6 Anhang

6.1 Plasmidkarten

6.1.1 Restriktionskarte des Vektors pBin19

Abb. 43 : Restriktionskarte des Vektors pBin19 (Bevan, 1984). Der binäre Vektor für E. coli und A. tumefaciens mit dem Replikationsursprung (ori) aus RK2 wird zur Transformation von Pflanzen eingesetzt. Der T-DNA Bereich (verstärkt schwarz) wird von der linken und rechten Grenze (LB, RB) flankiert. Die T-Region enthält den lac Z´-Bereich mit der MCS aus M13mp19. Rekombinante Klone können durch Blau/Weiß-Screening identifiziert werden. Zur Selektion transformierter Pflanzen enthält die T-Region ein dominant vererbbares Neomycin-Phosphotransferase Gen II (npt II). Die Expression des npt II-Gens wird durch den Promotor des Nopalin-Synthase Gens (P nos ) gesteuert. Die Transkriptionstermination für das npt II-Gen stammt ebenfalls aus dem Nopalin-Synthase Gen (nos A). Außerhalb der T-Region enthält das Plasmid ein Kanamycinresistenz Gen (kmR ) für die Selektion in Bakterien.

6.1.2 Darstellung des T-DNA Bereichs von pBinlux-SalI

Abb. 44 : Schematische Darstellung des rekombinanten T-DNA Bereichs des Plasmides pBinlux-SalI. Insertion der promotorlosen lux AB-Gene als Sal I-Fragment aus Mini-Tn5lux AB (de Lorenzo et al. , 1990; Herrero et al. , 1990; siehe Kap. 6.1.9, Abb. 51) in die MCS des Vektors pBin19 (Bevan, 1984; siehe Kap. 6.1.1, Abb. 43). Die Größe des Plasmids pBinlux-SalI beträgt ca. 15 kbp.

6.1.3 Darstellung des T-DNA Bereichs von pBinlux-BamHI

Abb. 45 : Schematische Darstellung des rekombinanten T-DNA Bereichs des Plasmides pBinlux-BamHI. Insertion der promotorlosen lux AB-Gene als Bam HI-Fragment aus pBinlux-SalI (siehe Kap. 6.1.2, Abb. 44) in die MCS des Vektors pBin19 (Bevan, 1984; siehe Kap. 6.1.1, Abb. 43). Die Größe des Plasmids pBinlux-BamHI beträgt ca. 15 kbp.

6.1.4 Darstellung des T-DNA Bereichs des Vektors pBi101.2

Abb. 46 : Schematische Darstellung des T-DNA Bereichs des Plasmides pBi101.2 (Jefferson et al. , 1987). In die MCS des Vektors pBin19 (Bevan, 1984; siehe Kap. 6.1.1, Abb. 43) wurde ein promotorloses gus- Gen (1,87 kbp) inseriert mit der Transkriptionstermination aus dem Nopalin-Synthase Gen (nos A). Die Größe des pBi101.2 beträgt ca. 12,2 kbp.

6.1.5 Restriktionskarte des Vektors pKK232-8

Abb. 47 : Restriktionskarte des Vektors pKK232-8 (Brosius, 1984). Der für Promotorstudien konzipierte Vektor besitzt ein promotorloses Chloramphenicol-Acetyltransferase Gen (cat ), sowie einen Transkriptionsstop (T1 ) aus dem rrn B-Operons aus E. coli stromaufwärts der MCS und zwei Transkriptionsstops (T2 , T3 ) des rrn B stromabwärts des cat -Gens. Der Replikationsursprung (ori) stammt aus dem Plasmid pBR322. Zur Selektion enthält das Plasmid ein Ampicillinresistenz Gen (ampR ).

6.1.6 Darstellung des rekombinanten Bereichs des Plasmides pKKlux

Abb. 48 : Schematische Darstellung de rekombinanten Bereichs des Plasmides pKKlux. Insertion der promotorlosen lux AB-Gene als Sal I/Hin dIII-Fragment aus dem Mini-Tn5lux AB (de Lorenzo et al. , 1990; Herrero et al. , 1990; siehe Kap. 6.1.9, Abb. 51) in die MCS des Vektors pKK232-8 (Brosius, 1984; siehe Kap. 6.1.5, Abb. 47). Die Größe des Plasmids pKKlux beträgt ca. 8,3 kbp.

6.1.7 Darstellung des rekombinanten Bereichs des Plasmides pKKlux-BamHI

Abb. 49 : Schematische Darstellung des rekombinanten Bereichs des Plasmides pKKlux-BamHI. Insertion der promotorlosen lux AB-Gene als Bam HI-Fragment aus dem pBinlux-SalI (siehe Kap. 6.1.2, Abb. 44) in die MCS des Vektors pKK232-8 (Brosius, 1984; siehe Kap. 6.1.5, Abb. 47). Die Größe des pKKlux beträgt ca. 8,3 kbp.

6.1.8 Restriktionskarte des Vektors pLitmus28

Abb. 50 : Restriktionskarte des Vektors pLitmus28 (Evans et al. , 1995). pLitmus28 enthält den M13-Replikationsursprung (M13 ori) und den ColE1-Replikationsursprung (pUC ori). Zur Selektion enthält das Plasmid ein Ampicillinresistenz Gen (ampR ). Die MCS unterbricht den lac Z´-Bereich, somit kann eine Blau/Weiß-Selektion stattfinden.

6.1.9 Restriktionskarte des Plasmides Mini-Tn5lux AB

Abb. 51 : Restriktionskarte des Plasmides Mini-Tn5lux AB (de Lorenzo et al. , 1990; Herrero et al. , 1990). Mini-Tn5lux AB wurde zum Auffinden von Promotorsequenzen in Gram-negativen Bakterien konstruiert. Für die Transposition enthält das Transposon repetitive Sequenzen des Tn5 (0, I) von 19 bp und ein Transposase Gen (tnp* ). Zwischen diesen Sequenzen befinden sich die promotorlosen Luziferase-Gene (lux AB) aus V. harveyi. Als Selektionsmarker liegt in dem Transposonbereich ein Tetrazyklinresistenz Gen (tcR ). Das Transposon ist als Eco RI/Xba I-Fragment auf dem Vektor pUT lokalisiert. pUT besitzt den Replikationsursprung (ori) aus R6K und als Selektionsmarker ein Ampicillinresistenz Gen (ampR ).

6.2 Pflanzenspezifische Promotorsequenzen

Innerhalb der nachfolgenden Sequenzen der pflanzenspezifischen Promotoren sind CAAT- und TATA-Box kursiv im Fettdruck und der Transkriptionsstart innerhalb der Pflanzen nur im Fettdruck dargestellt.

Potentielle prokaryontische Promotor Konsensus Sequenzen sind wie folgt dargestellt:

6.2.1 35S-Promotor aus CaMV (531 bp)

Die DNA-Sequenz entspricht dem P 35S-Promotor aus dem Vektor pBAR-35S mit der Acc. # AJ251014. Die Sequenzierung ergab keinerlei Basenaustausche.

6.2.2 B33-Patatin-Promotor (1526 bp)

Die DNA-Sequenz entspricht der 5´UTR des B33-Patatin-Gens aus S. tuberosum mit der Acc. # X14483. Durch Sequenzierung wurde nur der Bereich von 1318-1713 überprüft.

6.2.3 ST-LS1-Promotor (1585 bp)

Die DNA-Sequenz entspricht der 5´UTR des ST-LS1-Gens aus S. tuberosum mit der Acc. # X04753. Durch Sequenzierung wurde nur der Bereich von 1235-1585 überprüft, dabei wurden Sequenzunterschiede an Position 1286/1287 von GG zu AA festgestellt, sowie das Fehlen eines A an Position 1583.

HaeIII-Restriktionsschnittstelle

6.2.4 RolC-Promotor (1120 bp)

Keine Acc. # vorhanden.

6.2.5 Promotor P 130 (1341 bp)

Keine Acc. # vorhanden.

6.2.6 Promotor P 247 (1123 bp)

Keine Acc. # vorhanden.

6.2.7 FBP1,1-Promotor (1108 bp)

Keine Acc. # vorhanden.

6.2.8 FBP1,7-Promotor (1730 bp)

Keine Acc. # vorhanden.

6.2.9 Nos-Promotor (306 bp)

Die Sequenz des P Nos stammt aus der Vektor-DNA von pBin19 (Acc. # U09365). Die angegebenen Lokalisationen beziehen sich auf diese Acc. # .

In dem P Nos des pNoslux-Konstrukts befindet sich ein Basenaustauch von C nach T an Position 9170 gegenüber pBin19 (siehe Alignment, Kap. 6.5.1).

6.2.10 SKT2-Promotor (3036 bp)

Keine Acc. # vorhanden.

6.2.11 KST1-Promotor (1580 bp)

Die DNA-Sequenz entspricht der 5´UTR des kst1-Gens aus S. tuberosum mit der Acc.# AJ242852. Basenaustausche gegenüber dieser Sequenz traten übereinstimmend bei der Template-DNA, den pBin- und pKK-Konstrukten (pKST1lux, pKKKST1lux) auf:

Position 291 C zu T; Position 593 G zu A; Position 595 A zu T; Position 632, 633 CT zu AA; Position 700 C zu G; Position 703 A zu C; Position 770 T zu A; Position 774,775 AA zu TT; Position 982 G zu C; Position 991 G zu T; Position 1133 C zu A. Fehlen von Basen: C an Position 307; C an Position 585; TG an Position 598/599; G an Position 607; T an Position 634; G an Position 789; G an Position 1329. Hinzufügen von Basen: T zwischen den Positionen 494/495, A zwischen den Positionen 701/702; C zwischen den Positionen 938/939; T zwischen den Positionen 977/978; C zwischen den Positionen 1061/1062; C zwischen den Positionen 1156/1157; A zwischen den Positionen 1162/1163; A zwischen den Positionen 1164/1165 (siehe Alignment, Kap. 6.5.3).

6.2.12 KCO1-Promotor (980 bp)

Die DNA-Sequenz stammt von der 5´UTR des kco1-Gens aus A. thaliana mit der Acc.# Y07825. Das pBin-Konstrukt (pKCO1lux) weißt an Position 416 ein Basenaustausch von T nach G auf und an Position 491 das Fehlen der Base T. Im A-Stretch von Position 617-628 wurde ein A weniger und von 685-699 wurden ein bzw. zwei A weniger sowohl in der Template-DNA als auch in den pBin- und pKK-Konstrukten (pKCO1lux, pKKKCO1lux) sequenziert (siehe Alignment, Kap. 6.5.2).

6.3 Promotorsequenzen aus dem Chloroplasten von N. tabacum

Die Sequenzen stammen aus dem Chloroplasten von N. tabacum (Acc. # Z00044). Die angegebenen Lokalisationen beziehen sich auf diese Acc. #. Kursiv im Fettdruck dargestellt sind die Sequenzen, welche von der PEP oder/und NEP erkannt werden. Die entsprechende Transkriptionsinitiationsstelle ist im Fettdruck dargestellt.

Potentielle TATA-Konsensus Sequenzen sind wie folgt dargestellt:

TATA-Box

6.3.1 Promotorregion des psb A-Gens

In dem P PsbA traten zwei Basenaustausche gegenüber dieser Sequenz übereinstimmend in der Template-DNA (pKL13) und dem pBi-PsbA auf:

Position 1675 A zu C und Position 1678 G zu T

6.3.2 Promotorregion des rbcL-Gens

In dem P RbcL trat ein Basenaustausch an Position 57508 von A zu G gegenüber dieser Sequenz übereinstimmend in der Template-DNA (pKL12) und dem pBi-RbcL auf.

6.3.3 Promotorregion des accD-Gens

Insertion eines Cytosin zwischen den Positionen 59391 und 59392.

6.3.4 Promotorregion des rpoB-Gens

6.3.5 Promotorregion des atpB-Gens

6.3.6 Promotorregion des clpP-Gens

6.4 Bakterielle Promotorsequenzen

Kursiv im Fettdruck sind die –35- und –10-Region dargestellt. Die entsprechende Transkriptionsinitiationsstelle ist im Fettdruck dargestellt.

Potentielle TATA-Konsensus Sequenzen sind wie folgt dargestellt:

TATA-Box

6.4.1 Promotorregion des bla-Gens

Die Sequenz stammt aus dem Vektor pKK232-8 (Acc. # U13859). Die angegebenen Positionen beziehen sich auf diese Acc. #.

6.4.2 Promotorregion des nptIII-Gens

Die Sequenz stammt aus dem Vektor pBin19 (Acc. # U09365). Die angegebenen Positionen beziehen sich auf diese Acc. #.

6.4.3 Promotorregion des lac-Operons

Die Sequenz stammt aus dem Vektor pBi101.2 (Acc. # U12668). Sie beinhaltet die pBi101.2 Vektor-DNA mit dem lac-Promotor von der XmnI – bis zur HindIII-Restriktionsschnittstelle.

6.5 Alignments

6.5.1 Alignment der Sequenzierungen des Nos-Promotors

Abb. 52 : Alignment der Promotorsequenz des P Nos nach Shaw (P Nos, 1984), des Sau 3A-Fragments aus pBin19 (NosP26-364) als Template-DNA für die PCR und des pKK- bzw. pBin-Konstrukts. Der Basenaustausch von C nach T in pNoslux befindet sich an Position 9170 des pBin19 (Acc. # U09365).

6.5.2 Alignment der Sequenzierungen des KCO1-Promotors

Abb. 53 : Alignment der übermittelten Promotorsequenz des P KCO1, der Template-DNA pPK-Gus-4 für die PCR und des pKK- bzw. pBin-Konstrukts.

6.5.3 Alignment der Sequenzierungen des KST1-Promotors

Abb. 54 : Alignment der übermittelten Promotorsequenz des P KST1, der Template-DNA pDKP3 für die PCR und des pKK- bzw. pBin-Konstrukts.


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16.02.2004