGT TTC

AJ242852

307-287

5´UTR KST1-Gen

60

KST692AS

GGA AAT GAC GTT GGA ACT CTG

AJ242852

695-675

5´UTR KST1-Gen

58

KST1189AS

CAA ACG AGG CGA GAT ATG AG

AJ242852

1173-1192

5´UTR KST1-Gen

60

KST1523AS

CGA GTT TCT TGG AAA GGC AAT G

AJ242852

1526-1505

5´UTR KST1-Gen

58

2.6 DNA-Techniken

2.6.1 Plasmid-Isolierungstechniken

Zur Überprüfung erfolgreicher Klonierungen in E. coli und zur DNA-Sequenzierung wurden Plasmidisolierungen mit dem NucleoSpin®Plus-Kit (Clontech) durchgeführt. Hierfür wurden die zu untersuchenden Zellen in 2 bis 10 ml LB-Medium mit dem jeweiligen Antibiotikum-Zusatz über Nacht bei 37 °C und 200 rpm kultiviert. Entsprechend dem NucleoSpin®Plus-Kit Protokoll wurden dann die Plasmide von den Kulturen isoliert.

Die Plasmidisolierungsmethode mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) wurde bei Benötigung großer Mengen von Plasmid-DNA aus E. coli vorgenommen. Hierfür wurden die Zellen mit den jeweiligen zu isolierenden Plasmiden je nach Kopienzahl in 100 bis 500 ml LB-Medium mit Antibiotikum-Zusatz über Nacht bei 37 °C und 200 rpm kultiviert. Von diesen Flüssigkulturen wurden dann nach den Angaben des Herstellers die Plasmide isoliert.

Die Plasmidisolierung mittels CsCl-Dichtegradientenzentrifugation (Sambrook et al., 1989) wurde angewandt zur Gewinnung hochreiner, konzentrierter Plasmide der ccc-Form. Diese Methode der Plasmidisolierung erfolgte für Plasmide, die für das Partikelbombardement eingesetzt wurden. Die Anzucht der Kulturen erfolgte wie beschrieben bei der Plasmidisolierungsmethode nach QIAGEN.

2.6.2 DNA-Aufreinigungstechniken

Die Aufreinigung von Plasmid-DNA z. B. nach Restriktionsverdau erfolgte bei den pBin-Konstrukten mit Phenol-Chloroform und anschließender Fällung mit Isopropanol (Sambrook et al., 1989).

Bei Plasmiden, deren Gesamtgröße kleiner als 10 kbp war, wurde die DNA-Reinigung mit dem Wizard™ DNA Clean-Up System (Promega) durchgeführt. Die Reinigung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers, wobei die DNA nach der Elution in Aqua bidest. vorlag.

Zur Klonierung gezielter DNA-Fragmente wurden Restriktionsverdaus elektrophoretisch im Agarosegel aufgetrennt und die entsprechende DNA-Bande aus dem Gel mit dem QIAquick™ Gel Extraktion Kit (Qiagen) nach den Angaben des Herstellers eluiert. Dieses Kit eignet sich nur zur Eluierung von DNA-Fragmenten der Größe 100 bis 10000 bp. Die DNA lag nach der Elution in Aqua bidest. vor.

DNA-Fragmente der Größe von 100 bis 10000 bp, die mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt wurden, wurden durch das QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt. Die Aufreinigung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers.

2.6.3 Fluorometrische DNA-Konzentrationsbestimmung

Die DNA-Konzentration wurde fluorometrisch mit dem DyNA Quant 200-Fluorometer (Hoefer - Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg) bestimmt. Diese Messung wird weder durch vorhandene RNA- noch Proteinverunreinigungen gestört. Die hochspezifische Erfassung der DNA erfolgt mit einem Farbstoff (Hoechst-Dye Solution 33258 Stammlösung, Frankfurt a. M.), der sich in die kleinen Furchen der DNA-Helix einlagert. Die DNA-Konzentrationsmessung erfolgte, nach Kalibrierung des Gerätes mit einem Standard, nach den Angaben des Herstellers.

2.6.4 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese erfolgte in Horizontalelektrophorese-Apparaturen (GIBCO BRL, Life Technologies, Eggenstein; Biometra, Göttingen). Je nach Anforderung wurden 0,8 bis 2,0 %ige Agarosegele eingesetzt. Den Gelen wurde zur Detektion der aufgetrennten DNA-Fragmente 5 µl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) zu 100 ml Agarose-Lösung zugegeben. Als Laufpuffer wurde 1x TBE-Puffer (100 mM Tris-HCl; 100 mM Borsäure; 1 mM EDTA, pH 8,0) verwendet. Die Laufzeit und angelegte Spannung variierte je nach Größe und Konzentration der Agarosegele zwischen 1 bis 3 Stunden bei 70 bis 140 V.

Zur Bestimmung der DNA-Fragmentgrößen wurden folgende DNA-Größenstandards (MBI Fermentas) mitgeführt: 100 bp DNA Ladder (100-1000 bp), 1 kbp DNA Ladder (ab 500 bp) und λ DNA/Eco130I (ab 1000 bp).

Von den Agarosegelen wurden mit Hilfe der Fotodokumentationsanlagen (Polaroid MP4+ Instant Camera System, Polaroid, Offenbach; INTAS Modellreihe 95KFE103, Rothhaar & Schroeder) Bilder erstellt.

2.6.5 Enzymatische Reaktionen

2.6.5.1 DNA-Restriktion

Die DNA-Restriktionsverdaus wurden nach den von den Herstellern der Enzyme (MBI Fermentas, New England Biolabs) empfohlenen Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchgeführt. Pro Verdau wurde ca. 50 bis 200 ng DNA und 8 bis 12 U der erforderlichen Restriktionsendonuklease eingesetzt. Die optimale Salzkonzentration wurde durch die Zugabe der entsprechenden Menge an 10x Enzympuffer erreicht. Weitere Zusätze wie BSA (Rinderserumalbumin) oder Triton TX-100 waren entweder im Enzympuffer enthalten (MBI Fermentas) oder wurden nach den vom Hersteller empfohlenen Richtlinien eingesetzt (New

England Biolabs). Die Inkubationszeit betrug 1 bis 2 Stunden. Die Inkubationstemperaturen richteten sich nach dem Temperaturoptimum der Restriktionsendonuklease.

Für präparative Zwecke erfolgte ein proportionales Scale-up des Standard-Restriktionsansatzes bis zu 200 µl.

Die Verdaus wurden anschließend mit 0,1 Volumen Bromphenolblau-Lösung (0,25 % Bromphenolblau, 40 % Saccharose in 1x TE pH 8,0) gestoppt.

2.6.5.2 Alkalische Phosphatase Behandlung

Für diese Reaktion wurde die `Calf Intestine Alkaline Phosphatase´ (CIAP, MBI Fermentas) verwendet. Das Reaktionsvolumen betrug 50 µl. Die DNA wurde nach der Restriktion sofort zur Phosphatase-Behandlung eingesetzt. Zum Verdau-Ansatz mit maximal 20 pmol DNA-Enden wurden 5 µl 10x Enzympuffer, sowie 1 µl (1 U) CIAP gegeben und ad 50 µl mit Aqua bidest. aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C für 30 Minuten. Die Denaturierung der Phosphatase erfolgte durch Erhitzen des Ansatzes bei 75 °C für 10 Minuten mit anschließender zweimaliger Phenolisierung. Danach wurde die DNA gefällt.

2.6.5.3 Auffüllreaktion mit Klenow-Enzym

Mit Hilfe des Klenow-Enzyms (MBI Fermentas) wurden die nach einer DNA-Restriktion erhaltenen 5´- kohäsiven Enden zu glatten Enden aufgefüllt. Die Auffüllreaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 30 µl mit maximal 1 µg DNA durchgeführt. Die Reaktion erfolgte entweder bei geeigneter Pufferkonzentration durch den Restriktionsansatz direkt nach dem Restriktionsverdau nach Aufreinigung der verdauten DNA durch das WizardTM DNA Clean-Up System (Promega GmbH) oder durch Phenol-Chloroform mit anschließender Fällung. Es wurden 1 µl (bei 20 µl Restriktionsverdau) oder 3 µl (nach Fällung) 10x Enzympuffer, 1 µl dNTP (4 mM) und 1 bis 5 U Klenow-Enzym zusammengegeben und auf ein Endvolumen von 30 µl mit Aqua bidest. aufgefüllt. Die Inkubation erfolgte für 1 Stunde bei 37 °C. Anschließend wurde die Reaktion für 15 Minuten bei 70 °C gestoppt. Nach dem Abkühlen des Ansatzes auf Raumtemperatur erfolgte die Reinigung der DNA (s. o.).

2.6.5.4 Ligation

Die Ligase-Ansätze erfolgten in einem Gesamtvolumen von 20 µl. Es wurden 50 bis 100 ng Insert-DNA eingesetzt. Die Menge an eingesetzter Vektor-DNA richtete sich nach der Anzahl der freien Enden des Inserts und wurde im Verhältnis 1:1 zueinander gegeben. Zum Ansatz wurden weiterhin 2 µl 10x Ligase-Puffer, 2 µl T4-DNA-Ligase (MBI Fermentas) gegeben und mit Aqua bidest. ad 20 µl aufgefüllt. Bei blunt-end Ligationen wurden maximal 5 % PEG 4000 vom Gesamtvolumen zugesetzt.

Blunt-end Ligationsansätze wurden mindestens drei Stunden bei RT und sticky-end Ligationsansätze über Nacht bei 12 °C im Wasserbad durchgeführt. Nach der Inkubation wurde der Ansatz, sofern er nicht sofort transformiert wurde, bei –20 °C gelagert.

2.6.6 Transformation

Die in dieser Arbeit untersuchten Bakterienstämme wurden auf unterschiedliche Weise transformiert.

Der E. coli K-12 Stamm DH5α wurde mit der Hitzeschock-Methode nach Hanahan (1983) transformiert. Die nach dieser Methode hergestellten kompetenten Zellen wurden entweder direkt mit 10 µl eines Ligationsansatzes oder 10 bis 100 ng eines Plasmids transformiert oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –75 °C mehrere Monate aufbewahrt.

Y. enterocolitica, A. tumefaciens und P. putida wurden durch Elektroporation mit dem Elektroporator Easy jecT (Equi Bio, Angleur, Belgien) transformiert.

Das Protokoll zur Transformation von Y. enterocolitica ist beschrieben in Lewin et al. (1998).

Die elektrokompetenten Zellen von A. tumefaciens wurden nach dem Protokoll von Nagel et al. (1989) hergestellt. Hierfür wurde der Stamm jedoch nicht wie beschrieben in YEP-Medium, sondern in TY-Medium angezogen. Zur Regeneration der elektroporierten Zellen wurde SOC-Medium (Sambrock et al., 1989) statt YEP-Medium eingesetzt.

Die Herstellung elektrokompetenter P. putida-Zellen, sowie deren Elektroporation wurden nach dem Protokoll von Artiguenave et al. (1997) mit den Elektroporationsparametern 12,5 kV cm-1, 25 µF, 200 Ω und einer Pulszeit von 5 ms durchgeführt.

Die elektrokompetenten Zellen, die nicht sofort transformiert wurden, wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –75 °C mehrere Monate gelagert.

Die Filtertransformation von Acinetobacter sp. BD413 wurde nach der Beschreibung von Nielsen et al. (1997) vorgenommen.

2.6.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR (Mullis und Faloona, 1987) ist ein in vitro-Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und Sequenz aus einem Nukleinsäuregemisch.

Bei der Reaktion wird die doppelsträngige DNA der Probe durch Erhitzen auf 95 °C in ihre Einzelstränge getrennt (Denaturierung). Danach wird die Probe auf eine Temperatur abgekühlt, die für die Hybridisierung der Primer an ihrer Zielsequenz optimal ist (Primer Annealing), so daß für die Taq-Polymerase ein doppelsträngiger Startpunkt für die Auffüllreaktion des DNA-Einzelstranges entsteht (Elongation). Eine Temperaturerhöhung auf 72 °C verschafft optimale Bedingungen für die Amplifikation der DNA durch die Taq-Polymerase. Durch Wiederholung des Zyklus von Denaturierung, Primer Annealing und Elongation wird eine exponentielle Vermehrung der Ziel-DNA erreicht.

Die PCR-Amplifikationen erfolgten in den Thermocyclern GeneAmp® PCR System 2400 und 9700 (PE Applied Biosystems).

2.6.7.1 PCR zur Amplifizierung definierter Promotorsequenzen

Die PCR, deren Reaktionsansatz und Temperaturprofil des Thermocyclers in Tab. 17 dargestellt sind, wurde zur Amplifizierung der Promotorsequenzen von P KST1, P KCO1, P NptIII, P Bla, P PsbA, P RbcL, P AccD, P RpoB, P AtpB und P ClpP eingesetzt. Die jeweiligen Primer enthielten Restriktionsschnittstellen, die ein gezieltes Klonieren der PCR-Produkte in die jeweiligen Vektoren ermöglichte.

Tab. 17 : PCR-Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen zur Amplifikation definierter Promotorsequenzen. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer. ** Der gewählte Zeitraum für die Elongation war abhängig von der Größe des zu amplifizierenden Nukleinsäure-Fragmentes (ca. 1 min/1 kbp zu amplifizierendes Nukleinsäure-Fragment).

Reaktionsansatz

Temperaturprofil

0,1 – 1

ng

Template-DNA

   

10

µl

10x PCR-Puffer

5 min

95 °C

1x

8

µl

25 mM MgCl2

1 min

95 °C

 

10

µl

2 mM dNTP-Mix

30 s

55 – 60 °C*

35x

je 150

ng

Primer

1 –2 min**

72 °C

 

2,5 U Taq DNA-Polymerase

7 min

72 °C

1x

ad 100

µl Aqua bidest.

4 °C

 

2.6.7.2 Direkt-PCR

Die Direkt-PCR ermöglichte den Nachweis von inserierter DNA richtiger Orientierung in einem Vektor ohne vorherige Isolierung der DNA. Für diesen Zweck wurden Flüssigkulturen der zu überprüfenden Klone über Nacht angezogen. 1 µl dieser Kultur dienten im PCR-Ansatz (siehe Tab. 18) als Template.

Tab. 18 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Direkt-PCR. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer.

Reaktionsansatz

Temperaturprofil

1,0

µl

Template-Kultur

   

2,5

µl

10x PCR-Puffer

10 min

95 °C

1x

1,5

µl

25 mM MgCl2

20 s

95 °C

 

2,5

µl

2 mM dNTP-Mix

20 s

53 – 60 °C*

35x

je 75

ng

Primer

1 min

72 °C

 

0,5 U Taq DNA-Polymerase

7 min

72 °C

1x

ad 25

µl

Aqua bidest.

4 °C

 

2.6.7.3 Megaprimer PCR

Die Methode der Megaprimer PCR ist ein in vitro-Verfahren zur Einführung von Basenaustauschen oder Deletionen in die zu amplifizierenden Nukleinsäure-Sequenzen (Abb. 7; Barik, 1996). Zur Einführung der gewünschten Modifikation werden zwei PCR-Runden benötigt, die mit drei verschiedenen Primern durchgeführt werden. In der ersten PCR-Runde wird ein Primer mit gewünschter Modifikation (Mismatch-Primer) in Kombination mit einem zweiten Primer eingesetzt. Das resultierende Amplifikat enthält den jeweilig gewünschten Basenaustausch oder die Deletion und wird in einer zweiten PCR-Runde in Kombination mit einem dritten Primer als Megaprimer eingesetzt.

Abb. 7 : Schematische Darstellung der Megaprimer PCR. Primer 1 stellt den Mismatch-Primer dar

(■ = Mismatch).

Bei der Megaprimer-PCR sollte darauf geachtet werden, dass die eingesetzte Polymerase keine `proof-reading´-Aktivität besitzt. Die Reaktionsansätze und Thermocycler-Bedingungen sind in Tab. 19 dargestellt. Entgegen herkömmlichen PCR-Protokollen wird die Template-DNA in der zweiten PCR-Runde im μg-Bereich eingesetzt. Dieses verhindert ein `selfannealing´ der Megaprimer.

Tab. 19 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Megaprimer PCR. In der 1. PCR-Runde wurden die Megaprimer hergestellt, welche in der 2. PCR-Runde zur Synthese der Promotor-DNA eingesetzt wurden. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer.

Reaktionsansatz

Temperaturprofil

1. PCR-Runde

   

1,0

ng

Template-DNA

7 min

96 °C

1x

10,0

µl

10x PCR-Puffer

1 min

96 °C

 

8,0

µl

25 mM MgCl2

30 s

56 bzw. 60 °C*

35x

10,0

µl

2 mM dNTP-Mix

1 min

72 °C

 

150

ng

Primer

7 min

72 °C

1x

150

ng

Mismatch-Primer

4 °C

 

2,5 U Taq DNA-Polymerase

   

ad 100

µl

Aqua bidest.

   

2. PCR-Runde

   

1,0- 5,0

µg

Template-DNA

7 min

96 °C

1x

10,0

µl

10x PCR-Puffer

1 min

96 °C

 

8,0

µl

25 mM MgCl2

2 min

60 °C

35x

10,0

µl

2 mM dNTP-Mix

2 min

72 °C

 

150

ng

Primer

7 min

72 °C

1x

150

ng

Mismatch-Primer

4 °C

 

2,5 U Taq DNA-Polymerase

   

ad 100

µl

Aqua bidest.

   

2.6.7.4 Sondenherstellung mittels PCR

Bei bekannter DNA-Sequenz ist die Amplifizierung eines DNA-Fragmentes mit gleichzeitiger Markierung durch fluoreszenzmarkierte Nukleotide möglich. Diese fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente werden als Sonden zur Detektion spezifischer DNA oder RNA mittels Hybridisierung eingesetzt.

Für die Markierung solcher DNA-Fragmente wurde der PCR Fluorescein Labeling Mix (Roche Diagnostics) eingesetzt. Zur Herstellung der Sonden wurden die von der Herstellerfirma empfohlenen PCR-Protokolle verwendet.

2.6.8 Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung erfolgte nach dem Prinzip des Kettenabbruch- oder Didesoxynukleotidverfahrens nach Sanger et al. (1977).

Die Reaktion wurde nach den in Tab. 20 aufgezeichneten Bedingungen mit dem ABI PRISM® FS Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems) und den im Kapitel 2.6.7beschriebenen Thermocycler durchgeführt.

Tab. 20 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Sequenzierung. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer. ** Der Hersteller macht keine Angaben über die genaue Zusammensetzung.

Reaktionsansatz

Temperaturprofil

250

ng

DNA

2 min

96 °C

1x

3

µl

Big Dye**

10 s

95 °C

 

30 ng Primer

5 s

42 – 60 °C*

25x

ad 10

µl

Aqua bidest.

4 min

72 °C

 
   

4 °C

 

Die Reinigung und Fällung der Sequenzieransätze erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Proben wurden auf 4,8 %ige PAGE-Plus-Gele aufgetrennt und mit dem ABI PRISM® 377 DNA Sequencer (PE Applied Biosystems) analysiert.

Zur Auswertung der Sequenzdaten wurden die Programme Factura 2.2.0 und Auto Assembler 2.1 (PE Applied Biosystems) verwendet. Die Analyse der Sequenzen erfolgte mit dem Programm Mac Vector 6.5.3 (Oxford Molecular Group).

2.7 RNA-Techniken

2.7.1 RNA-Isolierung

Die RNA-Isolierung erfolgte mit dem SV RNA Isolation System Kit (Promega) und wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Für die Isolierung der RNA aus Bakterien ist es wichtig, dass die Flüssigkulturen in kürzester Zeit auf eine optische Dichte von 0,6 bis 1,0 bei einer Wellenlänge 600 nm (OD600) heranwachsen. Weitere wichtige Schritte sind die Inaktivierung endogener RNasen, sowie der DNase-Verdau, welche in dem Kit beinhaltet waren.

2.7.2 RNA-Konzentrationsbestimmung

Zur Bestimmung der RNA-Konzentration wurde eine 1:50 oder 1:100 Verdünnung der RNA mit Aqua bidest. hergestellt und diese in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge λ = 260 nm gemessen. Eine Absorption A260 von 1,0 entspricht einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Zur Untersuchung der Reinheit der RNA wurde diese Verdünnung ebenfalls bei einer Wellenlänge λ = 280 nm gemessen. Das Verhältnis der Absorptionen von A260/A280 liegt bei einer Protein-, DNA-freien RNA-Präparation zwischen 1,9 und 2,1.

2.7.3 RNA-Gelelektrophorese

Zur weiteren Untersuchung der RNA mittels Northern Hybridisierung wurden denaturierende Agarosegele mit Formaldehyd erstellt. Hierbei wurde das Protokoll aus Sambrook et al. (1989) optimiert.

Um RNA der Größe von 2000 bis 3000 Basen im Blot nachzuweisen, eignet sich ein 1,3 %iges denaturierendes Agarosegel. Für ein Agarosegel mit z. B. dem Volumen von 110 ml wurden 1,43 g Agarose, 11 ml 10x FA-Gelpuffer (0,2 M MOPS; 50 mM NaAcetat; 10 mM EDTA; pH 7,0 mit NaOH) und 99 ml DEPC-Wasser (0,1 %) zueinander gegeben, aufgekocht und auf 65 °C abgekühlt. Nach Zugabe von 1,26 ml 37 %iges Formaldehyd polymerisierte das Gel ohne Zusatz von Ethidiumbromid in der vorgesehenen Kammer.

Als Laufpuffer wurde der 10x FA-Gelpuffer mit entsprechender Menge von DEPC-Wasser versetzt. Zusätzlich wurde 37 %iges Formaldehyd in einem Anteil von 1/50 zum Endvolumen des Laufpuffers gegeben.

Vor dem Beladen des Gels mit den RNA-Proben, lief dieses 30 Minuten bei 5 bis 7 V/cm vor. Vier Teile der RNA-Probe (max. 30 µg) sowie 5 µl des RNA-Markers (Promega) wurden mit einem Teil 5x Beladungspuffer (16 µl Bromphenolblau-Lösung; 80 µl 0,5 M EDTA, pH 8,0; 720 µl 37 % Formaldehyd; 2 ml 100 % Glycerol; 3084 µl Formamid; 4 ml 10x FA-Gelpuffer; ad 10 ml DEPEC-Wasser) versetzt, 3 bis 5 Minuten auf 65 °C erhitzt und auf Eis abgekühlt.

Der Gellauf erfolgte ebenfalls bei 5 bis 7 V/cm. Die Puffer der beiden Kammern wurden stündlich durchmischt, um eine Ionenkonzentrierung zu vermeiden.

Nach dem Lauf wurden die Spuren das Markers abgeschnitten und über Nacht im Ethidiumbromid-Bad (5 µl Ethidiumbromidlösung [10 mg/ml] zu 100 ml DEPC-Wasser) gefärbt.

2.7.4 Northern Hybridisation und Visualisierung

Um das Gel auf eine Membran (Hybond N+, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg) zur Hybridisierung zu übertragen, wurde ein Kapillarblot (Sambrook et al., 1989) durchgeführt.

Die Hybridisierungen und Visualisierungen wurden mit dem Renaissance® Kit (NENLife Science Products) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Hierbei wurden die fluoreszenzmarkierten Sonden mit Hilfe der indirekten Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Dabei schließt sich dem Hybridisierungsschritt eine Inkubation mit einem Antikörperkonjugat an. Die nachfolgende katalytische Reaktion bewirkt eine Lichtemission, welche mit einem Chemilumineszenz-Film (Lumi-Film, Chemiluminescent Detection Film, Boehringer Mannheim) detektiert wurde und die Lage der RNA-Hybridmoleküle zeigt.

2.7.5 Bestimmung des Transkriptionsstarts mittels 5´-RACE

Die Methode der `Rapid Amplification of cDNA Ends´ (RACE) dient zur Charakterisierung von mRNA-Enden (Frohman et al., 1988). Dabei wird die Nukleinsäuresequenz einer mRNA-Matrize zwischen einer definierten Sequenz und einer unbekannten Sequenz am 3´- oder 5´-Ende der mRNA amplifiziert (Abb. 8).

Mit Hilfe des 5´-RACE System (Life Technologies)wurden die Transkriptionsstarts in dieser Arbeit charakterisiert. Dabei wurden aus der Gesamt-RNA mit Hilfe des genspezifischen Primers 1 (GSP1) und der Reversen Transkriptase (RT´) komplementäre DNA-Stränge (cDNA) der zu untersuchenden mRNA gebildet. Bei der Auswahl der Nukleotidsequenz des GSP1 sollte darauf geachtet werden, dass die Schmelztemperatur (Tm) des Primers nahe der optimalen Elongationstemperatur der RT´ liegt. Die verwendete SuperScript II RT´ ist nur bis 50 °C hitzestabil. Nach Degradierung der mRNA aus der Heteroduplex mit Hilfe eines RNase Mix, wurde die cDNA gereinigt. Durch die Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) und Zugabe von dCTP´s wurde das 3´-Ende der cDNA mit einem Cytosin-Schwanz (C-Schwanz) versehen (`tailing´). Zur Amplifizierung der getailten cDNA wurde ein weiterer genspezifischer Primer (GSP2) und ein im Kit enthaltener Anker-Primer (AAP) eingesetzt. Der Anker-Primer bindet an dem C-Schwanz der cDNA und beinhaltet zur Erniedrigung der Tm Inosin statt Guanin, sowie Restriktionsschnittstellen zur Klonierung der amplifizierten Nukleinsäure-Fragmente. Dem kann noch eine Nested-PCR mit einen weiteren genspezifischen Primer (GSP3) und dem `Abridged Universal Amplification Primer´ (AUAP) angeschlossen werden.

Abb. 8 : Schematische Darstellung der 5´-RACE.

Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit dem PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und konnten hinterher direkt sequenziert oder kloniert werden.

Die einzelnen Reaktionsschritte der 5´-RACE wurden mit den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen und Reaktionsbedingungen durchgeführt. Das Temperaturprofil der PCR der dC-getailten cDNA sowie der Nested-PCR ist in Tab. 21 dargestellt.

Tab. 21 : Temperaturprofil der 5´-RACE-PCR. * Zur Elongation wurde der ELONGase Ezyme Mix (Life Technologies ) eingesetzt, welcher bei einer Temperatur von 68 °C das Aktivitätsoptimum besitzt.

Temperaturprofil

2 min

94 °C

1x

1 min

94 °C

 

30 s

65 °C

35x

2 min

68 °C*

 

10 min

68 °C

1x

4 °C

 

2.7.6 TaqMan® Universal RT-PCR

Das TaqMan® System (PE Applied Biosystems) ist eine auf PCR beruhende Methode, bei der die Amplifikationsreaktion durch den Einsatz einer zusätzlichen Fluoreszenz-gekoppelten Oligonukleotid-Sonde verfolgt und quantifiziert werden kann (Abb. 9).

Die sequenzspezifische Oligonukleotid-Sonde ist am 5´-Ende mit einem Reporterfarbstoff (Fam, 6-Carboxy-Fluorescein) und am 3´-Ende mit einem Quencher-Molekül (Tamra, 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin) versehen. Ihre Sequenz ist so gewählt, dass sie zeitlich vor den PCR-Primern zwischen deren Bindungsstellen auf der Zielsequenz bindet. Solange die Sonde intakt ist, unterdrückt das Quenching-Molekül durch die räumliche Nähe, das durch Anregung entstehende Signal des Reporterfarbstoffes. Bei der Elongation der Primer zerlegt die Taq-Polymerase aufgrund ihrer 5´-3´-Exonuklease die Sonde in ihre Nukleotide. Durch die Trennung von Reporterfarbstoff von dem Quencher-Molekül kommt es zur Detektion des Reporterfarbstoffes. Aus dem Anstieg der freien Reporterkonzentration ergibt sich ein wachsendes Fluoreszenzsignal, das proportional zu der Anzahl des PCR Produkts ist. Der Zeitpunkt, bei dem ein signifikanter Anstieg des Signals erfolgt, erlaubt Rückschlüsse auf die Anfangskonzentration der zu quantifizierenden Nukleinsäure.

Abb. 9 : Schematische Darstellung der TaqMan® PCR.

Die TaqMan®PCR wurde zur Bestätigung der Ergebnisse der Lumineszenz-Messung herangezogen. Hierbei wurden die nach Isolierung der Gesamt-RNA aus verschiedenen Bakterienstämmen gewonnenen luxAB-mRNA Moleküle quantifiziert.

Die Reaktion des Umschreibens der mRNA in die cDNA durch die Reverse Transkriptase (RT´) und die nachfolgende quantitative PCR wurden in einem Schritt mit dem Titan One Tube RT´-PCR System (Roche) und denen in Tab. 22 aufgeführten Bedingungen durchgeführt. Zur Konzentrationsberechnung der Proben wurde eine Standardreihe des Plasmids pKKlux mit den Konzentrationen 730 pg/µl (Standard 1) bis 0,073 pg/µl (Standard 5) mitgeführt.

Tab. 22 : Protokoll der quantitativen RT-PCR. * Die genaue Zusammensetzung wurde vom Hersteller nicht angegeben.

Reaktionsansatz

Temperaturprofil

100 Gesamt-RNA bzw.

  

X pg Standard-DNA (s.o.)

   

10,0 µl 5 x RT´-PCR-Puffer *

cDNA-Synthese

0,5 µl 100 µM Rox-Farbstoff

   

1,0 µl RNase- Inhibitor (40 U/µl)

30 min

50 °C

1x

5,0 µl 2 mM dNTP-Mix

   

2,5 µl 100 mM DTT

10 min

95 °C

1x

2,0 µM Fam-Sonde-Tamra

30 s

95 °C

 

0,5 µl Primer lux2270F (150 ng)

1 min

60 °C

35x

0,5 µl Primer lux2329R (150 ng)

4 °C

 

1,0 µl Enzym-Mix (RT/Taq-Polymerase)

   

ad 50 µl DEPC-Wasser

   

Die TaqMan® PCR und deren Auswertung wurde mit dem ABI PRISM 7700 Sequence Detektor (PE Applied Biosystems) durchgeführt.

2.8 Lumineszenz-Messung

Die Bakterienkulturen mit den Fusionen aus den zu untersuchenden Promotoren und den promotorlosen luxAB aus V. harveyi wurden zur Ermittlung der Expressionsstärke auf Biolumineszenz untersucht. Die Lumineszenzmessungen wurden mit dem Microlumat LB96P (Berthold GmbH & Co. KG) durchgeführt.

Die zur Lumineszenz-Messung angezogenen Bakterienkulturen wurden in den jeweiligen Flüssigmedien (siehe Kap. 2.3) in einem Schüttelinkubator bei 28 °C und 200 rpm bis zu einer OD600= 1,0 bis 1,3 (OD600= 1,0 entspricht einer Zellzahl von 109 Zellen/ml) inkubiert. Nach Verdünnung der Kulturen der stationären Phase auf eine Zellzahl von 106 Zellen/ml, wurde die Lumineszenz von 100 µl der verdünnten Kultur über eine Zeitspanne von 10 s bei 28 °C im Luminometer gemessen. Als Substrat wurde zu jeder Probe 50 µl Dekanal-Lösung (2 %iges Dekanal in 50 mM Na-Phosphatpuffer, pH 7,0) injiziert. Von jeder Probenverdünnung wurde eine Dreifachbestimmung durchgeführt.

Die Auswertung der Daten erfolgte mit der am Luminometer angeschlossenen Software (Instrument Software Version 2.01, Programm Win Glow, Berthold GmbH & Co. KG). Von dem aufgezeichneten Kurvenverlauf der Messung wurde mit Hilfe dieser Software das Integral

über den Zeitraum von 10 s gebildet und als Meßergebnis in Relative Lichteinheiten (RLU) dargestellt. Die Werte der Dreifachbestimmung wurden gemittelt.

Als Screening einer erfolgreichen Klonierung mit luxAB und anschließender Transformation des Plasmids in die zu untersuchenden Bakterienzellen, wurden die Lumineszenzen direkt von den unverdünnten stationären ü. N.-Kulturen gemessen.

2.9 Nachweis der Chloramphenicol-Acetyltransferase

Kulturen von E. coli mit den Fusionen aus den zu untersuchenden Promotoren und dem promotorlosen cat-Gen des Vektors pKK232-8 wurden auf LB-Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Chloramphenicol (5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml und 30 µg/ml) auf Expressionsstärke untersucht.

Hierfür wurden die Bakterienkulturen in LB flüssig mit Ampicillin (100 µg/ml) in einem Schüttelinkubator bei 37 °C und 200 rpm ü. N. inkubiert. Nach Bestimmung der OD600 wurden die Kulturen so verdünnt, dass pro LB-Agarplatte mit Chloramphenicol zwischen 102 bis 103 Zellen ausplattiert wurden. Zur Berechnung des prozentualen Anteils gewachsener Kolonien mit und ohne Antibiotikum, wurde von derselben Verdünnungsstufe der jeweiligen Kultur eine LB-Agarplatte ohne Chloramphenicol angelegt. Die Kolonien der antibiotikumhaltigen Platten wurden nach 48 h und die der Platten ohne Antibiotikum nach 24 h Inkubation bei 37 °C ausgezählt.

2.10 Biolistischer Gentransfer

Bei der Transformation von Pflanzen mit Hilfe der Partikelkanone (Klein et al., 1989b) werden kleine mit DNA beschichtete Gold- oder Wolframpartikel (Microcarrier) durch eine Helium getriebene Partikelkanone in intakte Pflanzenzellen hineingeschossen. Bei Eintritt in die Pflanzenzellen wird die DNA von den Partikeln abgestreift. Die Expression der eingeführten rekombinanten DNA beginnt, wenn die DNA in den Zellkern oder in die Plastiden gelangt. Die DNA kann entweder in das Pflanzengenom integriert werden und es kommt zur stabilen Transformation. Häufiger ist jedoch das Verbleiben der DNA im freien Zustand im Zellkern mit anschließendem Abbau durch nukleolytische Enzyme. Hierbei wird eine transiente Expression erzeugt.

2.10.1 Vorbereitung der Microcarrier

Als Microcarrier wurde Goldpuder verwendet. Hierfür wurden 30 mg Goldpuder (1 µm, Bio-Rad Laboratories, München) mit 1 ml 70 %igen EtOH versetzt, 5 min gevortext und nach 1 min absetzen kurz zentrifugiert, damit der Überstand abgehoben werden kann. Anschließend folgt ein dreimaliges Waschen des Goldpellets mit je 1 ml Aqua bidest. Die Suspension wurde 2 min gevortext, der Überstand nach 1 min absetzen kurz zentrifugiert und abgenommen. Das Goldpellet wurde in 500 µl sterilem 50 %igen Glycerin resuspendiert (Endkonzentration 60 mg/ml).

2.10.2 Gold-Coating-Ansatz

Für drei Schuss werden unter ständigem Rühren 25 µl Gold (60 mg/ml) mit 3 µg Plasmid DNA, 25 µl 2,5 M CaCl2-Lösung und 10 µl 0,1 M Spermidin-Lösung gemischt, 3 min gevortext und nach 1 min absetzen kurz zentrifugiert. Der Überstand wurde abgehoben und der Coating-Ansatz mit je 140 µl 70 %igen EtOH und absolutem EtOH gewaschen. Nach Zugabe von 24 µl absolutem EtOH zum Coating-Ansatz wurde dieser resuspendiert und je 8 µl des Ansatzes auf je einen Macrocarrier pipettiert und getrocknet.

2.10.3 Vorbereitung der Pflanzen

Für das Partikelbombardement wurden von 1 bis 2 Monate alten sterilen N. tabacum Blättern mit dem `Korkbohrer 5´ Blattscheiben hergestellt. Vier dieser Blattscheiben wurden in eine Petrischale gelegt, mit MS-Medium (Murashige and Skoog Basalmedium, Tomes et al., 1990) mit 2 % Saccharose bedeckt, und über Nacht bei 23 °C unter Licht in Gewebekulturkammern aufbewahrt.

2.10.4 Partikelbombardement

Das Bombardement erfolgte mit dem Modell `PDS 1000/He biolistic particle delivery system´ von Bio-Rad (München). Es wurden 1100 psi `rupture disks´ verwendet. Die Macrocarrier mit dem zu untersuchenden Coating-Ansatz wurden in die Haltevorrichtungen eingebaut. Die Petrischalen mit den Tags zuvor hergestellten Blattscheiben in MS-Medium wurden auf die Plattform in die 2. oder 3. Ebene geschoben. Nachdem das Gerät geschlossen wurde, wurde ein Vakuum mit 26 inch Hg angelegt und der Schuß ausgelöst. Nach dem Beschuß wurde die Kammer wieder belüftet (20 s.) und die Proben entnommen. Die Petrischalen mit den

bombardierten N. tabacum Blattscheiben in MS-Medium wurden wiederum 2 Tage bei 23 °C und Licht in den Gewebekulturkammern aufbewahrt.

2.10.5 Gus-Nachweis

Für den transienten Nachweis der β-Glucuronidase wurden die Blattscheiben in eine Petrischale mit GUS-Färbelösung (Mendel et al., 1989) überführt. Die Blattscheiben wurden in der Lösung bei 37 °C über Nacht im Dunkeln inkubiert. Bei einer Expression des gus-Gens wird der Farbstoff 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (X-Gluc) durch die β-Glucuronidase hydrolysiert und es kommt zur Blaufärbung des Pflanzengewebes. Um das Chlorophyll aus den Blättern zu entfernen, wurden die Blattscheiben am darauffolgenden Tag mit 70 % EtOH bei 72 °C über Nacht gewaschen. Die Aufbewahrung der Blattscheiben erfolgte ebenfalls in 70 %igen EtOH im Kühlschrank.


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16.02.2004