3 Ergebnisse und Auswertung

3.1 Untersuchung der pflanzenspezifischen Promotoren in Eubakterien

Die Abb. 10 beschreibt die schematische Vorgehensweise der Untersuchung der pflanzenspezifischen Promotoren.

Es wurden die Promotoren P 35S aus CaMV, P Nos aus A. tumefaciens und P RolC aus A. rhizogenes, die Promotoren P B33, P ST-LS1, P KST1, P FBP1,1, P FBP1,7 und P SKT2 aus S. tuberosum,die Promotoren P 130 und P 247 aus N. tabacum und der Promotor P KCO1 aus A. thaliana untersucht (Kap. 1.3, Tab. 3).

Fusionen der pflanzenspezifischen Promotoren mit den promotorlosen luxAB-Genen aus V. harveyi wurden in den für Promotorstudien hergestellten Vektor pKK232-8 und in den Pflanzentransformationsvektor pBin19 kloniert. Die pKK-Konstrukte wurden in E. coli und diepBin-Konstrukte in E. coli, Y. enterocolitica, A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. BD413 transformiert (siehe (1) in Abb. 10) und auf Biolumineszenz (2) untersucht. Zur Bestätigung der durch die Biolumineszenz-Messungen ermittelten Genexpressionsstärken wurde mit der RNA ausgewählter Transformanten, die die beschriebenen Fusionen enthielten, quantitative RT-PCR und Northern Hybridisierung (3) durchgeführt.

Weiterhin ermöglichten Promotor-cat-Fusionen in dem Vektor pKK232-8 in E. coli den phänotypischen Nachweis einer heterologen Genexpression als Wachstum auf Agarplatten mit Chloramphenicol (4).

Für die Promotoren P 35S, P ST-LS1, P Nos und P KST1 wurden mittels 5´-RACE die Transkriptionsstarts bestimmt (5). In Abhängigkeit der Transkriptionsstarts konnte eine Zuordnung der von der bakteriellen DNA-abhängigen RNA Polymerase erkannten –35- und –10-Konsensus Sequenzen stattfinden. Für den P ST-LS1 wurden mehrere Mutanten mit ortsspezifischen Basenaustauschen in der –10-Konsensus Sequenz hergestellt (6). Die Genexpression der Mutanten wurde wiederum mit Hilfe der Biolumineszenz analysiert. Weiterhin fand eine Charakterisierung der Transkripte mittels Northern Hybridisierung und 5´-RACE statt.

Für die Untersuchung der Genexpression in N. tabacum wurden die Mutanten und der Wildtyp P ST-LS1 in den Pflanzentransformationsvektor pBi101.2 kloniert (7). Dieser besitzt zur Bestimmung der Expressionsstärke in Pflanzen ein promotorloses β-Glucuronidase Gen (gus). Die Expression des gus-Gens ausgehend von den mutagenisierten Promotoren konnte nach dem Partikelbombardement nachgewiesen werden (8).

Abb. 10 : Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Untersuchung der pflanzenspezifischen Promotoren (nähere Erläuterung siehe Text).

3.1.1 Klonierungsarbeiten

Insgesamt wurden in dieser Arbeit zwölf pflanzenspezifische Promotoren auf Genexpression in Bakterien untersucht. Acht der Promotoren wurden im Rahmen der Arbeit sowohl in den Pflanzentransformationsvektor pBin19 (Bevan, 1984; siehe Kap. 6.1.1, Abb. 43) als auch in den Promotorstudienvektor pKK232-8 (Brosius, 1984; siehe Kap. 6.1.5, Abb. 47) kloniert. Die Konstrukte mit den Fusionen aus den Promotoren P 35S, P B33, P ST-LS1 und P RolC mit den luxAB-Genen in pBin19 (siehe Kap. 3.1.1.1, Abb. 13) und pKK232-8 (siehe Kap. 3.1.1.2, Abb. 15), sowie pKKlux als Negativ-Kontrolle (siehe Kap. 6.1.6, Abb. 48) sind im Rahmen der Diplomarbeit entstanden und wurden in die weiteren Genexpressionsstudien integriert.

Die Plasmide, aus denen die Promotoren für die Klonierungsarbeiten gewonnen wurden, sind in Kap. 2.2.4, Tab. 8 aufgeführt. Die Abb. 11 zeigt eine schematische Darstellung der MCS der Ausgangsderivate. Die luxAB-Gene, die mit den Promotoren fusioniert wurden, wurden aus den Plasmiden Mini-Tn5luxAB (De Lorenzo et al., 1990; Herrero et al., 1990; siehe Kap. 6.1.9, Abb. 51) oder pBinlux-SalI (siehe Kap. 6.1.2, Abb. 44) gewonnen.

Die erzeugten Plasmide, welche durch die Fusionen der Promotoren mit den luxAB-Genen in den jeweiligen Vektoren entstanden sind, werden innerhalb dieser Arbeit als Konstrukte bezeichnet.

Zur Beurteilung der Höhe der Genexpression der heterologen Promotoren wurde der Lac-Promotor als homologer Promotor mit den luxAB-Genen fusioniert und dessen Genexpressionsstärke mitaufgeführt.

3.1.1.1 Herstellung der pBin-Konstrukte und Transformation in E. coli, Y. enterocolitica, A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. BD413

Die Klonierungsschritte zur Herstellung der pBin-Konstrukte wurden aufgrund unterschiedlicher Vektoren und dem Vorhandensein verschiedenster Restriktionsschnittstellen in den DNA-Sequenzen der Promotoren unterschiedlich durchgeführt. Bei den Derivaten pBinG130, pBinG247 und pFBPase1,1 lagen die Promotoren bereits in dem Vektor pBin19 vor, so dass nur die Klonierung der luxAB-Gene erfolgen musste.

Zur Insertion der luxAB-Gene wurden die Plasmide pBinG130 mit BamHI, pBinG247 und pFBPase1,1 mit SalI restringiert. Die luxAB-Gene wurden zur Insertion in die linearisierten Promotor-Derivate als BamHI-Fragment aus dem Plasmid pBinlux-SalI und als SalI-Fragment aus dem Plasmid Mini-Tn5luxAB isoliert. Abb. 12 zeigt den unterschiedlichen

Abb. 11 : Schematische Darstellung der MCS der Ausgangsderivate mit den pflanzenspezifischen Promotoren. Die pBin19-Derivate (pBinG130, pBinG247 und pFBPase1,1) weisen stromabwärts der Hin dIII-Schnittstelle in antisense den Lac-Promotor ( ) auf. Die Transkriptionstermination stammt aus dem Octopin-Synthase Gen (ocs). Die pBi101-Derivate (pME1, pBi101-SKT2 und pDKP3) bzw. das pGPTV-HPT–Derivat (pPK-Gus-4) besitzen zum Nachweis der Genexpressionsstärke der Promotoren in Pflanzen ein promotorloses β -Glucuronidase Gen (gus ) und die Transkriptionstermination des Nopalin-Synthase Gens (nos).

Aufbau des Transposon-Bereichs des Plasmides Mini-Tn5luxAB (a) im Vergleich zu der MCS mit dem luxAB-Fragment aus pBinlux-SalI (b). Die 3,2 kbp große DNA-Bande mit den luxAB-Genen wurde mit der BamHI restringierten DNA des Plasmides pBinG130 bzw. der SalI restringierten DNA der Plasmide pBinG247 und pFBPase1,1 ligiert. Die Ligationsansätze wurden in E. coli DH5α–Zellen transformiert.

Abb. 12 : Schematische Darstellung der lux AB-Gene mit Restriktionsschnittstellen a des Transposon-Bereichs des Mini-Tn5lux AB (de Lorenzo et al. , 1990) und b der MCS des pBinlux-SalI mit dem Lac-Promotor (Pfeil).

Zur Herstellung der weiteren Konstrukte wurden sowohl die DNA der Promotor-Fragmente als auch die luxAB-Gene in pBin19 kloniert. Die DNA der Promotoren P FBP1,7 und P SKT2 wurde nach Restriktion der Fragmente kloniert. Die DNA-Fragmente der Promotoren P Nos, P KST1 und P KCOI wurden mittels PCR und sequenzspezifischen Primern hergestellt. Durch Integration von Restriktionsschnittstellen in die Oligonukleotide konnten die PCR-Fragmente in die Vektoren kloniert werden.

Durch BamHI-Restriktion wurden die DNA-Fragmente mit P FBP1,7 und P SKT2 gewonnen. Die Promotor-Fragmente wurden in den BamHI restringierten Vektor pBin19 kloniert. Der Ligationsansatz wurde in E. coli DH5α transformiert.

Die DNA der Fusion des pBin19 mit P FBP1,7 wurde zur Insertion der luxAB-Gene mit SalI und die DNA des Klons mit der Fusion des pBin19 mit P SKT2 mit SalI und HindIII restringiert. Zur Klonierung der luxAB-Gene wurde das Plasmid Mini-Tn5luxAB mit SalI bzw. HindIII und SalI geschnitten und das jeweilige 3,2 kbp große DNA-Fragment isoliert. Anschließend wurden die entsprechenden DNA-Fragmente miteinander ligiert und in E. coli DH5α transformiert.

Für die Promotoren P KST1, P KCO1 und P Nos, welche mittels PCR hergestellt wurden, dienten als Template-DNA pDKP3 (P KST1), pPK-Gus-4 (P KCO1) und pBin19 (P Nos). Zur Herstellung des P Nos wurde mit den Primern Nos-S1 und Nos-AS1 ein ca. 500 bp großes DNA-Fragment amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde mit Sau3A geschnitten und dann in den Bam HI restringierten Vektor pBin19 kloniert. Nach einem Doppelverdau mit SalI und HindIII wurde die entsprechende luxAB-DNA in die Restriktionsschnittstellen kloniert und der Ligationsansatz in DH5α transformiert.

Für die Klonierung zur Herstellung der pKST1lux- und pKCO1lux-Konstrukte wurde zuerst das BamHI-Fragment mit den luxAB-Genen aus pBinlux-SalI in den BamHI restringierten Vektor pBin19 kloniert. Der Ligationsansatz wurde in DH5α transformiert. So wurde ein weiterer pBinlux (pBinlux-BamHI) hergestellt. Die Darstellungen beider Plasmide (pBinlux-SalI, pBinlux-BamHI), mit dem unterschiedlichen Aufbau der MCS sind Kap. 6.1.2, Abb. 44 und Kap. 6.1.3, Abb. 45 aufgeführt. Zur Klonierung der Promotoren wurde die DNA des pBinlux-BamHI mit SmaI geschnitten. Die DNA-Fragmente, welche P KST1 und P KCO1 beinhalteten, wurden mittels PCR und sequenzspezifischer Primer (2-KST1-S und KST1-AS bzw. 2-KCO1-S und KCO1-AS) mit SmaI-Restriktionsschnittstellen hergestellt, mit SmaI verdaut und in die SmaI-Schnittstelle von pBinlux-BamHI kloniert. Der Ligationsansatz wurde wiederum in DH5α transformiert.

Die richtigen Orientierungen der klonierten Promotor-DNA-Fragmente wurden durch spezifische Restriktionsverdaus und Sequenzierungen überprüft. Bei allen pBin-Konstrukten wurden die Übergänge der Promotor-Sequenz zu den luxAB-Genen durch Sequenzierung mit dem Primer luxA/AS2 überprüft.

Die Basenabfolge der Promotor-Fragmente P Nos, P KST1 und P KCO1, welche mittels PCR hergestellt wurden, wurde durch Sequenzierung überprüft. Bei den Promotoren P KST1 und P KCO1 wurden Basenaustausche gegenüber den übermittelten Originalsequenzen festgestellt. Dies führte zur Sequenzierung der Promotorbereiche der Ausgangsderivate pPK-Gus-4 und pDKP3. Ein Vergleich der sequenzierten Bereiche (Kap. 6.5.2, Abb. 53 und Kap. 6.5.3, Abb. 54) zeigte, dass die ermittelten Basenaustausche auch in den DNA-Sequenzen der Derivate vorlagen, mit Ausnahme des P KCO1 im pBin-Konstrukt, welcher zwei Basenaustausche gegenüber der Originalsequenz am 5´-Ende aufweist und des P Nos im pBin-Konstrukt, welcher einen Basenaustausch gegenüber der Originalsequenz (Kap. 6.5.1, Abb. 52) aufweist. Dieser Basenaustausch befindet sich jedoch außerhalb der Sequenz des von Shaw (1984) beschriebenen Nos-Promotors.

Um die Genexpressionsstärke der pflanzenspezifischen Promotoren mit einer homologen Genexpression vergleichen zu können, wurde der Promotor des lac-Operons untersucht. Hierfür wurde der P Lac aus pBin19 mit dem SalI-Fragment der luxAB-Gene fusioniert. Die Fusion (placlux) erwies sich in den verschiedenen Bakterienarten als instabil. Das Konstrukt, welches zwischen dem P Lac und dem SalI-Fragment der luxAB-Gene die Terminationssequenz des Octopin-Synthase Gens beinhaltete (placOCSlux), war stabil.

Als weiterer bakterieller Promotor wurde die nach Transposonmutagenese von Y. enterocolitica Stamm 78 mit dem Mini-Tn5luxAB entstandene Promotorfusion P 143 in pBin19 kloniert und zum Vergleich der bakteriellen Expression in Yersinia mitgeführt.

In der Tab. 23 wurde die Herstellung der pBin-Konstrukte nochmals zusammengefasst dargestellt. Abb. 13 zeigt die schematische Darstellung der MCS aller pBin-Konstrukte.

Tab. 23 : Überblick über die Strategien zur Klonierung der pflanzenspezifischen Promotoren und der lux AB-Fragmente in pBin19, sowie die Namen der resultierenden pBin-Konstrukte. Zum Vergleich der Expressionsstärke heterologer Promotoren wurde der bakterielle Promotor des lac -Operons in pBin19 untersucht.

Name des Promotors

Name des Ausgangs-derivates

Klonierungs-

vektor des Ausgangs-derivates

Promotor-

Restriktions-fragment

PCR-

Restriktions-

fragment

luxAB-

Restriktions-

fragment

Name des

pBin-

Konstruktes

P 35S

pBinAR

pBin19

-

-

SalI-

Fragment

p35Slux

P B33

pB33-Bin19

pBin19

-

-

SalI-

Fragment

pB33lux

P ST-LS1

pBin-L700

pBin19

-

-

SalI-

Fragment

pST-LS1lux

P RolC

pBin19-RolC

pBin19

-

-

SalI-

Fragment

pRolClux

P 130

pBinG130

pBin19

-

-

Bam HI-

Fragment

p130lux

P 247

pBinG247

pBin19

-

-

SalI-

Fragment

p247lux

P FBP1,1

pFBPase1,1

pBin19

-

-

SalI-

Fragment

pFBP1,1lux

P FBP1,7

pME1

pBi101.1

Bam HI-

Fragment

-

SalI-

Fragment

pFBP1,7lux

P SKT2

pBi101

-SKT2

pBi101

Bam HI-

Fragment

-

Sal I/Hin dIII-

Fragment

pSKT2lux

P Nos

pBin19

-

-

Sau 3A-

Fragment

Sal I/Hin dIII-

Fragment

pNoslux

P KST1

pDKP3

pBi101

-

SmaI-

Fragment

Bam HI-

Fragment

pKST1lux

P KCO1

pPK-Gus-4

pGPTV-HPT

-

SmaI-

Fragment

Bam HI-

Fragment

pKCO1lux

P Lac

pBin19

-

-

-

SalI-

Fragment

placlux

P LacOCS

pBinAR

pBin19

-

-

SalI-

Fragment

placOCSlux


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Abb. 13 : Schematische Darstellung der MCS der pBin-Konstrukte.

3.1.1.2 Herstellung der pKK-Konstrukte und Transformation in E. coli

Der Vektor pKK232-8 wurde für Promotorstudien konzipiert. Er besitzt stromaufwärts vor der MCS einen Transkriptionsstop (T1) und zum Nachweis der Expressionsstärke klonierter Promotoren ein promotorloses Chloramphenicol-Acetyltransferase Gen (cat). Die Promotoren

P 130, P 247, P FBP1,1, P FBP 1,7, P Nos, P SKT2, P 35S, P B33, P ST-LS1 und P RolC wurden mit dem cat-Gen fusioniert. E. coli Transformanten mit den Fusionen wurden auf Wachstum auf LB-Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Chloramphenicol untersucht. Um die Expressionsstärke der Promotoren in pKK232-8 mit den pBin-Konstrukten mittels Lumineszenz vergleichen zu können, wurden die luxAB-Gene zwischen die Sequenz der Promotor-DNA und dem cat-Gen inseriert.

Die DNA der Promotor-Derivate pBinG130, pBinG247 und pFBPase1,1 wurde durch EcoRI-Restriktion verdaut. Durch den EcoRI-Verdau des Plasmides pFBPase1,1 wurde das Promotor-Fragment herausgeschnitten. Danach wurden die kohäsiven Enden der DNA der linearisierten Plasmide pBinG130 und pBinG247 sowie das DNA-Fragment mit dem P FBP1,1 aufgefüllt. Die DNA von pBinG130 wurde weiterhin mit BamHI, die von pBinG247 mit SalI restringiert. Die Promotor-DNA der Derivate pME1 (P FBP1,7) und pBi101-SKT2 (P SKT2) lag durch BamHI-Restriktion zur weiteren Klonierung in pKK232-8 vor. Die Herstellung und Aufarbeitung des P Nos erfolgte wie in Kap. 3.1.1.1 beschrieben.

Zur Klonierung der Promotor-Fragmente wurde die DNA des Vektor pKK232-8 mit SmaI und BamHI, sowie SmaI und SalI doppelt verdaut, als auch nur mit BamHI oder SmaI verdaut. Das DNA-Fragment mit P 130 wurde mit dem SmaI/BamHI verdauten Vektor ligiert, sowie die DNA-Fragmente mit P 247 und P FBP1,1 mit den SmaI/SalI bzw. SmaI verdauten Vektor ligiert. Die BamHI-Fragmente mit P FBP1,7 und P SKT2, sowie das Sau3A-Fragment mit P Nos wurden mit der BamHI geschnittenen Vektor-DNA ligiert. Die Ligationsansätze wurden in E. coli DH5α transformiert.

Zur Klonierung der luxAB-Gene wurden die Fusionen mit den Promotoren P FBP1,1 und P FBP1,7 SalI und die Fusion mit P 130 BamHI verdaut. Die DNA der Fusionen mit den Promotoren P 247, P SKT2 und P Nos wurden mit HindIII und SalI restringiert.

Zur Insertion der luxAB-Gene wurde das Plasmid Mini-Tn5luxAB SalI bzw. HindIII und SalI geschnitten. Das BamHI-Fragment der luxAB-Gene wurde aus pBinlux-SalI isoliert. Die Promotor-cat-Fusionen wurden mit dem jeweiligen luxAB-Fragment ligiert und in DH5α transformiert.

Zur Herstellung der pKK-Konstrukte mit den Promotoren P KST1 und P KCO1 wurde zuerst in den BamHI verdauten Vektor pKK232-8 das BamHI-Fragment der luxAB-Gene aus pBinlux-SalI inseriert. Hierbei entstand der pKKlux-BamHI (siehe Kap. 6.1.7, Abb. 49). Diese DNA wurde SmaI verdaut und mit den SmaI-geschnittenenPCR-Fragmenten, deren Herstellung in Kap. 3.1.1.1 erklärt wurde, ligiert und in DH5α transformiert. Die Promotoren

P Nos, P KCO1 und P KST1 wurden vollständig sequenziert (Kap. 6.5.1, Abb. 52, Kap. 6.5.2, Abb. 53 und Kap. 6.5.3, Abb. 54).

Die Insertion des Lac-Promotors in pKKlux war für den E. coli Stamm DH5α letal. Er konnte nach erfolgreicher Klonierung und Transformation des Plasmides nicht mehr in LB-Medium mit Ampicillin angezogen werden.

Die richtigen Orientierungen der klonierten Promotor-DNA-Fragmente der Promotor-cat-Fusionen wurden durch spezifische Restriktionsverdaus und Sequenzierungen überprüft. Bei allen pKK-Konstrukten wurden die Übergänge der Promotor-Sequenz zu den luxAB-Genen durch Sequenzierung mit dem Primer luxA/AS2 überprüft.

Die Tab. 24 fasst die Klonierungsschritte der Promotor-cat-Fusionen und der pKK-Konstrukte sowie deren Namen zusammen.

Tab. 24 : Überblick über die Klonierungsstrategien der pflanzenspezifischen Promotoren in pKK232-8 und die Namen der resultierenden Promotor-cat- Fusionen. Nach Klonierung der lux AB-Gene entstanden die pKK-Konstrukte.

Name des Promotors

Name des Ausgangs-derivates

Promotor-

Restriktions-fragment

PCR-

Restriktions-

fragment

Name der

Promotor-cat-

Fusion

luxAB-

Restriktions-

fragment

Name des

pKK-

Konstruktes

-

pKK232-8

-

-

-

SalI/HindIII-

Fragment

pKKlux

P 35S

pBinAR

EcoRI-blunt/

SalI-

Fragment

-

pKK35S

SalI/HindIII-

Fragment

pKK35Slux

P B33

pB33-Bin19

EcoRI-blunt/

SalI-

Fragment

-

pKKB33

Sal I/Hin dIII-

Fragment

pKKB33lux

P ST-LS1

pBin-L700

EcoRI-blunt/

SalI-

Fragment

-

pKKST-LS1

Sal I/Hin dIII-

Fragment

pKKST-LS1lux

P RolC

pBin19-RolC

EcoRI-blunt/

SalI-

Fragment

-

pKKRolC

SalI-

Fragment

pKKRolClux

P 130

pBinG130

EcoRI-blunt/

Bam HI-

Fragment

-

pKK130

Bam HI-

Fragment

pKK130lux

P 247

pBinG247

EcoRI-blunt/

SalI-

Fragment

-

pKK247

Sal I/Hin dIII -

Fragment

pKK247lux

P FBP1,1

pFBPase1,1

EcoRI-blunt-

Fragment

-

pKKFBP1,1

SalI-

Fragment

pKKFBP1,1lux

P FBP1,7

pME1

Bam HI-

Fragment

-

pKKFBP1,7

SalI-

Fragment

pKKFBP1,7lux

P SKT2

pBi101

-SKT2

Bam HI-

Fragment

-

pKKSKT2

Sal I/Hin dIII-

Fragment

pKKSKT2lux

P Nos

pBin19

-

Sau 3A-

Fragment

pKKNos

Sal I/Hin dIII-

Fragment

pKKNoslux

P KST1

pDKP3

-

SmaI-

Fragment

-

Bam HI-

Fragment

pKKKST1lux

P KCO1

pPK-Gus-4

-

SmaI-

Fragment

-

Bam HI-

Fragment

pKKKCO1lux

Weiterhin ließ sich die Insertion der Promotor- bzw. luxAB-DNAin pKK232-8 durch PvuII-Restriktion nachweisen. Abb. 14 zeigt ein 0,8 %iges Agarosegel mit den PvuII restringierten pKK-Konstrukten (mit Ausnahme des Konstruktes pKKFBP1,1lux). Die DNA des Vektor pKK232-8 wurde durch PvuII-Restriktion in drei Fragmente geschnitten (2677 bp, 1278 bp und 1139 bp). Die Promotor-Fragmente inserierten in das größte DNA-Fragment des Vektors. Die luxAB-Gene wiesen eine weitere PvuII-Restriktionsschnittstelle auf und ergaben zwei Fragmente mit 2393 bp und 993 bp (bei Klonierung des luxAB-SalI-Fragments) bzw. 949 bp (bei Klonierung des luxAB-BamHI-Fragments). Hierbei inserierte das große luxAB-Fragment (2393 bp) in das größte Fragment bestehend aus Vektor-DNA und Promotor-DNA. Ein verändertes Restriktionsmuster wiesen die pKK-Konstrukte mit den Promotoren P ST-LS1, P RolC, P FBP1,1 und P FBP1,7 auf. Sie besaßen in den jeweiligen Promotor-Fragmenten eine weitere PvuII-Restriktionsschnittstelle, so dass es zur Restriktion des entstandenen großen Fragments kam.

Abb. 14 : Restriktionsverdau der pKK-Konstrukte mit Pvu II. 1 = λ DNA/Eco 130I, 2 = pKKlux, 3 = pKKARlux, 4 = pKKB33lux, 5 = pKKST-LS1lux, 6 = pKKRolClux, 7 = pKK130lux, 8 = pKK247lux, 9 = pKKFBP1,7lux, 10 = pKKNoslux, 11 = pKKSKT2lux, 12 = pKKKCO1lux, 13 = pKKKST1lux, 14 = λ DNA/Eco 130I.

Zusammenfassend sind die pKK-Konstrukte mit der MCS, sowie den weiteren Restriktionsschnittstellen in Abb. 15 dargestellt.

Abb. 15 : Schematische Darstellung der MCS der pKK-Konstrukte. Stromaufwärts der klonierten Promotoren liegt ein Transkriptionsstop, stromabwärts schließt sich die DNA des promotorlosen cat -Gens an.

3.1.1.3 Klonierung der Hae III-Restriktionsfragmente des ST-LS1-Promotors in pKK232-8 und Transformation in E. coli

Der Promotor des ST-LS1-Gens zeigte schon in den Voruntersuchungen (Jacob, 1997) eine starke Genexpression in E. coli, Y. enterocolitica und A. tumefaciens. Stockhaus et al. (1987) beschrieben, dass für eine Genexpression in Pflanzen nur 334 bp der 5´-upstream Region des ST-LS1-Gen benötigt werden. Die Genexpressionsstärke war jedoch gegenüber der der 1600 bp 5´-upstream Region um zwei Drittel reduziert. Eine 5´-upstream Region von 130 bp, welche die CAAT- und TATA-Sequenzelemente enthielt, zeigte keinerlei Genexpression.

Um Teilfragmente des Promotors P ST-LS1 auf die Expressionsstärke in Bakterien untersuchen zu können, wurde eine Subklonierung vorgenommen. Hierfür wurde die DNA des Promotor-Fragmentes mittels Doppelverdau mit EcoRI und BamHI von der restlichen DNA des Derivates pBin-L700 getrennt. Die kohäsiven Enden des EcoRI/BamHI-Verdaus

wurden aufgefüllt und nach Auftrennung der DNA in einem 0,8 %igen präparativen Agarosegel, wurde das 1600 bp große P ST-LS1-Fragment eluiert. Der anschließende Restriktionsverdau mit HaeIII trennte die Promotor-DNA in vier Fragmente (Abb. 16), wovon drei Fragmente in den SmaI restringierten Vektor pKK232-8 kloniert wurden. Nach blunt-end Ligation wurde der Ligationsansatz in DH5α transformiert.

Abb. 16 : Schematische Darstellung des Eco RI/Bam HI-Fragmentes des Promotors P ST-LS1 mit den vorhandenen Hae III-Restriktionsschnittstellen. Die dargestellten Hae III-DNA-Fragmente wurden in pKK232-8 kloniert und erhielten die Namen pKKST-LS1.1, pKKST-LS1.2 und pKKST-LS1.3.

Zur Klonierung der DNA der luxAB-Gene, wurde das SalI/HindIII-Fragment aus Mini-Tn5luxAB in die SalI und HindIII restringierten Plasmide mit den cat-Fusionen kloniert. Die Ligationsansätze wurden wiederum in DH5α transformiert. Die rekombinanten Plasmide wurden durch Restriktionsverdaus und Sequenzierungen überprüft. In Abb. 17 ist die MCS der entstanden pKK-Konstrukte dargestellt.

Abb. 17 : Schematische Darstellung der pKK-Konstrukte mit den Hae III-DNA-Fragmenten des P ST-LS1. * Die Restriktionsschnittstelle kann durch das Enzym Sma I nicht mehr erkannt werden, da je nach DNA-Fragment eine aufgefüllte Eco RI oder Bam HI bzw. Hae III Restriktionsschnittstelle mit Sma I ligiert wurde.

3.1.2 Computer-gestützte Sequenzanalyse der pflanzenspezifischen Promotoren

Der Sequenzanalyse der pflanzenspezifischen Promotoren kommt eine große Bedeutung zu, da eine wichtige Fragestellung für die Risikobewertung von GVOs ist, ob man eine Vorhersage über die Stärke der Promotoren in heterologen Systemen mittels Computeranalyse treffen kann. In dieser Arbeit wird somit die Expressionsstärke der Promotoren mit der Existenz von Konsensus Sequenzen verglichen. Es soll geklärt werden, ob pflanzliche Promotoren, die zu einer starken Expression in Bakterien führen, mehr oder auch stärkere Homologien zu Konsensus Sequenzen bakterieller Promotoren liefern als solche mit einer schwachen Genexpression.

3.1.2.1 Computer-gestützte Suche nach prokaryontischen Promotor Konsensus Sequenzen

Für die Computer-gestützte Suche nach potentiellen prokaryontischen Konsensus Sequenzen wurden die von Hawley und McClure (1983), Harley und Reynolds (1987) und Lisser und Margalit (1993) für E. coli beschriebenen Konsensus HexamereTTGACA (-35-Region) und TATAAT (-10-Region) zugrunde gelegt. Der optimale Abstand zwischen den beiden Hexameren liegt bei 16 bis 18 nt (Harley und Reynolds, 1987). Schon Hawley und McClure (1983) fällt an Position –16/-15 das gehäufte Auftreten der Nukleotide T/G auf. Explizit beschrieben wurde die `extended-10-Region´ erst von Keilty und Rosenberg (1987). Das Vorhandensein der `extended -10-Region´ macht die –35-Konsensus Sequenz entbehrlich, jedoch wurden in einigen Promotoren sowohl die –35- und –10-Konsenus Sequenzen mit dem zusätzlichen T/G-Motiv gefunden (Chan und Busby, 1989).

Die pflanzenspezifischen Promotoren wurden einer Computer-gestützten Promotorsuche unterzogen. Es wurde nach folgenden Motiven gesucht:

Konsensus –35- und –10-Sequenz

 
 

TTGACA

_______________

TATAAT

(3 bzw. 2 Mismatche erlaubt)

  

15 – 20 nt

  

`extended – 10-Sequenz´

 
 

TGNTATAAT

(3 Mismatche erlaubt)

Bei den Konsensus Sequenzen wurden die am stärksten konservierten Basen im Fettdruck dargestellt (Hawley und McClure, 1983; Harley und Reynolds; 1987; Lisser und Margalit,

1993). Diese Nukleotide blieben auch bei der Analyse konserviert. Bei den restlichen Basen der Konsensus Sequenzen waren bei der –35-Region wie auch bei der `extended -10-Region´ drei Mismatche und bei der –10-Region zwei Mismatche erlaubt. Der Abstand zwischen den beiden Hexameren wurde auf 15 bis 20 nt festgelegt.

Die Länge der untersuchten pflanzenspezifischen Promotorsequenzen variierte von 300 bis 3100 bp. Um die Ergebnisse der Suche miteinander vergleichen zu können, wurden die 300 bp des jeweiligen Promotor-Fragments analysiert, die direkt stromaufwärts der zu transkribierenden luxAB-Genen lagen.

Die Computeranalyse lieferte für jede mögliche Übereinstimmung einen Treffer. Bei der Erkennung der –35- in Abhängigkeit von der –10-Konsensus Sequenz wurden Treffer gefunden, bei denen eine der beiden Sequenzen identisch ist und die andere Konsensus Sequenz sich um ein bis mehrere Nukleotide verschiebt. Solche Übereinstimmungen wurden als ein Treffer gerechnet, da angenommen werden kann, dass die RNAP einen solchen Promotorbereich als eine Erkennungsstelle betrachtet.

In Tab. 25 wurden die Ergebnisse der Computer-gestützen Suche nach potentiellen bakteriellen Konsensus Sequenzen dargestellt. Im Anhang (Kap. 6.2) wurden diese Treffer in den pflanzenspezifischen Sequenzen farbig hervorgehoben.

Mit acht Treffern wurde für den P SKT2 mit Abstand das höchste Ergebnis an Übereinstimmungen mit der Konsensus Sequenz erzielt. Für die weiteren Promotoren wurden null bis vier Treffer gefunden. Vier Treffer wurden für P B33, drei für P 35S, P ST-LS1, P RolC, P 247 und P KST1 gefunden. Weiterhin konnte ein Treffer für P FBP1,1 bzw. P FBP1,7, P Nos und P KCO1 festgestellt werden. Die Analyse ergab keinen Treffer für den P 130. Die Homologie zu dem bekannten Hexamer der –35-Konsensus Sequenz variierte zwischen drei bis vier Basen. Bei der –10-Konsensus Sequenz lag sie bei vier bis fünf Basen. Für die `extended –10-Region´ wurden sechs bzw. sieben Basen Übereinstimmung gefunden. Somit war die Homologie der potentiellen prokaryontischen Konsensus Sequenzen gegenüber der bekannten σ70-Konsensus Sequenzen eher gering.

Die Untersuchung der Subklone des P ST-LS1 ergab für P ST-LS1.2 sieben Treffer, wovon in einem Fall eine vollkommene Homologie mit der –10-Konsensus Sequenz nachzuweisen war. Jedoch war in diesem Falle der Abstand zwischen den beiden Hexameren mit 19 und 20 nt nicht optimal. Für P ST-LS1.1 konnten zwei Treffer nachgewiesen werden. Die Suche in P ST-LS1.3 entspricht den 300 bp, welche im Gesamtfragment des P ST-LS1 analysiert wurden.

Tab. 25 : Ergebnisse der Computer-gestützen Suche nach potentiellen bakteriellen Konsensus Sequenzen in den pflanzenspezifischen Promotoren. Untersucht wurden die 300 bp der Promotoren, welche direkt vor dem Fragment mit den lux AB-Genen lagen. Übereinstimmungen der Nukleotide mit der σ70 -Konsensus Sequenz wurden in Großbuchstaben dargestellt. Verschiebt sich die Konsensus Sequenz bei der Suche nur um ein bis mehrere Nukleotide, so wurde diese Sequenz in Klammern dargestellt und als ein Treffer gezählt. Der Sequenzursprung bezieht sich auf die Acc. # (wenn vorhanden), der im Anhang aufgeführten Sequenzen.

Promotor

Potentielle Promotorsequenz

(-35-/-10-Sequenz oder

`extended -10-Sequenz´)

Position in Acc. # siehe Anhang

Abstand

zwischen der

–35- und

-10-Sequenz

[nt]

Übereinstimmung mit der Konsensus Sequenz

Treffer-

zahl

P 35S

TTGcCc / TATtgT

2405/2426

15

4/6 und 4/6

3

TGTgAagAT

2429

-

6/9

TGCcATcAT

2466

-

6/9

P B33

TTtcaA (TTcAag) /

1493(1494)/

19/18/20

3/6 und 5/6

4

TATAtT (TATtAT)

1518(1520)

  

TTtAtt (TTGgtt) / TAaAAT

1617(1621)/1642

19/15

3/6 und 5/6

TGTcAaAcT

1628

-

6/9

TTGttA/cAaAAT

1683/1706

17

4/6 und 4/6

P ST-LS1

TTtgtA (TTGtag) /gATAAT

1395(1396)/1419

18/17

3/6 und 5/6

3

TGATAatgT

1418

-

6/9

TTattA (TTatCA) /gAaAAT

1512(1515)/1537

19/16

3 bzw. 4/6 und 4/6

P ST-LS1.1

TGCgAgAgt

351

-

6/9

2

TTttgA (TTtgaA;TTGAat) / TAccAT (cATAgT)

485(486;487)/ 510(513)

19/18/17/20

3 bzw. 4/6 und 4/6

P ST-ST1.2

TTttCA / TATgcT

754/775

15

4/6 und 4/6

7

TTagCA / TAcAgT

788/809

15

4/6 und 4/6

TTaACc /aATAcT

897/922

19

4/6 und 4/6

TTGttt (TTtAag; TTaAgt)/ gAgAAT

938(941;942)/

963

19/16/15

3/6 und 4/6

TTGAgt (TTGtgc) / gATgAT

361(366)/387

20/15

4 bzw. 3/6 und 4/6

TTtgaA (TTGAag) / TATAAT

381(382)/407

20/19

3 bzw. 4/6 und 6/6

TTcAag / gATAtT

398/420

16

3/6 und 4/6

P ST-LS1.3

TTtgtA (TTGtag) /gATAAT

1395(1396)/1419

18/17

3/6 und 5/6

3

TGATAatgT

1418

-

6/9

TTattA (TTatCA) /gAaAAT

1512(1515)/1537

19/16

3 bzw. 4/6 und 4/6

P RolC

TTaAaA / TATAtT

978/1002

18

4/6 und 5/6

3

TTGtgg / aATAtT (TATttT)

1061/1083(1085)

16/18

3/6 und 4/6

TTtgCt (TTGctc) /gATtAT

1096(1097)/1122

20/19

3/6 und 4/6

P 130

-

-

-

-

0

P 247

TGATAaAgT

889

-

7/9

3

TTctgA / TAaAAT

907/928

15

3/6 und 5/6

TTtcaA (TTcAac) / TATccT

1092(1093)/1114

16/15

3/6 und 4/6

P FBP1,1

TGGcATccT

1035

-

6/9

1

P FBP1,7

TGGcATccT

1646

-

6/9

1

P Nos

TTccCc / cATAtT

9016/8990

20

3/6 und 4/6

1

P SKT2

TTtAtA(TTataA) / TATtAT

2731/2756

19/18

4 bzw. 3/6 und 5/6

8

TTacaA / TAaAAT

2767/2791

18

3/6 und 5/6

TTtAtA / TAaAAT

2785/2810

19

4/6 und 5/6

TTGtat / aATtAT

2805/2831

20

3/6 und 4/6

TTGctA / aAaAAT

2897/2923

20

4/6 und 5/6

TGTaAaAgT

2905

-

6/9

TTGctc / TATttT

2913/2936

17

3/6 und 4/6

TGCTATttT

2933

-

7/9

P KST1

TTctCc / gATAcT (TActAT)

1307/1332(1334)

18/20

3/6 und 4/6

3

TGGgAagAT

1325

-

6/9

TTcttA (TTaAag) / aAgAAT

1366(1369)/1391

19/16

3/6 und 4/6

P KCO1

TTGAtt / cATAgT

1177/1198

15

4/6 und 4/6

1

3.1.2.2 Bestimmung des AT-Gehalts

Um festzustellen, ob es einen Zusammenhang zwischen der Genexpressionsstärke von pflanzenspezifischen Promotoren in Bakterien und dem AT-Gehalt gibt, wurde dieser bestimmt. Um den AT-Gehalt der Promotoren vergleichen zu können, wurden wiederum die 300 bp des Promotor-Fragmentes analysiert, die direkt stromaufwärts der zu transkribierenden luxAB-Genen lagen. Die Berechnung des AT-Gehalts ist bei einem `window size = 50´ jeweils von einem Punkt aus auf je 25 bp stromaufwärts und stromabwärts, also insgesamt 50 bp, bezogen. Abb. 18 führt die Diagramme der untersuchten AT-Gehalte der Promotoren auf, wobei die AT-Gehalte von P FBP1,1 und P FBP1,7 zusammen dargestellt wurden, da sie identisch sind. Die Diagramme sind nach zunehmenden AT-Gehalt angeordnet. Die Darstellung zwischen 50 bis 350 entspricht dem AT-Gehalt der untersuchten 300 bp der Promotoren.

P 35S und P Nos besitzen mit 52,6 % und 53,7 % den geringsten AT-Gehalt. Bei den weiteren Promotoren liegt er bei 60 % oder darüber. Der AT-Gehalt des P SKT2 ist mit 76,6 % am höchsten. Dies zeigt den Zusammenhang mit der Trefferzahl der potentiellen prokaryontischen Konsensus Sequenzen auf. Jedoch wurde für den P 130 kein Treffer gefunden, während der AT-Gehalt mit 61,6 % relativ hoch ist. Auch für P FBP1,1 bzw. P FBP1,7 und P KCO1 liegt der AT-Gehalt mit 64,3 % und 66,7 % relativ hoch, und für diese Promotoren konnte jeweils nur ein Treffer bei der Computer-getützten Suche ermittelt werden.

Abb. 18 : Darstellung des AT-Gehaltes innerhalb der 300 bp (in der Darstellung 50 bis 350) der Sequenz der pflanzenspezifischen Promotoren, welche direkt vor dem Klonierungsfragment mit den zu transkribierenden lux AB-Genen lagen.

3.1.3 Genexpressionsbestimmungen

3.1.3.1 Genexpressionsbestimmung mittels Lumineszenzmessung

Zum Nachweis einer möglichen Expression der luxAB-Genedurch die pflanzenspezifischen Promotoren wurde die Lumineszenz in RLU/10 s gemessen. Die Lumineszenz der pflanzenspezifischen Promotoren innerhalb der pBin-Konstrukte wurde in E. coli K-12 Stamm DH5α, Y. enterocolitica Stamm 78, A. tumefaciens Stamm ATHV, P. putida und Acinetobacter sp. BD413 bestimmt. Die Lumineszenz der pKK-Konstrukte wurde aufgrund des Replikationsursprungs des Plasmides und der Instabilität der Konstrukte in Yersinia (Jacob, 1997) nur in E. coli untersucht.

Die folgenden abgebildeten Histogramme der Lumineszenzen stellen die Mittelwerte dreier Dreifachbestimmungen mit den dazugehörigen Standardabweichungen dar.

In Abb. 19 sind die Lumineszenzen ausgehend von den pflanzenspezifischen Promotoren der pKK-Konstrukte denen der pBin-Konstrukte in E. coli gegenübergestellt. Die pKK-Konstrukte wiesen aufgrund der höheren Kopienzahl (15 bis 20) eine doppelt bis 3,5-fach höhere Lumineszenz gegenüber den pBin-Konstrukten (Kopienzahl 3 bis 7) auf. Als Negativ-Kontrolle wurde die Lumineszenz des promotorlosen pKKlux-Konstruktes mit 1000 RLU/10 s gemessen. Der Vektor pKK232-8 besitzt im Gegensatz zum Vektor pBin19 vor der MCS einen Transkriptionsstop, welcher das Durchlesen stromaufwärts liegender Sequenzen verhinderte. Die Fusion des pBin19 mit den luxAB-Genen ohne pflanzenspezifischen Promotor, stellte keine geeignete Negativ-Kontrolle dar, da bakterielle Vektorsequenzen zu einer Genexpression führten (Mudge, 1996; Jacob, 1997). Bakterielle Kulturen, welche keine luxAB-Gene beinhalteten, wiesen eine Hintergrund-Lumineszenz von etwa 100 RLU/10 s auf.

Die Lumineszenzmessungen in E. coli zeigten, dass acht der zwölf getesteten pflanzenspezifischen Promotoren eine Genexpression verursachten, die der Genexpression ausgehend von dem P 35S aus CaMV entsprachen oder stärker waren. Der P 35S aus CaMV wurde als Positiv-Kontrolle mitgeführt, da dessen Expression in E. coli bereits von Assaad und Signer (1990) beschrieben wurde. Die Promotoren P B33, P 130, P FBP1,7, P Nos und P SKT2 zeigten eine Expression der luxAB-Gene, die vergleichbar mit der des P 35S waren. Stärkere Genexpressionen wiesen hingegen die Promotoren P ST-LS1, P KST1 und P KCO1 auf. Die Lumineszenzen ausgehend von den Promotoren P RolC und P 247 entsprachen der Negativ-Kontrolle. Die Genexpression ausgehend von P FBP1,1 war etwas höher als die der Negativ-Kontrolle. Beim Vergleich der Lumineszenzen ausgehend von den Promotoren in den pKK-Konstrukten mit denen der pBin-Konstrukte zeigten zwei Konstrukte diskrepante Werte. Der P FBP1,7 zeigte im pBin-Konstrukt eine zu hohe Expression im Vergleich zu dem

pKK-Konstrukt. Die Expression ausgehend von dem P KCO1 war wiederum im pBin-Konstrukt im Vergleich zu dem pKK-Konstrukt zu niedrig.

Abb. 19 : Lumineszenzmessungen der a pKK-Konstrukte und b pBin- Konstrukte in E. coli .

Eine mögliche Ursache für die geringere Genexpression des pKCO1lux gegenüber dem pKKKCO1lux könnten die beiden Basenfehlpaarungen nahe dem 5´-Ende des Promotors (Kap. 6.5.2, Abb. 53) sein. Interessant ist auch die Beobachtung, dass der P FBP1,7 gegenüber dem P FBP1,1, welcher am 5´-Ende um 600 bp verkürzt ist, in dem pBin-Konstrukt eine höhere Genexpression aufweist. Möglicherweise führten die unterschiedlichen Zusammensetzungen der MCS der P FBP1,1- bzw. P FBP1,7-Konstrukte zu einem veränderten Genexpressionsverhalten. Lisser und Margalit (1994) konnten durch Computeranalyse von E. coli Promotoren zeigen, dass die die Konsensus Sequenzen (-35- und

-10-Region) umgebenden Nukleotide entscheidend für die physikalisch-chemischen und strukturellen Eigenschaften der DNA sind und somit die Promotorstärke beeinflussen können.

Zum Vergleich der Genexpression der heterologen, pflanzenspezifischen Promotoren mit einem homologen bakteriellen Promotor wurde die Genexpression des Lac-Promotors fusioniert mit den luxAB-Genen in pBin19 gemessen. Hierbei wurde für placlux unter Zugabe von IPTG eine Lumineszenz von 200000 RLU/10 s gemessen. Dieses Konstrukt erwies sich in E. coli als instabil, so dass dieser Wert nicht reproduziert werden konnte. Für das Konstrukt placOCSlux konnte 260000 RLU/10 s gemessen werden. Die Genexpression ausgehend von dem Lac-Promotor ist somit ca. 20mal höher als die stärkste pflanzenspezifische Genexpression.

Weiterhin wurde in unserem Labor der Promotor des TEM1 bla-Gens (P Bla) mit den luxAB-Genen fusioniert und in den Vektor pKK232-8 kloniert. Die Expression ausgehend von P Bla führte in E. coli bei Anwesenheit von Ampicillin im Medium zu einer sechsfach höheren Expression als die des P KST1 (pKK-Konstrukt, persönliche Mitteilung A. Lewin).

Die Lumineszenz der pflanzenspezifischen Promotoren der pBin-Konstrukte in Y. enterocolitica, A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. sind in Abb. 20 dargestellt.


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Abb. 20 : Lumineszenzmessungen der pBin-Konstrukte in a Y. enterocolitica, b A. tumefaciens, c P. putida und d Acinetobacter sp. BD413

In Y. enterocolitica zeigten drei Promotoren, P B33, P FBP1,7 und P SKT2, eine Genexpressionsstärke, die mit der des P 35S vergleichbar war. P ST-LS1, P KST1 und P KCO1 zeigten wiederum eine sehr starke Expression der luxAB-Gene. Vergleicht man die Expressionen der Promotoren in E. coli mit denen in Yersinia, so sehen sich die Profile der Histogramme sehr ähnlich. Die Lumineszenz war jedoch im Wildtyp Yersinia-Stamm höher als im E. coli K-12 Stamm. Beide Arten gehören zur Familie der Enterobacteriaceae, so dass die übereinstimmende Genexpression durch die pflanzenspezifischen Promotoren erklärbar ist. Für das placOCSlux-Konstrukt wurde in Yersinia eine Genexpression von 180000 RLU/10 s gemessen. Vergleicht man die Genexpression des placOCSlux-Konstrukts mit der des P ST-LS1, so war diese nur 1,5-fach höher und ungefähr doppelt so hoch wie die des P KST1. In der Abbildung nicht dargestellt ist die Expressionsstärke eines Promotors P 143 aus Y. enterocolitica. Dieser Promotor wurde innerhalb unserer Arbeitsgruppe mittels Transposonmutagenese mit dem Mini-Tn5luxAB (De Lorenzo et al., 1990) im Chromosom von Y. enterocolitica Stamm 78 (Lewin et al., 1996) identifiziert und nach Restriktion mit den luxAB-Genen in pBin19 kloniert. Es ist jedoch nicht bekannt, welchem Gen dieser Promotor zuzuordnen ist und ob er reguliert wird oder als konstitutiver Promotor angesehen werden muß. Die Lumineszenz des P 143 mit ca. 30000 RLU/10 s deutet eher auf einen schwachen Promotor hin. Hingegen erreichten die pflanzenspezifischen Promotoren P ST-LS1 mit 125000 RLU/10 s, P KST1 mit 95000 RLU/10 s und P KCO1 mit 55000 RLU/10 s Expressionsniveaus, die die Expressionsstärke des P 143 weit überstiegen.

In A. tumefaciens wurde die stärkste Genexpression der luxAB-Gene durch den P 35S aus CaMV verursacht. Weiterhin starke Expressionen zeigten P ST-LS1, P FBP1,1 und P FBP1,7. Für das placOCSlux-Konstrukt wurde in Agrobacterium eine Lumineszenz von 50000 RLU/10 s gemessen. Somit wurde für den pflanzenspezifischen Promotor P 35S mit 66000 RLU/10 s eine stärkere Lumineszenz gemessen als für den bakteriellen Lac-Promotor, der aus E. coli stammt.

In P. putida zeigte das Konstrukt mit P SKT2, gefolgt von P B33 und P ST-LS1 die stärkste Genexpression. Für das placOCSlux-Konstrukt wurde in P. putida eine Lumineszenz von 2700 RLU/10 s gemessen.

In Acinetobacter sp. Stamm BD413, einem Stamm mit einer natürlichen Kompetenz für DNA-Aufnahme (Nielsen et al., 1997), führten die Promotoren P B33, P ST-LS1, P 130, P SKT2, P KST1 und P KCO1 zu einer Genexpression. Für das placOCSlux-Konstrukt wurde in Acinetobacter eine Lumineszenz von 9000 RLU/10 s gemessen. Somit war die

Lumineszenz ausgehend von dem placOCSlux-Konstrukt geringer als die der pBin-Konstrukte mit den pflanzlichen Promotoren P B33, P ST-LS1, P 130 und P KST1.

Die Untersuchung der Lumineszenz der Subklone des P ST-LS1 in pKK232-8 ist in Abb. 21 dargestellt.

Hierbei verursachten die Subklone eine höhere Genexpression als das 1600 bp umfassende Wildtyp (WT) ST-LS1-Promotorfragment. Das Promotorfragment des pKKST-LS1.1 führte zu einer Lumineszenz, die achtfach höher war. pKKST-LS1.2 exprimierte die luxAB-Gene doppelt so stark wie der WT-Promotor und pKKST-LS1.3, dem Fragment mit der identischen Sequenz am 3´-Ende vor den zu exprimierenden luxAB-Genen wie der P ST-LS1 im pKKST-LS1lux-Konstrukt, wies ein 2,5-fach höhere Genexpression gegenüber dem WT-Promotor auf.

Abb. 21 : Lumineszenzmessung der pKK-Konstrukte der Subklone des P ST-LS1 im Vergleich zu dem Gesamtfragment in E. coli .

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass es in 50 % der getesteten Kombinationen aus pflanzenspezifischem Promotor und Bakterienart zu einer Genexpression kam (Tab. 26). Der Promotor P ST-LS1 führte in allen fünf Bakterienarten zu einer Expression der luxAB-Gene. Zwei Promotoren, P RolC und P 247, führten in keiner der Bakterienarten zu einer Genexpression.

3.1.3.2 Nachweis der Transkriptmenge mittels TaqMan® Universal PCR

Die Methode der TaqMan® Universal PCR diente zum quantitativen Nachweis der luxAB-mRNA. Sie wurde eingesetzt um nachzuweisen, dass die Stärke der Lumineszenz mit der Menge an luxAB-Transkript der jeweiligen Konstrukte korrelierte und die Lumineszenzwerte somit die Promotorstärken wiederspiegelten. Zum Vergleich der Transkriptmengen mit der Stärke der Lumineszenz wurde von jeweils denselben Y. enterocolitica-Kulturen ausgewählter pBin-Konstrukte zu einem identischen Zeitpunkt sowohl Gesamt-RNA für den Ansatz der quantitativen RT-PCR isoliert als auch die Lumineszenz der Kulturen bestimmt. Abb. 22 zeigt die Gegenüberstellung der jeweiligen Meßergebnisse. Der Vergleich der mRNA-Transkriptmengen mit den Lumineszenzen der pflanzenspezifischen Promotoren P 35S, P ST-LS1, P RolC, P FBP1,7 und P Nos in Y. enterocolitica zeigte, dass das verwendete luxAB-Reportersystem zur Bestimmung der Transkriptionsstärke in Bakterien geeignet war. Alle Promotoren wiesen zu den Transkriptmengen übereinstimmende Lumineszenzwerte auf.

Weiterhin wurde der in Kapitel 3.1.3.1 beschriebene Promotor P 143 aus Y. enterocolitica analysiert. Vergleicht man die Genexpressionsstärke des pflanzenspezifischen Promotors P ST-LS1 mit der des P 143, so ist diese sechsmal stärker als die des Yersinia-Promotors. Die

weiteren in Abb. 22 aufgeführten pflanzenspezifischen Promotoren haben jedoch eine viel schwächere Genexpression als der P 143.

Abb. 22 : Gegenüberstellung der a lux AB-Transkriptmengen und der b Lumineszenzwerte ausgewählter pBin- Konstrukte in Y. enterocolitica .

3.1.3.3 Nachweis der Genexpression mittels Northern Hybridisierung

Zur Charakterisierung der luxAB-Transkripte in ausgewählten Transformanten mit Promotor-luxAB-Fusionen wurden Northern Hybridisierungen durchgeführt. Hierfür wurden zwischen 3 bis 10 µg Gesamt-RNA elektrophoretisch aufgetrennt und mit einer fluoreszenzmarkierten Sonde homolog einem 400 bp großen Sequenzabschnitt aus dem luxA-Gen hybridisiert.

Abb. 23 zeigt die Hybridisierungsergebnisse der Transkripte der Promotoren P SKT2, P ST-LS1, P FBP1,7 und P KST1 in E. coli und P ST-LS1 in Y. enterocolitica und P. putida.

Die Northern Hybridisierungen aller untersuchten Transkripte zeigten distinkte Banden und weisen damit auf spezifische Transkriptionsstartpunkte hin. Bei den untersuchten Konstrukten, waren mindestens zwei Transkripte zu erkennen. Das Konstrukt, welches den P KST1 beinhaltet, zeigt als einziges ein schwaches drittes Transkript.

Abb. 23: Northern Hybridisierung. a 1 = pKKSKT2lux, 2 = pST-LS1lux, 3 = pFBP1,7lux, 4 = pKST1lux in E. coli. b 1 = E. coli (pKKST-LS1lux), 2 = Y. enterocolitica (pST-LS1lux), 3 = E. coli (pST-LS1lux). c 1 = E. coli (pST-LS1lux), 2 = E. coli (pKKST-LS1lux); 3 = P. putida (pST-LS1lux).

Bei der Berechnung der Transkriptlängen identischer Transkripte in unterschiedlichen Blots traten methodisch bedingt Unterschiede in den Transkriptlängen auf. Es konnte somit nur eine Abschätzung der Transkriptlängen erfolgen. Das Transkript, welches je nach Blot bei einer Länge von 2250 bis 2450 nt lag, war bei allen Proben identisch. Geht man von einer Transkriptlänge von 2250 nt aus, würde das Transkript innerhalb des Klonierungsfragmentes mit den luxAB-Genen starten (siehe Abb. 24) und das Vorkommen in allen untersuchten Konstrukten erklären.

Für den Promotor P SKT2 konnte ein weiteres Transkript der ungefähren Größe von 2800 nt, für P FBP1,7 ein Transkript mit der Größe von 2700 nt und für P KST1 zwei weitere Transkripte mit den Größen von 2600 nt und 2850 nt nachgewiesen werden. Für den P ST-LS1 konnte gezeigt werden, dass die Transkriptlängen mit einer Größe zwischen 2400 und 2600 nt in E. coli, Y. enterocolitica und P. putida identisch waren, als auch die Transkripte der pKK- und pBin-Konstrukte in E. coli.

Abb. 24 : Schematische Darstellung der durch Northern Hybridisierung erhaltenen Transkriptlängen. Transkript 1 wurde bei allen getesteten Proben identifiziert. Die Promotoren P ST-LS1, P FBP1,7 und P SKT2 wiesen ein zweites Transkript auf. Bei dem Promotor P KST1 konnte neben einem zweiten noch ein drittes Transkript identifiziert werden.

Somit konnte für alle untersuchten Konstrukte die Genexpression ausgehend von den jeweiligen pflanzenspezifischen Promotoren bestätigt werden. Die analysierten Transkriptlängen weisen, mit der Ausnahme des kürzesten Transkripts, darauf hin, dass die Transkriptionsinitiation durch die bakterielle RNA-Polymerase von den pflanzenspezifischen Promotoren ausging.

Eine Erklärung für die ca. 2250 nt großen Transkripte konnte durch Sequenzierung der 5´-RACE-Produkte gefunden werden (siehe Kap. 3.1.4).

3.1.3.4 Nachweis der phänotypischen Ausprägung eines Antibiotikumresistenzgens durch Aktivität pflanzenspezifischer Promotoren in Bakterien

Der Vektor pKK232-8 besitzt für Promotorstudien ein promotorloses cat-Gen, welches den Nachweis der Genexpression der E. coli K-12 DH5α Stämme mit den Promotor-cat-Fusionen durch Wachstum auf Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Chloramphenicol (CA) erlaubt. Der Nachweis der Expression erfolgte für die Promotor-cat-Fusionen pKK35S, pKKB33, pKKST-LS1, pKKRolC, pKK130, pKK247, pKKFBP1,1, pKKFBP1,7, pKKSKT2 und pKKNos auf LB-Agarplatten mit 5 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml und 30 µg/ml CA. Als Negativ-Kontrolle wurde der pKK232-8 mitgeführt (Abb. 25).

P Nos exprimierte das cat-Gen so stark, dass die Fusion in E. coli bis zu einer Konzentration von 30 µg/ml CA zu einem gleichmäßigen Wachstum von über 95 % gegenüber der Kontrollplatte ohne Antibiotikum führte. Hingegen zeigten die Stämme mit der Negativ-Kontrolle pKK232-8, sowie mit den Fusionen pKKRolC, pKK247 und pKKFBP1,1 bei 10 µg/ml CA kein Wachstum mehr auf den Agarplatten. E. coli mit den Fusionen pKKB33, pKK130, pKKFBP1,7 und pKKSKT2 wuchs nicht mehr auf Agarplatten mit 15 µg/ml CA. Der Stamm mit der Fusion pKK35S zeigte auf 20 µg/ml CA nur noch ein sehr schwaches Wachstum, wohingegen E. coli mit pKKST-LS1 auf 25 µg/ml CA noch Wachstum zeigte.

Abb. 25 : Vergleichendes Wachstum ausgewählter Promotor-cat -Fusionen und pKK232-8 als Negativ-Kontrolle in E. coli auf LB-Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen von CA.

In Abb. 26 ist der Vergleich des prozentualen Wachstums der E. coli-Stämme mit den Fusionen auf Agarplatten mit 5 µg/ml CA gegenüber den Lumineszenzwerten der pKK-Konstrukte in E. coli dargestellt. Die Expressionsniveaus der cat- bzw. luxAB-Gene transkribiert von dem jeweiligen untersuchten Promotor ähnelten sich sehr, mit der Ausnahme des Nos-Promotors. Dessen Expression des cat-Gens war stärker als die Expression ausgehend von dem ST-LS1-Promotor, welcher wiederum die luxAB-Gene am stärksten exprimierte.

Abb. 26 : Vergleich der Genexpression der E. coli –Stämme mit den Promotor-cat -Fusionen als Wachstum auf LB-Agarplatten mit 5 µg/ml CA gegenüber den Lumineszenzwerten der pKK-Konstrukte.

Für die diskrepanten Ergebnisse des P Nos in bezug auf die Expression der luxAB- und cat-Gene konnte keine Erklärung gefunden werden. Der Klon wurde durch Restriktionsverdaus mit DraI, PvuII und EcoRI überprüft. Weiterhin wurde durch Sequenzierung geprüft, ob der stromaufwärts der MCS liegende Transkriptionsstop (T1, siehe Kap. 6.1.5, Abb. 47) aus der

Fusion pKKNos verloren gegangen ist. Die DNA-Sequenz des Promotors, sowie deren Übergänge zum cat-Gen wurden durch Sequenzierung ebenfalls nochmals überprüft. Der einzige Unterschied zwischen den Konstrukten mit den der luxAB-Genen und dem cat-Gen ist die 5´-UTR des jeweiligen Reportergens. Sie beträgt bei den luxAB-Genen ca. 140 bp und bei dem cat-Gen nur ca. 80 bp.

Eine Möglichkeit wäre, dass das mRNA-Transkript der luxAB-Gene damit instabiler wäre und schneller degradiert wurde. Die anderen cat-Fusionen, die ähnliche Expressionen zeigten wie die luxAB-Fusionen, haben jedoch die gleiche 5´-UTR des cat-Reportergens wie die Fusion pKKNos.

Schlussfolgernd ist festzuhalten, dass bei einer typischen Selektionskonzentration von 25 µg/ml Chloramphenicol zwei Promotor-cat-Fusionen, pKKST-LS1 und pKKNos in der Lage waren, Wachstum zu vermitteln. Mit einer Ausnahme (pKKNos) wurden die gemessenen Lumineszenzwerte der E. coli Stämme mit den pKK-Konstrukten durch den Wachstumsnachweis der Stämme mit den Promotor-cat-Fusionen auf Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen von 5 µg/ml bis 30 µg/ml CA bestätigt.

3.1.4 Transkriptionsstartbestimmung ausgewählter Promotoren mittels 5´-RACE

Zur Bestimmung der Transkriptionsstarts der pflanzenspezifischen Promotoren P ST-LS1, P 35S, P KST1 und P Nos mittels 5´-RACE wurde 1 µg Gesamt-RNA eingesetzt. Die 5´-RACE-Produkte wurden zur Kartierung des Transkriptionsstarts entweder direkt sequenziert oder nach Klonierung sequenziert.

In dem luxAB-Klonierungsfragment wurde ein mehrere Nukleotide umfassender Bereich vor dem Translationsstart des luxA-Gens festgestellt an dem mRNA-Transkripte starteten (Abb. 27). Diese mRNA-Starts wurden in den RACE-Produkten aller untersuchten Promotoren gefunden und bestätigten somit das Ergebnis der Northern Hybridisierung (Kap. 3.1.3.3).

Eine Ursache für das gehäufte Auftreten der mRNA-Starts könnte die Degradierung der mRNA sein. Die Endoribonuklease E (RNase E) ist das Schlüsselenzym für die Initiation der mRNA-Degradierung in Bakterien. Das Enzym setzt den ersten Schnitt bevorzugt stromaufwärts eines `stem-loop´ geschützten 3´- oder 5´-Endes der mRNA. Danach kann die Degradierung durch 3´→ 5´ Exonukleasen des Degradosoms erfolgen. Für E. coli wurde als Schnittstelle der RNase E eine wenig konservierte Einzelstrang Konsensus Sequenz mit (A/G)AUU(A/U) beschrieben (Rauhut und Klug, 1999). Die RACE-Produkte zeigten gehäuft den mRNA-Start an den in der Abb. 27 eingezeichneten drei Adenin-Basen. Zwei dieser

Adenin-Basen mit den stromabwärts liegenden zwei Thymin-Basen (AATT) bilden in der mRNA die Sequenz AAUU, welche als mögliche Schnittstelle für die RNase E fungieren könnte. Drei Nukleotide stromabwärts der Sequenz AATT ist mit AAGCC eine Sequenz zu finden, welche mit der Sequenz GGCTT als `inverted repeat´ einen möglichen `stem-loop´ ausbilden könnte (Abb. 27). Somit handelte es sich bei den analysierten Transkripten innerhalb des luxAB-Klonierungsfragmentes wahrscheinlichum mRNA-Degradierungsprodukte, welche ebenfalls die zusätzlichen Hybridisierungsbanden im Northern Blot erklären würden (siehe Abb. 23, Kap. 3.1.3.3).

Abb. 27 : Schematische Darstellung der rekombinanten DNA der Plasmide mit 200 nt der 5´-upstream Region des lux AB-Fragmentes. Der schwarze Pfeil zeigt die möglichen Schnittstellen der RNase E in der mRNA. Die blauen Pfeile markieren einen `inverted repeat´, welcher in der mRNA einen `stem-loop´ ausbilden könnte. Das Startkodon für den Translationsstart des lux A-Gens wurde unterstrichen.

3.1.4.1 Bestimmung des Transkriptionsstarts des ST-LS1-Promotors

Der Transkriptionsstart des P ST-LS1 wurde in E. coli, Y. enterocolitica, A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. untersucht. Es wurde in allen untersuchten Bakterienarten ein prominentes Transkript (Abb. 28) gleicher Größe nachgewiesen. Die Größe des Transkripts lag bei 370 nt. Die elektrophoretische Auftrennung der RACE-Produkte im Agarosegel zeigte eine unterschiedliche Intensität des Transkripts in den untersuchten Bakterienarten. Für P. putida und A. tumefaciens konnte nur eine schwache Bande des Transkripts nachgewiesen werden.

Abb. 28 : Ergebnisse der 5´-RACE des P ST-LS1. a 1,5 %iges Agarosegel mit einer Auftragsmenge von 10 µl des PCR-Ansatzes der 5´-RACE. Spur 1 und 10 = 100 bp ladder, Spur 2 = E. coli (pKKlux), Spur 3 = E. coli (pKKST-LS1lux), Spur 4 = E. coli (pST-LS1lux), Spur 5 = Y. enterocolitica (pST-LS1lux), Spur 6 = Acinetobacter sp. (pST-LS1lux), Spur 7 = P. putida (pST-LS1lux), Spur 8 = A. tumefaciens (pST-LS1lux), Spur 9 = H2 O-Kontrolle. b Schematische Darstellung der rekombinanten DNA des pKKST-LS1lux mit 300 nt der Sequenz des 3´-Endes des P ST-LS1. Unterstrichen dargestellt sind die potentiellen per Computer-gestützte Analyse ermittelten –35- und –10-Konsensus Sequenzen. CAAT- und TATA-Box, sowie der Transkriptionsstart (mit Pfeil) in Pflanzen sind in grüner Schrift dargestellt. Der Transkriptionsstart innerhalb der untersuchten Bakterienarten wurde durch einen schwarzen Pfeil markiert und die auf den prokaryontischen Transkriptionsstart bezogenen potentiellen –35- und –10-Regionen sind unterbrochen gestrichelt dargestellt.

Durch Direktsequenzierung der 5´-RACE-Produkte konnte der Transkriptionsstart in den getesteten Bakterienarten zwölf bzw. 13 nt stromabwärts der eukaryontischen TATA-Box kartiert werden (Abb. 28). Bei der Sequenzierung der DNA nach Klonierung wurde neben dem analysierten Transkriptionsstart, vor allem bei den RACE-Produkten aus P. putida und A. tumefaciens,eine Verschiebung des Starts auf 14 bzw. 15 nt stromabwärts der eukaryontischen TATA-Box ermittelt.

Weiterhin wurde eine Analyse der 5´-RACE-Produkte der Promotor-cat-Fusion pKKST-LS1 und des Subklons pKKST-LS1.3lux in E. coli durchgeführt. Die Direktsequenzierung des cat-Transkripts als auch des lux-Transkripts des am 5´-Ende verkürzten P ST-LS1 in E. coli bestätigen den Transkriptionsstart zwölf bzw. 13 nt stromabwärts der eukaryontischen TATA-Box.

Durch die Analyse des Transkriptionsstarts konnte auf eine potentielle –10- und –35-Konsensus Sequenz als Erkennungssequenz für die bakterielle RNAP zur Transkriptionsinitiation geschlossen werden. Die potentielle –10-Region mit der Sequenz CATACT liegt direkt stromabwärts der eukaryontischen TATA-Box an Position -6/-7 bis –11/-12 bezogen auf den bakteriellen Transkriptionsstart. Die Sequenz CATACT zeigt in vier der sechs Basen Homologie zur –10-Konsensus Sequenz TATAAT (Hawley und McClure, 1983; Harley und Reynolds, 1987; Lisser und Margalit, 1993). Weiterhin wurde das Hexamer TGCAAA als potentielle –35-Sequenz an Position –28/-29 bis –33/-34 identifiziert. Die Transkriptionsinitiation erfolgte somit nicht an den durch die Computeranalyse identifizierten potentiellen –10- und –35-Konsensus Sequenzen.

Weitere Transkriptionsstarts konnten durch Sequenzierung dieser 5´-RACE-Produkte nicht ermittelt werden.

Die Transkriptionsstarts der Subklone des P ST-LS1 mit den Promotoren P ST-LS1.1 und P ST-LS1.2 wurden ebenfalls näher charakterisiert.

Durch Direktsequenzierung der 5´-RACE-Produkte der Subklone pKKST-LS1.1lux und pKKST-LS1.2lux wurden die in Abb. 29 dargestellten Transkriptionsstarts bestimmt. Diesen Transkriptionsstarts konnten durch die Computer-gestützte Analyse potentielle –35- und –10-Konsensus Sequenzen zugewiesen werden.

Der Transkriptionsstart des P ST-LS1.1 liegt vier bzw. fünf oder sieben bzw. acht nt stromabwärts potentieller –10-Konsensus Sequenzen.

Für den P ST-LS1.2 liegt der Transkriptionsstart acht bzw. neun nt stromabwärts der potentiellen –10-Konsensus Sequenz mit dem Hexamer TATAAT, welche der –10-Konsensus

Sequenz in E. coli entspricht. Ein weiterer Start an den umliegenden potentiellen Konsensus Sequenzen konnte mittels 5´-RACE nicht gefunden werden.

Die Transkriptionsstarts der Subklone des P ST-LS1 konnten mittels 5´-RACE nicht in dem Gesamtfragment P ST-LS1 nachgewiesen werden.

Abb. 29 : Schematische Darstellungen der rekombinanten DNA des a pKKST-LS1.1lux und b pKKST-LS1.2lux mit 300 nt der Sequenzen des 3´-Endes des jeweiligen Promotorfragmentes. Unterstrichen dargestellt sind potentielle –35- und –10-Konsensus Sequenzen. Die mittels 5´-RACE analysierten Transkriptionsstarts in E. coli sind durch Pfeile dargestellt.

3.1.4.2 Bestimmung des Transkriptionsstarts des CaMV 35S-Promotors

Bei der Transkriptionsstartbestimmung des P 35S mittels 5´-RACE in E. coli konnten zwei Starts festgestellt werden. Ein Transkriptionsstart wurde sechs bzw. sieben nt stromabwärts der eukaryontischen TATA-Box und ein weiterer Transkriptionsstart wurde 13 nt stromaufwärts der CAAT-Box kartiert (Abb. 30).

Abb. 30 : Schematische Darstellung der rekombinanten DNA des pKK35Slux mit der vollständigen Sequenz des P 35S. Schwarz unterstrichen dargestellt sind potentielle mittels Computer-gestützter Suche gefundene –35- und –10-Konsensus Sequenzen. CAAT- und TATA-Box, sowie der Transkriptionsstart (mit Pfeil) in Pflanzen sind in grüner Schrift dargestellt. Die Transkriptionsstarts in E. coli kartiert mittels 5´-RACE sind durch schwarze Pfeile dargestellt. Potentielle –35- und –10-Regionen, welche für die Transkriptionsinitiationen in E. coli verantwortlich sein könnten, wurden schwarz gestrichelt. Die von Assaad und Signer (1990) analysierten –35- und –10-Konsensus Sequenzen mit deren Transkriptionsstarts zweier identifizierter Transkripte sind blau unterstrichen bzw. als blaue Pfeile dargestellt.

Nach Assaad und Signer (1990) liegt in E. coli der Transkriptionsstart des kürzeren, schwächeren Transkripts zehn nt stromabwärts der TATA-Box. In bezug auf den Abstand zur von Assaad und Signer (1990) beschriebenen möglichen –10-Region als Erkennungssequenz für die bakterielle RNAP, sind beide beschriebenen Transkriptionsstarts möglich, und das Auffinden unterschiedlicher Starts leitet sich möglicherweise von der Verwendung

unterschiedlicher Methodiken ab. Die Transkriptionsstartbestimmungen bei Assaad und Signer (1990) erfolgten mit dem `RNase-Protection Assay´.

Ein weiterer Transkriptionsstart wurde 13 nt stromaufwärts der CAAT-Box kartiert. Dieser Transkriptionsstart wurde nur einmal als PCR-Produkt und nach Klonierung sequenziert. Durch die Computer-gestützte Suche nach prokaryontischen Promotor Konsensus-Sequenzen konnten diesem Start keine –35- und –10-Konsensus Sequenzen zugeordnet werden. Eine potentielle –10-Region oder auch `extended –10-Region´ wurde neun nt stromaufwärts des Transkriptionsstarts mit der Sequenz (TGA)TATCTC gefunden. 18 nt stromaufwärts dieser –10-Region befindet sich mit TTCAAA eine potentielle –35-Region.

Ein weiterer Start, wie von Assaad und Signer (1990) beschrieben an Position –315 bezogen auf den pflanzlichen Transkriptionsstart, konnte mit der 5´-RACE nicht festgestellt werden.

Den mit Computer-gestützter Suche nach prokaryontischen Promotor Konsensus Sequenzen identifizierten zwei `extended-10-Regionen´ und der Kombination aus –35- und –10-Region konnten mittels 5´-RACE keine Transkriptionsstarts zugeordnet werden.

3.1.4.3 Bestimmung des Transkriptionsstarts des Nos-Promotors

Der Transkriptionsstart des P Nos wurde mittels 5´-RACE für das pKK-Konstrukt pKKNoslux und für die Promotor-cat-Fusion pKKNos in E. coli untersucht. Sowohl die lux- als auch die cat-Fusion wiesen trotz der unterschiedlichen Expressionsniveaus ausgehend von P Nos den gleichen Transkriptionsstart drei Nukleotide stromabwärts der eukaryontischen TATA-Box auf (Abb. 31). Die durch Computer-gestützte Suche gefundene potentielle bakterielle Konsensus Sequenz wurde nicht zur Transkriptionsinitiation in E. coli genutzt. Hingegen ist es möglich, dass die eukaryontische TATA-Box als solchegenutztwurde. Es wurden zwei auf den Transkriptionsstart in E. coli bezogene potentielle –35- und –10-Regionen gefunden. Die Sequenz CATAAA als mögliche –10-Region liegt nur drei nt stromaufwärts des Transkriptionsstarts kartiert in E. coli und somit wäre der Abstand sehr gering. Eine zugehörige –35-Region ist mit der Sequenz TCAAAA 17 nt stromaufwärts von der –10-Region zu finden. Eine weitere Möglichkeit wäre die Kombination der Sequenzen TTGTCA und 17 nt stromabwärts TTCCAT als potentielle –35- bzw. –10-Regionen. Hierbei liegen zwischen der –10-Region und dem kartierten Transkriptionsstart sechs Nukleotide.

Abb. 31 : Schematische Darstellung der rekombinanten DNA des pKKNoslux mit der vollständigen Sequenz des P Nos. Unterstrichen dargestellt sind potentielle mittels Computer-gestützter Suche gefundene –35- und –10-Konsensus Sequenzen. CAAT- und TATA-Box, sowie der Transkriptionsstart (mit Pfeil) in Pflanzen sind in grüner Schrift dargestellt. Der Transkriptionsstart in E. coli kartiert mittels 5´-RACE ist durch einen schwarzen Pfeil und die dazugehörigen potentiellen –35- und -10-Regionen schwarz gestrichelt dargestellt.

3.1.4.4 Bestimmung des Transkriptionsstarts des KST1-Promotors

Für den KST1-Promotor konnte durch direkte Sequenzierung der 5´-RACE-Produkte und durch Sequenzierung der klonierten 5´-RACE-Produkte nur ein Transkriptionsstart in E. coli festgestellt werden (Abb. 32). Dieser liegt innerhalb der Sequenz der Restriktionsschnittstellen für SmaI und BamHI zwischen der Promotorsequenz und der Sequenz des luxAB-Fragmentes und erstreckt sich über die fünf Nukleotide GGGGA. Aus methodischen Gründen, dem Anhängen eines C-Schwanzes an das 3´-Ende der cDNA als Erkennungssequenz für den Ankerprimer, lässt sich der Transkriptionsstart nicht genauer eingrenzen. Direkt stromaufwärts des Transkriptionsstarts liegt eine AT-reiche Region u. a. mit der Sequenz TATAAT als potentielle –10-Region als Erkennungssequenz für die bakterielle RNAP. 17 nt stromaufwärts wäre mit TCAACA eine mögliche –35-Region zu finden. Die Computeranalyse zeigte hier jedoch keine Homologien zu den Suchkriterien. Jedoch konnten weiter stromaufwärts Treffer mit den –35- und –10-Konsensus Sequenzen, sowie der `extended –10-Region´ gefunden werden.

Abb. 32 : Schematische Darstellung der rekombinanten DNA des pKKKST1lux mit 300 nt der Sequenz des 3´-Endes des P KST1. Unterstrichen dargestellt sind mittels Computer-gestützter Suche identifizierte potentielle –35- und –10-Konsensus Sequenzen. Die mögliche TATA-Box für die Transkriptionsinitiation in Pflanzen ist in grüner Schrift dargestellt. Der Transkriptionsstart in E. coli wurde durch einen Pfeil dargestellt und die dazugehörigen möglichen –35- und –10-Regionen wurden schwarz gestrichelt.

3.1.5 Mutagenese des ST-LS1-Promotors

Nach der Bestimmung der Transkriptionsstarts des P ST-LS1 in den untersuchten Bakterienarten konnte mittels Computer-gestützer Suche keine der analysierten potentiellen –35- und –10- Regionen aufgrund des Abstandes dem Transkriptionsstart zugewiesen werden (siehe Kap. 3.1.4.1). Durch Mutagenese möglicher Regionen des Promotors, welche als Erkennung für die RNA-Polymerase zur Transkriptionsinitiation in Frage kamen, sollte die –10-Region identifiziert werden.

In einer ersten Versuchsreihe wurde die pflanzliche TATA-Box des P ST-LS1 mutagenisiert (Steinborn, 2000). Sie weist eine hohe Ähnlichkeit zur bakteriellen Konsensus Sequenz auf und wurde als potentielle –10-Region für die Promotorerkennung durch die bakterielle RNA-Polymerase angenommen. Ortsspezifische Mutagenesen dieser Region erzielten jedoch nur geringfügige Veränderungen in der Stärke der exprimierten Gene gegenüber der Originalsequenz. Eine weitere potentielle –10-Region wurde in Abb. 33 als unterstrichene Sequenz innerhalb der Originalsequenz des P ST-LS1 dargestellt. Sie liegt zwölf bzw. 13 nt stromabwärts von der pflanzlichen TATA-Box. Dieses Hexamer besitzt mit

Abb. 33 : a Schematische Darstellung der –35- und –10-Konsensus Sequenzen in E. coli . Der optimale Abstand der beiden Hexamere voneinander liegt bei 16 bis 18 nt. Der optimale Abstand der –10-Region zum Transkriptionsstart liegt bei 5 bis 9 nt. Der Transkriptionsstart wird häufig von einer Purinbase (Adenin oder Guanin) gebildet (Hawley und McClure, 1983; Harley und Reynolds, 1987; Lisser und Margalit, 1993).
b Darstellung von 80 Basen der 5´upstream-Region des ST-LS1-Promotors als Originalsequenz und mit ortsspezifischen Basenaustauschen (rot ). CAAT- und TATA-Box, welche für die Transkriptionsinitiation in Pflanzen notwendig sind, sowie der Transkriptionsstart (Pfeil) in Pflanzen sind grün dargestellt. Die potentielle –10- und -35-Region zur Transkriptionsinitiation, sowie der Transkriptionsstart (Pfeil) in Bakterien wurden in der Originalsequenz unterstrichen. Die Mutanten des P ST-LS1 H , J und K sind `down-Mutanten´, welche zur Verminderung der Genexpression führen sollten. Die Mutanten L und N sollten als `up-Mutanten´ die Genexpressionsstärke des zu exprimierenden Gens erhöhen. Die Sequenzen der –10-Region der Mutante L und der `extended -10-Region´ der Mutante N entsprechen den Konsensus Sequenzen in E. coli . Die Mutanten D und M dienten als Template-DNA bei der Megaprimer-PCR zur Herstellung der Mutante N.

fünf bzw. sechs nt einen optimalen Abstand zum Transkriptionsstart in E. coli und weist außerdem die beiden am stärksten, konservierten Basen der Konsensus Sequenz (P ST-LS1: CATACT; Konsensus Sequenz: TATAAT) in E. coli auf (Hawley und McClure, 1983; Harley und Reynolds, 1987). Die Darstellung in Abb. 33 zeigt die durch die ortsspezifische Mutagenese eingebrachten Basenaustausche gegenüber der Originalsequenz.

3.1.5.1 Ortsspezifische Mutagenese des ST-LS1-Promotors

Die ortsspezifischen Basenaustausche wurden mit der Methode der Megaprimer-PCR (Barik, 1996) in die Promotorsequenz des P ST-LS1 eingeführt.

Insgesamt wurden fünf P ST-LS1-Derivate mit Substitutionen (P ST-LS1H, P ST-LS1J, P ST-LS1K, P ST-LS1L und P ST-LS1N) und der P ST-LS1 mit der Originalsequenz hergestellt (Abb. 33). In der ersten PCR-Runde wurden die Megaprimer mittels der Mismatch-Primer (Kap. 2.6.7.3) bzw. dem Primer der Originalsequenz ST-LS1/1530/OM, dem Primer pBin19 6847 (Kap. 2.5.5; Tab. 13) und dem Derivat pBin-L700 als Template-DNA amplifiziert. Die Größe der Megaprimer lag bei 320 bp. Eine Ausnahme bildete jedoch die Herstellung der Mutante N des P ST-LS1. Hierbei wurde erst der Megaprimer der Mutante M mittels PCR mit dem Mismatch-Primer 1530-D-TATAAT, dem Primer luxA/AS2 und der Mutante P ST-LS1D des Plasmids pST-LS1Dlux als Template-DNA hergestellt. Diese Mutante ist in der eingangs beschriebenen ersten Versuchsreihe der Mutagenese der TATA-Box des P ST-LS1 entstanden (Steinborn, 2000). Das hieraus resultierende Megaprimer-Amplifikat hatte eine Größe von 220 bp.

Das Vorhandensein der gewünschten Basenaustausche wurde durch Sequenzierung überprüft. In einer zweiten PCR-Runde wurden die Megaprimer in Kombination mit dem Primer pBin19 6746 und pBin-L700 als Template-DNA zur Amplifikation der mutagenisierten Promotoren eingesetzt. Die Amplifikate wurden mit EcoRI und SalI doppelt verdaut und mit dem EcoRI/SalI verdauten Vektor pBin19 ligiert und in DH5α transformiert. Die Insertionen der Promotor-DNA wurde durch Restriktion und die vorhandenen Basenaustausche durch Sequenzierung mit dem Primer ST-LS1305 überprüft (Abb. 34). Mit der Mutante P ST-LS1M als Template-DNA wurde mittels PCR, den Primern 1530-TGNTAT und pBin19 6847 der Megaprimer hergestellt, welcher für die Amplifikation der Mutante N in einer zweiten PCR-Runde eingesetzt wurde. Die weitere Klonierung des Promotors P ST-LS1N in pBin19 und weitere Vorgehensweise erfolgte wie für die anderen Derivate beschrieben.

Abb. 34 : Die Abbildung zeigt einen Ausschnitt des Alignments der Sequenzierung des P ST-LS1 gegenüber dem mit PCR hergestellten, unmutierten Promotor P ST-LS1-PCR und den Mutanten H, J, K, L und N.

Die DNA der Promotor-Derivate wurde mit SalI restringiert, mit dem SalI restringierten luxAB-Fragment ligiert und in DH5α transformiert. Die richtige Orientierung der luxAB-Gene wurde durch BamHI-Restriktion überprüft. Abb. 35 zeigt die schematische Darstellung der MCS der pBin-Konstrukte mit den mutierten bzw. den nicht-mutierten Promotoren sowie der Originalsequenz von P ST-LS1 nach Klonierung der PCR-Fragmente und der luxAB-Gene.

Abb. 35 : Schematische Darstellung der MCS der pBin-Konstrukte mit P ST-LS1, welcher entsprechend der Originalsequenz oder mit Substitutionen mittels PCR hergestellt wurde. * = PCR; H; J; K; L; N.

3.1.6 Ermittlung der Expressionsstärke der mutagenisierten ST-LS1-Promotor-Derivate durch Messung der Luziferase-Aktivität

Die ortsspezifische Mutagenese der potentiellen –10-Region (CATACT) des P ST-LS1 führte in E. coli und Acinetobacter sp. zu einem eindeutig verändertem Expressionsverhalten (Abb. 36). Die Expression der `down-Mutanten´ P ST-LS1H, P ST-LS1J und P ST-LS1Kerniedrigte die Expression in E. coli auf ein Fünftel der Expression des WT-Promotors. In Acinetobacter sp. wurde die Expression halbiert. Die `up-Mutante´ P ST-LS1Lmit der optimierten –10-Region (TATAAT) führte in beiden Bakterienstämmen zu einer 3,5-fachen Erhöhung der Expressionsstärke. Die Mutagenese der potentiellen –10-Region zu einer

`extended –10-Region´ der Mutante P ST-LS1N(TGNTATAAT) führte in E. coli zu einer zwölffach höheren Expression und in Acinetobacter sp. zu einer neunfach höheren Expression gegenüber dem WT-Promotor.

Abb. 36: Vergleich der Lumineszenzmessungen der P ST-LS1-Mutanten in a E. coli, b Y. enterocolitica, c Acinetobacter sp., d A. tumefaciens und e P. putida

Für die Bakterienarten Y. enterocolitica, A. tumefaciens und P. putida führte die Mutagenese der potentiellen –10-Region des P ST-LS1 vor allem bei den `down-Mutanten´, nicht zu der erwarteten Expressionserniedrigung und damit Verminderung der Stärke der Lumineszenz.

In Y. enterocolitica war die Lumineszenz der `down-Mutanten´ P ST-LS1H mit 71000 RLU/10 s, P ST-LS1J mit 100000 RLU /10 s und P ST-LS1K mit 85000 RLU/10 s gegenüber der Expression des WT-Promotors mit 114000 RLU/10 s nicht eindeutig erniedrigt. Ebenso zeigten die `up-Mutanten´ P ST-LS1L mit einer Lumineszenz von 142000 RLU/10 s und

P ST-LS1N mit 130000 RLU/ 10 s keine eindeutig stärkere Expression der luxAB-Gene. Bei der Anzucht der `up-Mutanten´ in flüssigen LB-Medium zur Lumineszenzmessung war jedoch auffällig, dass die Mutante L ein verlangsamtes und die Mutante N ein stark verlangsamtes Wachstum aufwiesen, so dass deren Lumineszenzmessung meist Stunden nach der Messung der anderen Kulturen erfolgte. Die Expression der luxAB-Gene, welche mit einem hohen Energieverbrauch für die Zellen verbunden ist, führte bei diesen Mutanten zu einer verminderten Expression der Haushaltsgene und wirkte vielleicht auf Zellen letal, die bei der Messung der OD600 zur Berechnung der Verdünnung für die Lumineszenzmessung miteinbezogen wurden. Die luxAB-Gene wurden somit wahrscheinlich nur von einem geringen Anteil lebender Zellen bei gleicher Zellzahl (Gesamtzellzahl) gegenüber den Kulturen anderer Mutanten exprimiert.

Die Mutanten zeigten in A. tumefaciens keine eindeutige Veränderung des Expressions-verhalten. Alle Mutanten wiesen im Vergleich zum WT-Promotor P ST-LS1 eine Erniedrigung der Lumineszenz auf, wobei z. B. die `down-Mutante´ J mit ca. 6000 RLU/10 s die gleiche Lumineszenz aufwies wie die `up-Mutante´ N. Weiterhin exprimierten die Mutanten H und J die luxAB-Gene stärker als die Mutanten L und N. In A. tumefaciens führte somit die Mutagenese nicht zu dem erwarteten Ergebnis.

In P. putida war die Lumineszenz der `up-Mutante´ L doppelt so hoch und die der Mutante N 16 mal höher als die Lumineszenz des WT-Promotors P ST-LS1 mit 1700 RLU/ 10 s. Als einzige der `down-Mutanten´ zeigte K eine Erniedrigung der Lumineszenz mit 1100 RLU/10 s. Die Mutanten H und J wiesen mit 2700 RLU/10 s und 2100 RLU/10 s eine leichte Erhöhung der Lumineszenz gegenüber dem WT-Promotor auf.

Trotz identischem Transkriptionsstart des P ST-LS1 in allen fünf getesteten Bakterienarten führte die Mutagenese der potentiellen –10-Region, die für die Transkriptionsinitiation durch die RNAP mit verantwortlich ist, nicht zu einem einheitlichen Expressionsverhalten in den untersuchten Bakterienarten.

Mit der Mutagenese der Promotorsequenz des P ST-LS1 konnte gezeigt werden, dass in E. coli und Acinetobacter sp. die Sequenz CATACT des P ST-LS1 als –10-Region genutzt wurde. Für die anderen Bakterienarten konnte dies nicht bestätigt werden.

Die Ergebnisse der Mutagenese des P ST-LS1 in den verschiedenen Bakterienarten zeigten auch, dass die Herstellung `optimierter Vektoren´, welche bei einem möglichen Gentransfer von Pflanzen auf Bakterien zu keiner Genexpression in möglichst vielen Bakterien führen sollen, sehr schwer ist.

3.1.7 Untersuchung der Transkripte der mutagenisierten ST-LS1-Promotoren

Um nachzuweisen, ob die Einführungen der ortsspezifischen Basenaustausche in den P ST-LS1 zu Veränderungen der Transkriptmenge oder der Transkriptionsstarts führten, wurde von den P ST-LS1-Mutanten Northern Hybridisierung und 5´-RACE durchgeführt. Hierfür wurde Gesamt-RNA der Mutanten P ST-LS1H, P ST-LS1J, P ST-LS1K, P ST-LS1L und P ST-LS1N, sowie des P ST-LS1-PCR aus E. coli isoliert.

Für die Northern Hybridisierung wurde je 5 µg Gesamt-RNA der untersuchten Proben elektrophoretisch aufgetrennt und mit der luxA-Sonde hybridisiert. Die Intensitätszunahme der Banden der `up-Mutanten´ P ST-LS1L und P ST-LS1N gegenüber dem unmutierten P ST-LS1, dargestellt in Abb. 37, verdeutlicht die Zunahme der Transkriptmengen. Für diese Mutanten konnten zwei Banden der Größe 2250 und 2400 nt identifiziert werden, welche identisch mit den Transkriptlängen des WT-Promotors waren. Für die `down-Mutanten´ P ST-LS1H und P ST-LS1J zeigte die Hybridisierung jeweils nur die Bande der Größe von 2250 nt, welche dem mRNA-Degradierungsprodukt des luxAB-Klonierungsfragmentes entsprach. Die `down-Mutante´ P ST-LS1K wies dagegen auch die Bande der Größe von 2400 nt mit einer sehr geringen Intensität auf.

Abb. 37 : Northern Hybridisierung des P ST-LS1 im Vergleich zu den Mutanten P ST-LS1H, P ST-LS1J, P ST-LS1K, P ST-LS1L und P ST-LS1N.

Zur Durchführung der Transkriptionsstartbestimmungen mittels 5´-RACE wurde je 1 µg Gesamt-RNA der Proben eingesetzt. Für die `up-Mutanten´ P ST-LS1L und P ST-LS1N, sowie den P ST-LS1-PCR wurde sowohl durch Direktsequenzierung der 5´-RACE-Produkte als auch nach Klonierung der RACE-Produkte in pLitmus28 mit anschließender Sequenzierung der in Kapitel 3.1.4.1 beschriebene Transkriptionsstart zwölf bzw. 13 nt

stromabwärts der pflanzlichen TATA-Box bestätigt. Für die `down-Mutanten´ P ST-LS1H, P ST-LS1J und P ST-LS1K konnte mit der Methode der 5´-RACE kein Transkriptionsstart innerhalb der Promotorregion identifiziert werden. PCR-Fragmente, deren Größe auf das mRNA-Degradierungsprodukt des luxAB-Fragmentes hindeuteten, wurden nicht näher charakterisiert.

Die Northern Hybridisierung und 5´-RACE bestätigten das Ergebnis der Lumineszenzmessung in E. coli.

3.1.8 Herstellung von pBi101.2-Konstrukten mit mutagenisierten ST-LS1-Promotoren

Ein wichtiges Ziel der Arbeit war die Frage nach der Möglichkeit der Herstellung `sicherer Vektoren´, die eine minimierte heterologe Genexpression aufweisen bei voller Funktionsfähigkeit in dem Zielorganismus. Durch ortsspezifische Basenaustausche des P ST-LS1 konnten sogenannte `down-Mutanten´ mit einer geringeren Genexpression gegenüber dem WT-Promotor in E. coli und Acinetobacter sp. BD413 hergestellt werden. Da hierbei im Promotorfragment des P ST-LS1 die für die Genexpression in Pflanzen verantwortliche CAAT- und TATA-Box nicht verändert wurden, sollte der Frage nachgegangen werden, obdie `down-Mutanten´ veränderte Expressionseigenschaften gegenüber dem WT-Promotor in Pflanzen aufweisen.

Um die Expressionseigenschaften der Mutanten P ST-LS1H, P ST-LS1J und P ST-LS1K, sowie des P ST-LS1-PCR in Pflanzen beurteilen zu können, musste eine Umklonierung in den Vektor pBi101.2 (Jefferson et al., 1987; Kap. 6.1.4, Abb. 46) erfolgen. Dieser Vektor enthält zur Bestimmung der Transkriptionsstärke in Pflanzen ein promotorloses β-Glucuronidase Gen. pBi101.2 kann sowohl zur Beurteilung transienter Expression nach Partikelbombardement eingesetzt werden als auch zur Herstellung transgener Pflanzen.

3.1.8.1 Klonierungsarbeiten

Zur Isolierung der Promotor-Fragmente der Plasmide P ST-LS1H, P ST-LS1J, P ST-LS1K und P ST-LS1-PCR wurde die DNA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und SalI geschnitten, anschließend die kohäsiven Enden aufgefüllt und nach Auftrennung der DNA in einem präparativen Agarosegel konnten die Promotor-Fragmente eluiert werden.

Die Promotor-Fragmente wurden mit der XmnI/SmaI-restringierten Vektor-DNA des pBi101.2 ligiert (Abb. 38) und in E. coli Stamm DH5α transformiert.

Abb. 38 : Schematische Darstellung eines Teilausschnitts der pBi-Konstrukte mit P ST-LS1 und dessen Mutanten. * = H; J; K

Als Negativ-Kontrolle wurde die XmnI/SmaI-restringierte Vektor-DNA religiert und in DH5α transformiert. Durch den XmnI/SmaI-Verdau der pBi101.2 Vektor-DNA wurde aus dem Vektor ein ca. 330 bp großes DNA-Fragment stromaufwärts der MCS entfernt, welches den Lac-Promotor enthielt (Abb. 39).

Abb. 39 : Ausschnitt eines Alignments der Sequenzen des Vektors pBi101.2 mit Darstellung der Restriktionsschnittstellen, Promotorerkennungssequenzen des lac- Operons (-35-, -10-Region) und dem dazugehörigen Transkriptionsstart im Vergleich zu der Sequenz der Negativ-Kontrolle, in welcher die Sequenz zwischen Xmn I und Sma I entfernt wurde. Die DNA der Promotoren, deren Expression der gus -Gene in N. tabacum getestet werden sollte, wurde zwischen die Xmn I- und Sma I-Restriktionsschnittstellen kloniert.

Die erfolgreiche Klonierung mit richtiger Orientierung der Promotor-Fragmente in pBi101.2 wurde durch Direkt-PCR mit den Primern ST-LS1-1305 und GUS-2583-AS überprüft. Zur Bestimmung der Größe der inserierten Fragmente wurde eine weitere Direkt-PCR mit den

Primern Bi-2052 und Gus-2583-AS angeschlossen. Die DNA der ausgewählten Klone pBi-ST-LS1X/S, pBi-ST-LS1HX/S, pBi-ST-LS1JX/S und pBi-ST-LS1KX/S wurde dann am jeweiligen 5´- und 3´-Ende der Promotor-Fragmente durch Sequenzierung nochmals überprüft. In Abb. 38 ist ein Ausschnitt der rekombinanten DNA schematisch dargestellt.

Für die Pflanzentransformation wurde Caesiumchlorid-Gradienten-gereinigte DNA mit einer Konzentration von ca. 1 µg/µl hergestellt.

3.1.9 Partikelbombardement von N. tabacum

Zur Überprüfung der transienten Genexpression ausgehend von dem P ST-LS1 und dessen Mutanten H, J und Kwurdeein Partikelbombardement von N. tabacum vorgenommen. Hierfür wurden mit den zu testenden Plasmiden der pBi-Konstrukte jeweils zweimal vier bis fünf Beschüsse der präparierten Blattscheiben vorgenommen. Der Nachweis der β-Glucuronidase-Aktivität erfolgte durch Hydrolyse des Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure, wobei eine Blaufärbung des transformierten Pflanzengewebes entstand. Zur besseren Hervorhebung der Blaufärbung des transformierten Gewebes, wurde dieses anschließend mit 70 %igem Ethanol entfärbt.

Die DNA des pBi-Konstrukts mit dem Wildtyp-Promotor P ST-LS1 diente in der Versuchsreihe auch als Positiv-Kontrolle, da dessen Genexpression in N. tabacum mehrfach beschrieben wurde (Eckes et al., 1986; Stockhaus et al., 1987; Stockhaus et al., 1989b). Als Negativ-Kontrolle wurde die in Kapitel 3.1.8.1 beschriebene DNA des pBi101.2 mitgeführt.

3.1.9.1 Genexpressionsbestimmungen der mutagenisierten ST-LS1-Promotoren

Die Ergebnisse der Expression der gus-Gene ausgehend von den mutagenisierten ST-LS1-Promotoren gegenüber dem WT-Promotor und der Negativ-Kontrolle in N. tabacum sind in Abb. 40 dargestellt. Die Mutanten P ST-LS1H und P ST-LS1J zeigten eine mit dem WT-Promotor vergleichbare Expressionsstärke. Im Gegensatz dazu zeigte die Mutante P ST-LS1K eine wesentlich geringere Expression. Der Unterschied der Mutanten H und J zu K liegt in den Basenaustauschen an unterschiedlichen Positionen gegenüber dem WT-Promotor. Bei den Mutanten H und J wurden die Positionen –16 und –20 bezogen auf den pflanzlichen Transkriptionsstart des WT-Promotors von T (-16) und A (-20) jeweils gegen G (P ST-LS1H) bzw. jeweils gegen C (P ST-LS1J) ausgetauscht. Bei der Mutante P ST-LS1K wurden die Positionen –18/-19 von A/T zu G/C in der Promotor-Sequenz verändert.

Die Herstellung stabiler, transgener Tabakpflanzen durch Agrobacterium-vermittelten Transfer, zeigte für alle drei `down-Mutanten´ eine unverminderte Expression im Vergleich zum WT-Promotor (persönliche Mitteilung E. Glickman, IPK Gatersleben).

Abb. 40 : Vergleich der transienten Expression der P ST-LS1-Mutanten (H, J und K) gegenüber dem WT-Promotor P ST-LS1 und der Negativ-Kontrolle in N. tabacum.

Mit den `down-Mutanten´ konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, die DNA-Sequenz eines pflanzlichen Promotors so zu verändern, dass dieser die Expressionsstärke des WT-Promotor in der Pflanze beibehält, jedoch in Bakterien (E. coli und Acinetobacter sp.) die Expressionseigenschaft stark vermindert wird.

3.2 Untersuchung von bakteriellen und Plastiden Promotoren in N. tabacum

Es wurden die bakteriellen Promotoren des lac-Operons (P Lac), der Neomycin-Phosphotransferase III (P NptIII) und der TEM1 β-Lactamase (P Bla) untersucht. Bei den Plastiden Promotoren wurden die Promotoren der Gene psbA (P PsbA) und rbcL (P RbcL), welche von der PEP erkannt werden, accD (P AccD) und rpoB (P RpoB), welche von der NEP erkannt werden, sowie atpB (P AtpB) und clpP (P ClpP), welche sowohl von der PEP als auch der NEP erkannt werden, untersucht.Die untersuchten Plastiden Promotoren stammten aus dem Chloroplasten von N. tabacum.

Die bakteriellen und Plastiden Promotoren wurden nach Fusionierung mit dem promotorlosem gus-Gen des Vektors pBi101.2 auf Expression in N. tabacum untersucht.

3.2.1 Herstellung von pBi101.2-Konstrukten mit den bakteriellen und Plastiden Promotoren

Die bakteriellen Promotoren P NptIII und P Bla, sowie alle Plastiden Promotoren wurden mittels PCR mit spezifischen Primern (siehe Kap. 2.5.2, Tab. 10; Kap. 2.5.3, Tab. 11) und der jeweiligen spezifischen Template DNA (siehe Kap. 2.2.2, Tab. 6: pBin19, pKK232-8; Kap. 2.2.4, Tab. 8: pKL12, pKL13, pKL14, pKL18, pKL43, pKL44) amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden zur Klonierung in den Vektor pBi101.2 mit SmaI geschnitten. Danach wurden die PCR-Produkte mit der XmnI/SmaI-restringierten Vektor-DNA des pBi101.2 ligiert und in E. coli DH5 α transformiert. Die Insertion der Promotor-Fragmente in den Vektor pBi101.2 wurde durch Direkt-PCR analysiert. Die DNA ausgewählter Klone wurde durch Sequenzierung auf Sequenzhomologie mit der Template-DNA und richtige Orientierung im Vektor überprüft. In Abb. 41 ist schematisch der rekombinante Bereich mit den auf Expression zu untersuchenden Promotoren des Vektor pBi101.2 dargestellt.

Abb. 41 : Schematische Darstellung eines Teilausschnitts der pBi-Konstrukte mit den zu untersuchen Promotoren. P* = NptIII; Bla; PsbA; RbcL; AccD; RpoB; AtpB; ClpP

Zur Expressionsstudie des P Lac wurde der im Vektor pBi101.2 stromaufwärts der MCS enthaltene Lac-Promotor genutzt. Um den Abstand der Promotorstrukturen zu dem zu transkribierenden gus-Gen zu verkürzen, wurde die MCS aus der Vektor-DNA entfernt (siehe Kap. 3.1.8.1, Abb. 39). Hierfür wurde pBi101.2 mit HindIII und SmaI restringiert, die HindIII-Restriktionsschnittstelle aufgefüllt, religiert und in E. coli DH5 α transformiert. Die rekombinante DNA wurde durch Sequenzierung überprüft. Die pBi-Konstrukte erhielten die in Tab. 27 aufgeführten Bezeichnungen.

Für die Pflanzentransformation wurde Caesiumchlorid-Gradienten gereinigte DNA mit einer Konzentration von ca. 1 µg/µl hergestellt.

Tab. 27 : pBi-Konstrukte

Promotor

pBi-Konstrukt

P Lac

pBi-Lac

P Bla

pBi-BlaX/S

P NptIII

pBi-NptIIIX/S

P PsbA

pBi-PsbAX/S

P RbcL

pBi-RbcLX/S

P AccD

pBi-AccDX/S

P RpoB

pBi-RpoBX/S

P AtpB

pBi-AtpBX/S

P ClpP

pBi-ClpPX/S

Bei der Sequenzierung des Konstrukts pBi-AccDX/S wurde zwischen den Positionen 59391 und 59392 in bezug auf die Sequenz der Chloroplasten-DNA von N. tabacum (Acc. # Z00044) eine Insertion eines C festgestellt (siehe Kap. 6.3.3). Da sich diese Insertion am 5´-Ende der Promotorsequenz befindet und die Erkennungssequenz für die NEP 261 Basen stromabwärts von der Insertion liegt, ist es unwahrscheinlich, dass diese Änderung der Sequenz eine mögliche Expression beeinflussen würde.

3.2.2 Sequenzanalyse der bakteriellen und Plastiden Promotoren

Wie bei der Computer-gestützten Sequenzanalyse der pflanzenspezifischen Promotoren auf prokaryontische Promotor Konsensus Sequenzen, stellt sich auch bei den bakteriellen und Plastiden Promotoren die Frage, ob mittels Computer-gestützer Suche nach eukaryontischen Promotor Konsensus Sequenzen eine Vorhersage über die Wahrscheinlichkeit und die Stärke einer heterologen Genexpression getroffen werden kann.

3.2.2.1 Computer-gestützte Suche nach eukaryontischen Promotor Konsensus Sequenzen in den untersuchten bakteriellen und Plastiden Promotoren

Die Promotorregion eukaryontischer Gene, welche von der RNAP II zur Transkriptionsinitiation genutzt wird, ist wesentlich komplexer aufgebaut als die prokaryontischer Gene (siehe Kap. 1.2.2). Als häufigste Konsensus Sequenz wurde in eukaryontischen Promotoren die TATA-Box mit der Sequenz TATA(A/T)A(A/T) nachgewiesen (Breathnach und Chambon, 1981; Bucher und Trifonov, 1986; Bucher, 1990). Sie liegt ungefähr 25 bis 30 nt stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle.

Die pflanzlichen Promotorregionen zeigten nach einem Vergleich von Joshi (1987) ebenfalls eine starke Konservierung der TATA-Box mit der Konsensus Sequenz TATATATA. Hierbei waren die ersten vier Nukleotide und das A an Position sechs mit 90 % bis 97 % am häufigsten vertreten. An Position fünf und sieben der pflanzlichen TATA-Box kommt neben dem T ebenfalls ein A am häufigsten in der Konsensus Sequenz vor.

Somit unterscheidet sich die Konsensus Sequenz der pflanzlichen TATA-Box (Joshi, 1987) nicht von der vorher beschriebenen TATA-Box mit der Konsensus Sequenz TATA(A/T)A(A/T) (Breathnach und Chambon, 1981; Bucher und Trifonov, 1986; Bucher, 1990). Da Joshi (1987) nur 79 pflanzliche Promotorregionen untersucht hatte und im Gegensatz dazu von Bucher (1990) 502 Promotoren untersucht wurden, lehnte sich die Computer-gestützte Suche an die Sequenz TATA(A/T)A(A/T) an.

Bei der nachfolgenden Computer-gestützten Suche wurde jeweils die gesamte Sequenz der bakteriellen und Plastiden Promotoren auf die Konsensus Sequenzen der TATA-Box mit folgendem Motiv analysiert:

TATA- Konsensus Sequenz

  

TATAWAW

W = A oder T

  

(1 Mismatch erlaubt)

 

Bei der Konsensus Sequenz wurden die konservierten Basen im Fettdruck dargestellt. Für die nicht konservierte Region der TATA-Konsensus Sequenz wurde eine Mismatch erlaubt. Es wurde die gesamte Promotor-Sequenz analysiert. Für jede Übereinstimmung mit der angegebenen TATA-Konsensus Sequenz lieferte die Computeranalyse einen Treffer. Bei sich überlappenden Sequenzen, welche Homologien zur Konsensus Sequenz zeigten, wurde nur ein Treffer angegeben. Die Ergebnisse der Computeranalyse sind in Tab. 28 dargestellt.

Tab. 28 : Ergebnisse der Computer-gestützen Suche nach potentiellen TATA-Konsensus Sequenzen in den bakteriellen und Plastiden Promotoren. Übereinstimmungen mit der Konsensus Sequenz wurden in Großbuchstaben dargestellt. Verschiebt sich die Konsensus Sequenz bei der Suche nur um eine bis mehrere Basen, so wurde diese Sequenz in Klammern dargestellt und als ein Treffer gezählt. Der Sequenzursprung bezieht sich auf die Acc. # der im Anhang aufgeführten Sequenzen.

Promotor

Potentielle

Promotorsequenz

Position in

Acc. #

(siehe Anhang)

Übereinstimmung

mit der Konsensus Sequenz

Treffer-

zahl

P Lac

-

-

-

-

P Bla

gATAAAT

TATgTAT

4915

4944

6/7

6/7

2

P NptIII

TATtTAA

TATAAtT

2169

2218

6/7

6/7

2

P PsbA

TATATAA

(TATAAgT)

aATAAAA

1707

(1705)

1683

7/7

(6/7)

6/7

2

P RbcL

TATATAT

(TATATAT)

(TATATgA)

(TATgAAA)

TATAcAA

TATgAAA

57385

(57387)

(57389)

(57391)

57401

57507

7/7

(7/7)

(6/7)

(6/7)

6/7

6/7

3

P AccD

TATtAAA

TATtAAA

TATATtA

aATATAA

(TATAAAg)

TATtAAT

(aATATAT)

(TATATAg)

59461

59603

59613

59628

(59630)

59649

(59653)

(59655)

6/7

6/7

6/7

6/7

(6/7)

6/7

(6/7)

(6/7)

5

P RpoB

TATATAT

TATAcAA

TATAAcT

TATcAAT

27965

27822

27810

27758

7/7

6/7

6/7

6/7

4

P AtpB

-

-

-

-

P ClpP

TATtTAT

TATgAAT

gATAAAT

(aATAAAT)

gATAAAA

TATgAAT

TATAAAg

aATAAAA

gATATAT

74697

74638

74617

(74612)

74603

74591

74582

74573

74423

6/7

6/7

6/7

(6/7)

6/7

6/7

6/7

6/7

6/7

8

Im Anhang (Kap. 6.3; Kap. 6.4) wurden die Treffer in den jeweiligen bakteriellen und Plastiden Promotoren farbig markiert.

Für den bakteriellen Promotoren P Lac und den Plastiden Promotor P AtpB wurde innerhalb der untersuchten Sequenz keine Homologie zu der Konsensus Sequenz gefunden. Jeweils zwei Treffer wurden für die bakteriellen Promotoren P Bla und P NptIII, sowie für den Plastiden Promotor P PsbA gefunden. Für die Promotoren P RbcL wurden drei, für P RpoB vier, für P AccD fünf und für P ClpP acht Treffer gefunden. In der Sequenz des bakteriellen Promotors P NptIII überlappt eine der beiden potentiellen TATA-Konsensus Sequenzen mit der –35-Region, welche als Erkennungssequenz für die bakterielle RNAP dient. Bei den Plastiden Promotoren wurde für P RbcL, P AccD und P ClpP ein Treffer erzielt, welcher die Sequenz umgibt, die von der jeweiligen Polymerase (PEP, NEP) als Erkennungssequenz für die Transkriptionsinitiation in den Chloroplasten genutzt wird.

3.2.3 Partikelbombardement von N. tabacum

Zur Beurteilung der transienten Genexpression ausgehend von den zu testenden Promotoren, wurden zweimal vier bis fünf Beschüsse mit der DNA der pBi-Konstrukte auf präparierte Blattscheiben von N. tabacum vorgenommen. Als Kontrollen wurde die DNA der Negativ-Kontrolle des pBi101.2 (Kap. 3.1.8.1) und die DNA des pBi-ST-LS1 als Positiv-Kontrolle (Kap. 3.1.9) mitgeführt. Wie für die Mutanten des P ST-LS1 in Kapitel 3.1.9 bereits beschrieben, erfolgte der Nachweis der Expression der β-Glucuronidase durch Hydrolyse des Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure.

3.2.3.1 Genexpressionsbestimmung der bakteriellen und Plastiden Promotoren

Mit der Methode des Partikelbombardements von N. tabacum konnten für die bakteriellen Promotoren P Lac, P Bla und P NPTIII und für die Plastiden Promotoren P PsbA, P RbcL, P RpoB, P AtpB und P ClpP keine Expression der gus-Gene festgestellt werden. Für das Konstrukt pBi-AccDX/S mit dem P AccD konnten mit Hilfe 35-facher Vergrößerung zwei Spots durch Blaufärbung des transformierten Gewebes identifiziert werden (Abb. 42). Die Expression ausgehend von der Positiv-Kontrolle des P ST-LS1 in N. tabacum und die fehlende Expression der Negativ-Kontrolle ist in Abb. 40 (Kapitel 3.1.9.1) dargestellt. Negativ- und Positiv-Kontrolle wurden in jeder Versuchsreihe des Bombardements mitgeführt.

Abb. 42 : Teilausschnitte von Blattscheiben aus N. tabacum . Die Expression des gus- Gens ausgehend von dem P AccD ist anhand zweier Spots (Pfeil) erkennbar.

Die Expression der gus-Gene ausgehend von dem P AccD ist sehr schwach im Vergleich zur Positiv-Kontrolle. Die Methodik ermöglicht es nicht, eine genaue Lokalisation der übertragenen DNA in den Zellen anzugeben. Es besteht die Möglichkeit, dass durch den Beschuss die DNA im Chloroplasten exprimiert wurde. In den Chloroplasten würde die Promotor-DNA des P AccD durch die NEP mit Hilfe der Transkriptionsfaktoren erkannt werden und durch die Expression der gus-Gene zu einem falsch positiven Ergebnis führen. Das Ergebnis der Expression der gus-Gene ausgehend von dem P AccD müsste durch die Herstellung transgener Pflanzen von N. tabacum mit diesen Promotor überprüft werden.


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16.02.2004