Erkennung von Regulationssequenzen für die Transkription in heterologen Systemen

D I S S E R T A T I O N

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r r e r u m n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Ing. (FH) Daniela Jacob

19. Februar 1965, Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. M. Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Thomas Börner
2. Prof. Dr. Bernd Appel
3. Priv.-Doz. Dr. Thomas Pickardt

Tag der mündlichen Prüfung: 15.07.2003

Zusammenfassung

Mit dieser Arbeit sollte die Spezifität von Promotoren analysiert und ihre Funktionalität über `kingdom´-Grenzen hinaus untersucht werden. Hierfür wurden zwölf pflanzenspezifische Promotoren, welche in der Gentechnik zur Herstellung von transgenen Pflanzen eingesetzt werden, auf Genexpression in fünf Bakterienarten untersucht. Die Bakterienarten, in denen die pflanzenspezifischen Promotoren untersucht wurden, stellten mit Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida und Acinetobacter sp. Vertreter taxonomisch unterschiedlicher Gruppen dar. Auch die untersuchten pflanzenspezifischen Promotoren stammten aus phylogenetisch nicht-verwandten Gruppen wie Pflanzen, Pflanzenviren und Agrobakterien. Weiterhin wurden drei bakterielle und sechs Plastiden Promotoren auf Genexpression in Nicotiana tabacum untersucht. Die drei bakteriellen Promotoren stammten aus E. coli und Streptococcus faecalis, die Plastiden Promotoren aus N. tabacum.

Die pflanzenspezifischen Promotoren wurden zur Quantifizierung der Expression mit den promotorlosen luxAB-Genenaus Vibrio harveyi und dem promotorlosen cat-Gen fusioniert.Die Frequenz mit der die pflanzenspezifischen Promotoren in den untersuchten Bakterienarten zu einer Expression führten, war mit einer Expressionsrate von 50 % der getesteten Kombinationen sehr hoch. Für einen Promotor (P), den P ST-LS1 aus Solanum tuberosum, wurde eine Expression in allen fünf untersuchten Bakterienarten nachgewiesen. Zwei der getesteten pflanzenspezifischen Promotoren,P RolC aus Agrobacterium rhizogenes und P 247 aus N. tabacum zeigten keine Expression der luxAB-Gene in den untersuchten Bakterienarten. Für zwei pflanzenspezifische Promotoren, P ST-LS1 und P Nos aus A. tumefaciens erfolgte für E. coli der Nachweis der phänotypischen Relevanz der heterologen Genexpression, da diese ein Wachstum auf Agarplatten mit einer gängigen Selektionskonzentration von Chloramphenicol ermöglichten. Die Charakterisierung der mRNA-Transkripte ausgewählter Fusionen der pflanzenspezifischen Promotoren mit den Reportergenen zeigten eindeutig, dass für die Transkriptionsinitiation durch die bakterielle RNA-Polymerase Sequenzelemente der pflanzenspezifischen Promotoren genutzt wurden. In zwei Fällen, dem P 35S aus Cauliflower Mosaic Virus und P Nos, wurde die pflanzliche TATA-Box zur Transkriptionsinitiation in E. coli genutzt. Eine genaue Charakterisierung der durch die bakterielle RNA-Polymerase genutzten –10-Region in dem P ST-LS1 in E. coli und Acinetobacter sp. fand durch Mutagenese statt. Hierbei wurden sogenannte `down-Mutanten´ hergestellt, die in E. coli und Acinetobacter sp. eine Reduktion der Expression gegenüber dem

Wildtyp-Promotor P ST-LS1 aufwiesen. Zur Untersuchung der Expression der mutagenisierten Promotoren und des Wildtyp-Promotors P ST-LS1 in N. tabacum wurden diese mit dem promotorlosen gus-Gen fusioniert. Die mutagenisierten Promotoren zeigten nach stabiler Integration in das Pflanzengenom von N. tabacum eine unverminderte Expression in bezug auf den Wildtyp-Promotor.

Die bakteriellen und Plastiden Promotoren wurden zur Untersuchung der Expression in N. tabacum ebenfalls mit dem promotorlosen gus-Gen fusioniert. Die Untersuchung ergab nur in einem einzigen Fall von neun getesteten Promotoren, dem des Plastiden Promotors des accD-Gens eine sehr geringe transiente Expression. Diese Expression müßte durch die Herstellung stabiler transgener Pflanzen überprüft werden.

Eine Vorhersage über das Ausmaß einer möglichen heterologen Expression nachgeschalteter Gene durch eine Computer-gestützte Suche nach potentiellen eukaryontischen bzw. prokaryontischen Konsensus Sequenzen in den verwendeten Promotoren konnte nicht getroffen werden.

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Bedeutung der Übertragung heterologer Regulationssequenzen für die Risikobewertung gentechnisch veränderter Organismen
  • 1.2 Regulationssequenzen der Transkriptionsinitiation
    • 1.2.1 Transkriptionsinitiation in Prokaryonten
    • 1.2.2 Transkriptionsinitiation in Eukaryonten
      • 1.2.2.1 Der Core-Promotor der RNA-Polymerase II in Pflanzen
    • 1.2.3 Transkriptionsinitiation in Plastiden
  • 1.3 In der vorliegenden Arbeit untersuchte Promotoren
  • 1.4 Ziel der Arbeit
• 2 Material und Methoden
  • 2.1 Chemikalien, Enzyme und Kits
    • 2.1.1 Chemikalien
    • 2.1.2 Enzyme und Kits
  • 2.2 Bakterienstämme, Plasmide und Pflanzen
    • 2.2.1 Verwendete Bakterienstämme
    • 2.2.2 Klonierungsvektoren
    • 2.2.3 Vorhandene Promotorkonstrukte
    • 2.2.4 Promotorderivate, Reportergene
    • 2.2.5 Pflanzen
  • 2.3 Nährmedien und Kulturbedingungen
  • 2.4 Stammhaltung
  • 2.5 Primer
    • 2.5.1 Primer zur Herstellung der bakteriellen Promotoren
    • 2.5.2 Primer zur Sondenherstellung für die Northern Hybridisierung
  • 2.6 DNA-Techniken
    • 2.6.1 Plasmid-Isolierungstechniken
    • 2.6.2 DNA-Aufreinigungstechniken
    • 2.6.3 Fluorometrische DNA-Konzentrationsbestimmung
    • 2.6.4 Agarose-Gelelektrophorese
    • 2.6.5 Enzymatische Reaktionen
      • 2.6.5.1 DNA-Restriktion
      • 2.6.5.2 Alkalische Phosphatase Behandlung
      • 2.6.5.3 Auffüllreaktion mit Klenow-Enzym
      • 2.6.5.4 Ligation
    • 2.6.6 Transformation
    • 2.6.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
      • 2.6.7.1 PCR zur Amplifizierung definierter Promotorsequenzen
      • 2.6.7.2 Direkt-PCR
      • 2.6.7.3 Megaprimer PCR
      • 2.6.7.4 Sondenherstellung mittels PCR
    • 2.6.8 Sequenzierung
  • 2.7 RNA-Techniken
    • 2.7.1 RNA-Isolierung
    • 2.7.2 RNA-Konzentrationsbestimmung
    • 2.7.3 RNA-Gelelektrophorese
    • 2.7.4 Northern Hybridisation und Visualisierung
    • 2.7.5 Bestimmung des Transkriptionsstarts mittels 5´-RACE
    • 2.7.6 TaqMan® Universal RT-PCR
  • 2.8 Lumineszenz-Messung
  • 2.9 Nachweis der Chloramphenicol-Acetyltransferase
  • 2.10 Biolistischer Gentransfer
    • 2.10.1 Vorbereitung der Microcarrier
    • 2.10.2 Gold-Coating-Ansatz
    • 2.10.3 Vorbereitung der Pflanzen
    • 2.10.4 Partikelbombardement
    • 2.10.5 Gus-Nachweis
• 3 Ergebnisse und Auswertung
  • 3.1 Untersuchung der pflanzenspezifischen Promotoren in Eubakterien
    • 3.1.1 Klonierungsarbeiten
      • 3.1.1.1 Herstellung der pBin-Konstrukte und Transformation in E. coli, Y. enterocolitica, A. tumefaciens, P. putida und Acinetobacter sp. BD413
      • 3.1.1.2 Herstellung der pKK-Konstrukte und Transformation in E. coli
      • 3.1.1.3 Klonierung der Hae III-Restriktionsfragmente des ST-LS1-Promotors in pKK232-8 und Transformation in E. coli
    • 3.1.2 Computer-gestützte Sequenzanalyse der pflanzenspezifischen Promotoren
      • 3.1.2.1 Computer-gestützte Suche nach prokaryontischen Promotor Konsensus Sequenzen
      • 3.1.2.2 Bestimmung des AT-Gehalts
    • 3.1.3 Genexpressionsbestimmungen
      • 3.1.3.1 Genexpressionsbestimmung mittels Lumineszenzmessung
      • 3.1.3.2 Nachweis der Transkriptmenge mittels TaqMan® Universal PCR
      • 3.1.3.3 Nachweis der Genexpression mittels Northern Hybridisierung
      • 3.1.3.4 Nachweis der phänotypischen Ausprägung eines Antibiotikumresistenzgens durch Aktivität pflanzenspezifischer Promotoren in Bakterien
    • 3.1.4 Transkriptionsstartbestimmung ausgewählter Promotoren mittels 5´-RACE
      • 3.1.4.1 Bestimmung des Transkriptionsstarts des ST-LS1-Promotors
      • 3.1.4.2 Bestimmung des Transkriptionsstarts des CaMV 35S-Promotors
      • 3.1.4.3 Bestimmung des Transkriptionsstarts des Nos-Promotors
    • 3.1.5 Mutagenese des ST-LS1-Promotors
      • 3.1.5.1 Ortsspezifische Mutagenese des ST-LS1-Promotors
    • 3.1.6 Ermittlung der Expressionsstärke der mutagenisierten ST-LS1-Promotor-Derivate durch Messung der Luziferase-Aktivität
    • 3.1.7 Untersuchung der Transkripte der mutagenisierten ST-LS1-Promotoren
    • 3.1.8 Herstellung von pBi101.2-Konstrukten mit mutagenisierten ST-LS1-Promotoren
      • 3.1.8.1 Klonierungsarbeiten
    • 3.1.9 Partikelbombardement von N. tabacum
      • 3.1.9.1 Genexpressionsbestimmungen der mutagenisierten ST-LS1-Promotoren
  • 3.2 Untersuchung von bakteriellen und Plastiden Promotoren in N. tabacum
    • 3.2.1 Herstellung von pBi101.2-Konstrukten mit den bakteriellen und Plastiden Promotoren
    • 3.2.2 Sequenzanalyse der bakteriellen und Plastiden Promotoren
      • 3.2.2.1 Computer-gestützte Suche nach eukaryontischen Promotor Konsensus Sequenzen in den untersuchten bakteriellen und Plastiden Promotoren
    • 3.2.3 Partikelbombardement von N. tabacum
      • 3.2.3.1 Genexpressionsbestimmung der bakteriellen und Plastiden Promotoren
• 4 Diskussion
  • 4.1 Spezifität von Promotorsequenzen
  • 4.2 Identifizierung von Promotorsequenzen
    • 4.2.1 Computer-gestützte Suche nach Promotor Konsensus Sequenzen
    • 4.2.2 Transkriptionsstartbestimmungen
  • 4.3 Analyse des ST-LS1-Promotors
  • 4.4 Schlußfolgerungen
• 5 Literatur
• 6 Anhang
  • 6.1 Plasmidkarten
    • 6.1.1 Restriktionskarte des Vektors pBin19
    • 6.1.2 Darstellung des T-DNA Bereichs von pBinlux-SalI
    • 6.1.3 Darstellung des T-DNA Bereichs von pBinlux-BamHI
    • 6.1.4 Darstellung des T-DNA Bereichs des Vektors pBi101.2
    • 6.1.5 Restriktionskarte des Vektors pKK232-8
    • 6.1.6 Darstellung des rekombinanten Bereichs des Plasmides pKKlux
    • 6.1.7 Darstellung des rekombinanten Bereichs des Plasmides pKKlux-BamHI
    • 6.1.8 Restriktionskarte des Vektors pLitmus28
    • 6.1.9 Restriktionskarte des Plasmides Mini-Tn5lux AB
  • 6.2 Pflanzenspezifische Promotorsequenzen
    • 6.2.1 35S-Promotor aus CaMV (531 bp)
    • 6.2.2 B33-Patatin-Promotor (1526 bp)
    • 6.2.3 ST-LS1-Promotor (1585 bp)
    • 6.2.4 RolC-Promotor (1120 bp)
    • 6.2.5 Promotor P 130 (1341 bp)
    • 6.2.6 Promotor P 247 (1123 bp)
    • 6.2.7 FBP1,1-Promotor (1108 bp)
    • 6.2.8 FBP1,7-Promotor (1730 bp)
    • 6.2.9 Nos-Promotor (306 bp)
    • 6.2.10 SKT2-Promotor (3036 bp)
    • 6.2.11 KST1-Promotor (1580 bp)
    • 6.2.12 KCO1-Promotor (980 bp)
  • 6.3 Promotorsequenzen aus dem Chloroplasten von N. tabacum
    • 6.3.1 Promotorregion des psb A-Gens
    • 6.3.2 Promotorregion des rbcL-Gens
    • 6.3.3 Promotorregion des accD-Gens
    • 6.3.4 Promotorregion des rpoB-Gens
    • 6.3.5 Promotorregion des atpB-Gens
    • 6.3.6 Promotorregion des clpP-Gens
  • 6.4 Bakterielle Promotorsequenzen
    • 6.4.1 Promotorregion des bla-Gens
    • 6.4.2 Promotorregion des nptIII-Gens
    • 6.4.3 Promotorregion des lac-Operons
  • 6.5 Alignments
    • 6.5.1 Alignment der Sequenzierungen des Nos-Promotors
    • 6.5.2 Alignment der Sequenzierungen des KCO1-Promotors
    • 6.5.3 Alignment der Sequenzierungen des KST1-Promotors
• Lebenslauf
• Publikationen
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1 : Multisubunit RNA-Polymerasen. Konservierte UEs der bakteriellen RNAP, archealen RNAP und eukaryontischen RNAP I, II und III (Ebright, 2000).
• Tab. 2 : Vergleich des prozentualen Anteils der aufgeführten Nukleotide der –35- und –10-Regionen in den untersuchten Promotoren.
• Tab. 3 : Untersuchte pflanzenspezifische, bakterielle und Plastiden Promotoren.
• Tab. 4 : Verwendete Enzyme und Kits
• Tab. 5 : Verwendete Bakterienstämme
• Tab. 6 : Klonierungsvektoren
• Tab. 7 : Vorhandene Promotorkonstrukte
• Tab. 8 : Promotorderivate, Reportergene
• Tab. 9 : Verwendete Primer zur Herstellung des Nos-, KST1- und KCO1-Promotors. Die Lokalisationen der Primer des Nos-Promotors beziehen sich auf die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365), bei dem KCO1-Promotor auf die DNA-Sequenz mit der Acc. # Y07825 und bei dem KST1-Promotor auf die DNA-Sequenz mit der Acc. # AJ242852 (2-KST1-S) und die DNA-Sequenz des Vektors pBi101 mit der Acc. # U12639 (KST-AS).
• Tab. 10 : Verwendete Primer zur Herstellung der Promotoren von npt III und bla . Die Lokalisationen der Primer des NptIII-Promotors beziehen sich auf die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365) und die des Bla-Promotors auf die DNA-Sequenz des Vektors pKK232-8 (Acc. # U13859).
• Tab. 11 : Verw endete Primer zur Herstellung der Chloroplasten Promotoren. Die Lokalisation bezieht sich auf die Chloroplasten-DNA aus N. tabacum (Acc. # Z00044).
• Tab. 12 : Verwendete Primer zur Bestimmung der Transkriptionsstarts mittels 5´-RACE. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961) und des cat-Gens des Vektors pKK232-8 (Acc. # U13859). * I = Inosin. Inosin dient der Erniedrigung der Schmelztemperatur des Primers.
• Tab. 13 : Verwendete Primer zum Einfügen von Basenaustauschen in den ST-LS1-Promotor. Die Lokalisation bezieht sich auf die Promotor-Sequenz des ST-LS1-Gens aus S. tuberosum (Acc. # X04753), sowie die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961) und die DNA-Sequenz des Vektors pBin19 (Acc. # U09365).
• Tab. 14 : Verwendete Primer zur Herstellung quantitativer PCR-Produkte. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961). * F : 6-Carboxy-Fluorescein (Fam); T : 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin (Tamra = Quencher).
• Tab. 15 : Verwendete Primer zur Sondenherstellung. Die Lokalisation bezieht sich auf die DNA-Sequenz der lux AB-Gene aus V. harveyi (Acc. # M10961).
• Tab. 16 : Verwendete Primer zur Sequenzierung und für die Direkt-PCR. Die Lokalisation bezieht sich auf die angegebene DNA-Sequenz der Acc. #.
• Tab. 17 : PCR-Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen zur Amplifikation definierter Promotorsequenzen. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer. ** Der gewählte Zeitraum für die Elongation war abhängig von der Größe des zu amplifizierenden Nukleinsäure-Fragmentes (ca. 1 min/1 kbp zu amplifizierendes Nukleinsäure-Fragment).
• Tab. 18 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Direkt-PCR. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer.
• Tab. 19 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Megaprimer PCR. In der 1. PCR-Runde wurden die Megaprimer hergestellt, welche in der 2. PCR-Runde zur Synthese der Promotor-DNA eingesetzt wurden. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer.
• Tab. 20 : Reaktionsansatz und Thermocycler-Bedingungen der Sequenzierung. * Die Wahl der Annealing-Temperatur richtete sich nach den Schmelztemperaturen der eingesetzten Primer. ** Der Hersteller macht keine Angaben über die genaue Zusammensetzung.
• Tab. 21 : Temperaturprofil der 5´-RACE-PCR. * Zur Elongation wurde der ELONGase™ Ezyme Mix (Life Technologies™ ) eingesetzt, welcher bei einer Temperatur von 68 °C das Aktivitätsoptimum besitzt.
• Tab. 22 : Protokoll der quantitativen RT-PCR. * Die genaue Zusammensetzung wurde vom Hersteller nicht angegeben.
• Tab. 23 : Überblick über die Strategien zur Klonierung der pflanzenspezifischen Promotoren und der lux AB-Fragmente in pBin19, sowie die Namen der resultierenden pBin-Konstrukte. Zum Vergleich der Expressionsstärke heterologer Promotoren wurde der bakterielle Promotor des lac -Operons in pBin19 untersucht.
• Tab. 24 : Überblick über die Klonierungsstrategien der pflanzenspezifischen Promotoren in pKK232-8 und die Namen der resultierenden Promotor-cat- Fusionen. Nach Klonierung der lux AB-Gene entstanden die pKK-Konstrukte.
• Tab. 25 : Ergebnisse der Computer-gestützen Suche nach potentiellen bakteriellen Konsensus Sequenzen in den pflanzenspezifischen Promotoren. Untersucht wurden die 300 bp der Promotoren, welche direkt vor dem Fragment mit den lux AB-Genen lagen. Übereinstimmungen der Nukleotide mit der σ70 -Konsensus Sequenz wurden in Großbuchstaben dargestellt. Verschiebt sich die Konsensus Sequenz bei der Suche nur um ein bis mehrere Nukleotide, so wurde diese Sequenz in Klammern dargestellt und als ein Treffer gezählt. Der Sequenzursprung bezieht sich auf die Acc. # (wenn vorhanden), der im Anhang aufgeführten Sequenzen.
• Tab. 27 : pBi-Konstrukte
• Tab. 28 : Ergebnisse der Computer-gestützen Suche nach potentiellen TATA-Konsensus Sequenzen in den bakteriellen und Plastiden Promotoren. Übereinstimmungen mit der Konsensus Sequenz wurden in Großbuchstaben dargestellt. Verschiebt sich die Konsensus Sequenz bei der Suche nur um eine bis mehrere Basen, so wurde diese Sequenz in Klammern dargestellt und als ein Treffer gezählt. Der Sequenzursprung bezieht sich auf die Acc. # der im Anhang aufgeführten Sequenzen.
• Tab. 29 : Vergleich der putativen σ70 Konsensus Sequenzen (modifiziert nach Wösten et al. , 1998b). Es wurden 29 Promotorsequenzen aus Streptomyces (Strohl, 1992), 33 Promotorsequenzen aus C. glutamicum (Pátek et al. , 1996), 21 Promotorsequenzen aus C. jejuni (Wösten et al. , 1998b) und 263 Promotorsequenzen aus E. coli (Harley und Reynolds, 1987) untersucht. * Aufgeführt wurden nur die Nukleotide, welche in mehr als 47 % der Fälle an den Positionen vorkamen.

Bilder

• Abb. 1 : Schematische Darstellung einer prokaryontischen Promotorregion, welche von dem σ70 -Faktor des Holo-Enzyms der RNAP erkannt wird. a Aufbau der Promotorregion mit den –35- und –10-Konsensus Sequenzen sowie dem UP-Element, welches nur in stark exprimierenden Promotoren vorhanden ist. Der Transkriptionsstart (Pfeil) wird häufig von einer Purinbase gebildet. Bei Vorhandensein einer `extended –10-Region´ ist die –35-Region entbehrlich. b Struktureller Aufbau des σ70 -Faktors mit den vier Regionen und den dazugehörigen Subregionen mit den entsprechenden Funktionen (modifiziert nach Wösten, 1998a).
• Abb. 2 : Vereinfachtes Modell der Transkriptionsinitiation in Prokaryonten. Das Core-Enzym (α2ββ ´) der RNAP bildet mit dem σ -Faktor das Holo-Enzym, welches an die Promotorregion binden kann. Nach erfolgreicher Transkriptionsinitiation dissoziiert der σ -Faktor vom Holo-Enzym und das Core-Enzym geht in die Elongation und damit zur RNA-Synthese über. Nähere Erläuterungen siehe Text.
• Abb. 3 : Schematische Darstellung möglicher eukaryontischer Promotorregionen. Die TATA-Box ist am häufigsten in eukaryontischen Promotoren vertreten. Sie liegt ca. 25 bis 30 nt stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstelle (Pfeil). Im humanen Transkriptionsapparat befindet sich teilweise direkt stromaufwärts der TATA-Box das `IIB recognition element´ (BRE). Neben der TATA-Box beinhalten einige Promotoren das Inr-Element. Die Transkriptionsinitiation geht häufig von einem Adenin aus. TATA-less Promotoren beinhalten nur das Inr-Element. In TATA-less Promotoren wurde in Drosophila und in humanen Zellen das `downstream promoter element´ (DPE) nachgewiesen. Cis -regulierende DNA-Sequenzelemente, die nicht zum Core-Promotor gehören, wurden als UAS dargestellt.
• Abb. 4 : Modell für die Transkriptionsinitiation durch die RNAP II (modifiziert nach Orphanides et al. , 1996). a Beispiel für ein Holo-Enzym-Modell. b In vitro -Modell des PICs bei dem sich die GTFs und die RNAP II in einer bestimmten Reihenfolge an der Promotorsequenz der DNA versammeln. Nähere Erläuterungen siehe Text.
• Abb. 5 : Schematische Darstellung der Promotorregionen, welche von den verschiedenen Plastiden Polymerasen zur Transkriptionsinitiation genutzt werden (modifiziert nach Weihe und Börner, 1999). a σ70 -Typ ähnlicher Promotor der PEP mit den –35- und –10-Konsensus Sequenzen. b Drei Typen von Promotorregionen, die von den verschiedenen NEPs zur Transkriptionsinitiation genutzt werden (Weihe und Börner, 1999). Eine Promotorregion weist das charakteristische YRT-Motiv innerhalb einer AT-reichen Sequenz auf. Daneben gibt es NEP-Promotoren, welche sowohl die YRT-Box als auch 9 bis 20 nt stromaufwärts eine weitere Box mit dem hochkonserviertem GAA-Motiv enthalten. Andere NEP-Promotoren weisen keine der beiden beschriebenen Motive auf. Der Transkriptionsstart wurde durch einen Pfeil dargestellt.
• Abb. 6 : Spezifität und Funktion der NEP bzw. PEP (Hess und Börner, 1999). Die NEP, welche aus einer einzigen UE besteht, transkribiert mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren (TF) z. B. die Gene rpo A, rpo B, rpo C1 und rpo C2 der PEP. Die PEP wiederum erkennt mit Hilfe des σ-Faktors die für Eubakterien-ähnlichen –35- und –10-Konsensus Sequenzen der Promotoren der Gene rbc L und psb A.
• Abb. 7 : Schematische Darstellung der Megaprimer PCR. Primer 1 stellt den Mismatch-Primer dar
• Abb. 8 : Schematische Darstellung der 5´-RACE.
• Abb. 9 : Schematische Darstellung der TaqMan® PCR.
• Abb. 10 : Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Untersuchung der pflanzenspezifischen Promotoren (nähere Erläuterung siehe Text).
• Abb. 11 : Schematische Darstellung der MCS der Ausgangsderivate mit den pflanzenspezifischen Promotoren. Die pBin19-Derivate (pBinG130, pBinG247 und pFBPase1,1) weisen stromabwärts der Hin dIII-Schnittstelle in antisense den Lac-Promotor ( ) auf. Die Transkriptionstermination stammt aus dem Octopin-Synthase Gen (ocs). Die pBi101-Derivate (pME1, pBi101-SKT2 und pDKP3) bzw. das pGPTV-HPT–Derivat (pPK-Gus-4) besitzen zum Nachweis der Genexpressionsstärke der Promotoren in Pflanzen ein promotorloses β -Glucuronidase Gen (gus ) und die Transkriptionstermination des Nopalin-Synthase Gens (nos).
• Abb. 12 : Schematische Darstellung der lux AB-Gene mit Restriktionsschnittstellen a des Transposon-Bereichs des Mini-Tn5lux AB (de Lorenzo et al. , 1990) und b der MCS des pBinlux-SalI mit dem Lac-Promotor (Pfeil).
• Abb. 13 : Schematische Darstellung der MCS der pBin-Konstrukte.
• Abb. 14 : Restriktionsverdau der pKK-Konstrukte mit Pvu II. 1 = λ DNA/Eco 130I, 2 = pKKlux, 3 = pKKARlux, 4 = pKKB33lux, 5 = pKKST-LS1lux, 6 = pKKRolClux, 7 = pKK130lux, 8 = pKK247lux, 9 = pKKFBP1,7lux, 10 = pKKNoslux, 11 = pKKSKT2lux, 12 = pKKKCO1lux, 13 = pKKKST1lux, 14 = λ DNA/Eco 130I.
• Abb. 15 : Schematische Darstellung der MCS der pKK-Konstrukte. Stromaufwärts der klonierten Promotoren liegt ein Transkriptionsstop, stromabwärts schließt sich die DNA des promotorlosen cat -Gens an.
• Abb. 16 : Schematische Darstellung des Eco RI/Bam HI-Fragmentes des Promotors P ST-LS1 mit den vorhandenen Hae III-Restriktionsschnittstellen. Die dargestellten Hae III-DNA-Fragmente wurden in pKK232-8 kloniert und erhielten die Namen pKKST-LS1.1, pKKST-LS1.2 und pKKST-LS1.3.
• Abb. 17 : Schematische Darstellung der pKK-Konstrukte mit den Hae III-DNA-Fragmenten des P ST-LS1. * Die Restriktionsschnittstelle kann durch das Enzym Sma I nicht mehr erkannt werden, da je nach DNA-Fragment eine aufgefüllte Eco RI oder Bam HI bzw. Hae III Restriktionsschnittstelle mit Sma I ligiert wurde.
• Abb. 18 : Darstellung des AT-Gehaltes innerhalb der 300 bp (in der Darstellung 50 bis 350) der Sequenz der pflanzenspezifischen Promotoren, welche direkt vor dem Klonierungsfragment mit den zu transkribierenden lux AB-Genen lagen.
• Abb. 19 : Lumineszenzmessungen der a pKK-Konstrukte und b pBin- Konstrukte in E. coli .
• Abb. 20 : Lumineszenzmessungen der pBin-Konstrukte in a Y. enterocolitica, b A. tumefaciens, c P. putida und d Acinetobacter sp. BD413
• Abb. 21 : Lumineszenzmessung der pKK-Konstrukte der Subklone des P ST-LS1 im Vergleich zu dem Gesamtfragment in E. coli .
• Abb. 22 : Gegenüberstellung der a lux AB-Transkriptmengen und der b Lumineszenzwerte ausgewählter pBin- Konstrukte in Y. enterocolitica .
• Abb. 23: Northern Hybridisierung. a 1 = pKKSKT2lux, 2 = pST-LS1lux, 3 = pFBP1,7lux, 4 = pKST1lux in E. coli. b 1 = E. coli (pKKST-LS1lux), 2 = Y. enterocolitica (pST-LS1lux), 3 = E. coli (pST-LS1lux). c 1 = E. coli (pST-LS1lux), 2 = E. coli (pKKST-LS1lux); 3 = P. putida (pST-LS1lux).
• Abb. 24 : Schematische Darstellung der durch Northern Hybridisierung erhaltenen Transkriptlängen. Transkript 1 wurde bei allen getesteten Proben identifiziert. Die Promotoren P ST-LS1, P FBP1,7 und P SKT2 wiesen ein zweites Transkript auf. Bei dem Promotor P KST1 konnte neben einem zweiten noch ein drittes Transkript identifiziert werden.
• Abb. 25 : Vergleichendes Wachstum ausgewählter Promotor-cat -Fusionen und pKK232-8 als Negativ-Kontrolle in E. coli auf LB-Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen von CA.
• Abb. 26 : Vergleich der Genexpression der E. coli –Stämme mit den Promotor-cat -Fusionen als Wachstum auf LB-Agarplatten mit 5 µg/ml CA gegenüber den Lumineszenzwerten der pKK-Konstrukte.
• Abb. 27 : Schematische Darstellung der rekombinanten DNA der Plasmide mit 200 nt der 5´-upstream Region des lux AB-Fragmentes. Der schwarze Pfeil zeigt die möglichen Schnittstellen der RNase E in der mRNA. Die blauen Pfeile markieren einen `inverted repeat´, welcher in der mRNA einen `stem-loop´ ausbilden könnte. Das Startkodon für den Translationsstart des lux A-Gens wurde unterstrichen.
• Abb. 28 : Ergebnisse der 5´-RACE des P ST-LS1. a 1,5 %iges Agarosegel mit einer Auftragsmenge von 10 µl des PCR-Ansatzes der 5´-RACE. Spur 1 und 10 = 100 bp ladder, Spur 2 = E. coli (pKKlux), Spur 3 = E. coli (pKKST-LS1lux), Spur 4 = E. coli (pST-LS1lux), Spur 5 = Y. enterocolitica (pST-LS1lux), Spur 6 = Acinetobacter sp. (pST-LS1lux), Spur 7 = P. putida (pST-LS1lux), Spur 8 = A. tumefaciens (pST-LS1lux), Spur 9 = H2 O-Kontrolle. b Schematische Darstellung der rekombinanten DNA des pKKST-LS1lux mit 300 nt der Sequenz des 3´-Endes des P ST-LS1. Unterstrichen dargestellt sind die potentiellen per Computer-gestützte Analyse ermittelten –35- und –10-Konsensus Sequenzen. CAAT- und TATA-Box, sowie der Transkriptionsstart (mit Pfeil) in Pflanzen sind in grüner Schrift dargestellt. Der Transkriptionsstart innerhalb der untersuchten Bakterienarten wurde durch einen schwarzen Pfeil markiert und die auf den prokaryontischen Transkriptionsstart bezogenen potentiellen –35- und –10-Regionen sind unterbrochen gestrichelt dargestellt.
• Abb. 29 : Schematische Darstellungen der rekombinanten DNA des a pKKST-LS1.1lux und b pKKST-LS1.2lux mit 300 nt der Sequenzen des 3´-Endes des jeweiligen Promotorfragmentes. Unterstrichen dargestellt sind potentielle –35- und –10-Konsensus Sequenzen. Die mittels 5´-RACE analysierten Transkriptionsstarts in E. coli sind durch Pfeile dargestellt.
• Abb. 30 : Schematische Darstellung der rekombinanten DNA des pKK35Slux mit der vollständigen Sequenz des P 35S. Schwarz unterstrichen dargestellt sind potentielle mittels Computer-gestützter Suche gefundene –35- und –10-Konsensus Sequenzen. CAAT- und TATA-Box, sowie der Transkriptionsstart (mit Pfeil) in Pflanzen sind in grüner Schrift dargestellt. Die Transkriptionsstarts in E. coli kartiert mittels 5´-RACE sind durch schwarze Pfeile dargestellt. Potentielle –35- und –10-Regionen, welche für die Transkriptionsinitiationen in E. coli verantwortlich sein könnten, wurden schwarz gestrichelt. Die von Assaad und Signer (1990) analysierten –35- und –10-Konsensus Sequenzen mit deren Transkriptionsstarts zweier identifizierter Transkripte sind blau unterstrichen bzw. als blaue Pfeile dargestellt.
• Abb. 31 : Schematische Darstellung der rekombinanten DNA des pKKNoslux mit der vollständigen Sequenz des P Nos. Unterstrichen dargestellt sind potentielle mittels Computer-gestützter Suche gefundene –35- und –10-Konsensus Sequenzen. CAAT- und TATA-Box, sowie der Transkriptionsstart (mit Pfeil) in Pflanzen sind in grüner Schrift dargestellt. Der Transkriptionsstart in E. coli kartiert mittels 5´-RACE ist durch einen schwarzen Pfeil und die dazugehörigen potentiellen –35- und -10-Regionen schwarz gestrichelt dargestellt.
• Abb. 32 : Schematische Darstellung der rekombinanten DNA des pKKKST1lux mit 300 nt der Sequenz des 3´-Endes des P KST1. Unterstrichen dargestellt sind mittels Computer-gestützter Suche identifizierte potentielle –35- und –10-Konsensus Sequenzen. Die mögliche TATA-Box für die Transkriptionsinitiation in Pflanzen ist in grüner Schrift dargestellt. Der Transkriptionsstart in E. coli wurde durch einen Pfeil dargestellt und die dazugehörigen möglichen –35- und –10-Regionen wurden schwarz gestrichelt.
• Abb. 33 : a Schematische Darstellung der –35- und –10-Konsensus Sequenzen in E. coli . Der optimale Abstand der beiden Hexamere voneinander liegt bei 16 bis 18 nt. Der optimale Abstand der –10-Region zum Transkriptionsstart liegt bei 5 bis 9 nt. Der Transkriptionsstart wird häufig von einer Purinbase (Adenin oder Guanin) gebildet (Hawley und McClure, 1983; Harley und Reynolds, 1987; Lisser und Margalit, 1993). b Darstellung von 80 Basen der 5´upstream-Region des ST-LS1-Promotors als Originalsequenz und mit ortsspezifischen Basenaustauschen (rot ). CAAT- und TATA-Box, welche für die Transkriptionsinitiation in Pflanzen notwendig sind, sowie der Transkriptionsstart (Pfeil) in Pflanzen sind grün dargestellt. Die potentielle –10- und -35-Region zur Transkriptionsinitiation, sowie der Transkriptionsstart (Pfeil) in Bakterien wurden in der Originalsequenz unterstrichen. Die Mutanten des P ST-LS1 H , J und K sind `down-Mutanten´, welche zur Verminderung der Genexpression führen sollten. Die Mutanten L und N sollten als `up-Mutanten´ die Genexpressionsstärke des zu exprimierenden Gens erhöhen. Die Sequenzen der –10-Region der Mutante L und der `extended -10-Region´ der Mutante N entsprechen den Konsensus Sequenzen in E. coli . Die Mutanten D und M dienten als Template-DNA bei der Megaprimer-PCR zur Herstellung der Mutante N.
• Abb. 34 : Die Abbildung zeigt einen Ausschnitt des Alignments der Sequenzierung des P ST-LS1 gegenüber dem mit PCR hergestellten, unmutierten Promotor P ST-LS1-PCR und den Mutanten H, J, K, L und N.
• Abb. 35 : Schematische Darstellung der MCS der pBin-Konstrukte mit P ST-LS1, welcher entsprechend der Originalsequenz oder mit Substitutionen mittels PCR hergestellt wurde. * = PCR; H; J; K; L; N.
• Abb. 36: Vergleich der Lumineszenzmessungen der P ST-LS1-Mutanten in a E. coli, b Y. enterocolitica, c Acinetobacter sp., d A. tumefaciens und e P. putida
• Abb. 37 : Northern Hybridisierung des P ST-LS1 im Vergleich zu den Mutanten P ST-LS1H, P ST-LS1J, P ST-LS1K, P ST-LS1L und P ST-LS1N.
• Abb. 38 : Schematische Darstellung eines Teilausschnitts der pBi-Konstrukte mit P ST-LS1 und dessen Mutanten. * = H; J; K
• Abb. 39 : Ausschnitt eines Alignments der Sequenzen des Vektors pBi101.2 mit Darstellung der Restriktionsschnittstellen, Promotorerkennungssequenzen des lac- Operons (-35-, -10-Region) und dem dazugehörigen Transkriptionsstart im Vergleich zu der Sequenz der Negativ-Kontrolle, in welcher die Sequenz zwischen Xmn I und Sma I entfernt wurde. Die DNA der Promotoren, deren Expression der gus -Gene in N. tabacum getestet werden sollte, wurde zwischen die Xmn I- und Sma I-Restriktionsschnittstellen kloniert.
• Abb. 40 : Vergleich der transienten Expression der P ST-LS1-Mutanten (H, J und K) gegenüber dem WT-Promotor P ST-LS1 und der Negativ-Kontrolle in N. tabacum.
• Abb. 41 : Schematische Darstellung eines Teilausschnitts der pBi-Konstrukte mit den zu untersuchen Promotoren. P* = NptIII; Bla; PsbA; RbcL; AccD; RpoB; AtpB; ClpP
• Abb. 42 : Teilausschnitte von Blattscheiben aus N. tabacum . Die Expression des gus- Gens ausgehend von dem P AccD ist anhand zweier Spots (Pfeil) erkennbar.
• Abb. 43 : Restriktionskarte des Vektors pBin19 (Bevan, 1984). Der binäre Vektor für E. coli und A. tumefaciens mit dem Replikationsursprung (ori) aus RK2 wird zur Transformation von Pflanzen eingesetzt. Der T-DNA Bereich (verstärkt schwarz) wird von der linken und rechten Grenze (LB, RB) flankiert. Die T-Region enthält den lac Z´-Bereich mit der MCS aus M13mp19. Rekombinante Klone können durch Blau/Weiß-Screening identifiziert werden. Zur Selektion transformierter Pflanzen enthält die T-Region ein dominant vererbbares Neomycin-Phosphotransferase Gen II (npt II). Die Expression des npt II-Gens wird durch den Promotor des Nopalin-Synthase Gens (P nos ) gesteuert. Die Transkriptionstermination für das npt II-Gen stammt ebenfalls aus dem Nopalin-Synthase Gen (nos A). Außerhalb der T-Region enthält das Plasmid ein Kanamycinresistenz Gen (kmR ) für die Selektion in Bakterien.
• Abb. 44 : Schematische Darstellung des rekombinanten T-DNA Bereichs des Plasmides pBinlux-SalI. Insertion der promotorlosen lux AB-Gene als Sal I-Fragment aus Mini-Tn5lux AB (de Lorenzo et al. , 1990; Herrero et al. , 1990; siehe Kap. 6.1.9, Abb. 51) in die MCS des Vektors pBin19 (Bevan, 1984; siehe Kap. 6.1.1, Abb. 43). Die Größe des Plasmids pBinlux-SalI beträgt ca. 15 kbp.
• Abb. 45 : Schematische Darstellung des rekombinanten T-DNA Bereichs des Plasmides pBinlux-BamHI. Insertion der promotorlosen lux AB-Gene als Bam HI-Fragment aus pBinlux-SalI (siehe Kap. 6.1.2, Abb. 44) in die MCS des Vektors pBin19 (Bevan, 1984; siehe Kap. 6.1.1, Abb. 43). Die Größe des Plasmids pBinlux-BamHI beträgt ca. 15 kbp.
• Abb. 46 : Schematische Darstellung des T-DNA Bereichs des Plasmides pBi101.2 (Jefferson et al. , 1987). In die MCS des Vektors pBin19 (Bevan, 1984; siehe Kap. 6.1.1, Abb. 43) wurde ein promotorloses gus- Gen (1,87 kbp) inseriert mit der Transkriptionstermination aus dem Nopalin-Synthase Gen (nos A). Die Größe des pBi101.2 beträgt ca. 12,2 kbp.
• Abb. 47 : Restriktionskarte des Vektors pKK232-8 (Brosius, 1984). Der für Promotorstudien konzipierte Vektor besitzt ein promotorloses Chloramphenicol-Acetyltransferase Gen (cat ), sowie einen Transkriptionsstop (T1 ) aus dem rrn B-Operons aus E. coli stromaufwärts der MCS und zwei Transkriptionsstops (T2 , T3 ) des rrn B stromabwärts des cat -Gens. Der Replikationsursprung (ori) stammt aus dem Plasmid pBR322. Zur Selektion enthält das Plasmid ein Ampicillinresistenz Gen (ampR ).
• Abb. 48 : Schematische Darstellung de rekombinanten Bereichs des Plasmides pKKlux. Insertion der promotorlosen lux AB-Gene als Sal I/Hin dIII-Fragment aus dem Mini-Tn5lux AB (de Lorenzo et al. , 1990; Herrero et al. , 1990; siehe Kap. 6.1.9, Abb. 51) in die MCS des Vektors pKK232-8 (Brosius, 1984; siehe Kap. 6.1.5, Abb. 47). Die Größe des Plasmids pKKlux beträgt ca. 8,3 kbp.
• Abb. 49 : Schematische Darstellung des rekombinanten Bereichs des Plasmides pKKlux-BamHI. Insertion der promotorlosen lux AB-Gene als Bam HI-Fragment aus dem pBinlux-SalI (siehe Kap. 6.1.2, Abb. 44) in die MCS des Vektors pKK232-8 (Brosius, 1984; siehe Kap. 6.1.5, Abb. 47). Die Größe des pKKlux beträgt ca. 8,3 kbp.
• Abb. 50 : Restriktionskarte des Vektors pLitmus28 (Evans et al. , 1995). pLitmus28 enthält den M13-Replikationsursprung (M13 ori) und den ColE1-Replikationsursprung (pUC ori). Zur Selektion enthält das Plasmid ein Ampicillinresistenz Gen (ampR ). Die MCS unterbricht den lac Z´-Bereich, somit kann eine Blau/Weiß-Selektion stattfinden.
• Abb. 51 : Restriktionskarte des Plasmides Mini-Tn5lux AB (de Lorenzo et al. , 1990; Herrero et al. , 1990). Mini-Tn5lux AB wurde zum Auffinden von Promotorsequenzen in Gram-negativen Bakterien konstruiert. Für die Transposition enthält das Transposon repetitive Sequenzen des Tn5 (0, I) von 19 bp und ein Transposase Gen (tnp* ). Zwischen diesen Sequenzen befinden sich die promotorlosen Luziferase-Gene (lux AB) aus V. harveyi. Als Selektionsmarker liegt in dem Transposonbereich ein Tetrazyklinresistenz Gen (tcR ). Das Transposon ist als Eco RI/Xba I-Fragment auf dem Vektor pUT lokalisiert. pUT besitzt den Replikationsursprung (ori) aus R6K und als Selektionsmarker ein Ampicillinresistenz Gen (ampR ).
• Abb. 52 : Alignment der Promotorsequenz des P Nos nach Shaw (P Nos, 1984), des Sau 3A-Fragments aus pBin19 (NosP26-364) als Template-DNA für die PCR und des pKK- bzw. pBin-Konstrukts. Der Basenaustausch von C nach T in pNoslux befindet sich an Position 9170 des pBin19 (Acc. # U09365).
• Abb. 53 : Alignment der übermittelten Promotorsequenz des P KCO1, der Template-DNA pPK-Gus-4 für die PCR und des pKK- bzw. pBin-Konstrukts.
• Abb. 54 : Alignment der übermittelten Promotorsequenz des P KST1, der Template-DNA pDKP3 für die PCR und des pKK- bzw. pBin-Konstrukts.