4 Diskussion

4.1 Spezifität von Promotorsequenzen

Das Ziel der Arbeit war es, die Spezifität von Promotorsequenzen, welche für die Bindung der jeweiligen RNAP mit Hilfe der entsprechenden Transkriptionsfaktoren und somit für die Transkriptionsinitiation verantwortlich sind, zu untersuchen. Da die Ähnlichkeiten der RNAPs aus Eubakterien, Archaebakterien und Eukaryonten, sowie deren Sequenzen zur Erkennung für die Transkription in Prokaryonten und Eukaryonten schon häufig in der Literatur diskutiert wurden (Sentenac et al., 1992; Fassler und Gussin, 1996; Soppa, 1999; Ebright, 2000; Minakhin et al., 2001), sollte mit dieser Arbeit die Funktionalität von Promotoren in verschiedenen `kingdoms´ untersucht werden. Hierfür wurden zwölf pflanzenspezifische Promotoren auf Genexpression in fünf Bakterienarten, sowie drei bakterielle und sechs Plastiden Promotoren auf Genexpression in N. tabacum untersucht.

Die Bakterienarten, in denen die pflanzenspezifischen Promotoren untersucht wurden, stellten Vertreter taxonomisch unterschiedlicher Gruppen dar. E. coli und Y. enterocolitica gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. A. tumefaciens ist eine Bakterienart, welche mit Pflanzen interagiert und zur Familie der Rhizobiaceae gehört. P. putida und Acinetobacter sind weitverbreitete Bodenbakterien, wobei der Stamm Acinetobacter sp. BD413 eine natürliche Kompetenz aufweist (Nielsen et al., 1997). Die zu untersuchenden pflanzenspezifischen Promotoren stammten ebenfalls aus phylogenetisch nicht-verwandten Gruppen wie Pflanzen, Pflanzenviren und Agrobakterien. Sechs der Promotoren stammten aus S. tuberosum (P B33, P ST-LS1, P FBP1,1, P FBP1,6, P SKT2 und P KST1), zwei aus N. tabacum (P 130 und P 247) und einer aus A. thaliana (P KCO1). Je ein pflanzenspezifischer Promotor stammte aus CaMV (P 35S), A. rhizogenes (P RolC) und A. tumefaciens (P Nos).

Die bakteriellen Promotoren, welche in N. tabacum untersucht wurden, stammten aus E. coli, (P Lac und P Bla) und S. faecalis (P NptIII). Die Plastiden Promotoren stammten aus N. tabacum, wobei vier der Promotoren (P RbcL, P PsbA, P ClpP, P AtpB) Erkennungssequenzen der RNAP (PEP) aufwiesen, die denen des σ70-Faktorsaus E. coli sehr ähnlich sind. Die Promotoren P ClpP und P AtpB wiesen außerdem Erkennungssequenzen für eine Bakteriophagen-ähnliche RNAP (NEP) auf, welche ebenfalls in zwei weiteren Plastiden Promotoren (P AccD und P RpoB) vorhanden waren.

Die Frequenz mit der die pflanzenspezifischen Promotoren in den untersuchten Bakterienarten zu einer Expression führte, war mit einer Rate von 50 % der getesteten Kombinationen erstaunlich hoch. Bei den getesteten bakteriellen und Plastiden Promotoren in

N. tabacum kam es nur in einem Falle (P AccD) zu einer sehr geringen Expression. Dies weist daraufhin, dass die untersuchten pflanzenspezifischen Promotoren Sequenzen beinhalten, die von der bakteriellen RNAP zur Transkriptionsinitiation genutzt wurden. Die getesteten bakteriellen und Plastiden Promotoren wiesen hingegen mit einer Ausnahme keine Sequenzen auf, die von der eukaryontischen RNAP II aus N. tabacum zur Transkriptionsinitiation genutzt werden konnten. Dieses Ergebnis verdeutlicht zwei unterschiedliche Aspekte: einerseits konnten im Falle pflanzenspezifischer Promotoren in Prokaryonten heterologe Promotoren zur Transkriptionsinitiation genutzt werden und anderseits wird damit bewiesen, dass die Transkriptionsmaschinerie in Prokaryonten viel einfacher aufgebaut ist als die der Eukaryonten, so dass die angebotenen pflanzenspezifischen Promotorsequenzen erkannt wurden.

Bisher wurde die Genexpression ausgehend von heterologen Promotoren nur in wenigen Fällen beschrieben. Assaad und Signer (1990) beschrieben die Expression ausgehend von dem P 35S aus CaMV in E. coli. Der Promotor des amt-Gens aus dem Chlorella Virus zeigte eine Expression in verschiedenen transgenen Pflanzen als auch in verschiedenen Bakterienarten (Mitra et al., 1994). Mehrere Autoren beschrieben die Genexpression ausgehend von den pflanzenspezifischen Promotoren der T-DNA von A. tumefaciens in Agrobacterium (Gelvin et al., 1981; Schröder et al., 1983; 1984; Jansens et al., 1984). Weiterhin wurdevon Pandolfini et al. (2000) beschrieben, dass die `untranslatierte leader region´ des rolA-Gens aus A. rhizogenes ein Intron enthält, welches als prokaryontischer Promotor zu einer Expression in Agrobakterien, Rhizobien und Bakteroiden führte.

Die Erkennung der Promotorregion wird in Eubakterien durch den σ-Faktor des Holo-Enzyms der RNAP vermittelt. Der primäre σ-Faktor, welcher zur Transkription der Haushaltsgene genutzt wird, ist als σ70 in Gram-negativen Bakterien bekannt und ist in allen bekannten Eubakterien für die Lebensfähigkeit notwendig (Gruber und Bryant, 1997). Der σ70-Faktor der RNAP erkennt zur Transkriptionsinitiationdie –35- und -10-Regionen mit den Konsensus Sequenzen TTGACA und TATAAT und einem optimalen Abstand von 17 ± 1 nt (Hawley und McClure, 1983; Harley und Reynolds, 1987; Lisser und Margalit, 1993) bzw. der `extended -10-Region´ mit der Konsensus Sequenz TGNTATAAT (Keilty und Rosenberg, 1987; Kumar et al., 1993). Sind solche bakteriellen Sequenzen in den pflanzenspezifischen Promotorsequenzen vorhanden, kann es zu einer Expression der nachgeschalteten Gene kommen. Neben dem Vorhandensein der –35- und –10-Regionen in den Promotorsequenzen ist, nach der Computeranalyse von Lisser und Margalit (1994) an E. coli Promotoren, die Nukleotidzusammensetzung der umliegenden Sequenzen für die

physikalisch-chemischen und strukturellen Eigenschaften der DNA und somit auch für die Stärke eines Promotors verantwortlich.

Bei den pflanzenspezifischen Promotoren verursachte ein Promotor, P ST-LS1, in allen fünf untersuchten Bakterienarten eine Expression. Hingegen führten zwei der untersuchten pflanzenspezifischen Promotoren, P RolC und P 247, zu keiner Expression. Die anderen Promotoren zeigten in den untersuchten Bakterien unterschiedliche Expressionsverhalten. Der P KST1 führte z. B. zu einer starken Expression in E. coli, Y. enterocolitica und Acinetobacter sp. In A. tumefaciens und P. putida fand hingegen nur eine sehr geringe Expression statt.

Die Promotoranalysen von Hawley und McClure (1983), Harley und Reynolds (1987) und Lisser und Margalit (1993) beschränkten sich auf Analysen von Promotoren, welche von der RNAP aus E. coli erkannt wurden. Allgemein wird die Stärke eines Promotors darüber definiert, wie ähnlich die –35- und -10-Regionen der jeweiligen Promotoren den Konsensus Sequenzen bei einem optimalen Abstand von 17 ± 1 nt der beiden Regionen zueinander sind (Dombroski et al., 1992; Busby und Ebright, 1994). Dass sich Konsensus Sequenzen von Promotoren anderer Bakterienarten gegenüber denen von E. coli unterscheiden können, zeigten z. B. die Analysen der Konsensus Sequenzen von den Gram-positiven Bakterien Streptomyces (Strohl, 1992)und Corynebacterium glutamicum (Pátek et al., 1996) als auch die des Gram-negativen Bakteriums Campylobacter jejuni (Tab. 29; Wösten et al., 1998b).

Tab. 29 : Vergleich der putativen σ70 Konsensus Sequenzen (modifiziert nach Wösten et al. , 1998b). Es wurden 29 Promotorsequenzen aus Streptomyces (Strohl, 1992), 33 Promotorsequenzen aus C. glutamicum (Pátek et al. , 1996), 21 Promotorsequenzen aus C. jejuni (Wösten et al. , 1998b) und 263 Promotorsequenzen aus E. coli (Harley und Reynolds, 1987) untersucht. * Aufgeführt wurden nur die Nukleotide, welche in mehr als 47 % der Fälle an den Positionen vorkamen.

Spezies

Nukleotide an Position [%]*

-39 -38 -37 -36 -35 -34 -33 -32 -31 -30 // -22 -21 -20 -19 –18 –17 –16 –15 –14 –13 –12 –11 –10 –9 –8 –7 –6 –5 –4

Streptomyces

(Strohl, 1992)

 

T86 T90 G100 A69 C66

//

T59 A86

T100

C. glutamicum

(Pátek et al. , 1996)

 

T48 T48 G73 C52

A52

//

G55

T79 A73

A58

T85

C. jejuni

(Wösten et al. , 1998b)

T52 T67 T57 A67 A76 G62 T57

T71 T52 // T62 T62 T52 T57 T71 T52 T71 G52

T95 A90 T57 A76 A62 T81 T86

A52

E. coli

(Harley und Reynolds, 1987)

 

T78 T82 G68 A58 C52 A54

//

T82 A89 T52 A59 A49 T89

Die Konsensus Sequenz der –35-Region aus Streptomyces entsprach in den ersten fünf Positionen (TTGAC) der aus E. coli.An Position sechs wurde mit 62 % eine Purinbase gefunden (Strohl, 1992). Die Promotorsequenzen von C. glutamicum zeigten dagegen schon an Position vier der –35-Region mit einem Cytosin eine Differenz gegenüber den E. coli-Promotoren auf. Für die –10-Region wiesen die Analysen beider Bakterien an den Positionen eins, zwei und sechs (TANNNT) dieselben Basen auf, die auch in E. coli am stärksten konserviert sind.Die Promotorregionen der Gene aus C. jejuni besitzen drei konservierteRegionen bei 10, 16 und 35 nt stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle. Die –10-Region entspricht der –10-Konsensus Sequenz der σ70 E. coli Promotoren, wohingegen die –35-Region vollkommen verschieden gegenüber der von E. coli ist. In der Studie von Wösten et al. (1998b) wurde festgestellt, dass nur sechs von elf Promotoren aus C. jejuni in E. coli zu einer Expression führten. Diese Untersuchungen zu Promotor Konsensus Sequenzen verschiedener Bakterienarten als auch die unterschiedliche Expression ausgehend von den pflanzenspezifischen Promotoren in den untersuchten Bakterienarten beweisen, dass die Strukturen, welche die jeweilige bakterielle RNAP zur Transkriptionsinitiation nutzt, meist nur geringe, aber für das Bakterium spezifische Unterschiede aufweist.

In E. coli wurde die Genexpression der pflanzenspezifischen Promotoren in zwei verschiedenen Vektoren untersucht. Der Vektor pKK232-8 wurde für Promotorstudien konzipiert und besitzt einen Transkriptionsstop vor der MCS. Dieser Vektor ist aufgrund seines Replikationsursprungs nicht für die Expressionsstudien in A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. geeignet. Auch in Y. enterocolitica konnte er nicht verwendet werden, da Rekombinationsereignisse zu Rearrangements führten. Der Pflanzentransformationsvektor pBin19 besitzt keinen Transkriptionsstop vor der MCS, wodurch es bei der promotorlosen Kontrolle zur Expression der inserierten luxAB-Gene als Reportergene durch die stromaufwärts liegenden bakteriellen DNA-Sequenzen kam (Jacob, 1997). pBin19 besitzt mit dem RK2 einen `broad host range´ Replikationsursprung und konnte somit in die anderen zu untersuchenden Bakterienarten transformiert werden.Die Interpretation der Ergebnisse der Promotorexpression waren für die pKK- und pBin-Konstrukte in E. coli identisch. Einzig die Höhe der Expression des P KCO1 und P FBP1,7 war diskrepant zwischen den beiden Plasmiden. Somit konnten die pBin-Konstrukte zur Beurteilung der Expression ausgehend von den pflanzenspezifischen Promotoren in Y. enterocolitica, A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. herangezogen werden.

In E. coli zeigten acht der untersuchten pflanzenspezifischen Promotoren (P B33, P ST-LS1, P 130, P FBP1,7, P Nos, P SKT2, P KCO1 und P KST1) eine Expression der luxAB-Gene, die stärker war als die des P 35S, welcher als Positiv-Kontrolle mitgeführt

wurde (Assaad und Signer, 1990). Somit exprimierten in dem Laborstamm E. coli K-12 DH5α die meisten der pflanzenspezifischen Promotoren. In Y. enterocolitica ging von zwei Promotoren (P 130 und P Nos), die in E. coli exprimierten, keine Expression aus. Der P ST-LS1 führte in Y. enterocolitica zur stärksten Expression der luxAB-Gene. Die Expressionsniveaus der pBin-Konstrukte in dem E. coli K-12 Stamm DH5α waren im Gegensatz zu denen des Yersinia WT-Stamms sehr gering, aber vergleichbar mit denen in Acinetobacter sp. In Acinetobacter sp. führten sechs Promotoren (P B33, P ST-LS1, P 130, P SKT2, P KST1 und P KCO1) zu einer Expression. Das höchste Expressionsniveau der luxAB-Geneging hier von dem P 130 aus. In A. tumefaciens exprimierten fünf der pflanzenspezifischen Promotoren (P 35S, P ST-LS1, P FBP1,1, P FBP1,7 und P KCO1) die luxAB-Gene, wobei die stärkste Genexpression mit Abstand von dem P 35S ausging. Der Promotor P FBP1,1 führte nur in A. tumefaciens zu einer Expression. Die geringsten Expressionen ausgehend von den pflanzenspezifischen Promotoren wurden in P. putida gemessen. Hier exprimierten nur P B33, P ST-LS1 und P SKT2, drei Promotoren aus S. tuberosum, die luxAB-Gene. Die Höhe der Lumineszenzmessungen der pBin-Konstrukte in P. putida war im Vergleich zu den Messungen in den anderen Bakterienarten sehr gering. P. putida benötigt als obligat aerober Mikroorganismus Sauerstoff zum Wachstum. Bei der Oxidationsreaktion durch die bakterielle Luziferase wird ebenfalls molekularer Sauerstoff benötigt (Blouin et al., 1996). Sauerstoff darf bei dieser Reaktion kein limitierender Faktor sein. So konkurrieren zwei Mechanismen um den Sauerstoff, wobei das Wachstum der Zellen im Vordergrund steht und somit die niedrigen Lumineszenzwerte erklärbar wären.

Eine weitere Möglichkeit für die geringe Expression der pflanzenspezifischen Promotoren in P. putida wäre, dass sich die σ70-Faktor Erkennungssequenzen zur Transkriptionsinitiation von P. putida von denen aus E. coli unterscheiden. Für P. putida, Y. enterocolitica, A. tumefaciens und Acinetobacter sp. gibt es bisher keine Veröffentlichungen, welche sich mit den -35- und –10-Region σ70 Konsensus Sequenzen befassen. Jedoch gibt es einzelne Veröffentlichungen, wie die molekulare Charakterisierung der rpoH-Genregulation in dem P. putida Stamm KT2440 (Manzanera et al., 2001), in welcher mögliche -35- und –10-Sequenzen zur Transkriptionsinitiation diskutiert wurden. Das rpoH-Gen, welches für den Hitzeschock σ32-Faktor kodiert, wird bei einem Zellwachstum von 30 °C von drei verschiedenen Promotoren exprimiert. Zwei der Promotoren weisen Homologien zu den Konsensus Sequenzen des σ70-Faktors auf, wobei sie mit den Sequenzen TCTTGAT und GGTATA für die –35- bzw. –10-Region des P1 und TTCCAG und CACAAG für die –35- bzw. –10-Region des P3 sehr diskrepant gegenüber den Konsensus Sequenzen in E. coli

sind. Der Abstand zwischen der –35- und –10-Region beträgt bei P1 17 Nukleotide und bei P3 18 Nukleotide. Zwischen dem Transkriptionsstart und der –10-Region befinden sich bei P1 neun Nukleotide und bei P3 sieben Nukleotide.

Untersuchungen heterologer Promotoren in A. tumefaciens sind von besonders großer Bedeutung, da zur Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen u. a. bakterielle Gene unter der Kontrolle pflanzenspezifischer Promotoren mittels binärer Vektoren und A. tumefaciens in das Pflanzengenom eingeschleust und dort exprimiert werden. Der Frage, ob diese pflanzenspezifischen Promotoren eine Expression der bakteriellen Gene schon in Agrobacterium bewirken, wurde zwar schon nachgegangen (Gelvin et al., 1981; Schröder et al., 1983; 1984; Jansens et al., 1984), sie wurde aber nicht systematisch geklärt. Mit der Sequenzierung des Genoms von A. tumefaciens C58 (Wood et al., 2001) werden sich zunehmend Untersuchungen zu den Promotoren der entschlüsselten Gene anschließen, um mögliche Promotor Konsensus Sequenzen für A. tumefaciens zu erstellen. Das et al.(1986) charakterisierten die Promotoren der sechs Operons (virA, virB, virC, virD, virE, virG)des Ti-Plasmids aus A. tumefaciens, welche die Virulenzgene tragen. Die Promotoren zeigten eine Homologie zur –10-Region, weniger zur –35-Region der untersuchten Konsensus Sequenzen für E. coli. Die –10-Region der vir-Promotoren wurde mit der Konsensus Sequenz (T/G)NTAA(T/C) beschrieben. Dabei fällt auf, dass die Nukleotide an den Positionen eins, zwei und sechs, welche in E. coli am stärksten konserviert sind, bei diesen Promotoren am geringsten konserviert sind. Diese Untersuchung ist auch deswegen interessant, da nur die Gene zweier vir-Operons (virA und virG) in Agrobacterium-Kulturen exprimiert wurden. Die Expression der Gene der anderen vier Operons wurde nur bei Cokultivierung von Agrobacterium mit Pflanzenzellen beobachtet.

Interessant ist auch die Beobachtung, dass der P FBP1,1, welcher am 5´-Ende um 600 bp verkürzt gegenüber dem P FBP1,7 ist, in allen getesteten Bakterienarten eine geringere Expression aufwies als der P FBP1,7. Eine mögliche Erklärung wäre, dass durch die Verkürzung des 5´-Endes des Promotors die Plasmid-DNA eine andere Struktur annahm und somit nicht die DNA-Sequenzen, die in dem P FBP1,7 zu einer Expression durch die bakterielle RNAP führten, in dem P FBP1,1 nicht optimal erkannt wurden (Geiselmann, 1997; Dai und Rothman-Denes, 1999). Weiterhin könnten Sequenzen des 5´-Endes des P FBP1,7, welche auf den 600 bp liegen, die in dem P FBP1,1 nicht vorhanden sind für die erhöhte Expression des P FBP1,7 gegenüber dem P FBP1,1 verantwortlich sein. Dies würde bedeuten, dass möglicherweise Sequenzen, welche über 1100 bp stromaufwärts des Translationsstarts des luxA-Gens lagen, für die Transkriptionsinitiation verantwortlich wären. Womöglich führte das Vorhandensein zusätzlicher Nukleotide in der MCS der pBin- bzw.

pKK-Konstrukte der beiden Promotoren zu einem veränderten Expressionsverhalten. Bei dem pFBP1,1lux-Konstrukt liegen die Restriktionsschnittstellen EcoRI, KpnI, SmaI, BamHI und SalI zwischen der Sequenz des P FBP1,1 und den Reportergenen, wohingegen bei dem pFBP1,7lux-Konstrukt nur die DNA-Sequenz der Restriktionsschnittstellen von BamHI, XbaI und SalI zwischen P FBP1,7 und den luxAB-Genen zu finden ist. Der Unterschied der Restriktionsschnittstellen bei den pKK-Konstrukten liegt nur in einer aufgefüllten EcoRI-Schnittstelle ligiert mit SmaI in dem pKKFBP1,1lux-Konstrukt gegenüber dem pKKFBP1,7lux-Konstrukt. Lisser und Margalit (1994) konnten durch Computeranalyse von E. coli-Promotoren zeigen, dass die Nukleotide, welche die Konsensus Sequenzen (-35- und –10-Region) umgeben, entscheidend für die physikalisch-chemische und strukturelle Eigenschaft der DNA sind und somit die Promotorstärke beeinflussen können.

Um die Höhe der heterologen Expression in Bakterien beurteilen zu können wurde die Expressionsstärke mit bakteriellen, also homologen Promotoren verglichen. Der Lac-Promotor führte in den untersuchten Bakterienarten zu sehr unterschiedlichen Expressionsstärken.

In E. coli konnte für den P Lac eine Expression gemessen werden, welche 20 mal stärker war als die des stärksten Pflanzenpromotors P KST1 (pBin-Konstrukt). Der Promotor des TEM1 bla-Gens, welcher in unserem Labor mit den luxAB-Genen fusioniert und in den Vektor pKK232-8 kloniert wurde, führte in E. coli hingegen nur zu einer sechsfach höherenExpression verglichen mit dem P KST1 (pKK-Konstrukt).

In Yersinia führte der P Lac zu einer Expression, die nur 1,5mal höher bzw. doppelt so hoch war wie die durch die pflanzlichen Promotoren P ST-LS1 und P KST1 bewirkten Expressionen. Die Expression eines weiteren bakteriellen Promotors, welcher aus dem Y. enterocolitica Stamm 78 gewonnen wurde, war schwächer als die Expression dreier pflanzenspezifischer Promotoren (P ST-LS1, P KST1 und P KCO1) in Y. enterocolitica.

Zur Charakterisierung der luxAB-Transkripte wurden Northern Hybridisierungen, quantitative PCRs und 5´-RACE-Analysen von ausgewählten Promotor-luxAB-Fusionen durchgeführt. Mit den Northern Hybridisierungen konnte durch die Anwesenheit distinkter Banden gezeigt werden, dass es zu spezifischen Transkriptionsstarts in den Pflanzenpromotoren kam.

Außerdem wurde ein Transkript identischer Länge in allen Promotor-luxAB-Fusionen nachgewiesen. Durch Transkriptionsstartbestimmungen konnte gezeigt werden, dass dieses Transkript in der 5´untranslatierten Region des luxA-Gens begann und es sich hierbei um ein Degradierungsfragment handelte. Das 5´-Ende der mRNA dieser Transkripte wurde von den Nukleotiden 5´-AAUU-3´ gebildet, welche als Erkennungssequenz für die Endoribonuklease

E (RNase E) dienen könnte. Die RNase E ist das Schlüsselenzym für die Initiation der mRNA-Degradierung. Für E. coli wurde die Konsensus Sequenz mit (A/G)AUU(A/U) oft in Kombination mit zusätzlichen lateralen `stem-loop´-Ankern beschrieben (Rauhut und Klug, 1999). In 3´-Richtung der untersuchten Sequenz wurde ein `inverted repeat´ gefunden, welcher eine `stem-loop´-Struktur ausbilden könnte und somit die Erkennung der Sequenz 5´-AAUU-3´ als Erkennungssequenz für die RNase E erhöht. Nach dem initialen Bruch der mRNA durch die RNase E, kann die Degradierung durch die 3´→5´-Exonukleasen und weiteren Enzyme des Degradosoms erfolgen. Das Problem von Arbeiten mit bakterieller mRNA ist, dass diese Halbwertszeiten besitzen, welche im Bereich von wenigen Minuten liegen. Im Vergleich dazu liegen mRNA-Halbwertszeiten eukaryontischer Zellen im Bereich von Stunden. Diese geringen mRNA-Halbwertszeiten ermöglichen Bakterien eine schnelle Anpassung an eine sich verändernde Umgebung. Bei der Herstellung von Reportersystemen sollte eine Erkennungssequenz für die RNase E mit `stem-loop´-Strukturen in der 5´untranslatierten Region wie sie in den luxAB-Genen gefunden wurde, vermieden werden. Die Degradierung wirkte sich jedoch nicht auf die Translation aus, wie die mRNA-Mengen ausgewählter Promotor-luxAB-Fusionen in Y. enterocolitica mittels quantitativer PCR im Vergleich zur Stärke der Lumineszenz bewiesen. Hierbei wurde für die Promotoren P 35S, P ST-LS1, P RolC und P Nos gezeigt, dass die ermittelten Transkriptmengen der luxAB-mRNA mit den Luziferase-Aktivitäten korrelierte und sich somit die Lumineszenzmessung zur Beurteilung der Expressionsstärke eignete.

Fusionen der pflanzenspezifischen Promotoren mit dem promotorlosen cat-Gen erlaubten den Nachweis der phänotypischen Ausprägung durch Wachstum auf Agarplatten mit Chloramphenicol. Hierbei wiesen die Promotoren P ST-LS1 und P Nos Expressionsstärken des cat-Gens in E. coli auf, die bei einer typischen Selektionskonzentration von 25 µg/ml für Chloramphenicol Wachstum vermitteln konnten. Weiterhin konnte durch den Vergleich der Expressionsstärken der pflanzenspezifischen Promotoren in den beiden Reportersystemen (cat und luxAB) bewiesen werden, dass die untersuchten Promotoren und nicht die Sequenzen des jeweiligen Reportersystems für die Expressionen der Reportergene verantwortlich waren. Eine Ausnahme bildete hier jedoch die Expression des P Nos. Dieser exprimierte die luxAB-Gene in E. coli ähnlich stark wie der P 35S aus CaMV und somit geringer als der P ST-LS1. Die Expression des cat-Gens ausgehend von dem P Nos war jedoch viel stärker als die des P ST-LS1. Alle weiteren getesteten Promotoren führten zu Lumineszenzen in E. coli, diemit dem Wachstum der E. coli-Stämme mit den Promotor-cat-Fusionen auf Agarplatten mit Chloramphenicol korrelierten. Für das luxAB-Transkript ausgehend von dem P Nos wurde in Y. enterocolitica nachgewiesen, dass die Transkriptmenge mit der Proteinmenge an gebildeter

Luziferase und somit mit der Luziferase-Aktivität korrelierte. Außerdem wiesen die Transkripte von der Promotor-cat-Fusion (pKKNos) und der Promotor-luxAB-Fusion (pKKNoslux) von P Nos in E. coli den gleichen Transkriptionsstart auf. Somit blieb die Ursache für die unterschiedliche Expressionsstärke der beiden Reportersysteme ausgehend von P Nos ungeklärt. Die Ursache könnte sowohl auf der Transkriptions-, als auch auf der Translationsebene zu suchen sein. Die Proteinmenge eines bestimmten Proteins in der Zelle wird durch die Transkriptionsrate des zu exprimierenden Gens, die Zerfallsrate bzw. Degradierung der mRNA, die Translationsrate der mRNA und die Degradierung des Proteins bestimmt. Kuzj et al.(1998) beschrieben, dass die Stabilität der cat-Transkriptein E. coli Kulturen in Abhängigkeit von der Wachstumsphase variierte, aber die Translationsrate nicht mit der erhöhten mRNA-Stabilität korrelierte. Die cat-mRNA-Halbwertszeit war während der lag-Phase lang, nahm in der exponentiellen Phase ab und erhöhte sich wieder in der stationären Phase. Betrachtete man jedoch die Menge an cat-mRNA bezogen auf die Zellmasse, so erkannte man keinen signifikanten Unterschied zwischen den einzelnen Wachstumsphasen. Dieses lässt darauf schließen, dass es Kompensationsmechanismen für die cat-Transkription gibt. In dem Falle der Expression des cat-Gens ausgehend von dem P Nos könnte jedoch eine erhöhte mRNA-Stabilität vorliegen, die auch zu einer erhöhten Menge an Chloramphenicol-Acetyltransferase führte.

Für Expressionsstudien von Promotoren bedeutet dieses Ergebnis, dass in einzelnen Fällen verschiedene Reportersysteme zu einer unterschiedlichen Aussage über die Stärke eines Promotors führen können. So wurde z. B. eine Transkription der nopalinen T-DNA-Region des Ti Plasmids C58 in E. coli und Agrobacterium beschrieben (Janssens et al., 1984). Für diese Expression waren die Promotorsequenzen der nopalinen T-DNA verantwortlich. Daneben wurde eine Expression der Fusion des Promotors des Nopalin Synthase Gens mit der kodierenden Region der β-Galactosidase in Agrobacterium, jedoch ohne Angabe der Expressionshöhe beschrieben. Die in dieser Arbeit gemessene geringe Menge an Luziferase-Aktivität des Nos-Promotors in A. tumefaciens wurde als nicht signifikant eingestuft.

Bei der Untersuchung der bakteriellen und Plastiden Promotoren führte nur der Plastiden Promotor P AccD zu einer sehr geringen Expression in N. tabacum. Dieser Promotor wird in Chloroplasten von der NEP exprimiert. Die NEP erkennt auf der Promotor-DNA mit der YRT-Box und teilweise GAA-Box Sequenzen, welche weder den Konsensus Sequenzen der bakteriellen –35- und –10-Regionen, noch der eukaryontischen TATA-Box oder dem Inr-Element ähnlich sind. Der P AccD besitzt zur Erkennung durch die NEP nur die YRT-Box mit dem hochkonservierten YATA-Motiv, welches hier durch die Nukleotide TAT an Position –9 bis –7 bezogen auf den Transkriptionsstart in Chloroplasten gebildet wird (Liere

und Maliga, 1999a; 1999b). Zwei mögliche Ereignisse können zu der positiven Expression ausgehend von dem P AccD in N. tabacum nach dem Partikelbombardement geführt haben. Eine Möglichkeit ist, dass die inserierte DNA in den Zellkern gelangte und die RNAP II des Tabaks auf der Promotor-DNA Sequenzen erkannt hatte, welche zu einer sehr geringen Expression führte. Eine weitere Möglichkeit ist, dass die durch das Bombardement eingeführte DNA teilweise in die Chloroplasten gelangte, dort die Promotor-DNA von der NEP erkannt, zu einer Expression und somit zu einem falsch positiven Ergebnis führte. Die Methodik des Partikelbombardements ermöglicht es nicht, eine genaue Lokalisation der übertragenen DNA in den Zellen anzugeben. Um nachzuweisen, dass diese Expression durch die RNAP II des Tabaks verursacht wurde, müssten gentechnisch veränderte Pflanzen mit dem P AccD hergestellt werden.

Ein Problem ist, dass Ergebnisse transienter Genexpressionsstudien in Pflanzen mittels Partikelbombardement sich bei der Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen mit derselben DNA nicht immer reproduzieren lassen. So kann nicht ausgeschlossen werden, dass die getesteten bakteriellen und Plastiden Promotoren in transgenen Pflanzen zu einer Genexpression der nachgeschalteten Gene führen könnten. Jedoch ist diese Wahrscheinlichkeit eher gering (Christou, 1994).

4.2 Identifizierung von Promotorsequenzen

Ein weiteres wichtiges Ziel der Arbeit war die Beantwortung der Fragestellung, ob mit einer Suche nach eukaryontischen bzw. prokaryontischen Konsensus Sequenzen in den Promotorsequenzen eine Aussage darüber getroffen werden kann, ob und mit welchem Ausmaß eine heterologe Expression der nachgeschalteten Gene erfolgt. Auch ein möglicher Zusammenhang zwischen dem AT-Gehalt und der Genexpressionsstärke der pflanzenspezifischen Promotoren sollte überprüft werden.

Gängige Methoden zur Identifizierung von Promotorsequenzen sind die Analyse von DNA-Sequenzen mit Hilfe von Suchmaschinen und Software oder/und die Bestimmung des Transkriptionsstarts.

4.2.1 Computer-gestützte Suche nach Promotor Konsensus Sequenzen

Um vergleichende Aussagen über die Computer-gestützte Suche nach Promotorsequenzen in den pflanzenspezifischen Promotoren und über deren AT-Gehalt treffen zu können, wurden jeweils 300 bp des 3´-Endes der Promotoren auf das Vorhandensein von prokaryontischen Konsensus Sequenzen untersucht. Der kleinste untersuchte pflanzenspezifische Promotor P Nos hatte eine Gesamtlänge von 306 bp. Für die Computer-gestützte Suche nach

potentiellen prokaryontischen Konsensus Sequenzen in den pflanzenspezifischen Promotoren wurde nach den von Hawley und McClure (1983), Harley und Reynolds (1987) und Lisser und Margalit (1993) beschriebenen Hexameren für die –35- und –10-Region gesucht. Hierbei wurden gegenüber der Konsensus Sequenz der –35-Region mit TTGACA drei Mismatche erlaubt und bei der –10-Region mit TATAAT zwei Mismatche erlaubt. Bei der Sequenz der –35-Region blieben die ersten beiden Nukleotide (TTGACA) konserviert und bei der –10-Region die Nukleotide an Position zwei und sechs (TATAAT). Obwohl eine Spacerregion von 17 ± 1 nt zwischen den Konsensus Hexameren als optimal angesehen wird, berichteten Hawley und McClure (1983), dass die Promotoren mit den Konsensus Sequenzen in einem Abstand von 15 bis 20 nt noch funktionstüchtig waren. Außerdem wurde in die Suche die `extended –10-Region´ (Keilty und Rosenberg, 1987) miteinbezogen. In dieser Sequenz wurden drei Mismatche erlaubt bei einer Konservierung der Positionen eins, zwei, fünf und neun (TGNTATAAT). In einer Analyse von Ozoline et al. (1997) wurden 441 Promotorsequenzen, welche von der E. coli RNAP erkannt wurden, statistisch nach dem Auftreten von –10-Regionen untersucht. Hierbei wurden neben der Konsensus Sequenz für die –10-Region mit TATAAT noch zwölf weitere häufig auftretende –10-Konsensus Hexamere beschrieben. Diese wurden bei der Analyse mit berücksichtigt, ergaben jedoch keine weiteren Treffer.

Die Gestaltung der Computer-gestützten Suche nach potentiellen eukaryontischen Konsensus Sequenzen in den bakteriellen bzw. Plastiden Promotoren erwies sich als schwieriger, da eukaryontische Promotoren wesentlich heterogener als prokaryontische Promotoren aufgebaut sind. Sie weisen für die basale Transkription häufig die TATA-Box auf (Breathnach und Chambon, 1981; Bucher und Trifonov, 1986; Bucher, 1990), jedoch gibt es daneben auch Promotoren, welche als TATA-less bezeichnet werden und nur das Inr-Element aufweisen (Smale und Baltimore, 1989; Zenzie-Gregory et al., 1992). In Drosophila- und humanen Promotoren wurden in TATA-less Promotoren neben dem Inr-Element das `downstream promoter element´ (DPE) nachgewiesen (Burke und Kadonaga, 1996; 1997). Dieses Element liegt ca. 30 nt stromabwärts der Transkriptionsinitiationsstelle und beeinflusst die Promotoraktivität.Des weiteren sind die Konsensus Sequenzen der pflanzlichen Promotoren mit der einzigen aussagekräftigen Studie von Joshi (1987) eher gering untersucht. Die Computer-gestützte Suche wurde in den bakteriellen und Plastiden Promotoren nach der TATA-Box mit der Konsensus Sequenz TATAWAW mit der Konservierung an Position zwei und drei vorgenommen. Die Suche erlaubte einen Mismatch, wobei an den Positionen fünf und sieben sowohl ein Adenin als auch Thymin als ein Treffer erkannt wurde. Im Gegensatz zu der Suche in den pflanzenspezifischen Promotorsequenzen wurde in den bakteriellen und

Plastiden Promotoren die gesamte Promotorsequenz nach Konsensus Sequenzen untersucht. Die Größe der Promotoren variierte von 132 bp für den P Bla bis 376 bp für den P AccD. Dies erlaubte zwar nicht den direkten Vergleich der Anzahl der Treffer der jeweiligen untersuchten Promotoren, aber eine Reduzierung der untersuchten DNA-Sequenz auf die Länge von 132 bp des kleinsten Promotors wäre nicht sinnvoll gewesen, da eukaryontische Promotoren aufgrund ihrer Komplexität und durch Vorhandensein von den `upstream activating sequences´ mehrere Hundert Basenpaare lang sein können.

Allgemein zeigte das Ergebnis der Computer-gestützten Analyse in den untersuchten Promotoren nach Konsensus Sequenzen keine Übereinstimmung zwischen der Anzahl der gefundenen Treffer, sowie deren Homologie zur Konsensus Sequenz und der Wahrscheinlichkeit und Stärke einer heterologen Genexpression der jeweiligen Promotoren. Die maximale Trefferanzahl lag sowohl bei den pflanzenspezifischen als auch bei den bakteriellen bzw. Plastiden Promotoren bei acht Treffern.

Bei den pflanzenspezifischen Promotoren wurde die höchste Trefferquote für den SKT2-Promotor aus S. tuberosum festgestellt. Dieser Promotor führte zwar in P. putida zu der stärksten Genexpression aller getesteten Promotoren, jedoch war die Genexpression in E. coli, Y. enterocolitica und Acinetobacter sp. im Gegensatz zu der des P ST-LS1 eher gering. In A. tumefaciens wurde die geringe Lumineszenz ausgehend von dem P SKT2 sogar als nicht signifikante Genexpression gewertet. Für die Promotoren P RolC und P 247, welche beide keine Genexpression in den getesteten Bakterienarten verursachten, wurden jeweils drei Treffer mit der Computeranalyse gefunden. Ebenfalls drei Treffer wurden für den P ST-LS1 festgestellt, welcher in den fünf getesteten Bakterienarten zu einer Genexpression führte. Der einzige pflanzenspezifische Promotor für den überhaupt keine potentielle bakterielle Konsensus Sequenz gefunden werden konnte, war der P 130. Dieser zeigte immerhin in E. coli und Acinetobacter sp. eine signifikante Genexpression. Je ein Treffer wurde für die Promotoren P FBP1,1, P FBP1,7, P Nos und P KCO1 festgestellt. Die unterschiedliche Expression der Promotoren des FBPase-Gens (P FBP1,1 und P FBP1,7) wurde schon eingehend beschrieben. Durch den vorgegebenen Suchmodus wurden für beide Promotoren identische Treffer gefunden, obwohl P FBP1,7 in E. coli, Y. enterocolitica und A. tumefaciens eine Expression der nachgeschalteten Gene verursachte. Im Gegensatz dazu führte der P FBP1,1 nur in A. tumefaciens zu einer Expression. Für den P Nos konnte nur eine Expression in E. coli festgestellt werden. Hingegen führte der P KCO1 teilweise zu einer sehr starken Expression in E. coli, Y. enterocolitica, A. tumefaciens und Acinetobacter sp.

Bei der Untersuchung des AT-Gehalts der pflanzenspezifischen Promotoren waren für einige Promotoren Beziehungen zwischen der Expressionsstärke und der Höhe des

AT-Gehalts abzulesen. So wiesen die Promotoren P KCO1 mit 66,7 %, P KST1 mit 67,0 % und P ST-LS1 mit 68,7 % ein sehr hohen AT-Gehalt auf. Der P KST1 führte zwar nur in drei der getesteten Bakterienarten und der P KCO1 in vier der getesteten Bakterienarten zu einer Genexpression, jedoch waren die Genexpressionen in E. coli und Y. enterocolitica sehr stark. Einen höheren AT-Gehalt als P KCO1, P KST1 und P ST-LS1 wies nur der P SKT2 mit 76,6 % auf, welcher mit Ausnahme von A. tumefaciens in den weiteren vier untersuchten Bakterienarten zur Genexpression führte. Weiterhin auffällig war, dass die pflanzenspezifischen Promotoren P 35S aus CaMV mit 52,6 % und die beiden Promotoren P Nos mit 53,7 % und P RolC mit 60 % aus den Agrobakterien eher geringe AT-Gehalte aufwiesen. Im Vergleich zu dem AT-Gehalt von 42 % des Stammes A. tumefaciens C58 (Wood et al., 2001) ist der AT-Gehalt der beiden Promotoren aus Agrobacterium um ca. 12 % bzw. 18 % höher. Der AT-Gehalt des Genoms von E. coli liegt bei etwa 49 % (Blattner et al., 1997) und der der fünf Chromosomen von A. thaliana bei ca. 65 % (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Der Promotor P KCO1 aus A. thaliana liegt mit einem AT-Gehalt von 66,7 % nur gering über dem AT-Gehalt des Genoms. Die AT-Gehalte der Promotoren aus S. tuberosum betragen 64,3 % für den P B33 bis 76,6 % für den P SKT2. Diese hohen AT-Gehalte können dazu beitragen, dass diese Sequenzen von der prokaryontischen Transkriptionsmaschinerie zur Initiation genutzt wurden.

Die Korrelation zwischen der möglichen Genexpression bzw. Genexpressionsstärke der untersuchten Promotoren in bezug auf das Vorhandensein von potentiellen Konsensus Sequenzen in diesen Promotoren gestaltet sich u. a. deswegen als schwierig, da eine Vorhersage möglichst für mehrere Spezies getroffen werden sollte. Demeler und Zhou (1991) entwickelten ein Programm zur Vorhersage von E. coli-Promotoren durch die Verwendung eines neuralen Netzwerkes. Dabei konnte mit optimalen Parametern eine Vorhersagegenauigkeit von bis zu 100 % getroffen werden. Diese Vorhersage wurde jedoch nur für E. coli demonstriert, dessen Promotorsequenzen am besten untersucht sind (Hawley und McClure, 1983; Harley und Reynolds, 1987; Lisser und Margalit, 1993). Die Anwendung von Algorithmen zur Erkennung von Promotorsequenzen, welche für E. coli- bzw. B. subtilis-Promotoren entwickelt wurden, lassen sich nicht unbedingt auf andere Bakterienarten anwenden. Wenn sie dann auf andere Bakterienarten angewandt wurden, wie z. B. auf Helicobacter pylori (Vanet et al., 1999), so fehlte der Vergleich zu den ermittelten Konsensus Sequenzen durch experimentelle Daten.

Um vor allem die Stärke von Promotoren in Prokaryonten beurteilen zu können, genügt es nicht, nach den Konsensus Sequenzen und dem Abstand der Boxen zueinander zu suchen. Die DNA-Konformation als auch die elektrostatische Bindung innerhalb der Promotoren sind von

großer Bedeutung (Nickerson und Achberger, 1995; Geiselmann, 1997; Dai und Rothman-Denes, 1999) sowie das Vorhandensein von Bindungsstellen für bakterielle Transkriptionsaktivatoren (Busby und Ebright, 1994; Vicente et al., 1999) und/oder das Vorhandensein des UP-Elements (Ross et al., 1993; Rao et al., 1994). In Eukaryonten ist die Problematik noch größer, da die basale Transkription, d. h. die Transkriptionsinitiation durch die RNAP II mit ihren dazugehörigen GTFs an den Core-Promotor-Elementen wie TATA-Box und/oder Inr-Element in vivo nicht existent ist. Für die Transkription in vivo werden zusätzlich zu dem Core-Promotor noch wie einleitend beschrieben die `promoter-proximal elements´ und/oder Enhancer benötigt (Johnson und McKnight, 1989; Mitchell und Tjian, 1989; Zawel und Reinberg, 1995; Fassler und Gussin, 1996; Orphanides et al., 1996; Hampsey, 1998). Außerdem hat in Eukaryonten die Chromatinstruktur einen regulierenden Einfluß auf die Transkription (Paranjape et al., 1994; Kornberg und Lorch, 1995; Struhl, 1999).

Diese Problematik spiegelt auch das Ergebnis der Computer-gestützten Suche in den bakteriellen und Plastiden Promotoren nach der eukaryontischen TATA-Box wieder. Bei der Analyse für den P ClpP wurden acht Treffer, für P AccD fünf, für P RpoB und P RbcL vier bzw. drei, sowie für die Promotoren P PsbA, P NptIII und P Bla je zwei Treffer gefunden. Nur für zwei Promotoren (P Lac und P AtpB) wurden keine Treffer festgestellt. Im Gegensatz zu der hohen Expressionsrate der pflanzenspezifischen Promotoren in Prokaryonten in Kombination mit der hohen Anzahl der Treffer, kam es bei den bakteriellen bzw. Plastiden Promotoren nur in einem einzigen Fall, dem P AccD, zu einer sehr geringen Expression.

Die Frage nach einer Möglichkeit der Vorhersage der Expression in Prokaryonten ausgehend von eukaryontischen Promotorsequenzen durch den Nachweis von weiteren Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren scheint auch nicht vielversprechender. Die Transkriptionsfaktoren der Eukaryonten zeichnen sich durch eine große Vielfältigkeit aus und sind dann auch über große Distanzen des Promotors verteilt (Vanet et al., 1999). Eine Untersuchung in A. thaliana hatte gezeigt, dass fast 6 % des Genoms für mehr als 1500 Transkriptionsfaktoren kodieren (Riechmann et al., 2000). Nur 8 bis 23 % der Arabidopsis Proteine, welche Funktionen innerhalb der Transkription einnehmen, zeigten verwandte Gene in anderen eukaryontischenGenomen. Ursache hierfür ist die unabhängige Evolution von vielen pflanzlichen Transkriptionsfaktoren (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Bei dieser Spezifität pflanzlicher Transkriptionsfaktoren ist die geringe Expression der bakteriellen bzw. Plastiden Promotoren in N. tabacum verständlich. Eine weiteres Problem ist, dass für viele Transkriptionsfaktoren die Erkennungssequenzen noch nicht charakterisiert wurden. Der Nachweis einer perfekten Bindungsstelle auf der DNA-Sequenz des Promotors

muß andererseits nicht immer der Beweis dafür sein, dass unter bestimmten Bedingungen der korrespondierende Faktor bei der Transkription des Gens vorhanden ist (Pedersen et al., 1999). Trotz alledem wäre die Verbindung einer Computer-gestützten Suche nach den Core-Promotor-Elementen wie TATA-Box und/oder Inr-Element in eukaryontischen Promotoren in Verbindung mit Erkennungssequenzen für weitere Transkriptionsfaktoren, welche in bestimmten Wachstumsphasen in den jeweiligen Geweben zu einer Genexpression führen könnten, sehr viel aussagekräftiger. Jedoch kann diese Methode zur Vorhersage der Erkennung von Promotorsequenzen nach Übertragung in Organismen anderer `kingdoms´ nicht angewandt werden.

4.2.2 Transkriptionsstartbestimmungen

Durch die Bestimmung der Transkriptionsstarts ausgewählter Promotor-luxAB- und/oder Promotor-cat-Fusionen sollte geklärt werden, ob die durch die Computer-gestützte Suche gefundenen potentiellen Konsensus Sequenzen in den pflanzenspezifischen Promotoren für die Transkriptionsinitiation durch die bakterielle RNAP verantwortlich waren. Für die vier untersuchten pflanzenspezifischen Promotoren P ST-LS1, P 35S, P Nos und P KST1 traf keine der durch Computeranalyse gefundenen Konsensus Sequenzen als mögliche Erkennungssequenz für die bakterielle RNAP zu.

Für die Promotoren P ST-LS1 und P Nos wurde mit der Methode der 5´-RACE nur ein Transkriptionsstart innerhalb der DNA-Sequenz der pflanzenspezifischen Promotoren ermittelt. Für den P 35S wurden zwei mRNA-Starts ermittelt. Die Transkripte des P KST1 starteten in der MCS, wobei die für die Bindung der bakteriellen RNAP vorhandenen Konsensus Sequenzen innerhalb der Promotor-Sequenz lagen. Den ermittelten Transkriptionsstarts konnten ohne Computer-gestützte Analyse mögliche –35- und –10-Regionen zugeteilt werden. Hierbei wurde vor allem auf den Abstand des Transkriptionsstarts von der –10-Region mit fünf bis neun nt geachtet und auf den Abstand der beiden Konsensus Hexamere zueinander, welcher optimal bei 16 bis 18 nt liegt (Harley und Reynolds, 1987). Die nach dieser Methode ermittelten potentiellen –35- und -10-Regionen wichen meistens in einer der beiden Hexamere von der geforderten Nukleotidzusammensetzung der Computer-gestützten Suche ab, so dass es nicht zu einem Treffer kam. So befindet sich z. B. bei dem P KST1 vier bis acht nt stromaufwärts des Transkriptionsstarts eine konservierte –10-Region mit der Sequenz TATAAT. Die Erkennung durch die Computer-gestützte Suche fand nicht statt, da die 17 nt stromaufwärts liegende potentielle –35-Region die Sequenz TCAACA hatte. Würde man die Parameter der Konservierung der Nukleotide für die –35- und –10-Regionen bzw. der `extended –10-

Region´ bei der Computer-gestützten Suche nach den Konsensus Sequenzen weniger stringent gestalten, würde man sehr viel mehr Treffer erzielen. Diese Vielzahl von Treffern erhöht natürlich die Chance, die für die Bindung der RNAP verantwortlichen Sequenzen zu finden, jedoch erhöht sich die Zahl der nicht verantwortlichen Bindungsstellen um ein Vielfaches.

Für die beiden Subklone des P ST-LS1, den P ST-LS1.1 und P ST-LS1.2, führten die Computer-gestützten Suchen zu den potentiellen Bindungsstellen für die jeweiligen RNAPs. Die Zuordnung dieser Sequenzen nach Transkriptionsstartanalyse ergab für den P ST-LS1.1 sechs Nukleotide stromaufwärts die Sequenz TACCAT als potentielle –10-Region und drei mögliche –35-Regionen im Abstand von 17 bis 19 nt von der –10-Region. Für den P ST-LS1.2 wurde sieben nt stromaufwärts des Transkriptionsstarts durch die Computer-gestützte Analyse eine –10-Region gefunden, deren Sequenz eine 100 %ige Übereinstimmung zu der Konsensus Sequenz TATAAT zeigte. In Abhängigkeit von der –10-Region befanden sich 19 bzw. 20 nt stromaufwärts zwei mögliche –35-Regionen. Dies zeigt ebenfalls nochmals, dass für die Expressionsstärke von Promotoren nicht nur die Übereinstimmung zur Konsensus Sequenz wichtig ist, sondern auch der Abstand der beiden Konsensus Hexamere zueinander. Der Subklon P ST-LS1.2 besitzt zwar die konservierteste –10-Region, jedoch ist der Abstand mit 19 bis 20 nt zu der –35-Region nicht optimal. Dieser Subklon exprimierte die luxAB-Gene im Vergleich zu den Subklonen P ST-LS1.1 und P ST-LS1.3 am geringsten. Der Subklon P ST-LS1.1 zeigte zwar für die –35- und –10-Region nur Übereinstimmungen von drei bzw. vier gegenüber den sechs Nukleotiden der Konsensus Sequenz, der Abstand war jedoch für zwei der potentiellen –35-Regionen mit 17 und 18 nt optimal. P ST-LS1.1 exprimierte die luxAB-Gene vierfach höher als P ST-LS1.2.

Übereinstimmende Transkriptionsstarts wurden für den WT-Promotor P ST-LS1 und den Subklon P ST-LS1.3 trotz der unterschiedlichen Expressionshöhen festgestellt. Somit waren für die erhöhte Expressionsstärke des Subklons nicht zusätzliche Transkriptionsstarts verantwortlich, sondern eine spezifischere Bindung der RNAP an die –35- und –10-Region (siehe Kap. 4.3).

Die Transkriptionsstarts der Promotor-cat-Fusionen von P ST-LS1 und P Nos waren identisch mit denen der jeweiligen Promotor-luxAB-Fusionen. Im Falle des pKKNos ist dieses Ergebnis bemerkenswert, da die cat-Fusion des Nos-Promotors zu einer sehr starken Expression, erkennbar als Wachstum auf Chloramphenicol-haltigen Agarplatten, führte.

In E. coli lag der Transkriptionsstart für pKKNos und pKKNoslux 17 nt stromaufwärts von dem pflanzlichen Transkriptionsstart. Die pflanzliche TATA-Box wurde vermutlich auch in E. coli zur Transkriptionsinitiation für die RNAP als potentielle –10-Region genutzt.

Die Transkriptionsstartanalyse und die Relation der Lumineszenzwerte des pKKNoslux und pNoslux in E. coli deuten darauf hin, dass der Basenaustausch 148 nt stromaufwärts der TATA-Box in dem pBin-Konstrukt (pNoslux) keine Auswirkungen auf die Expression der nachgeschalteten Gene in E. coli hatte. Nach einer Analyse von Shaw et al. (1984) sind für die Expression der Nopalin-Synthase in Kalanchoe daigremontiana mit einer Stärke, die der des Wildtyps entspricht nur 88 bp stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle in Pflanzen nötig. Diese Sequenz beinhaltet TATA- und CAAT-Box, welche für die unverminderte Expression in der Pflanze benötigt werden. Sequenzen die weiter stromaufwärts liegen sind für die komplexere Expression der nos-Gene in Pflanzen gegenüber Bakterien nicht notwendig.

Eine Transkriptionsstartbestimmung des P 35S aus CaMV wurde bereits von Assaad und Signer (1990) in E. coli durchgeführt. Sie analysierten die Starts mittels `RNase Protection Assay´. Assaad und Signer charakterisierten einen schwachen Transkriptionsstart drei bzw. vier Nukleotide stromabwärts des mittels 5´-RACE in dieser Arbeit gefundenen Starts. Zur Transkriptionsinitiation nutzt die bakterielle RNAP hier wie in P Nos die TATA-Box als –10-Region. Ein weiterer, starker Transkriptionsstart wurde von Assaad und Signer an Position –315 bezogen auf den pflanzlichen Transkriptionsstart festgestellt. Dieser Start wurde mit der 5´-RACE nicht gefunden. Stattdessen wurde mit der Methodik der RACE ein weiterer Start 13 nt stromaufwärts der CAAT-Box kartiert.

Die Methode der 5´-RACE wurde vor allem zur Charakterisierung von 5´-Enden von mRNAs in Eukaryonten beschrieben (Frohman et al., 1988). Die Etablierung dieser Methode für Transkriptionsstartbestimmungen in Prokaryonten setzt eine hohe Qualität der RNA vor allem der mRNA voraus. Wohingegen z. B. bei der Methode des `S1-Mappings´ direkt mit der mRNA gearbeitet wird, wird im Falle der RACE die mRNA mittels Reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Starke Sekundärstrukturen der mRNAs können zum Anhalten und Abfallen der Reversen Transkriptase führen. Dies würde dazu führen, dass vor allem lange Transkripte nicht in die cDNA umgeschrieben werden. Ein Erhitzen der RNA vor dem Umschreiben durch die Reverse Transkriptase sollte eigentlich möglichen Sekundärstrukturen entgegenwirken.

Ein Nachteil der Charakterisierung der Transkriptionsstarts mittels 5´-RACE ist eine Ungenauigkeit bei der Kartierung des Transkriptionsstarts bei Vorhandensein einer oder mehrerer Guaninbasen (G) am 5´-Ende des Transkripts. Zur Erkennung durch den Ankerprimer wird an die cDNA ein Cytosin-Schwanz angehängt. Bilden Guaninbasen den Transkriptionsstart ist die Transkriptionsstartbestimmung auf ein Nukleotid genau durch diese Methode nicht möglich.

4.3 Analyse des ST-LS1-Promotors

Der Promotor des ST-LS1-Gens aus S. tuberosum war in der Lage, in den fünf untersuchten Bakterienarten E. coli, Y. enterocolitica, A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. eine Expression der Reportergene zu verursachen. Die Expressionseigenschaften des P ST-LS1 wurden in Pflanzen ebenfalls sehr genau untersucht. Der zur Herstellung von gentechnisch veränderten Pflanzen eingesetzte WT-Promotor P ST-LS1 umfasst mit 1600 bp sehr viel mehr DNA-Sequenz als der Core-Promotor. Stockhaus et al. (1987) untersuchten, welche DNA-Sequenzen des Promotors für eine Transkription nachgeschalteter Gene in Pflanzen nötig waren. Für eine lichtinduzierbare Expression des fusionierten cat-Gens in Tabak wurden 334 nt des 3´-Endes des Promotors benötigt. Die Expressionsstärke ausgehend von dem WT-Promotor mit 1600 bp war jedoch dreifach höher. Eine Fusion von 130 nt des 3´-Endes des P ST-LS1 mit dem cat-Gen, welche sowohl die TATA- als auch die CAAT-Box beinhaltete, reichte für eine Expression in der Pflanze nicht aus.Für die starke Expression des WT-Promotors P ST-LS1 innerhalb der Pflanzen waren positiv regulierende Elemente im Bereich von –530 bis –261 bezogen auf den pflanzlichen Transkriptionsstart verantwortlich (Stockhaus et al., 1989b).

Diese Untersuchungen sind von Bedeutung, da sie darauf hinweisen, dass eine Verkleinerung des WT-Promotors von 1600 bp auf 334 bp bei Beibehaltung der induzierbaren jedoch nicht vollständigen Expression in Pflanzen, die Möglichkeit der heterologen Expression bei einem Gentransfer in Prokaryonten minimieren könnte. Dies wäre nicht nur für die Risikobewertung gentechnisch veränderter Pflanzen vorteilhaft, sondern würde auch die durch Transformation inserierte DNA in transgenen Pflanzen von überflüssigen Sequenzen befreien.

Drei Teilfragmente des P ST-LS1 mit Größen von 446 bp (P ST-LS1.2), 511 bp (P ST-LS1.3) und 607 bp (P ST-LS1.1) wurden mit den luxAB-Genen fusioniert und in pKK232-8 auf Expression in E. coli untersucht. Hierbei führte jeder dieser Subklone zu einer höheren Expression als der WT-Promotor mit 1600 bp. Das Promotorfragment (pKKST-LS1.3lux) mit den 334 bp, welche für eine induzierbare Expression in Pflanzen benötigt würden, führte zu einer Expression der luxAB-Gene in E. coli, die 2,5-fach höher war als die des WT-Promotors. Im Gegensatz zu dem Ergebnis der beiden Promotoren des FBPase-Gens (P FBP1,1 und P FBP1,7) führte hier die Verkleinerung des P ST-LS1 am 5´-Ende um ca. 1100 bp zu einer Erhöhung der Expression. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre, dass die Verkürzung der Promotor-DNA zu einer spezifischeren Bindung der RNAP an die Konsensus Sequenzen führte. Die Expressionsstärke der beiden weiteren Subklone zeigte, dass die RNAP auf diesen Sequenzen ausreichend Bindungsstellen findet, um die

Transkription zu initiieren. Durch die Verkürzung des Promotors kam es zur Konzentrierung der RNAP an der Konsensus Sequenz.

Somit kann resümierend festgestellt werden, dass im Falle des P ST-LS1 die Verkürzung der Promotor-DNA am 5´-Ende nicht zu einer geringeren heterologen Genexpression in E. coli führte. Damit entfiel diese Möglichkeit der Herstellung eines `sicheren Vektors´.

Die Transkriptionsstartbestimmung des P ST-LS1 ergab für E. coli, Y. enterocolitica, A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. den identischen Start zwölf bzw. 13 nt stromabwärts der pflanzlichen TATA-Box. Direkt stromabwärts der TATA-Box und fünf bzw. sechs nt stromaufwärts des bakteriellen Transkriptionsstarts, lag mit der Sequenz CATACT eine potentielle –10-Region zur Erkennung durch die bakterielle RNAP. Durch ortsspezifische Basenaustausche innerhalb dieser Region wurden sogenannte `up´- und `down-Mutanten´ hergestellt. Bei den `up-Mutanten´ wurde die Sequenz entsprechend einer optimierten –10-Region mit TATAAT und für die `extended –10-Region´ mit TGTTATAAT verändert. Bei zwei der `down-Mutanten´ wurden die an Position zwei und sechs liegenden, stark konservierten Basen Adenin und Thymin (CATACT) nach Guanin (CGTACG) bzw. Cytosin (CCTACC) verändert. Eine weitere `down-Mutante´ wies mit der Sequenz CACGCT eine Veränderung der Basen Thymin und Adenin an den Positionen drei und vier gegenüber der Ausgangssequenz (CATACT) auf.

Die `up-Mutanten´ führten in E. coli, P. putida und Acinetobacter sp. zu einer eindeutigen Erhöhungen der Expression. Für die Mutante mit der optimierten –10-Region wurde eine 3,5-fach höhere Expression gegenüber dem WT-Promotor in den Bakterienstämmen E. coli und Acinetobacter sp. gemessen. In P. putida führte diese Mutante zu einer Verdoppelung der Expression gegenüber der WT-Promotor. Die Expression der Mutante mit der `extended –10-Region´ führte in E. coli zu einer zwölffach höheren, in P. putida zu einer 16-fach höheren und in Acinetobacter sp. zu einer neunfach höheren Expression der zu transkribierenden Reportergene gegenüber dem WT-Promotor. Für E. coli, P. putida und Acinetobacter sp. konnte somit die Aussage bestätigt werden, dass im Allgemeinen die Stärke eines Promotors darüber definiert wird, wie ähnlich die –35- und -10-Regionen den Konsensus Sequenzen bei einem optimalen Abstand von 17 ± 1 nt der beiden Regionen zueinander sind (Busby und Ebright, 1994). Außerdem führte das TG-Motiv der `extended –10-Region´ bei Vorhandensein der –35-Region zur Erhöhung der Genexpression (Chan und Busby, 1990).

Für die `down-Mutanten´ des P ST-LS1 konnte in E. coli ein Fünftel der Expression gegenüber dem WT-Promotor gemessen werden. In Acinetobacter sp. führten die `down-Mutanten´ zu einer halb so starken Expression gegenüber dem WT-Promotor. In P. putida führten sie allerdings zu keiner Erniedrigung der Expression. Die `up-Mutanten´ in

Y. enterocolitica zeigten ein verzögertes Wachstum, so dass die Beurteilung der sehr schwachen Steigerung der Expression dieser Mutanten nur unter Vorbehalt geschehen kann. Die `down-Mutanten´ des P ST-LS1 führten in Y. enterocolitica nur zu einer unwesentlichen Verringerung der Expression. In A. tumefaciens führten sogar alle Mutanten des P ST-LS1 zu einer Erniedrigung der Genexpression gegenüber dem WT-Promotor. Bei der Darstellung der 5´-RACE-Produkte des P ST-LS1 im Agarosegel (Kap. 3.1.4.1, Abb. 28) fiel die Bande des Haupttranskripts in A. tumefaciens sehr schwach aus. A. tumefaciens zeigte neben dem Haupttranskript noch weitere schwache Banden, an denen möglicherweise nach Veränderung der –10-Region die Transkription verstärkt startete. Auch für Y. enterocolitica, Acinetobacter sp. und P. putida zeigten die RACE-Produkte im Gel ein ca. 100 bp größeres Transkript, jedoch mit einer viel schwächeren Intensität gegenüber dem Haupttranskript. Die direkte Sequenzierung der RACE-Produkte des P ST-LS1 ergab für alle untersuchten Bakterienarten den identischen Transkriptionsstart. Auch die Klonierung der RACE-Produkte aus den unterschiedlichen Bakterienarten ergab keine weiteren im Pflanzenpromotor befindlichen Starts. Trotzdem führten die Mutationen des P ST-LS1 zu unterschiedlichen Expressionsverhalten in den untersuchten Bakterienarten. Wie in Kap. 4.1 schon diskutiert, wurden die Konsensus Sequenzen für die –35- und –10-Region vor allem in E. coli untersucht. Diese –35- und –10-Konsensus Sequenzen und deren Abstände zueinander, sowie der Abstand der –10-Region zum Transkriptionsstart, können nicht auf alle weiteren Gram-negativen Bakterien übertragen werden. Wösten et al. (1998b), die sich mit der Untersuchung der –35- und –10-Konsensus Sequenzen in C. jejuni befassten, stellten ebenfalls resümierend fest, dass die Promotorsequenzen von Bakterien durch experimentelle Methoden wie z. B. Charakterisierungen der Transkriptionsstarts bestimmt werden müssen, da sie andere Sequenzmotive als die bekannten aus E. coli und B. subtilis beinhalten können.

Die Untersuchungen der luxAB-Transkripte ausgehend von den mutagenisierten Promotoren des P ST-LS1 erfolgten nur in E. coli. Die Veränderungen der Transkriptmengen je nach Mutante des P ST-LS1 gegenüber dem WT-Promotor,konnten mittels Northern Hybridisierung nochmals bestätigt werden. Die Charakterisierungen der Transkriptionsstarts der beiden `up-Mutanten´ergaben den für den WT-Promotor beschriebenen Transkriptionsstart zwölf bzw. 13 nt stromabwärts der eukaryontischen TATA-Box.

Das Expressionsverhalten der drei `down-Mutanten´ des P ST-LS1 wurde in N. tabacum überprüft. Zwei der `down-Mutanten´, in denen das Adenin und Thymin der Ausgangssequenz (CATACT) durch Guanin (CGTACG) bzw. Cytosin (CCTACC) ersetzt wurde, zeigten bei der Untersuchung der transienten Expression keine Veränderung der Expression gegenüber dem WT-Promotor. Die dritte `down-Mutante´ des P ST-LS1, bei

welcher die Veränderung der Basen Thymin und Adenin der Ausgangssequenz (CATACT) an den Positionen drei und vier zu der Sequenz CACGCT führte, zeigte in dem transienten Versuch eine verminderte Expression gegenüber der Expression des WT-Promotors in N. tabacum. Die Herstellung stabiler, transgener Tabakpflanzen durch Agrobacterium-vermittelten Transfer, zeigte für alle drei `down-Mutanten´ eine unverminderte Expression im Vergleich zum WT-Promotor.

Die unterschiedlichen Substitutionen zweier Basen stromabwärts der pflanzlichen TATA-Box, welche die Expressionen in zwei der fünf Bakterienarten verminderten, hatten daher keine Auswirkungen auf das Expressionsverhalten der Promotoren in der Pflanze. Somit konnte für die Sequenzen der `down-Mutanten´ des P ST-LS1 gezeigt werden, dass die Herstellung eines `optimierten Vektors´ möglich ist. Jedoch kann man nicht davon ausgehen, dass ein vermindertes Expressionsverhalten dieser Mutanten in E. coli ebenfalls in weiteren Bakterienarten zu einer Erniedrigung der Expression führt. So sollte man in Hinblick auf die Risikobewertung für die Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen Promotoren einsetzen, welche von vornherein eine niedrige Expression in mehreren Bakterienarten aufweisen. Hierfür würde sich z. B. der RolC-Promotor eignen, welcher in keiner der untersuchten Bakterienarten zu einer Expression führte. Dieser Promotor eignet sich für die Herstellung transgener Pflanzen auch deswegen besonders gut, da er zu einer Expression der eingeführten Gene in bestimmten Gewebetypen, in Phloemzellen und vaskulärem Parenchym, führte (Yokoyama et al., 1994, Graham et al., 1997). So könnte der P RolC z. B. gezielt eingesetzt werden, um `Potato Leafroll Luteovirus´-resistente (PLRV) Kartoffellinien herzustellen, da sich dieses Virus nur in Phloemgewebe vermehrt (Graham et al., 1997).

4.4 Schlußfolgerungen

Die Untersuchung der Expressionseigenschaften von Promotoren über `kingdom´-Grenzen hinaus zeigte eindeutig, dass eukaryontische Promotoren in Eubakterien mit einer viel größeren Wahrscheinlichkeit zu einer Expression nachgeschalteter Gene führten als bakterielle oder Plastiden Promotoren in Eukaryonten. In weiteren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass DNA-Sequenzen aus S. cerevisiae in fast 80 % der untersuchten Sequenzen zu einer Expression in E. coli führten (Tran, 2001). Hierbei wurden nicht gezielt Promotorsequenzen aus S. cerevisiae auf Expression in E. coli untersucht, sondern durch `shot-gun´-Klonierungen erhaltene willkürliche DNA-Sequenzen mit den promotorlosen luxAB-Genen fusioniert und deren Expression bestimmt. Auch drei von vier untersuchten viralen Promotoren (Polyhedrin-Promotor des Baculo Virus, Thymidin-Kinase-Promotor des Herpes Simplex Virus, early Promotor des Cytomegalie Virus, early

Promotor des Simian Virus 40), welche in gängigen Vektoren für die Expression inserierter Gene in Zellkulturen genutzt werden, führten zu Expressionen nachgeschalteter Gene in E. coli (Chusainow, 2000). Bei den pflanzenspezifischen Promotoren, welche in 50 % der getesteten Kombinationen aus Promotor und Bakterienstamm zu einer Expression nachgeschalteter Gene führten, wurde in zwei Fällen die pflanzliche TATA-Box als –10-Region zur Transkriptionsinitiation durch die bakterielle RNAP genutzt. Diese Ergebnisse spiegeln einerseits die unterschiedliche Komplexität der Transkriptionsmaschinerien aus Prokaryonten und Eukaryonten wieder und bestätigen anderseits die Hypothese der Konservierung der Transkriptionsmaschinerie während der Evolution (Sentenac et al., 1992; Fassler und Gussin, 1996; Soppa, 1999; Ebright, 2000; Minakhin et al., 2001).

Die Ergebnisse verdeutlichen, dass bei der Herstellung von GVOs heterologe Genexpression vor allem in Prokaryonten stattfinden kann, wenn dadurch Sequenzen eingeführt werden, die durch die bakterielle RNAP zur Transkriptionsinitiation genutzt werden können. Vor allem bei der Herstellung von Expressionsvektoren sollte darauf geachtet werden, dass eine Expression der übertragenen Gene nur spezifisch in dem Zielorganismus erfolgt.

Eine Fragestellung, welche stark in der Literatur diskutiert wird, ist die Möglichkeit der Übertragung von DNA gentechnisch veränderter Pflanzen auf Bakterien. Damit die DNA von transgenen Pflanzen auf Bakterien übertragen und exprimiert werden kann, müssen mehrere aufeinanderfolgende biologische Ereignisse eintreten:die DNA muss durch Degradierung der Pflanzenzellen freigesetzt werden, es müssen transformierbare Bakterien vorhanden sein,die transgene DNA muss in die Erbsubstanz des Bakteriums integrieren und die DNA muss exprimiert werden. Durch diese Vielzahl von aufeinander folgenden Ereignissen wird der Fall eines horizontalen Gentransfers unter natürlichen Bedingungen als gering eingeschätzt (Nap et al., 1992; Schlüter et al., 1995; Nielsen et al., 1998; de Vries et al., 2001; Mercer et al., 2001).

Im Erdboden gibt es nur wenige bekannte natürlich transformierbare Bakterien (Lorenz und Wackernagel, 1994; Paget und Simonet, 1994) und diese Bakterien finden selten Konditionen bei denen sie eine natürliche Kompetenz entwickeln können (Bertolla und Simonet, 1999b), welche für die Möglichkeit eines Gentransfers Voraussetzung ist. Untersuchungen zur Degradierung von DNA im Erdboden haben gezeigt, dass diese durch Bindung z. B. an Ton für Wochen persistieren kann und trotzdem von kompetenten Bakterien aufgenommen werden kann (Paget et al.,1992; Gallori et al., 1994). Nicht gebundene hochmolekulare DNA wird jedoch schnell durch die im Boden befindlichen DNasen

degradiert (Blum et al., 1997). Das Persistieren von transgener Pflanzen-DNA im Boden über einen längeren Zeitraum wurde ebenfalls schon beschrieben (Widmer et al., 1997; Paget et al., 1998; Gebhard und Smalla, 1999). Dass kompetente Bakterien unter Laborbedingungen und bei Anwesenheit homologer bakterieller DNA-Sequenzen im Pflanzengenom in der Lage sind DNA von transgenen Pflanzen aufzunehmen (Gebhard und Smalla, 1998; de Vries et al., 1998; 2001; Nielsen et al., 2000; Kay et al., 2002), wurde einleitend beschrieben. In einem vor kurzem veröffentlichten Experiment konnten Kay et al. (2002) die Übertragung des aadA-Gens,einem Gen welches Resistenz für Spektinomycin und Streptomycin vermittelt, aus transgenen Tabakpflanzen auf Acinetobacter sp. BD413 nachweisen. Hierfür wurde der Stamm Acinetobacter sp. BD413 zusätzlich mit DNA-Sequenzen des Chloroplasten Genoms versehen, da der Tabak über die gentechnisch Veränderung des Chloroplasten Genom hergestellt wurde. Der transgene Tabak wurde mit Ralstonia solanacearum und Acinetobacter sp. BD413 koinfiziert. R. solanacearum ist ein pflanzenpathogenes Bakterium, welches sich in der Wirtpflanze vermehrt und über das vasikuläre Gewebe die Pflanze kolonisiert. Dabei entstehen Konditionen, die einen Gentransfer von Pflanzen-DNA begünstigen (Bertolla et al., 1999a). Der Gentransfer von Pflanzen-DNA auf R. solanacearum wurde nicht detektiert. Der Acinetobacter sp. Stamm war jedoch in der Lage, den mit R. solanacearum infizierten transgenen Tabak zu kolonisieren, seine natürliche Kompetenz (Nielsen et al., 1997) zu entwickeln, das aadA-Gen aufzunehmen und einen Spektinomycin-resistenten Phänotyp auszuprägen. Ein detektierbarer Gentransfer war abhängig von dem Vorhandensein homologer Sequenzen des Plastoms aus N. tabacum in Acinetobacter sp. BD413.

Eine Möglichkeit zur Verhinderung der Expression eukaryontischer Gene in Bakterien ist das Einführen eines Introns in die kodierende Region des zu exprimierenden Gens (Ohta et al., 1990; Vancanneyt et al., 1990). Vancanneyt et al.(1990) klonierten das Intron 2 des ST-LS1-Gens aus S. tuberosum in die kodierende Region des gus-Gens, welche für die β-Glucuronidase kodiert. Da Prokaryonten nicht in der Lage sind, die pre-mRNA zu spleißen, werden keine vollständigen Transkripte, die zu einem funktionsfähigen Proteinen translatiert werden könnten, gebildet. Bei gentechnisch veränderten Pflanzen werden häufig Introns verwendet, um die Genexpression zu verstärken (Koziel et al., 1996; Simpson und Filipowics, 1996).

Bei den Methoden zur Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen kommt es immer zur Insertion von bakteriellen Sequenzen in das Pflanzengenom. Diese stellen die Voraussetzung der Übertragung der transgenen Pflanzen-DNA auf Bakterien dar. Gerade auch bei der Insertion der Transgens in das Chloroplasten Genom (Daniell et al., 2001; Maliga, 2002) kommt es zur Vervielfachung des Markergens, welches häufig ein Antibiotikumresistenzgen

ist. Die Ausbreitung von Antibiotikumresistenzen durch deren Anwendung in der Landwirtschaft (Witte, 1998) oder deren Vorhandensein in Lebensmitteln (Perreten et al., 1997) stellt sowieso schon ein Problem dar.Deswegen müssen neue Methoden zur Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen angewandt werden, die das Risiko der Übertragung von Antibiotikumresistenzgenen aus gentechnisch veränderten Pflanzen auf Bakterien und damit auch die Diskussion darüber vermindern und die Akzeptanz dieser GVOs erhöhen. Daniell et al.(2001) stellten durch Transformation der Chloroplasten gentechnisch veränderte Pflanzen her, welche statt eines Antibiotikumresistenzgen das Gen der Betain Aldehyd-Dehydrogenase aus Spinat zur Selektion beinhalteten.

In der Zukunft werden gentechnisch veränderte Organismen vor allem auch für die Produktion von Therapeutika und Impfstoffe eingesetzt werden. Das Ziel der genetischen Veränderung ist die Produktion eines spezifischen Proteins. Hierfür sollten Expressionsvektoren eingesetzt werden, deren Kontrollelemente für die Genexpression gut charakterisiert sind. Bei einem erhöhten Gefährdungspotential für die Umwelt durch einen möglichen Gentransfer, sollte durch experimentelle Untersuchungen eine Expression dieser Gene unter Übertragung der benutzten Kontrollelemente möglichst ausgeschlossen werden. Eine Risikobewertung allein basierend auf Computer-gestützter Analyse der DNA-Sequenz gibt nach den Untersuchungen in dieser Arbeit keinen Aufschluß darüber, ob und/oder in welchem Ausmaß eine Genexpression in heterologen Organismen stattfinden kann.


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