Jacobi, Annett Marita: Zur Bedeutung des Prolaktins für Pathogenese und Krankheitsverlauf bei systemischem Lupus erythematodes (SLE)

28

Kapitel 3. Eigene Untersuchungen

3.1 Material und Methoden

3.1.1 Bestimmung der Serumprolaktinspiegel

3.1.1.1 Charakterisierung der drei untersuchten Gruppen

3.1.1.1.1 SLE - Patienten

Alle SLE-Patienten wurden zum Zeitpunkt der Untersuchung stationär bzw. ambulant, durch Mitarbeiter der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Rheumatologie und Klinische Immunologie der Charité betreut. Sie erfüllten mindestens vier der ARA-Kriterien zur Klassifikation des SLE ( 193 ). Genaue Angaben über Anzahl, Geschlecht, Alter und Therapie der Patienten sind der Tab. 7 zu entnehmen. Zusätzlich werden auch Medikamente aufgeführt, die möglicherweise die hypophysäre Prolaktinsekretion steigern. 10 Patienten nahmen Ranitidin in einer Dosis, der keine PRL-erhöhende Wirkung zugeschrieben wird ( 194 ). Jeweils ein Patient nahm Verapamil bzw. Clonidin ein. In beiden Fällen war PRL jedoch nicht erhöht. Drei SLE-Patientinnen, bei denen keine Anzeichen für die Aktivität der Erkrankung vorhanden waren und die PRL-Werte im unteren Normbereich lagen, betrieben hormonelle Kontrazeption. Aus den genannten Gründen wurden die PRL-Werte dieser 15 Patienten mit in die Auswertung einbezogen.

Kein Patient nahm während der Untersuchung Neuroleptika, Antidepressiva, Domperidon oder Metoclopramid ein. Keine der Patientinnen war schwanger oder stillte. TSH lag mit Ausnahme von drei Patientinnen mit grenzwertig erhöhten Werten im Normbereich. Eine manifeste Hypothyreose konnte hier durch das Fehlen von Symptomen und fT3/fT4-Bestimmung ausgeschlossen werden. Keiner der Patienten war terminal niereninsuffizient.


29

3.1.1.1.2 Patienten mit anderen Kollagenosen oder Vaskulitiden

Dieser Gruppe gehören ebenfalls Patienten der oben genannten Einrichtung an. Sie setzt sich folgendermaßen zusammen:

Dermatomyositis/Polymyositis: 3 ( 195 )

MCTD: 9 ( 196 )

Sjögren Syndrom: 4 ( 197 )

Sklerodermie: 1 ( 198 )

Wegener´sche Granulomatose: 1 ( 199 )

Zur genauen Charakterisierung der 2. Gruppe dient Tab. 8 . Auch für die Patienten dieser Gruppe sind alle Angaben unter 3.1.1.1.1 .1, Abs.2 zutreffend.

Tab. 7: SLE-Patienten

Gruppe

männlich

weiblich/ postmeno-pausal

weiblich/ prämeno-pausal

gesamt

n

8

13

39

60

mittleres Alter in Jahren

34,4

54,4

29,6

35,6

ohne Therapie (%)

1 (12,5)

3 (23,1)

4 (10,3)

8 (13,3)

Azathioprin (%)

3 (37,5)

2 (15,4)

12 (30,8)

17 (28,3)

Cyclophosphamid (%)

1 (12,5)

3 (23,1)

15 (38,5)

19 (31,7)

Prednison (%)

mittlere Dosis in mg/die

6 (75,0)

15,4

10 (76,9)

14,5

32 ( 82,1)

11,6

48 (80,0)

12,7

Prednison-Stoß (%)

1 (12,5)

0 (0)

2 (3)

3 (5)

Ranitidin

1

4

5

10

Clonidin

0

0

1

1

Verapamil

0

1

0

1

Östrogene

0

1

2

3


30

3.1.1.1.3 Gesunde Kontrollgruppe

Die dritte Gruppe besteht aus Blutspendern der Charité. Keiner der Blutspender nahm zum Zeitpunkt der Untersuchung regelmäßig Medikamente ein. Tab. 9 enthält genaue Angaben über Anzahl, Alter und Geschlecht der Blutspender.

Tab. 8: Patienten mit Kollagenosen und Vaskulitiden

Gruppe

männlich

weiblich/ postmeno-pausal

weiblich/ prämeno-pausal

gesamt

n

2

9

7

18

mittleres Alter in Jahren

58,0

56,0

33,7

47,6

ohne Therapie (%)

0 (0)

2 (22,2)

3 (42,9)

6 (33,3)

Azathioprin (%)

0 (0)

2 (22,2)

1 (14,3)

3 (16,7)

Cyclophosphamid (%)

1 (50,0)

2 (22,2)

1 (14,3)

4 (22,2)

Prednison (%)

mittlere Dosis in mg/die

2 (100,0)

6,2

5 (55,6)

5,3

3 (42,9)

4,4

10 (55,6)

5,0

Ranitidin

0

2

1

3

Östrogene

0

2

1

3

Tab. 9: Gesunde Kontrollgruppe

Gruppe

männlich

weiblich/ prämenopausal

gesamt

n

17

30

47

mittleres Alter

38,47

29,73

32,89

3.1.1.2 Prolaktin-Bestimmung

Die Blutentnahmen erfolgten bei allen Patienten und Blutspendern zwischen 9 und 12 Uhr. Körperlicher und psychischer Streß wurde durch die Blutentnahme unmittelbar nach der Nachtruhe bzw. nach halbstündlicher körperlicher Ruhe vermieden. Außerdem wurde auch unmittelbar nach den Hauptmahlzeiten kein Blut entnommen. Es wurden Serum-Monovetten (Sarstedt) verwendet. Das Serum wurde innerhalb von 4h separiert und bei -20°C bis zur Prolaktinbestimmung


31

gelagert.

29 Patienten mit SLE stellten sich wiederholt im Rahmen eines festgelegten Therapieregimes oder zu ambulanten Verlaufskontrollen vor. Dies ermöglichte eine Prolaktinbestimmung im Verlauf.

Die Prolaktinwerte der Patienten und einer aus Blutspendern bestehenden Kontrollgruppe wurde mit Hilfe eines kommerziellen ELISAs (Synchron Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, Elias - Medizintechnik GmbH, Freiburg), bzw. IRMAs (Radioisotopic Assay, Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, USA) in der hormonanalytischen Abteilung des Institutes für Experimentelle Endokrinologie der Charité bestimmt. Dabei kam Serum als Untersuchungsmaterial in Doppelbestimmungen zum Einsatz. Um Interferrenzen auszuschließen, wurde nur klares Serum (nicht lipämisch, nicht hämolytisch) verwendet.

3.1.1.2.1 Enzymimmunoassay

Das Besondere am „Synelisa Prolaktin“ ist, daß abweichend von den herkömmlichen ELISAs mit einem transferablen Solid Phase System (TSP-Synelisa Pinplatte) gearbeitet wird, welches nacheinander in drei unterschiedlichen Mikrotiterplatten zum Einsatz kommt. Die immunologische Reaktion findet also nicht an der Wand der mit den verschiedenen Lösungen gefüllten Mikrotiterplatten, sondern an der Pinplatte statt. Auf diese Weise werden Start und Stop sämtlicher Reaktionen synchronisiert. Der Test läuft folgendermaßen ab:

Die Syn elisa Pins werden vor ihrem Eintauchen in die erste Mikrotiterplatte einmalig gewaschen (Waschpufferbad). In der ersten Mikrotiterplatte (Rundboden) kommt es zur Reaktion der Prolaktin-Antigene, enthalten in den Standards und Patientenproben (25µl+100µl Probenpuffer), mit den an den Pins haftenden Prolaktin-Antikörpern. Die Mikrotiterplatte wird mit den Pins 30min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Pinplatte der ersten Mikrotiterplatte entnommen und nach zweimaligem Waschen in die zweite Mikrotiterplatte getaucht, die bereits 100µl Enzympuffer mit Enzymkonjugat enthält. Es kann nun


32

die Bildung eines Sandwich-Komplexes an den Synelisa Pins erfolgen ( Abb. 7 ). An den schon vorhandenen Antikörper-Antigen-Komplex haftet sich ein zweiter enzymmarkierter Prolaktin-Antikörper (Konjugat). Nach dem Inkubieren und Waschen unter den oben schon angeführten Bedingungen, wird die Pinplatte dann in die dritte Mikrotiterplatte (Flachboden), in der 200µl Enzymsubstrat und Wasserstoffperoxid enthalten sind, getaucht. Das Substrat wird von dem am Antigen-Antikörper-Komplex haftenden Enzym umgesetzt und verursacht nach 10min lichtgeschützter Inkubation eine Farbentwicklung, die durch anschließende Zugabe von Schwefelsäure (50µl/Kavität) zum Stillstand gebracht wird. Nach weiteren 10min erfolgt die Messung der Extinktionen bei 492nm am Plattenreader (SLT 400 ATX). Die Daten werden unter Verwendung eines PC-Programms der Firma Elias ausgewertet. Nach Angaben der Firma ist der Assay auf eine 95% reine hPRL-Präparation eingestellt, wobei 1ng hPRL/ml 33 µIU/ml entspricht. Die Intraassayvariation liegt bei 3,8 - 6,0% und die Interassayvariation bei 4,4 - 7,7% über den Meßbereich. Der Normalbereich dieses Testes beträgt:

für Männer: 1 - 15ng/ml

für Frauen (nicht schwanger): 2 - 20ng/ml

3.1.1.2.2 Immunradiometrischer Assay (IRMA)

24 der insgesamt 106 Prolaktinwerte der Patienten mit SLE wurden aufgrund einer Umstellung des Verfahrens zur Prolaktinbestimmung mit Hilfe eines IRMAs ermittelt.

Auch im Laufe dieses Testes kommt es zur Bildung eines Sandwich-Komplexes (siehe Abb. 7 ). Der Komplex besteht aus Prolaktin und drei monoklonalen Antikörpern. Diese besitzen eine hohe Affinität und Spezifität für das Hormon. Zwei der drei Antikörper sind radioaktiv markiert (125I). Der dritte ist an Biotin gekoppelt. Die Antikörper richten sich gegen drei unterschiedliche Epitope.

Zur Formation dieses zunächst löslichen Sandwich-Komplexes werden im ersten Schritt jeweils 50µl Serum und 200µl Antikörperlösung in die Reaktions-Röhrchen pipettiert.

Nach guter Vermischung beider Lösungen wird eine feste Phase zur Bindung des


33

Sandwich-Komplexes in Form einer Avidin-beschichteten Plastikkugel in jedes Röhrchen eingebracht. Es kommt zu einer hoch affinen und spezifischen Bindung zwischen Biotin und Avidin.

Die Röhrchen werden für 90min auf einem horizontalen Rotationsschüttler bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend werden die ungebundenen Komponenten durch zweimaliges Waschen entfernt.

Schließlich wird die Radioaktivität jedes Röhrchens mit dem automatischen Gammacounter (GammaMaster 1277, Pharmacia Wallac, Freiburg) gemessen. Die Auswertung erfolgte mit dem Ria Calc Programm der Firma Pharmacia.

Die Intraassayvariation lag bei 3,5 - 4,6% und die Interassayvariation bei 6,7 - 8,0% über den Meßbereich. Der Normalbereich dieses Testes ist mit dem des unter 3.1.2.1. angegebenen Verfahrens nahezu identisch.

für Männer: 1 - 15ng/ml

für Frauen (nicht schwanger): 2 - 23ng/ml

Abb. 7: Verfahren zur Prolaktinbestimmung

links: IRMA, a/b = Komplex aus Avidin und Biotin an der festen Phase in Verbindung mit dem Sandwich-Komplex bestehend aus einem PRL-Molekül (P), zwei 125 I-markierten PRL-Antikörpern (AB*) und einem weiteren PRL-Antikörper (AB)
rechts: ELISA mit an der Pinplatte haftendem Sandwich-Komplex bestehend aus einem PRL-Molekül (P) und zwei gegen verschiedene Epitope gerichtete PRL-Antikörper (AB), von denen einer enzymmarkiert ist (E)


34

3.1.1.3 Ermittlung des Aktivitätsindex bei SLE

Zur Einschätzung der Krankheitsaktivität der SLE-Patienten kam der ECLAM-Score (European Consensus Lupus Activity Measurement score) ( 200 ) zur Anwendung. In diesen Score gehen sowohl die vorliegenden klinischen Manifestationen als auch Aussagen über die Blutsenkungsgeschwindigkeit und das Vorliegen eines Komplementverbrauches ein. Eine Übersicht der bei den Patienten vorliegenden SLE-Manifestationen bietet Tab. 10 .

3.1.1.4 Bestimmung verschiedener Autoantikörper

Parallel zur Bestimmung der Serumprolaktinwerte erfolgte eine Untersuchung der Patientenseren auf das Vorhandensein verschiedener Autoantikörper. Dieses geschah im Rahmen der Routine-Diagnostik im Rheumatologischen Labor der Charité. Es kamen folgende Verfahren zum Einsatz:

  1. ANA: indirekte Immunfluoreszenz auf Hep-2-Zellen (im Rahmen der Routine-Diagnostik der Klinik für Rheumatologie und klinische Immunologie der Charité)
  2. Anti-dsDNA: ELISA (IgG) (im Rahmen der Routine-Diagnostik der Klinik für Rheumatologie und klinische Immunologie der Charité) Chrithidia lucilliae-Immunofluoreszenz (bei Patienten mit entsprechend hoher Anti-dsDNA-Antikörperkonzentration)
  3. Anti-Cardiolipin-Antikörper (IgG,IgM): ELISA (Imtec Immundiagnostic GmbH, Berlin)
  4. Zirkulierende Immunkomplexe (IgG-haltig): ELISA (Imtec Immundiagnostic GmbH, Berlin)

Als pathologisch wurden dabei gewertet:

  1. ANA > 1:80;
  2. Anti-dsDNA > 5,97 U/ml;
  3. Antikörper gegen Crithidien-DNS ab einem Titer von 1:2;

    35

  4. Anti-Cardiolipin-Antikörper(IgG) > 48 U/ml;
  5. Anti-Cardiolipin-Antikörper (IgM) > 44 U/ml;
  6. zirkulierende Immunkomplexe > 55 µg/ml.

Tab. 10: Krankheitsmanifestationen der SLE-Patienten

SLE - Manifestation

Anzahl der betroffenen Patienten

Prozentualer Anteil (%)

allgemeine Krankheitszeichen (Fieber/Müdigkeit)

24

40

Gelenkmanifestationen

22

37

Aktive Haut- und Schleimhautmanifestationen

23

38

Myositis

0

0

Perikarditis

1

2

Intestinale Manifestationen

0

0

Lungenmanifestationen

7

12

Neuropsychiatrische Manifestationen

12

20

Renale Manifestationen

31

52

Renale Manifestationen *

12

20

Anämie

24

40

Leukopenie

18

30

Thrombopenie

4

7

Anämie + Leukopenie

11

18

BSG > 25 mm in der ersten h

39

65

C3 erniedrigt

34

57

C3 + C4 erniedrigt

19

32

BSG > 25 mm/h + C3 +C4 erniedrigt

15

25

* renale Manifestationen mit Proteinurie und Hämaturie und Verminderung der Kreatininclearance bzw. Erhöhung der Retentionsparameter (bis Krea=2mg/dl)

3.1.1.5 Statistische Methoden

Die statistischen Analysen erfolgten mit dem nicht-parametrischen U-Test nach Mann und Whitney (Vergleich der untersuchten Gruppen hinsichtlich ihrer Serumprolaktinwerte auch in Abhängigkeit von der Manifestationsform,


36

Krankheitsaktivität und Therapie des SLE und Vergleich der Krankheitsaktivität der SLE-Patienten mit und ohne erhöhte PRL-Werte), dem Chiquadrat - Test (Häufigkeit des Auftretens spezifischer SLE-Manifestationen bei Patienten mit erhöhten PRL-Werten). Eine statistische Wahrscheinlichkeit von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant gewertet. Für die Überprüfung des Vorhandenseins einer Korrelation (Autoantikörperkonzentration bzw. ECLAM-Score und Serumprolaktinwert) wurde der nicht parametrischer Test nach Spearman gewählt. Die Durchführung aller angeführten statistischen Tests erfolgte unter Zuhilfenahme der Software GraphPad Prism 2.01 für Windows 95.

3.1.2 Effekte von Prolaktin auf die PBMC

3.1.2.1 Charakterisierung der untersuchten Gruppen

3.1.2.1.1 SLE-Patienten

Bei 11 Patienten, der unter 3.1.1.1.1 beschriebenen Patienten mit systemischem Lupus erythematodes, wurde Blut (jeweils um 3ml bzw. 20ml Citratblut) für die Anfertigung von Zellkulturen entnommen. Mit einer Ausnahme handelt es sich dabei um Patienten, die sich wegen eines Schubes der Grunderkrankung bzw. im Rahmen eines festgelegten Therapieregimes stationär vorstellten. 3 der 11 Patienten waren männlich, 8 weiblich. Die Aktivität des SLE der einzelnen Patienten war verschieden zum Zeitpunkt der Blutentnahme. Zur Beschreibung dieser Aktivität kam der ECLAM-Score zum Einsatz (ECLAM: 1 - 10; mean ECLAM=5,18; SD=2,9). Alle für die Einschätzung der Krankheitsaktivität notwendigen Informationen stammen aus den Krankenunterlagen oder von den behandelnden Ärzten. Weiterhin wurden Aufzeichnungen über die immunsuppressive und sonstige medikamentöse Therapie der Patienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme angefertigt. Keiner der Patienten nahm Medikamente ein, die das Serumprolaktin beeinflussen könnten. 6 Patienten wurden mit einer Kombination von Cyclophosphamid und Prednison, 3 mit einer Prednison-Stoß-Therapie und einer mit Azathioprin behandelt. Ein Patient war zum Untersuchungszeitpunkt ohne Therapie. Die Prolaktinwerte der Patienten lagen zwischen 6,4 und 39,5ng/ml mit einem Mittelwert von 19,3ng/ml (SD=10,5). Bei 6 der 11 Patienten war das Serumprolaktin zum Zeitpunkt der Untersuchung erhöht.


37

Das Durchschnittsalter der Patienten betrug zum Zeitpunkt der Untersuchung 31,7 Jahre (SD=12,8).

3.1.2.1.2 Gesunde Kontrollgruppe

Diese Kontrollgruppe setzt sich aus 13 Blutspendern zusammen (7 weiblich, 6 männlich). Um hormonelle Einflüsse bei den weiblichen Spendern von vornherein auszuschließen, wurden nur Spenderinnen ausgewählt, die keine hormonellen Kontrazeptiva oder andere Hormonpräparate einnahmen. Von allen 13 Probanden wurden die Zellkulturen zur Zytokinproduktion auf die gleiche Art und Weise wie bei den SLE-Patienten hergestellt. Von 8 der 13 Gesunden (3 männlich, 5 weiblich) sind zusätzlich PBMC zur Untersuchung der Immunglobulin-G-Produktion isoliert worden. Das Durchschnittsalter dieser Gruppe (n=8) betrug 32,7 Jahre (SD=11,8).

3.1.2.2 Zellkulturen

3.1.2.2.1 Lymphozytenkultur zur Immunglobulinproduktion

Zur Gewinnung der Lymphozyten wurden entweder Vollblut (Patienten) oder Buffy coats (Kontrollgruppe) verwendet. Die Blutproben der SLE-Patienten (Citratzusatz zur Gerinnungshemmung) wurden morgens entnommen und unverzüglich weiterverarbeitet. Sowohl die PBMC der Blutspender als auch die der Patienten wurden nach Überschichten von Ficoll (seromed, Berlin) mit dem Blut bzw. 1:2 verdünnten Buffy coats (PBS (seromed, Berlin)) mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert ( 201 ). Der durch die Zentrifugation entstandene Lymphozytenring (PBMC) wurde mit Hilfe einer Saugpipette abgenommen. Aus der so gewonnenen Lymphozytensuspension wurden die noch enthaltenen Serumimmunglobuline und Thrombozyten durch dreimaliges Waschen in PBS entfernt. Die PBMC wurden resuspendiert, ausgezählt und mit Kulturmedium (RPMI 1640, versetzt mit 5% FKS und Streptomycin/Penicillin, 10U/ml, alles seromed, Berlin) und den in RPMI 1640 gelösten Stimulationszusätzen PRL (Endkonzentration = 20 und 100ng/ml) bzw. LPS (Endkonzentration = 2pg/ml) so verdünnt, daß sie am Ende in einer


38

Endkonzentration von 1x106 Zellen/ml in der Kultur vorlagen. Die Zellkulturen mit den unterschiedlichen Zusätzen zur Stimulation wurden auf eine 96er Rundboden-Mikrotiterplatte (Greiner Labortechnik) zu je 200µl/Well aufgebracht und über 7 Tage bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

Im Verlauf der Untersuchungen fand aufgrund des hohen Endotoxingehaltes des anfangs verwendeten Prolaktins (human; Paesel+Lorei GmbH & Co-Hanau) (1,1EU/µg, bestimmt mittels Limulus Amoebocyte Lysate, BIO WHITTAKER) der Wechsel zu einem rekombinanten humanen Prolaktin (genzyme diagnostics, Cambridge, USA) statt. Für das rekombinante PRL ist vom Hersteller ein Endotoxingehalt von 0,02ng/µg angegeben worden. Die spezifische Aktivität des Prolaktins ist von den Herstellern durch unterschiedliche Verfahren bestimmt worden und deshalb nicht direkt vergleichbar:

PRL (Paesel+Lorei): 20 IU/mg bestimmt durch einen RIA

R-PRL (genzyme): 5*106 U/mg bestimmt durch den Nb2-Proliferations-Assay

Die Zellen von 4 Patienten und 6 Gesunden wurden mit dem PRL (Paesel+Lorei), die übrigen mit dem r-PRL (genzyme) stimuliert. In der IgG-Produktion unterschieden sich diese beiden Gruppen nicht voneinander.

Die nach der Inkubation abpipettierten Zellkulturüberstände wurden bei -20°C aufbewahrt und anschließend der IgG-Messung mittels ELISA zugeführt.

3.1.2.2.2 Zellkultur zur Zytokinproduktion

Die von den Patienten und Blutspendern gewonnenen Blutproben wurden mit Citratzusatz abgenommen und sofort weiterverarbeitet. Zu den Vollblutproben von je 20µl wurden je 180µl Kulturmedium mit Prolaktin (Paesel+Lorei) zugesetzt. Die Endkonzentration des Prolaktins betrug 20 und 100ng/ml. Als Positivkontrolle fungierte LPS (Sigma) in einer Endkonzentration von 2-100pg/ml.

Im Laufe der Untersuchungen wurde dann aufgrund des Vedachtes einer Kontamination des verwendeten Prolaktins durch Endotoxin sowohl den PRL- als auch den LPS- stimulierten Zellen der monoklonale Monozytenantikörper Anti-CD14 (big 14 biometec, Greifswald) in einer Konzentration von 50µg/ml zugesetzt.


39

Nach 24 stündiger Inkubation (37°C, 5%CO2) wurden alle Überstände abpipettiert und bis zur Zytokinmessung bei -70°C aufbewahrt.

3.1.2.3 Messungen

3.1.2.3.1 IgG-Bestimmung in den Kulturüberständen

Bei der Quantifizierung des Gesamt-IgG kam der „Human IgG SURALISA“ (Seramun Diagnostika GmbH-Dolgenbrot) zur Anwendung. Bei diesem 1-Schritt ELISA, liegt folgendes Testprinzip zugrunde: Das an die Festphase gebundene Anti-Human-IgG (isotypenspezifischer hoch-affiner polyklonaler Antikörper vom Schaf) kommt mit den Zellüberständen und dem Konjugat (POD-gekoppeltes Anti-IgG) zur Reaktion. Nach fünfmaligem Waschen und darauffolgender Substratzugabe (Tetrabenzylbenzidin und Wasserstoff-peroxid) wird die Reaktion mit Schwefelsäure gestoppt und der Test mit der Extinktionsmessung bei einer Wellenlänge von 450nm abgeschlossen. Die Zellüberstände (50µl) werden 1:10 (Patienten) bzw. 1:5 (Blutspender) verdünnt und danach zusammen mit dem Konjugat (Anti-human IgG-POD; 50µl; Verdünnung 1:100) auf die vorher einmalig gewaschenen Mikrowell-Streifen aufgetragen und dann für 20min bei 20°C inkubiert. Nach wiederholtem Waschen werden dann 100µl gebrauchsfertige Substratlösung/Well hinzugegeben und eine Substratreaktion von 10min (bei 20°C, im Dunkeln) angeschlossen. Die Reaktion wird dann durch den Zusatz von 1M Schwefelsäure zum Stillstand gebracht und die Messung, wie oben beschrieben, angeschlossen. Anhand der hergestellten Standard-Verdünnungsreihe kann eine Standardkurve ermittelt werden, mit deren Hilfe die Berechnung der einzelnen absoluten Werte erfolgt.

Der bestimmte Kontrollwert lag in den vom Hersteller angegebenen Grenzen.

3.1.2.3.2 Zytokinbestimmung

Die Zytokine IL-1beta, IL-6 und TNF-alpha in den Vollblutüberständen wurden mittels kommerzieller ELISAs (human IL-1beta Immunoassay und human IL-6 Immunoassay, QuantikineTM R&D Systems,TNF-alpha EASIATM, Medgenix


40

Diagnostics, Fleurus, Belgien) in der Abteilung für Klinische Immunologie der Charité bestimmt. Alle verwendeten Assays sind laut Hersteller nur für Forschungszwecke zugelassen. Zur Eingrenzung der Zahl der Zytokine, welche hinsichtlich der Einflußnahmen von PRL auf ihre Produktion von Intresse sein könnten, wurden anfänglich weitere Zytokine (IFN-gamma, IL-10, IL-1RA und IL-4) mittels kommerzieller ELISAs bestimmt (IFN-gamma EASIATM - Medgenix Diagnostics, Human IL-10 ELISA - Biosource international, Human IL-1RA-Immunoassay QuantikineTM - R&D Systems, IL-4 ELISA US - Laboserv).

Prinzip:

Die an der Mikrotiterplatte haftenden monoklonalen Anti-Zytokin-Antikörper bilden mit den in den zwei darauffolgenden Arbeitsschritten zugegebenen Zytokinen (enthalten in Standards und Proben) und den enzymmarkierten polyklonalen Anti-Zytokin-Antikörpern des Konjugates sogenannte Sandwich-Komplexe. Die nach abgeschlossener Inkubation nicht gebundenen Anteile werden durch interponierte Waschschritte eliminiert. Die am Ende gebundene Enzymmenge und deren zur Farbentwicklung führender Substratumsatz stehen in direktem Zusammenhang mit der Zytokinkonzentration der Proben.

Im TNF-alpha-Immunoassay kam eine Mischung verschiedener monoklonaler Anti-TNF-alpha-Antikörper, gerichtet gegen unterschiedliche Epitope des TNF-alpha-Moleküls, zum Einsatz. Auf diese Weise wurde eine Hyperspezifität des Testes vermieden und gleichzeitig die Sensitivität erhöht.

3.1.2.3.2.1 IL-6

Die Proben wurden abhängig vom erwarteten IL-6-Gehalt 1:10 bzw. 1:20 verdünnt und als Doppelwerte bestimmt.

Durchführung:

  1. 100µl Verdünnungspuffer (RD1A) und 100µl Standard bzw. vorverdünnte Probe/Kavität (2h bei Raumtemperatur inkubiert und 4 mal gewaschen)

    41

  2. 200µl IL-6-Konjugat/Kavität (2h bei Raumtemperatur inkubiert und 4 mal gewaschen)
  3. 200µl Substratlösung/Kavität (20min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit 2N Schwefelsäure gestoppt)
  4. innerhalb von 30min Messung der Extinktion am Spektrophotometer (anthos labtec instruments) bei 450 nm Wellenlänge

Es wurde eine Eichkurve aus 6 Werten (Doppelwertbestimmung) erstellt. Als Standard wurde in diesem Assay rekombinantes IL-6 eingesetzt. Laut Hersteller liegt die Intraassayvariation bei 1,7 - 4,4% und die Interassayvariation bei 1,9 - 3,6%.

3.1.2.3.2.1 IL-1beta

Die Proben wurden abhängig vom erwarteten IL-1beta-Gehalt in einer Verdünnung von 1:2 oder unverdünnt als Doppelwerte gemessen.

Durchführung:

  1. 200µl verdünnter Standard oder Probe/Kavität (2h bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal gewaschen)
  2. 200µl IL-1beta-Konjugat/Kavität (1h bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal gewaschen)
  3. 200ml Substratlösung/Kavität (20min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit 2N Schwefelsäure gestoppt)
  4. innerhalb von 30min Messung der Extinktion am Spektrophotometer (anthos labtec instruments) bei 450nm Wellenlänge

Es wurde eine Eichkurve aus 7 Werten (Doppelwertbestimmung) erstellt. Als Standard wurde „mature“ (biologisch aktives) IL-1beta verwendet. Aus diesem Grunde ist es möglich, daß das nicht prozessierte IL-1beta-Molekül, welches auch in den Proben enthalten sein kann, nicht erkannt wird. Da diese Form quantitativ jedoch nicht dominiert und außerdem biologisch inaktiv ist, stellt der Immunoassay eine zufriedenstellende Meßmethode für IL-1beta dar. Die Intraassayvariation ist vom Hersteller mit 2,3 - 3,4% angegeben. Die Interassayvariation liegt bei 3,4 - 7,1%.


42

3.1.2.3.2.1 TNF-alpha

Die Proben wurden 1:2 verdünnt als Doppelwerte gemessen.

Durchführung:

  1. 50µl Inkubationspuffer und 200µl vorverdünnte Probe/Standard pro Kavität (2h Inkubation bei Raumtemperatur und dreimaliges Waschen)
  2. 100µl Verdünnungspuffer und 50µl TNF-alpha-Konjugat /Kavität (2h Inkubation bei Raumtemperatur und dreimaliges Waschen)
  3. 200µl Substratlösung/Kavität (30min Inkubation, anschließend mit 50µl 1,8N H2SO4 gestoppt)
  4. innerhalb von 3h Messung der Extinktion am Spektrophotometer (anthos labtec instruments) bei 450nm Wellenlänge

Es wurde eine Eichkurve aus sechs Werten (Doppelwertbestimmung) erstellt. Die Intraassayvariation liegt bei 3,7 - 5,2%, die Interassayvariation bei 8 - 9,9% über den Meßbereich.

3.1.2.4 Statistische Methoden

Zum Vergleich der Gesamt-IgG-Produktion der SLE Patienten im unstimulierten bzw. stimulierten Zustand kam der nicht parametrische Wilcoxon-Test mit Bonferroni-Adjustierung zum Einsatz. Die Bewertung der IgG-Konzentration von Patienten und Gesunden im Vergleich erfolgte mit Hilfe des nicht parametrischen U-Tests nach Mann und Whitney. Ein möglicherweise vorhandener Zusammenhang zwischen Aktivität des SLE und Stimulierbarkeit der PBMC durch PRL wurde unter Einsatz des nicht parametrischen Testes nach Spearman untersucht.


43

3.1.3 Untersuchung einer Gruppe von Prolaktinompatienten auf das Vorhandensein von klinischen oder serologischen Anzeichen für einen Autoimmunprozeß

3.1.3.1 Charakterisierung der zwei untersuchten Gruppen

3.1.3.1.1 Prolaktinompatienten

Die Gruppe der Prolaktinompatienten setzt sich aus 39 ambulanten Patienten der Endokrinologischen Sprechstunde der Medizinischen Klinik mit Schwerpunkt Gastroenterologie und Endokrinologie der Charité zusammen, die dort zwischen Oktober 1994 und Mai 1998 medizinisch betreut worden sind. 6 Patienten sind männlich, 33 weiblich. Das mittlere Alter der Patienten beträgt 44,5 (SD=12,8) Jahre (27 - 68 Jahre). Zum Zeitpunkt der Untersuchung lagen die PRL-Werte zwischen 0,5 und 1000ng/ml, 21 Patienten hatten einen erhöhten und 18 Patienten einen normalen PRL-Wert.

3.1.3.1.2 Gesunde Kontrollgruppe

Die Gruppe der Gesunden besteht aus 39 Blutspendern des Blutspendezentrums Berlin-Marzahn. Das Alter der Blutspender lag zwischen 19 und 64 mit einem mittleren Alter von 38,5 (SD=11,4) Jahren. Hinsichtlich der Geschlechterverteilung gab es keinen Unterschied zur Patienten-Gruppe.

3.1.3.2 Bestimmung der Autoantikörper

Das zur Autoantikörperbestimmung erforderliche Blut wurde in Serum-Monovetten (Sarstedt) entnommen. Das anschließend durch Zentrifugation gewonnene Serum wurde bei - 20°C bis zur Bestimmung der Autoantikörper gelagert.

3.1.3.2.1 Antinukleäre Antikörper

Für die Bestimmung der ANA mittels indirekter Immunfluoreszenz erfolgte zunächst die Verdünnung der Seren (1:80) mit PBS (pH: 7,2). Je nach der Konzentration, der in den Seren enthaltenen ANA, wurden ggf. weitere


44

Verdünnungen nötig (1:160 - 1:10240). Anschließend erfolgte das Auftragen der verdünnten Seren und einer Positiv- und Negativkontrolle/Objektträger. Verwendet wurden mit Hep-2-Zellen beschichtete Objektträger (Bios GmbH, Gräfelfing). Nach Inkubation der Objektträger über 30min in der feuchten Kammer bei Raumtemperatur wurden diese abgespült und für 10min in ein Bad aus Spühllösung (PBS) gestellt. Dieser Vorgang des Waschens wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Danach erfolgte das Aufbringen des FITC-markierten Konjugates (Anti-Human IgGAM, The binding site, Birmingham, UK) und eine erneute Inkubation in der feuchten Kammer (30min) mit anschließendem Waschen (siehe oben), unter Vermeidung direkter Lichteinwirkung. Zur Konservierung der Präparate wurde mit PBS versetztes Glycerol (1:5) aufgetragen und der Objektträger mit einem Deckplättchen versiegelt. Die Auswertung erfolgte am Fluoreszenzmikroskop (Olympus AX70 PROVIS).

3.1.3.2.2 Anti-dsDNA-Antikörper

Die Bestimmung der Anti-dsDNA-Antikörper bei den Prolaktinompatienten wurde im Routine-Labor der Klinik für Rheumatologie und klinische Immunologie, vergleichbar mit der normalerweise bei SLE-Patienten vorgenommenen Bestimmung, durchgeführt (siehe 3.1.1.4).

3.1.3.2.3 Immunoblot

Die Hälfte der Seren der Prolaktinompatienten wurden im Immunoblot als Referenzmethode der Differenzierung der ANA untersucht. Dabei wurde in Anlehnung an vorausgegangene Untersuchungen MOLT-4-Zellextrakte als Antigenquelle verwendet ( 202 ). Nach elektrophoretischer Auftrennung des MOLT-4-Zellextraktes im Polyacrylamid-Gel (15%ig) und anschließendem Westernblotting auf Nitrozellulose erfolgte eine 30-minütige Blockierung der Nitrozellulosestreifen mit 5%iger Trockenmilch in PBS (0,1% Tween) und anschließend das Auftragen der 1:100 verdünnten Patientenseren (200µl/Streifen). Nach 30-minütiger Inkubation bei RT wurden die Streifen 3 mal 5min gewaschen. Das an die Streifen gebundene IgG konnte anschließend durch POD-gekoppeltes Anti-human-IgG (Kaninchen, Imtec Immundiagnostic GmbH,


45

Berlin), (200µl/Streifen) und mittels Chemolumineszenz durch den Einsatz von ECL-Reagenz (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL), (200µl/Streifen) detektiert werden.

3.1.3.3 Statistische Methoden

Zum Vergleich der Häufigkeit des Auftretens bestimmter Autoantikörper und Symptome bei Prolaktinom-Patienten und Gesunden kam der Chiquadrat-Test (chi2 -Test) zum Einsatz. Eine statistische Wahrscheinlichkeit von p< 0,05 wurde als statistisch signifikant gewertet.


46

3.2 Ergebnisse

3.2.1 Verhalten der Serumprolaktinwerte bei SLE

3.2.1.1 Vergleich der Serumprolaktinwerte von SLE-Patienten und Gesunden

Im folgenden Abschnitt sind die Ergebnisse der Serumprolaktinwert-Bestimmung der SLE-Patienten und der unter identischen Bedingungen untersuchten Blutspender und Patienten mit anderen Kollagenosen bzw. Vaskulitiden dargestellt. In der Tab. 11 sind die Mittelwerte der Serumprolaktinomwerte der drei untersuchten Gruppen aufgeführt. In die Betrachtung geht die Zusammensetzung der Gruppen hinsichtlich Geschlecht und Alter der Patienten ein.

Tab. 11: Serumprolaktinwerte im Vergleich

Gruppe

SLE - Patienten

Gesunde

Pat.*

 

M

F*

F

G

M

F

G

G

n

8

13

39

60

17

30

47

18

Mittelwert - PRL

in ng/ml (SD)

12,79

(7,53)

12,63

(6,96)

19,99

(17,52)

17,43

(15,05)

5,52

(3,17)

6,71

(3,23)

6,28

(3,22)

13,12

(10,30)

SD=Standardabweichung, n=Anzahl, M = männlich, F = weiblich/prämenopausal, F* = weiblich/ postmenopausal, Pat.* = Patienten mit Vaskulitiden und Kollagenosen (nicht SLE)

Die Serumprolaktinwerte der SLE-Patienten unterschieden sich signifikant von denen der Gesunden (p < 0,0001). Gleiches trifft auch für die Prolaktinwerte der Patienten mit sonstigen Kollagenosen zu (p = 0,001). Zwischen den zwei Patientengruppen gibt es hinsichtlich der Prolaktinwerte jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,1727). Die Prolaktinwerte der SLE - Patienten lagen zwischen 3,1 und 89,5ng/ml mit einem Mittelwert von 17,43ng/ml (SD=15,05). 20 Patienten hatten einen erhöhten PRL-Wert (33,3%). Hier muß hinzugefügt werden, daß die PRL-Werte postmenopausaler Frauen bereits ab >15ng/ml als erhöht eingestuft wurden (siehe unter 1.2.5 ) ( 76 , 77 ). Drei der Patienten mit erhöhten PRL-Werten waren männlich. Die PRL-Werte der postmenopausalen weiblichen und der männlichen Patienten unterschieden sich nicht wesentlich voneinander (MW=12,79ng/ml (SD=7,53) und 12,63ng/ml (SD=6,96)). Deshalb bot es sich an, diese Patienten für die folgende Betrachtung


47

hinsichlich der Krankheitsaktivität zusammenzufassen. Die Prolaktinwerte der Patientinnen im gebärfähigen Alter lagen höher (MW=19,99ng/ml (SD=17,52)). Die Krankheitsaktivität in den unterschiedlichen Gruppen war zwar vergleichbar (ECLAM-MW=4,38 (SD=3,01) vs. 4,90 (SD=2,82)), lag aber bei den Patientinnen im gebärfähigen Alter durchschnittlich höher.

Die Prolaktinwerte der Patienten mit verschiedenen Kollagenosen und Vaskulitiden lagen zwischen 3 und 44,2ng/ml mit einem Mittelwert von 13,12ng/ml (SD=10,30). In dieser Gruppe hatten 2 Patienten erhöhte PRL-Werte (beide weiblich). Keiner der Blutspender hatte einen erhöhten PRL-Wert. Alle Werte lagen in der Blutspender-Gruppe zwischen 1,90 und 16,40ng/dl mit einem Mittelwert von 6,28ng/ml (SD=3,22). Die Ergebnisse sind in Abb. 8 dargestellt.

Abb. 8:Prolaktinwerte im Vergleich

K.= Kollagenosen

3.2.1.2 Zusammenhang zwischen der Krankheitsaktivität und der Höhe der Serumprolaktinwerte der SLE-Patienten

Es konnte ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Krankheitsaktivität, ausgedrückt durch den ECLAM-Score und den Serumprolaktinwerten der SLE - Patienten nachgewiesen werden (nicht-parametrischer Test (Spearman);r = 0,5445; p<0,0001). Zur Veranschaulichung dient Abb. 9 .

Nach Einteilung der 60 untersuchten SLE-Patienten, hinsichtlich der Höhe der Krankheitsaktivität (ECLAM>4 und ECLAM le4), ergaben sich zwei gleich große


48

Gruppen mit unterschiedlich hohen PRL-Werten (nicht parametrischer U-test nach Mann und Whitney; p = 0,003) ( Abb. 10 ). Der Mittelwert der PRL-Serumkonzentration der Patienten mit hoher Krankheitsaktivität liegt bei 22,06ng/ml (SD=18,16), der Mittelwert der Patienten mit weniger stark ausgeprägter Aktivität bei 12,82ng/ml (SD=9,35).

Abb. 9: Zusammenhang zwischen der Krankheitsaktivität und dem PRL-Wert

Abb. 10: Verteilung der PRL-Werte in zwei Gruppen mit niedriger (ECLAMle4) und hoher Krankheitsaktivität (ECLAM>4)

Bildet man jeweils eine Gruppe mit normalen und erhöhten Serumprolaktinwerten und betrachtet deren durchschnittliche Krankheitsaktivität, so stellt man ebenfalls


49

einen signifikanten Unterschied fest. Nach der Zuordnung von 4 PRL-Werten postmenopausaler Frauen zwischen 18 und 19,8ng/ml (siehe Festlegung S.47) zur Gruppe mit erhöhten PRL-Werten, ergibt sich folgendes:

Der Mittelwert der Krankheitsaktivität liegt in der Gruppe mit erhöhtem PRL (n=20) bei 6,80 (SD=2,78) und in der Gruppe mit normalem PRL (n=40) bei 3,82 (SD=2,43), (nicht-parametrischer U-Test nach Mann und Whitney; p=0,0005).

Es besteht also ein statistisch signifikannter Unterschied in der Krankheitsaktivität der zwei Gruppen. Dies gillt auch für den Fall der Zuordnung der oben erwähnten vier Werte zur Gruppe der Patienten mit normalen PRL-Werten (p=0,0073). Genauere Informationen zur Verteilung der Werte bietet Abb. 11 .

Abb. 11: Verteilung der Krankheitsaktivität bei SLE-Patienten mit normalen und erhöhten PRL-Werten

3.2.1.3 Zusammenhang zwischen der Art der SLE-Manifestation und der Höhe des Serumprolaktins

Zunächst wurde untersucht, ob es Unterschiede in der Häufigkeit des Auftretens einzelner SLE-Manifestationen bei Patienten mit normalen bzw. erhöhten Prolaktinwerten gibt. Es ist festzustellen, daß die Häufigkeit jeder hier untersuchten SLE-Manifestation, mit Ausnahme der Thrombozytopenie und der Leukopenie, bei Patienten mit erhöhtem PRL-Werten höher ist als bei den übrigen Patienten. Die Unterschiede sind jedoch nicht statistisch signifikant (chi2-Test; p


50

zwischen 0,0987 und 0,9979). Einen genauen Überblick über die Häufigkeit der unterschiedlichen SLE-Manifestationen bei hyper- und normoprolaktinämischen SLE-Patienten bietet Tab. 12 .

Tab. 12: Häufigkeit bestimmter Krankheitsmanifestationen bei SLE-Patienten mit erhöhten bzw. normalen PRL-Werten

SLE - Manifestation

PRL erhöht

PRL normal

p

n

%

N

%

chi2-Test

allgemeine Krankheitszeichen

13

65

11

27,5

0,0987

Gelenkmanifestationen

9

45

13

32,5

0,925

Aktive Haut- und Schleimhautmanifestationen

10

50

13

32,5

0,7857

Perikarditis

1

5

0

0

0,7295

Lungenmanifestationen

4

20

3

7,5

0,7318

Neuropsychiatrische Manifestationen

6

30

6

15

0,7587

Renale Manifestationen

15

75

17

42,5

0,2261

Renale Manifestationen *

8

40

10

25

0,1117

Anämie

12

60

11

27,5

0,2023

Leukopenie

8

40

10

25

0,8392

Thrombopenie

1

5

3

7,5

0,9979

Anämie + Leukopenie

6

30

5

12,5

0,6045

BSG > 25 mm in der ersten h

16

80

23

57,5

0,5634

C3 erniedrigt

14

70

20

50

0,7042

C3 + C4 erniedrigt

7

35

12

30

0,9972

BSG > 25 mm/h + C3 +C4 erniedrigt

7

35

8

20

0,8088

N = Anzahl, % = prozentualer Anteil, renale Manifestationen*: mit Proteinurie und Hämaturie und Verminderung der Kreatininclearance bzw. Erhöhung der Retentionsparameter

Anschließend erfolgte die Einteilung der SLE-Patienten nach dem Merkmal des Vorhandenseins bzw. Nichtvorhandenseins der untersuchten Krankheits-manifestationen in zwei Gruppen, deren PRL-Werte dann miteinander verglichen werden konnten. Wie aus Tab. 13 hervorgeht, lag der Mittelwert der PRL-Werte der Patienten mit den jeweils untersuchten SLE-Manifestationen (Thrombozyto- und Leukopenie ausgenommen) höher als der der Patienten ohne die untersuchten SLE-Manifestationen. Signifikante Unterschiede waren hier bei


51

Patienten mit bzw. ohne allgemeine Krankheitszeichen (Fieber und Müdigkeit) (p=0,0056), renale Manifestationen (p=0,0447), Anämie (p=0,0135), erhöhte Blutsenkungsgeschwindigkeit (>25mm/h) (p=0,0181) und Komplementverbrauch (p=0,0091) zu finden (nicht-parametrischer U-test nach Mann und Whitney). Am deutlichsten war der Unterschied zwischen den PRL-Werten der Patienten mit aktiver Lupusnephritis (Proteinurie von >0,5g/d, Hämaturie, verminderte Kreatininclearance, erhöhten Retentionswerten bis Krea=2mg/dl) und der Patienten ohne diese Manifestation (p=0,005).

Tab. 13: Mittelwerte der Serumprolaktinwerte der SLE Patienten mit bzw. ohne bestimmte Krankheitsmanifestationen

SLE - Manifestation mit

ohne

P (Mann- Whitney)

PRL-Mittelwert (SD) n

PRL-Mittelwert (SD)

n

Allgemeine Krankheitszeichen

23,44 (19,72)

24

13,43 (9,223)

36

0,0056 **

Gelenkmanifestationen

21,05 (20,57)

22

15,35 (10,42)

38

0,2661 ns

Aktive Haut- u.Schleimhautmanif.

19,79 (17,79)

23

15,97 (13,11)

37

0,2737 ns

Perikarditis

27,91 (28,76)

1

16,05 (12,03)

59

n.u.

Lungenmanifestationen

30,3 (0)

7

17,22 (15,08)

53

n.u.

Neuropsychiatrische Manif.

20,17 (10,41)

11

16,75 (16,02)

49

0,0891 ns

Renale Manifestationen

20,14 (16,31)

31

14,34 (13,08)

29

0,0447 *

Renale Manifestationen *

22,81 (9,256)

12

16,09 (15,97)

48

0,005 **

Anämie

22,63 (19,60)

24

14,21 (10,41)

36

0,0135 *

Leukopenie

17,22 (7,358)

18

17,53 (17,42)

42

0,1357 ns

Thrombopenie

12,4 (5,083)

4

17,79 (15,48)

56

n.u.

Anämie + Leukopenie

18,23 (6,102)

11

17,26 (16,45)

49

0,0928 ns

BSG > 25 mm in der ersten h

20,38 (17,35)

39

11,96 (6,918)

21

0,0181 *

C3 erniedrigt

21,41 (17,99)

34

12,23 (7,587)

26

0,0091 **

C3/C4 erniedrigt

23,96 (22,14)

19

14,41 (9,155)

41

0,0608 ns

BSG > 25 mm/h/C3/C4 erniedrigt

27,44 (23,78)

15

14,1 (8,845)

45

0,0113 *

Renale Manifestationen* = Proteinurie, Hämaturie und Verminderung der Kreatininclearance bzw. Erhöhung der Retentionsparameter


52

3.2.1.4 Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Autoantikörpern, deren Konzentration und den Serumprolaktinwerten

3.2.1.4.1 Anti-dsDNA-Antikörper

Zwischen der Höhe der mittels ELISA bestimmten Antikörper (IgG) gegen Doppelstrang-DNA und dem Serumprolaktin der SLE-Patienten besteht ein statistisch signifikanter Zusammenhang (nicht-parametrischer Test (Spearman); r=0,2685; p=0,0381). Für die Patienten, bei denen auch Anti-dsDNA-Antikörper mittels Crithidien-Immunfluoreszenztest untersucht worden sind, wird ebenfalls ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Höhe des ermittelten Titers und dem Serumprolaktin deutlich (r=0,5184; p=0,0017). Die Ergebnisse sind in Abb. 12 . dargestellt.

Abb. 12: Zusammenhang zwischen dem Auftreten von DNS-Antkörpern und dem Serumprolaktin bei SLE-Patienten

links: Anti-dsDNA-Konzentration (IgG) gemessen durch einen ELISA
rechts: Anti-DNS-Antikörper-Titer - bestimmt mittels Crithidia-lucilliae-Immunofluoreszenz

3.2.1.4.2 Anti-Cardiolipin-Antikörper

Sowohl die Anti-Cardiolipin-Antikörper vom IgG-Typ als auch vom IgM-Typ wurden bei einem Teil der Patienten bestimmt. Sie korrelierten positiv mit den Serumprolaktinwerten. Für Antikörper vom IgG-Typ ist dieser Zusammenhang statistisch signifikant (nicht-parametrischer Test (Spearman); r=0,3192; p=0,0326), für Antikörper vom IgM-Typ hingegen nicht (r=0,2872; p=0,0619). Die Darstellung dieser Ergebnisse erfolgte in Abb. 13 .


53

Abb. 13: Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Anti-Cardiolipin-Antikörpern (ACL-AK) (links IgG, rechts IgM) und den Serumprolaktinwerten der SLE-Patienten

3.2.1.4.3 Zirkulierende Immunkomplexe

Die Konzentration der zirkulierenden Immunkomplexe und die des Serumprolaktins sind bei den SLE-Patienten positiv korreliert, es besteht jedoch kein statistisch signifikannter Zusammenhang (nicht-parametrischer Test (Spearman); r=0,09881; p=0,5185).

3.2.1.5 Zusammenhang zwischen der immunsuppressiven Therapie der SLE-Patienten und den Serumprolaktinwerten

In die Betrachtung ( Tab. 14 ) gehen fünf unterschiedliche Gruppen ein, wobei ein Patient aufgrund einer Kombinationstherapie mit zwei Medikamenten in zwei Gruppen vertreten sein kann. Die Mittelwerte der Patienten ohne bzw. mit weniger intensiver Therapie (Azathioprin) (n=25) liegen signifikant niedriger als die der Patienten unter Prednison- und Cyclophosphamidtherapie (n=19) (nicht-parametrischer U-test nach Mann und Whitney; p=0,001) (siehe Abb. 14 und Tab. 14 .).


54

Abb. 14: Verteilung der PRL-Werte in den Patientengruppen ohne Therapie und mit Therapie mit den Mittelwerten

Tab. 14: Prolaktinmittelwerte (MW-PRL) in ng/ml in Abhängigkeit von der Therapie der SLE-Patienen

 

 

männlich

weiblich/post- menopausal

weiblich/prä- menopausal

gesamt

ohne Therapie

MW-PRL (SD) n

11 (0)

1

12,25 (9,12)

2

11,16 (2,17)

5

11,41 (3,86)

8

Azathioprin

MW-PRL (SD) n

8,20 (4,42)

3

12,65 (2,62)

2

17,94 (22,83)

12

15,60 (19,40)

17

Cyclo-phosphamid

MW-PRL (SD) n

6,4 (0)

1

20,63 (4,14)

3

26,41 (17,07)

15

24,44 (15,8)

19

Prednison

MW-PRL (SD) n

10,58 (5,28)

6

13,12 (7,31)

10

21,66 (18,43)

32

18,49 (16,07)

48

Prenison-Bolus

MW-PRL (SD) n

27,8 (0)

1

0

18,75 (21,99)

2

21,77 (16,4)

3

3.2.1.6 Verlaufsbeobachtung von SLE-Patienten hinsichtlich Krankheitsaktivität, Anti-dsDNA-Antikörper-Titer und Serumprolaktin

Um zu untersuchen, ob im Krankheitsverlauf Schwankungen der Aktivität mit gleichsinnigen Veränderungen des Serumprolaktins einhergehen, wurde bei ca. 50% der Patienten die Prolaktinbestimmung zu einem, zwei bzw. drei späteren


55

Zeitpunkten wiederholt. Zur Einschätzung der Krankheitsaktivität wurden jeweils der ECLAM-Score und die Anti-dsDNA-Antikörper-Konzentration (IgG) verwendet. In Abb. 15 a/b sind Veränderungen dieser Parameter und des Serumprolaktins im Krankheitsverlauf von 10 SLE-Patienten (2 männlich, 8 weiblich) dargestellt. Kriterium für die Auswahl dieser 10 Patienten war eine unterschiedlich hohe Krankheitsaktivität zu den einzelnen Untersuchungszeitpunkten. Der Mittelwert der Serumprolaktinwerte der Patienten beträgt 17,49ng/ml (SD=7,32) und die mittlere Krankheitsaktivität liegt bei ECLAM=6,81 (SD=2,42).

Abb. 15a: Verläufe der Anti-dsDNA-Antikörper (_._._), Serumprolaktinwerte (.....), und der Krankheitsaktivität (ECLAM: _____) von 10 SLE-Patienten mit schwankender Krankheitsaktivität


56

Abb. 15b: Verläufe der Anti-dsDNA-Antikörper (_._._), Serumprolaktinwerte (.....), und der Krankheitsaktivität (ECLAM: __) von 10 SLE-Patienten mit schwankender Krankheitsaktivität

Wie anhand von Abb. 15 a/b erkennbar, zeigte sich bei 9 der 10 untersuchten SLE-Patienten, daß sich das Serumprolaktin ähnlich den Anti-dsDNA-Antikörpern, abhängig von der Krankheitsaktivität veränderte. Diese neun Patienten wiesen einen mehrjährigen Krankheitsverlauf auf. Bei Patient Nr.10 hingegen, handelt es sich um einen ca. 4 Wochen vor der ersten Bestimmung diagnostizierten SLE mit hämatologischer und renaler Manifestation. Bei diesem Patienten zeigte sich das Serumprolaktin erst nach ca. 6 Monaten, ungeachtet der zu diesem Zeitpunkt schon rückläufigen Krankheitsaktivität, als deutlich erhöht (27,8ng/ml) und lag auch nach 8 Monaten, bei weiterhin abnehmender Krankheitsaktivität, mit 20,3ng/ml noch deutlich über dem Normbereich. Es zeigte sich, daß 7 von 10 SLE-Patienten mit schwankender Krankheitsaktivität eine mäßige (7-20ng/ml) und 2 weitere eine geringfügige (ca.5ng/ml) Veränderung der Prolaktinkonzentration im Laufe der Untersuchungen aufwiesen. Diese war gleichsinnig zu den Veränderungen von Anti-ds-DNA-Antikörper-Konzentration und ECLAM-Score ausgerichtet. Bei Patient 10 hingegen erhöhte sich die


57

Serumprolaktinkonzentration unwesentlich (2,5ng/ml) bei fallendem ECLAM-Score.

Auch bei SLE-Patienten mit über den Untersuchungszeitraum konstantem Krankheitsaktivitätsindex (n=10, 8 weiblich, 2 männlich) lassen sich Schwankungen des Serumprolaktins feststellen. Diese sind jedoch im Unterschied zu denen, die bei den Patienten mit schwankender Krankheitsaktivität registriert wurden, in der Mehrzahl der Fälle (7 von 10) unwesentlich (<2,5ng/ml), in zwei Fällen geringfügig (ca. 5ng/ml) und nur in einem Fall mäßig (18ng/ml). Die Ergebnisse der Verlaufsbeobachtung von Serumprolaktinwerten, ECLAM-Score und Anti-dsDNA-Antikörperkonzentration bei Patienten mit über den Untersuchungszeitraum konstanter Krankheisaktivität sind in Abb. 16 a/b dargestellt.

Abb. 16a: Verläufe der Anti-dsDNA-Antikörper (_._._), Serumprolaktinwerte (.....), und der Krankheitsaktivität (ECLAM: _____) von 10 SLE-Patienten mit konstanter Krankheitsaktivität


58

Abb. 16b: Verläufe der Anti-dsDNA-Antikörper (_._._), Serumprolaktinwerte (.....), und der Krankheitsaktivität (ECLAM: __) von 10 SLE-Patienten mit konstanter Krankheitsaktivität

Der mittlere Krankheitsaktivitätsindex liegt bei diesen Patienten niedriger als bei den Patienten mit schwankender Krankheitsaktivität (ECLAM=2,86 (SD=1,46)). Ebenso verhält es sich mit dem Mittelwert der Serumprolaktinwerte (12,63ng/ml (SD=8,44)).


59

3.2.2 In-vitro-Effekte von Prolaktin auf PBMC

3.2.2.1 IgG-Produktion

Im folgenden Abschnitt sind die Ergebnisse der Stimulation von SLE- und normalen PBMC mit PRL dargestellt. Die IgG-Konzentration in den Zellkulturüberständen der SLE-PBMC war nach 7-tägiger Inkubation ohne Zusätze signifikant höher (Mittelwert=579,3ng/ml (SD=476,4)) als die der PBMC der Blutspender, welche unter der Nachweisgrenze (150ng/ml) lag (nicht-parametrischer U-Test nach Mann und Whitney, p<0,001). Nach Stimulation mit PRL in der noch physiologischen Konzentration von 20ng/ml kam es bei den SLE-PBMC zu einer Steigerung der IgG-Produktion (siehe Tab. 15 , und Abb. 17 ). Die mittlere IgG-Konzentration der Zellkulturüberstände lag für diesen Fall mit 1084ng/ml (SD=601,3) signifikant höher als die im unstimulierten Zustand (Wilcoxon - Test; p=0,001). Nach Inkubation mit PRL in der unphysiologisch hohen Konzentration von 100ng/ml lag die mittlere IgG-Konzentration der Zellkulturüberstände der SLE-PBMC mit 982,5ng/ml (SD=615,2) zwar signifikant höher als im unstimulierten Zustand (Wicoxon - Test; p=0,002), war jedoch niedriger als nach Stimulation mit PRL in physiologischer Konzentration. Dieser Unterschied ist statistisch signifikant (Wilcoxon-Test; p=0,042). Bei den PBMC der Gesunden kam es weder nach Stimulation mit PRL in der physiologischen noch in der unphysiologisch hohen Konzentration zur Steigerung der IgG-Produktion. Bis auf einen Fall lag die IgG-Konzentration der Zellüberstände stets unter der Nachweisgrenze. Ein Blutspender wies eine leichte Steigerung der IgG-Produktion nach Stimulation mit PRL auf (IgG-Konzentration=272 und 264ng/ml).

Tab. 15: mittlere IgG-Konzentrationen in den Zellüberständen von SLE-PBMC nach 7-tägiger Stimulation mit PRL und ohne Stimulation

 

IgG in ng/ml

Unstimuliert

+ PRL (20 ng/ml)

+PRL (100 ng/ml)

MW

SD

MW

SD

MW

SD

SLE-Patienten

579,3

476,4

1084

601,3

982,5

615,2

Gesunde

150,0

0

165,5

43,84

164,3

40,31


60

Abb. 17: IgG-Konzentration in den Zellüberständen von SLE-PBMC und normalen PBMC

(n=11) nach 7-tägiger Stimulation mit PRL in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (20 und 100ng/ml) und ohne Stimulation (0), mit Angabe SEM Signifikante Unterschiede wurden beobachtet zwischen der IgG-Produktion der PBMC der gesunden Kontrollen und der SLE-PBMC (spontan und nach Stimulation mit PRL) (U-Test nach Mann und Whitney; p<0,001) sowie zwischen der spontanen IgG-Produktion der SLE-PBMC und der IgG-Produktion nach Stimulation mit PRL (20 und 100ng/ml) (Wilcoxon-Test, Bonferroni-Adjustierung: p=0,043).

3.2.2.1.2 Abhängigkeit der durch PRL stimulierbaren IgG-Produktion der SLE-PBMC vom Prolaktinwert der Patienten

Nach Einteilung der Patienten in eine Gruppe mit erhöhtem und eine weitere Gruppe mit normalem Prolaktinwert zum Zeitpunkt der Blutentnahme, läßt sich feststellen, daß die Mittelwerte der IgG-Konzentrationen (unstimuliert, nach Stimulation mit PRL in physiologischer und unphysiologisch hoher Konzentration) in der erstgenannten Gruppe höher liegen als in der zweiten (siehe Tab. 16 ). Aufgrund der geringen Patientenzahl der beiden betrachteten Gruppen (n=6 bzw. 5) sind jedoch keine signifikanten Unterschiede ersichtlich.

Zwischen dem PRL-Wert und der durch PRL stimulierbaren bzw. spontanen IgG-Produktion der PBMC besteht kein statistisch signifikanter Zusammenhang (r=0,5727 und p=0,0655 für cPRL=20ng/ml; r=0,4182 und p=0,2006 für cPRL=100ng/ml und r=0,0636 und p=0,8525 ohne Stimulation; nicht parametrischer Test nach Spearman).


61

Tab. 16: Abhängigkeit der durch PRL stimulierbaren IgG-Produktion vom PRL-Wert der Patienten

 

Prolaktin erhöht

Prolaktin normal

n

6

5

MW-IgG (unstimuliert) in ng/ml

(SD)

687,7

(550,8)

449,2

(386,7)

MW-IgG (PRL 20 ng/ml) in ng/ml

(SD)

1375*

(561,9)

734,7*

(479,8)

MW-IgG (PRL 100 ng/ml) in ng/ml

(SD)

1226

(668)

690,3

(438,8)

*p=0,0519 (U-Test nach Mann und Whitney)

3.2.2.1.3 Zusammenhang zwischen der durch PRL stimulierten IgG-Produktion der SLE-PBMC und der Krankheitsaktivität

Zwischen der Krankheitsaktivität der 11 untersuchten Patienten und der spontanen IgG-Produktion ihrer PBMC war kein statistisch signifikanter Zusammenhang festzustellen (nicht-parametrischer Test (Spearman); r=0,5208; p=0,1003). Im Gegensatz dazu, sind Krankheitsaktivität und die durch PRL stimulierbare IgG-Produktion der PBMC positiv korrelliert. Das trifft sowohl für den Fall der Stimulation mit PRL in physiologischer (r=0,6452; p=0,0368) als auch in erhöhter (r=0,6729; p=0,0277) Konzentration zu (siehe Abb. 18 ).

Abb. 18: Zusammenhang zwischen Krankheitsaktivität und der durch PRL stimulierbaren IgG-Produktion von SLE-PBMC

links: nach Stimulation mit Prolaktin in einer Konzentration von 20ng/ml rechts: nachStimulation mit Prolaktin in einer Konzentration von 100ng/ml


62

3.2.2.1.4 Vergleich der verwendeten Prolaktine

Die folgende Betrachtung soll verdeutlichen, daß die gewonnenen Ergebnisse hinsichtlich der IgG-Konzentration der PBMC unabhängig vom verwendeten PRL und damit vergleichbar sind. Zwischen den mit PRL (Paesel+Lorei) und r-PRL (genzyme) gewonnenen Ergebnissen gibt es quantitativ keine Unterschiede. Die Mittelwerte für die IgG-Konzentration der Zellkulturüberstände der SLE-PBMC unterscheiden sich nicht wesentlich.

Tab. 17: Abhängigkeit der IgG-Konzentrationen in den Zellkulturüberständen von dem zur Stimulation verwendeten PRL

 

Immunglobulin G in ng/ml

unstimuliert

Stimuliert (PRL 20 ng/ml)

Stimuliert (PRL 100 ng/ml)

PRL (Paesel+Lorei) n=4

656 (312,4)

1033 (553,3)

969,5 (511,0)

r-PRL (genzyme) n=7

535,4 (568,7)

1113 (668,5)

989,9 (707,1)

Eine Stimulation der PBMC mit LPS in einer Konzentration, die der Endotoxinkonzentration des r-PRL, bei Stimulation in einer Konzentration von 100ng/ml, gleichkommt (2pg/ml), führte weder bei den Gesunden noch bei den SLE-Patienten zu einem Anstieg der IgG-Konzentration in den Zellkulturüberständen. Auch nach Einsatz von LPS in höherer Konzentration (10pg/ml) war die bestimmte IgG-Konzentration nicht bzw. nicht wesentlich höher als die der Zellüberstände unstimulierter PBMC. Das gilt sowohl für die SLE-PBMC als auch für die PBMC Gesunder.

3.2.2.2 Zytokin-Produktion

Der bei Stimulation unter Verwendung des PRL (Paesel+Lorei) nach 24-stündiger Inkubation aufgetretene Anstieg der Konzentration der Zytokine IL-6, IL-10, TNF-alpha und IL-1RA in den Zellkulturüberständen soll hier in seinem Ausmaß am Beispiel von drei gesunden Probanden dargestellt werden ( Abb. 19 ). Ein ähnliches Ergebnis ergab sich für IL-1beta. Die bei SLE-Patienten und Gesunden in gleich starkem Maße beobachtete konzentrationsabhängige Steigerung der Produktion dieser proinflammatorischen Zytokine nach Inkubation mit PRL, legte die


63

Vermutung einer Kontamination des Prolaktins durch Endotoxin nahe.

Abb. 19: Zytokinkonzentration in den Zellkulturüberständen von drei Gesunden nach 24-stündiger Inkubation mit PRL oder LPS

Am Beispiel von IL-6 wurde mit Hilfe von Anti-CD14-Antikörpern untersucht, ob die unter PRL-Inkubation aufgetretene Stimulation der Zytokinproduktion auf eine direkte Wirkung des Prolaktins über einen u. U. vorhandenen PRL-Rezeptor oder auf Endotoxin-Wirkung über den CD14-Rezeptor der Monozyten zurückzuführen ist. Die hier demonstrierte Stimulierbarkeit der IL-6-Produktion durch PRL konnte durch den Zusatz der Anti-CD14-Antikörper vollständig aufgehoben werden. Außerdem war sie unter Verwendung des r-PRL (genzyme) nicht reproduzierbar. Die IFN-gamma- und IL-4-Konzentrationen in den Zellüberständen waren nach Stimulation mit PRL im Vergleich zum Ausgangszustand nicht erhöht.


64

3.2.3 Das Auftreten von Autoantikörpern und klinischen Befunden im Sinne einer Kollagenose bei Prolaktinompatienten

3.2.3.1 Autoantikörper bei Prolaktinompatienten

3.2.3.1.1 ANA

3.2.3.1.1.1 Häufigkeit von ANA und ANA-Muster

Im folgenden Abschnitt soll auf die Ergebnisse des fluoreszenzmikroskopischen ANA-Nachweises auf Hep-2-Zellen eingegangen werden. Es werden dabei eine Gruppe von Prolaktinompatienten und eine gleich große in Geschlechts- und Altersstruktur dem Patientenkollektiv entsprechende Kontrollgruppe verglichen. In der Gruppe der Prolaktinom-Patienten lag der Anteil der ANA-positiven Personen (59%) signifikant über dem in der aus Blutspendern bestehenden Vergleichsgruppe (18%) (chi2-Test; p=0,0077, siehe Tab. 18 ).

Tab. 18: Anzahl (N) und Prozentsatz (%) der ANA-positiven Prolaktinompatienten und Gesunden

ANA-positiv

Patienten

Gesunde

N

23

7

%

59

18

Der höchste in der Gruppe der Gesunden gefundene ANA-Titer liegt bei 1:640. In der Gruppe der Prolaktinompatienten dagegen finden sich auch ANA-Titer, die deutlich darüber liegen (siehe Abb. 18 ). Betrachtet man die bei den Prolaktinom-Patienten auftretenden ANA-Muster im Vergleich zu den Mustern der Gesunden (siehe Tab. 19 ), so muß man folgendes feststellen:

  1. Die Häufigkeit des Auftretens nukleolärer und homogen/dicht feingranulärer ANA-Muster ist in den beiden Gruppen vergleichbar
  2. Feingranuläre ANA-Muster sind in der Patientengruppe signifikant häufiger vertreten als in der Gruppe der Blutspender (chi2-Test; p=0,0039).

    65

  3. In der Gruppe der Prolaktinompatienten finden sich Fluoreszenz-muster, die in der Gruppe der Blutspender nicht vorkommen (zytoplasmatische und nukleäre Dots, siehe Abb. 21 )

Abb. 20: Höhe der bei Prolaktinompatienten und gesunden Kontrollen beobachteten ANA-Titer

Tab. 19: Unterschiede in der Verteilung der verschiedenen ANA-Muster bei Prolaktinompatienten und Gesunden

Fluoreszenz - Muster

Prolaktinom-patienten n=39

Gesunde N=39

p (chi2-Test)

nukleolär

4

5

ns

homogen/dicht feingranulär

5

2

ns

feingranulär

15

1

0,0039 **

zytoplasmatische dots

4

0

ns

nukleäre dots

2

0

ns


66

Abb. 21 Nukleoläres Immunfluoreszenzmuster mit vereinzelten zytoplasmatischen und nukleären dots (Prolaktinompatient, Serum 1:80 verdünnt)

Abb. 22: Feingranuläres Immunfluoreszenzmuster (Prolaktinompatient, Serum 1:80 verdünnt)


67

Abb. 23: Nukleoläres Immunfluoreszenzmuster (Prolaktinompatient, Serum 1:80 verdünnt)

3.2.3.1.1.1 Einfluß des Serumprolaktins auf die ANA

Die Häufigkeit des Auftretens antinukleärer Antikörper bei den Prolaktinompatienten ist nicht von der Höhe des Serumprolaktins zum Untersuchungszeitpunkt abhängig. Bei 11 der 21 (52%) Patienten mit erhöhtem PRL (>20ng/ml) und 12 der 18 (67%) Patienten mit normalem PRL ließen sich antinukleäre Antikörper finden. Dieser Unterschied ist statistisch nicht signifikant (chi2-Test; p=0,9361). Ebenso unabhängig vom Prolaktinwert zum Untersuchungszeitpunkt ist die Häufigkeitsverteilung der verschiedenen ANA-Muster bei den Prolaktinompatienten ( siehe Tab. 20 ).


68

Tab. 20: Häufigkeit des Auftretens verschiedener ANA-Muster bei Prolaktinom-Patienten in Abhängigkeit vom Serumprolaktinwert zum Untersuchungszeitpunkt

Fluoreszenz - Muster

Patienten mit erhöhtem PRL n=21

Patienten mit normalem PRL n=18

P (chi2-Test)

nukleolär

4

0

ns

homogen/dicht feingranulär

2

3

ns

feingranulär

6

9

ns

nukleäre dots

1

1

ns

zytoplasmatische dots

1

3

ns

3.2.3.1.1.1 Einfluß der Krankheitsdauer auf die ANA

Nach Ermittlung der Krankheitsdauer der Prolaktinompatienten (n=33) erfolgte eine Einteilung in zwei Gruppen. Patienten, bei denen eine Krankheitsdauer von 10 Jahren mit Sicherheit nicht erreicht ist (n=11), und Patienten, bei denen das Prolaktinom seit mindestens 10 Jahren bekannt ist (n=22), werden unterschieden. In der ersten Gruppe finden sich bei 6 Patienten (55%) antinukleärer Antikörper. In der zweiten Gruppe haben relativ mehr Patienten (n=16; 73%) antinukleäre Antikörper. Dieser Unterschied ist jedoch statistisch nicht signifikant (chi2-Test; p=0,8957).

3.2.3.1.1.1 ANA-Differenzierung

Keiner der 20 mittels MOLT-4-Blot untersuchten Prolaktinompatienten bot ein positives Ergebnis.

3.2.3.1.2 Anti-dsDNA-Antikörper

Bis auf eine Patientin, liegen alle Prolaktinompatienten unter der Grenze des Normwertbereiches (-5,97U/ml) des ELISA zur Anti-dsDNA (IgG)-Bestimmung. Mit 8,5U/ml ist der Wert dieser Patientin allerdings nur leicht erhöht. Ihr Prolaktinwert ist mit 31,5ng/ml ebenfalls leicht erhöht.


69

3.2.4 Klinische Befunde im Sinne einer Kollagenose bei Prolaktinompatienten

Bei der Suche nach Hinweisen für das Vorliegen von Autoimmunerkrankungen im Zusammenhang mit der Hyperprolaktinämie fiel auf, daß sich zwei Patientinnen von allen anderen dadurch abhoben, daß ihre Anamnesen bezüglich dieser Hinweise positiv waren. Beide Fälle sollen in diesem Kapitel kurz geschildert werden.

Eine 31-jährige Patientin mit positiven ANA (1:10240, nukleoläres Muster) klagte zum Zeitpunkt der Diagnose ihres Prolaktinoms über seit ca. ½ Jahr bestehende, schmerzlose Schwellungen der Finger. Im weiteren Krankheitsverlauf zeigten sich, trotz der immer deutlich positiven ANA, keine weiteren klinischen Befunde im Sinne einer Kollagenose.

Anders verhielt es sich bei einer 51 jährigen Patientin mit positiven ANA (1:2560, feingranulär). Diese klagte im Verlauf ihrer Erkrankung über Arthralgien, rezidivierende Gelenkschwellungen unterschiedlicher Lokalisation und Schmerzen im LWS-Bereich. Eine außerdem bestehende Fotosensibilität, das positive Raynaud-Phänomen und eine wiederhohlt erhöhte Blutsenkungsgeschwindigkeit ließen an eine Erkrankung des rheumatischen Formkreises denken. Es wurde festgestellt, daß die Patientin Antikörper gegen Ro und La hat. Der durchgeführte Schirmertest war pathologisch. Eine gezielte Befragung erbrachte, daß die Patientin unter Mund- und Augentrockenheit und wiederhohlt auftretenden entzündlichen Veränderungen der Augen litt. Es wurde ein Sjögren-Syndrom diagnostiziert. Der Befund der Lippenbiopsie bestätigte die Diagnose. Bei der Kapillarmikroskopie fanden sich vereinzelte Megakapillaren. Die Fotoplethysmographie ergab den Befund einer akralen Minderdurchblutung bei erhaltener vaskulärer Reserve. Hand- und Fußskelett wiesen röntgenologisch keine arthritischen Direktzeichen auf. Die Patientin berichtete zusätzlich über eine vor mehreren Jahren diagnostizierte Hashimoto-Thyreoiditis.

Bei den übrigen Prolaktinompatienten fanden sich keine Hinweise für das Vorliegen einer Kollagenose.


70

3.3 Diskussion

3.3.1 Verhalten der Serumprolaktinwerte bei SLE

3.3.1.1 Vergleich der Serumprolaktinwerte von SLE-Patienten und Gesunden

Exakt ein Drittel der 60 untersuchten SLE-Patienten hatte einen über dem Normwertbereich liegenden Serumprolaktinwert. Dieses Ergebnis stimmt mit dem verschiedener vorausgegangener Studien überein ( 180 - 185 ). Im Vergleich mit diesen ist der ermittelte Anteil von Patienten mit erhöhten PRL-Werten jedoch relativ hoch (33,3% vs. 9-35%). Auffällig ist der Unterschied zwischen den PRL-Werten der Patientinnen im gebärfähigen Alter auf der einen und der männlichen Patienten bzw. postmenopausalen Patientinnen auf der anderen Seite (20ng/ml vs. 12,6 bzw. 12,8ng/m). Die Frage nach der Ursache läßt hier zwei Vermutungen zu. Erstens kann dies auf unterschiedlich hohe Östrogenspiegel zurückgeführt werden ( 76 , 77 , 78 , 80 , 81 ). Zweitens kann nicht ausgeschlossen werden, daß die im Durchschnitt etwas höher liegende Krankheitsaktivität der Patientinnen im gebärfähigen Alter, unter der Voraussetzung der Annahme der Existenz einer positiven Korrelation zwischen Krankheitsaktivität und Serumprolaktin, dem zugrunde liegt. Die durchschnittlichen Prolaktinwerte der weiblichen und männlichen Blutspender unterscheiden sich nicht in dem Maße wie die weiblicher und männlicher SLE-Patienten (6,7 vs. 5,5). Da jedoch bei Gesunden eine vergleichbare hormonelle Konstellation zu vermuten ist, muß angezweifelt werden, daß sich der bei den Patienten festgestellte Unterschied allein auf den Östrogeneinfluß zurückführen läßt.

Auch in der Gruppe der Patienten mit anderen Kollagenosen als dem SLE lagen die Serumprolaktinwerte durchschnittlich höher als in der Gruppe der Blutspender. Dies steht im Einklang mit den Beobachtungen von Gutiérrez, Kucharz und Picco ( 175 , 176 , 177 ).

Bei der Suche nach möglichen Ursachen der Hyperprolaktinämie bei SLE-Patienten müssen in erster Linie zahlreiche physiologische und pathologische PRL-erhöhende Faktoren in Betracht gezogen werden. Um ein Überlappen verschiedener PRL-erhöhender Einflüsse auszuschließen, wurden in die Auswertung dieser Arbeit nur Patienten ohne erkennbare Ursachen für eine


71

Hyperprolaktinämie mit einbezogen. Die bei den SLE-Patienten beobachtete Hyperprolaktinämie ist somit als idiopathisch einzuordnen. Patienten mit Hypothyreose (erhöhtem TSH), terminaler Niereninsuffizienz oder schwangere Patientinnen wurden aus dem Patientenkollektiv ausgeschlossen. Ein weiteres Ausschlußkriterium war die Einnahme von Psychopharmaka, Cimetidin oder Metoclopramid. Das häufig von SLE-Patienten in niedriger Dosis eingenommene Ranitidin bzw. Kalziumantagonisten (Nifedipin) stellen, aufgrund der Erkenntnisse von Müller und D’Armiento et al. ( 194 , 203 ), keine Ausschlußkriterien dar. Ebenfalls wurden Patienten mit Lupusnephritis, ohne das Vorliegen eines fortgeschrittenen Stadiums der Niereninsuffizienz ( 89 ), nicht von der Teilnahme ausgeschlossen. Drei Patienten, die hormonelle Kontrazeptiva einnahmen, wurden ebenso wie zwei weitere Patienten, die unter Therapie mit Clonidin bzw. Verapamil standen, in die Studie miteinbezogen, da das Serumprolaktin in diesen Fällen nicht erhöht war. Keiner der Patienten bot Hinweise für das Vorliegen eines Prolaktinoms.

Bei Einhalten dieser Vorraussetzungen, kann man davon ausgehen, daß bei den untersuchten SLE-Patienten weitere Ursachen für erhöhte Prolaktinwerte im Serum vorliegen müssen.

Zu diesen gehört möglicherweise die erhöhte Ausschüttung hypophysären Prolaktins durch eine erhöhte Zytokinkonzentration im Hypothalamus, wie sie z.B. im Falle einer zerebralen Manifestation des SLE zu erwarten wäre. El-Graf et al. berichteten über eine Assoziation zwischen Hyperprolaktinämie und ZNS-Manifestation in ihrem Kollektiv von SLE-Patienten ( 188. ). In Übereinstimmung damit, berichteten Jara et al. ( 204 ) über eine intrathekale IL-6- und Prolaktin-Synthese bei SLE-Patienten mit zerebraler Manifestation. Es gibt Hinweise für einen die PRL-Sekretion begünstigenden Einfluß des IL-6 auf die Hypophysenzellen ( 92 , 93 ). Bei SLE Patienten steht eine Störung des Regelkreises der PRL-Sekretion auf der Ebene von Hypothalamus und Hypophyse zur Diskussion. Gutiérrez et al. ( 205 ) stellten fest, daß unbehandelte aktive (SLEDAI: 5-25; mean: 12) SLE-Patienten neben einer Störung der HPA-Achse, mit verminderter Cortisolsekretion nach Hypoglykämie, auch eine Veränderung im Muster der PRL-Sekretion (nach TRH-Stimulation) aufwiesen. Obwohl sich der Zeitpunkt und die Höhe des PRL-Spitzenwertes bei Patienten und


72

Gesunden nicht unterschieden, lag die PRL-Sekretion der Patienten jedoch nach 60 und sogar nach 90 min noch höher als die der Gesunden. Dieser Unterschied war statistisch signifikant. Eine andere Gruppe ( 206 ) untersuchte SLE-Patienten mit im durchschnittlich niedrigerer Krankheitsaktivität (ECLAM: 0-3, mean:1,5) hinsichtlich ihrer PRL-Antwort nach TRH-Stimulation und nach Streß (Hypogykämie). In beiden Fällen konnte aber kein Unterschied zwischen der PRL-Sekretion von Patienten und Gesunden festgestellt werden. Die Stimulation der hypophysären PRL-Sekretion durch zirkulierende, in ihrer Konzentration von der Krankheitsaktivität abhängige Zytokine kann als mögliche Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse dieser beiden Untersuchungen herangezogen werden ( 92 , 93 ).

Desweiteren wäre auch eine erhöhte Produktion von Prolaktin in der Peripherie durch Zellen des Immunsystems vorstellbar. So ist es denkbar, daß primär autokrin bzw. parakrin wirksames PRL, das im Rahmen eines lokalisierten Entzündungsprozesses von Lymphozyten sezerniert wird, in den Blutkreislauf gelangt und unter Umständen sogar endokrin wirksam werden kann. Montgomery et al. berichteten über ein von humanen Lymphozyten sezerniertes PRL-ähnliches Protein ( 207 ). Larrea et al. wiesen nach, daß SLE-PBMC nach Con-A-Stimulation aber auch spontan mehr PRL (60kDa) produzieren als normale PBMC ( 133 ). Auch Gutiérrez et al. konnten zeigen, daß die spontane PRL-Produktion der SLE-PBMC (11, 24-27kDa) signifikant über der normaler PBMC lag. Ebenfalls nach Stimulation mit PHA und PWM produzierten SLE-PBMC mehr PRL als normale. Dieser Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant ( 134 ). Miranda et al. untersuchten Serum- und Urin-Prolaktin-Werte von Patienten mit Lupusnephritis und kamen zu dem Schluß, daß neben dem Serum-Kreatinin, der Albuminausscheidung/24h und dem Komplementverbrauch, die Prolaktinkonzentration im Urin als bedeutender prognostischer Parameter einzuordnen ist. Sie formulierten die Vermutung, daß die in der Niere am Entzündungsprozeß beteiligten Lymphozyten das im Urin erscheinende PRL produzieren, welches möglicherweise den lokalen Entzündungsprozeß gemeinsam mit anderen Botenstoffen unterhält ( 189 ). Die aufgeführten Untersuchungen legen die Möglichkeit nahe, daß ein Teil des bei den SLE-Patienten bestimmten Serumprolaktins lymphozytären Ursprunges sein könnte.


73

Eine weitere Erklärungsmöglichkeit für die Hyperprolaktinämie der SLE-Patienten sind Antikörper gegen PRL. Diese binden PRL und verhindern auf diesem Wege eine suffiziente Rückkopplung im Regelkreis. Hattori et al. fanden bei 16% der von ihnen untersuchten Patienten mit idiopathischer Hyperprolaktinämie Autoantikörper gegen Prolaktin ( 62 ). Nachdem eine positive Korrelation zwischen der Serumprolaktin- und der Anti-PRL-Antikörperkonzentration nachgewiesen werden konnte ( 66 ), lag die Vermutung nahe, daß die Antikörper die Ursache der Hyperprolaktinämie sein könnten. Durch das hohe Molekulargewicht ist es dem PRL-AB-Komplex nicht möglich, zum Hypothalamus vorzudringen und dort das negative Feed-Back in Hinblick auf die hypophysäre PRL-Sekretion auszulösen. Im Vergleich zu Hattori wiesen Leanos et al. ( 208 ) nach, daß 40,7% ihrer untersuchten SLE-Patienten mit idiopathischer Hyperprolaktinämie Antikörper gegen Prolaktin hatten. Erklärt werden kann dieser verhältnismäßig hohe Anteil möglicherweise durch die Neigung der SLE-Patienten, eine Vielfalt verschiedener Autoantikörper zu produzieren. Es gibt zwei denkbare Mechanismen, durch welche Anti-PRL-Antikörper das Serumprolaktin erhöhen können. Einerseits ist das bereits erwähnte Versagen des Feed-Back-Mechanismus auf der Ebene des Hypothalamus anzuführen. Andererseits muß an eine Retention der PRL-AB-Komplexe im Blutkreislauf.gedacht werden. Die herabgesetzten renalen Clearance des antikörpergebundenen Prolaktins, im Vergleich zur Clearance des freien Prolaktins, kann als Ursache dafür betrachtet werden.

3.3.1.2 Zusammenhang zwischen dem Serumprolaktin und der Krankheitsaktivität bei SLE

Zur Frage, nach einem Zusammenhang zwischen dem Serumprolaktin eines SLE-Patienten und seiner Krankheitsaktivität, gibt es unterschiedliche Ansichten. Die meisten Autoren lehnen jedoch die Existenz eines solchen Zusammenhanges ab ( 180 , 181 , 184 , 185 ). Das Ergebnis dieser Arbeit bestätigt eindeutig das Vorhandensein einer positiven Korrelation zwischen den PRL-Werten und der klinischen und serologischen Krankheitsaktivität und stimmt somit mit den Ergebnissen von Jara und Neidhart überein ( 183 , 179 ). Patienten mit einer Krankheitsaktivität von ECLAM<4 hatten niedrigere PRL-Werte (MW=12,82ng/ml)


74

als die mit höherer Aktivität (MW=22,06ng/ml). Die Gruppe der Patienten mit über dem Normwertbereich liegenden PRL-Werten hatten im Durchschnitt einen höheren ECLAM-Score (MW=6,8) als die Patienten mit normalen PRL-Werten (MW=3,8). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit dem Verhalten der Autoantikörper der SLE-Patienten in dieser Untersuchung. Sowohl für die Anti-dsDNA-Antikörper als auch für die Anti-Cardiolipin-Antikörper vom IgG-Typ konnte aufgezeigt werden, daß ihre Konzentration im Patienten-Serum positiv mit der des Serumprolaktins korreliert. Allerdings konnte eine solche Korrelation für die Anti-Cardiolipin-Antikörper vom IgM-Typ und auch für die Konzentration der zirkulierenden Immunkomplexe nicht nachgewiesen werden. Neidhart et al. haben bereits über einen Zusammenhang zwischen Anti-dsDNA-Antikörpern und Anti-Cardiolipin-Antikörpern (IgG) und Prolaktinwerten bei SLE- Patienten berichtet ( 183 ). Einen weiteren Rückschluß auf den Zusammenhang zwischen Krankheitsaktivität und PRL-Wert läßt die Betrachtung der Therapie der SLE- Patienten zu. So haben Patienten ohne oder mit wenig intensiver SLE-Therapie (Azathioprin) im Durchschnitt niedrigere Serumprolaktinwerte (MW=11,4 und 15,6ng/ml) als Patienten mit intensiveren Therapie-Formen, wie Glukokortikoid- (besonders nach Applikation als Prednison-Stoß-Therapie) oder der Kombinationstherapie von Glukokortikoiden und Cyclophosphamid (MW=18,5; 21,8 und 24,4ng/ml). Ähnliches konnten Rovenský et al. in dem von ihnen untersuchten Patientenkollektiv feststellen ( 209 ). Eine Steigerung der hypophysären PRL-Sekretion durch Glukokortikoide beim Menschen ist nicht bekannt. Im Gegenteil, einige Autoren wiesen supprimierende Effekte der Glukokortikoide an den Hypophysenzellen hinsichtlich der PRL-Sekretion nach. Diesem Mechanismus soll eine Beeinflussung des Prolaktin-Promotors Pit -1 zugrunde liegen ( 210 ).

Als Ursache für diese widersprüchlichen Ergebnisse kommen in erster Linie die Anti-PRL-Autoantikörper (PRL-AB), die bei einem großen Teil der Lupuspatienten nachzuweisen sind ( 208 ), in Frage. Leanos et al. stellten fest, daß Lupuspatienten mit idiopathischer Hyperprolaktinämie und Anti-PRL-Antikörpern eine niedrigere Krankheitsaktivität aufwiesen als die entsprechenden Patienten ohne diese Antikörper. Die biologische Aktivität des Antikörper-gebundenen Prolaktins ist nicht geringer als die der ungebundenen 23 kDa-Form (siehe Tab. 1 ). Es kann


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jedoch aufgrund des hohen Molekulargewichtes nicht ungehindert bis zum Zielgewebe vordringen. Die Wirkung in vivo ist demnach herabgesetzt.

Es muß außerdem beachtet werden, daß Anti-PRL-Antikörper einen Einfluß auf das Ergebnis der unterschiedlichen Methoden der PRL-Bestimmung im Serum haben können ( 58 ). So zeigten Hattori et al., daß durch verschiedene RIAs nur etwa 40-52% des im Serum enthaltenen Prolaktins von 10 hyperprolaktinämischen Patienten mit PRL-Antikörpern registriert wurden. Im Gegensatz dazu, konnte durch einen IRMA das gesamte, im Serum enthaltene Prolaktin erkannt werden. Möglicherweise wurden in den vorausgegangenen Untersuchungen des Zusammenhangs zwischen Serumprolaktinwert und Krankheitsaktivität der SLE-Patienten unterschiedliche Methoden der Prolaktinbestimmung verwendet. Dies könnte eine von vielen möglichen Erklärungen für die unterschiedlichen Ergebnisse sein.

Bei unseren Untersuchungen kamen ein nach dem Sandwich-Prinzip arbeitender ELISA und ein IRMA zum Einsatz. Da beiden Methoden ein vergleichbares Prinzip zugrunde liegt (siehe Abb. 7 ), muß angenommen werden, daß auch an Antikörper gebundenes Prolaktin bei der Bestimmung erkannt wurde.

Zusätzlich müssen auch Unterschiede der Alters- und Geschlechtszusammensetzung der Gruppen berücksichtigt werden. Es ist nicht auszuschließen, daß dem PRL, in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Vorraussetzungen der einzelnen Patienten, eine mehr oder weniger große Bedeutung im Sinne einer möglichen Einflußnahme auf die Krankheitsaktivität zukommt. Außerdem unterscheiden sich die Untersuchungen durch eine unterschiedlich hohe Teilnehmerzahl. Durch das Vermeiden PRL-erhöhender Umstände, wie Medikamenteneinnahme (siehe Tab. 3 ), Mahlzeiten, Streß, Niereninsuffizienz (Krea>2mg/dl), Hypothyreose oder Schwangerschaft und die Durchführung der Blutentnahmen am Vormittag, wurde das Vorliegen weiterer Faktoren, die ein unterschiedliches Ergebnis bedingen könnten, vermieden.

Bei den bisherigen Untersuchungen handelt es sich um Momentaufnahmen des Prolaktinwerts, der Anti-dsDNA-Antikörper-Konzentration oder der klinischen Krankheitsaktivität der SLE-Patienten. Bei der Untersuchung dieser Parameter im Verlauf konnte bei den Patienten mit langjähriger SLE-Erkrankung und über den


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Untersuchungszeitraum schwankender Krankheitsaktivität eine gleichsinnige Veränderung der erwähnten Parameter festgestellt werden. Bei einem Patienten mit Erstmanifestation stieg jedoch das Prolaktin erst 6 Monate nach dem Auftreten erster Symptome an. Dies verdeutlicht die Abhängigkeit der Ergebnisse dieser und anderer Untersuchungen von der Wahl des Untersuchungszeitpunktes. In der Gruppe der SLE-Patienten, bei denen es über den Untersuchungszeitraum nicht zu einer Änderung des Krankheitsaktivitätsindexes kam, fand sich in der Mehrzal der Fälle (7 von 10) auch keine wesentliche Schwankung des Serumprolaktins (>2,5ng/ml). In dieser Gruppe war zudem kein gleichsinniges Verhalten von PRL- und Anti-dsDNA-Antikörper-Konzentration der Patientenseren festzustellen. Die Mittelwerte der Prolaktin- und Anti-dsDNA-Antikörper-Konzentration und des ECLAM-Scores lagen in dieser Gruppe niedriger als bei den Patienten, die Schwankungen der Krankheitsaktivität über den Untersuchungszeitraum boten. Dies verdeutlicht die Bedeutung der Auswahlkriterien der Patienten für Verlaufsuntersuchungen. Patienten mit hoher und schwankender Krankheitsaktivität und mehrjährigem Krankheitsverlauf, scheinen für die Untersuchung der hier diskutierten Frage besonders geeignet zu sein. Hinzugefügt werden sollte an dieser Stelle, daß die Anzahl der im Verlauf untersuchten Fälle zu gering ist, um formulieren zu können, daß PRL ein Parameter ist, der die Krankheitsaktivität der SLE-Patienten zuverlässig widerspiegelt. In jedem Fall untermauert das Ergebnis der Verlaufsuntersuchungen jedoch die bei der Betrachtung der Gesamtheit aller SLE-Patienten gewonnene Erkenntnis. Prolaktinwert und Krankheitsaktivität der SLE-Patienten sind positiv korreliert.

Es wird die Frage nach dem zeitlichen Zusammenhang zwischen der Entwicklung einer Hyperprolaktinämie und der Manifestation des SLE und nach den Konsequenzen erhöhter Serumprolaktinwerte für den Krankheitsverlauf aufgeworfen. Zu deren Beantwortung ist die Durchführung weiterer Verlaufsbeobachtungen, insbesondere die verstärkte Untersuchung von Patienten mit Neumanifestationen des SLE, nötig.


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3.3.1.3 Assoziation der Hyperprolaktinämie mit bestimmten Manifestationen des SLE

Für einen Zusammenhang zwischen den Serumprolaktinwerten und dem Auftreten verschiedener klinischer Krankheitsmanifestationen und pathologischer Veränderungen der Laborparameter bei SLE-Patienten und Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen gibt es in der Literatur zahlreiche Hinweise. Miranda et al. stellten bei Patienten mit Lupusnephritis nicht nur erhöhte Serumprolaktinwerte, sondern auch eine zum Krankheitsverlauf parallel verlaufende Erhöhung der Prolaktinkonzentration im Urin fest ( 189 ). Anti-dsDNA-positive Patienten waren häufiger hyperprolaktinämisch als Anti-dsDNA-negative Patienten. El-Graf et al. berichten über eine Assoziation von erhöhten Serum-PRL-Werten und ZNS-Manifestation des SLE. Sie konnten außerdem eine positive Korrelation zwischen Prolaktinwert und BSG und eine inverse Korrelation zwischen Prolaktinkonzentration und Leukozyten- sowie Lymphozytenzahl bei ihren Patienten nachweisen ( 188. ). Neidhart et al. zeigten ebenfalls die negative Korrelation von Leukozytenzahl und Erythrozytenzahl und dem Serumprolaktin und eine positive Korrelation von Serumprolaktin-, Anti-dsDNA-Antikörper- und anti-Cardiolipin-Antikörperkonzentration (beide Antikörper vom IgG-Typ) bei SLE-Patienten ( 183 ). Bei dieser Untersuchung fiel auf, daß SLE-Patienten mit allgemeinen Krankheitszeichen (Fieber, Müdigkeit), renalen Manifestationen (insbesondere bei gleichzeitigem Vorhandensein von Hämaturie, Proteinurie und Verminderung der Kreatininclearance bzw. Erhöhung der Retentionsparameter), Anämie, erhöhter BSG und C3-Verminderung signifikant höhere PRL-Werte hatten als Patienten ohne diese Manifestationen. Das Vorliegen einer zerebralen Manifestation des SLE war bei dieser Untersuchung nicht mit einer Hyperprolaktinämie assoziiert.

3.3.2 In-vitro-Effekte von Prolaktin auf PBMC

3.3.2.1 IgG-Produktion

Die spontane IgG-Produktion der SLE-PBMC, welche unabhängig von der Krankheitsaktivität und dem Serumprolaktin der Patienten war, ließ sich durch


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Prolaktin in physiologischer Konzentration (20ng/ml) steigern. Bei Einsatz von Prolaktin in einer Konzentration von 100ng/ml konnte die IgG-Produktion im Vergleich zum Ausgangszustand zwar ebenfalls gesteigert werden, das Ergebnis war jedoch nur suboptimal. Die durch Prolaktin-Stimulation erreichbare IgG-Produktionssteigerung der SLE-PBMC war zudem von der Krankheitsaktivität der Patienten abhängig. Die PBMC der Patienten mit höherer Krankheitsaktivität waren am besten durch Prolaktin stimulierbar. Die normalen PBMC produzierten sowohl spontan als auch nach Stimulation mit Prolaktin keine meßbaren IgG-Mengen.

Diese Ergebnisse bestätigen vorangegangene Untersuchungen von Lahat et al. ( 141 ) und Gutiérrez et al. ( 148 ), welche über die Eigenschaft des Prolaktins, die Immunglobulinproduktion von mit Anti-IgM und IL-2 inkubierten B-Zellen und von SLE-PBMC zu stimulieren, Aufschluß gaben. Die in der vorliegenden Arbeit beschriebene Stimulierbarkeit der PBMC von Patienten mit SLE hinsichtlich ihrer IgG-Produktion durch Prolaktin in physiologischer Konzentration wurde bisher jedoch nicht beschrieben.

Abweichend von den vorangegangenen Untersuchungen, war in dieser die IgG-Produktion der normalen PBMC nicht durch Prolaktin stimulierbar. Dies liegt möglicherweise an der gewählten PRL-Konzentration. Gutiérrez et al. konnten einen stimulierenden Effekt des Prolaktins auf normale PBMC nachweisen. Sie berichteten sogar über eine bessere Stimulierbarkeit der IgG- und IgM-Produktion bei normalen PBMC im Vergleich zu SLE-PBMC. Diese war biphasisch, bei einer PRL-Konzentration von 10-7 und 10-4M zu beobachten. Ob diese Konzentrationen den in dieser Untersuchung gewählten PRL-Konzentrationen nahekommen, läßt sich nicht eindeutig sagen, da PRL, wie in Tab. 1 erläutert, eine heterogene Substanz ist, für die kein einheitliches Molekulargewicht angegeben werden kann. Nur bei Annahme eines Molekulargewichtes von 23kDa an, läßt sich ermitteln, daß die von Gutiérrez angegebene Konzentration zwischen 400ng/ml und 400µg/ml liegt. Als Begründung für ihr Ergebnis führten Gutiérrez et al. die bei SLE-Patienten bestehende Fehlfunktion der B-Zellen an.

Das Ergebnis dieser Untersuchung spricht dafür, daß für die überschießende IgG-Produktion der PBMC von SLE-Patienten nicht allein Prolaktin verantwortlich sein


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kann, sondern ein zusätzlicher Defekt der Zellen an sich bzw. ihrer Interaktion eine Rolle spielen muß. Prolaktin kann also den Vorgang der Immunglobulinproduktion nicht initiieren, wohl aber unterhalten oder verstärken. Hinzu kommt, daß das Prolaktin diesen Effekt in seiner physiologischen Konzentration zeigt. Das spricht für das Dimerisationsmodell des Prolaktin-Rezeptors. Ligandenüberschuß führt zur Verhinderung der Rezeptordimerisation (siehe Abb. 6 ). SLE-Patienten mit PRL-Werten, die im oberen oder leicht oberhalb des Normbereiches liegen, weisen nach diesem Ergebnis also optimale Bedingungen für die Immunglobulin-Produktion in vivo auf. Möglicherweise ist dies eine Erklärung für den therapeutischen Nutzen der BRC-Behandlung bei normoprolaktinämischen SLE-Patienten ( 191 ). Die durch PRL-Stimulation erreichbare IgG-Produktion hängt von der Krankheitsaktivität der Patienten ab. Dies könnte bedeuteten, daß die Rolle, die dem Prolaktin bei der Verstärkung der beim SLE ablaufenden pathologischen Prozesse zukommt, ganz wesentlich von der Aktivität der Erkrankung abhängt. Inwieweit PRL jedoch an dieser bereits Anteil hat, ist schwer einzuschätzen. Deutlich wird jedoch, daß PRL-Werte im unteren Normwertbereich bei SLE-Patienten erstrebenswert sind.

Das Ergebnis eröffnet die Frage nach der Ursache des beobachteten Unterschiedes in der IgG-Produktion der PBMC gesunder Probanden und der SLE-PBMC. Eine mögliche Erklärung wäre eine bessere Ansprechbarkeit der SLE-PBMC auf Prolaktin. Eventuell haben diese durch ihre in vivo Aktivierung eine erhöhte Anzahl von Prolaktinrezeptoren exprimiert, oder sie haben, ähnlich den CLL-B-Zellen, die Fähigkeit mit Hilfe besonderer Rezeptoren und Signaltransduktionswege, auf durch PRL-IgG-Komplexen übermittelte Signale (gleichzeitige Aktivierung von Fc- und PRL-R nötig ( 64 )) reagieren zu können. Denkbar ist ebenfalls der Eingriff des Prolaktins in die Vorgänge der Apoptose der SLE-PBMC über das Hochregulieren des Anti-Apoptose-Proteins Bcl-2. Auf diesem Weg könnte die Apoptose Autoantikörper-produzierender SLE-Plasmazellen durch Prolaktin verhindert werden. Diese antiapoptotische Wirkung des Prolaktins ist in der Literatur bereits für verschiedene Nb2-Lymphomzellinien beschrieben ( 211 , 212 ). Von Interesse wäre die Frage, ob SLE-PBMC unter den in dieser Untersuchung gewählten Bedingungen (cPRL=20ng/ml) vermehrt Bcl-2 exprimieren.


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3.3.2.2 Zytokin-Produktion

Die bei den SLE-Patienten und Gesunden nach Stimulation mit Prolaktin aufgetretene, dosisabhängige Erhöhung der Zytokinkonzentration in den Zellüberständen sind, nach den hier durchgeführten Untersuchungen, nicht auf den Effekt des Prolaktins, sondern wahrscheinlich auf Verunreinigungen dieser Substanz zurückzuführen. Eine Erhöhung der proinflammatorisch wirksamen Zytokine (IL-1beta, TNF-alpha, IL-6) sowie von IL-10 und IL-1RA konnte nach Stimulation mit Prolaktin nachgewiesen werden. Dies machte die Unterscheidung eines möglicherweise durch PRL ausgelösten Effektes von einem durch eine Endotoxinkontamination der verwendeten Substanz verursachten Anstieg der Zytokinproduktion notwendig. Am Beispiel des Zytokins IL-6 wurden deshalb weitere Untersuchungen durchgeführt. Durch den Zusatz von Anti-CD14-Antikörper zu den mit PRL stimulierten PBMC war der oben beschriebene Effekt vollständig aufhebbar. Außerdem war er nach dem Wechsel des zur Stimulation verwendeten Prolaktins nicht reproduzierbar. Auch die quantitative Endotoxin-Bestimmung ergab eine Kontamination. Diese Ergebnisse zeigen, daß PRL unter den gewählten Bedingungen wahrscheinlich keinen Einfluß auf die Sekretion der proinflammatorischen Zytokine (IL-1beta, IL-6 und TNF-alpha) hat. Auf den Einsatz von Anti-PRL-Antikörpern zum Nachweis einer möglichen Antagonisierbarkeit der anfänglich beobachteten Zytokinproduktion wurde hier verzichtet, da unklar ist, ob nicht möglicherweise eine Ansprechbarkeit der Monozyten auf PRL-/Anti-PRL-Komplexe hinsichtlich der Aktivierung zur Zytokinproduktion besteht. Prolaktin zeigte, unter den hier gewählten Versuchsbedingungen, ebenfalls keinen verstärkenden Effekt hinsichtlich der Produktion der T-Zell-Zytokine IL-4 und IFN-gamma.

In der Literatur gibt es Hinweise für eine Einflußnahme des Prolaktins auf das Muster der sezernierten Zytokine einzelner Zellen des Immunsystems. Zur Diskussion steht die Bedeutung dieses Aspektes hinsichtlich der Rolle des Prolaktins für den Verlauf von Autoimmunerkrankungen ( 149 , 152 , 192 ). Es mangelt bisher jedoch an Untersuchungen zu diesem Thema. Der in vivo Langzeiteffekt des Prolaktins wurde anhand eines Prolaktinompatienten-Kollektivs von Clodi et al. untersucht ( 213 ). Dies erfolgte vor und nach Beginn der BRC-


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Therapie. Die Serumzytokinwerte (IL-1, 6, IFNgamma, TNFalpha) unterschieden sich zu diesen beiden Zeitpunkten nicht. Es liegen bisher keine in vitro-Studien zum Effekt des PRL auf die Zytokinsekretion von normalen oder SLE-PBMC vor. Als Problem der in vitro-Untersuchungen stellt sich die klare Trennung des PRL-Effektes von den durch mögliche Endotoxinverunreinigungen bedingten Effekten dar. Die Rolle des Prolaktins in Hinblick auf die Beeinflussung des Zytokinmusters ist unklar. Aufgrund der Bedeutung der Überexpression verschiedener Zytokine, wie z.B. IL-6 oder IL-10, für die Pathogenese des SLE, ist ihre Klärung jedoch von großem Wert.

Betrachtet man das Ergebnis der in-vitro-Untersuchung der IgG- und der Zytokinproduktion unter PRL-Einfluß, läßt sich schlußfolgern, daß die durch PRL erreichte Steigerung der IgG-Produktion der SLE-PBMC nicht auf den indirekten Effekt einiger Zytokine (IL-6, IL-10), sondern wahrscheinlich auf den direkten Einfluß des PRL auf die PBMC zurückzuführen ist.

Weiterhin kann ein Zusammenhang zwischen der durch PRL in physiologischer Konzentration ausgelösten Steigerung der IgG-Produktion der SLE-PBMC und der Endotoxinkontamination eines der verwendeten Prolaktine weitgehend ausgeschlossen werden, denn die Ergebnisse waren unabhängig vom verwendeten PRL. Desweiteren ließ sich durch den Einsatz einer dem Endotoxingehalt des verwendeten Prolaktins entsprechenden LPS-Konzentration (c=2pg/ml) kein vergleichbares Ergebnis erzielen.

3.3.3 Das Auftreten von Autoantikörpern und klinischen Befunden im Sinne einer Kollagenose bei Prolaktinompatienten

Der Prolaktinompatient stellt ein gut geeignetes Studienobjekt zur Klärung der Frage des Einflusses einer langzeitig erhöhten Serumprolaktinkonzentration auf die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung Autoantikörper-produzierender B-Zell-Klone oder sogar der Manifestation einer Autoimmunerkrankung dar. McMurray et al. berichteten über die Manifestation eines SLE bei Prolaktinompatienten ( 155 ) und Buskila et al. sowie Krause et al. über das gehäufte Vorkommen verschiedener Autoantikörper bei diesen Patienten ( 156 , 157 ). Ganz im Einklang mit diesen bisherigen Erkenntnissen steht das Ergebnis dieser Untersuchung.


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Differenzierter betrachtet, läßt sich feststellen, daß zwar die Häufigkeit Antinukleärer-Antikörper bei den Prolaktinompatienten signifikant höher liegt als bei Gesunden, die Häufigkeit der Autoimmunerkrankungen in den beiden Gruppen jedoch nicht unterschiedlich ist. Nur bei einer Prolaktinompatientin konnten sich Autoimmunerkrankungen in Form eines Sjögren-Syndroms und einer Hashimoto-Thyreoiditis manifestieren. Hier sollte hinzugefügt werden, daß in diesem Fall eine zufällige Koinzidenz dieser Erkrankungen durchaus denkbar ist. Nicht nur die Häufigkeit des Auftretens von ANA war bei Prolaktinompatienten höher als bei Gesunden, sondern auch die Titer. Das vorherrschende Muster war das feingranuläre. Außerdem fanden sich bei der Fluoreszenzmikroskopie zytoplasmatische und nukleäre dots bei einigen Prolaktinompatienten. Diese ließen sich keinem der bisher bekannten Immunfluoreszenzmuster zuordnen. Bei keinem der Prolaktinompatienten fanden sich Anti-dsDNA-Antikörper in erwähnenswerter Konzentration. Diese Punkte weisen darauf hin, daß Prolaktin auf der einen Seite die Aktivität und möglicherweise auch die Anzahl Autoantikörper-produzierenden Zellen zwar erhöhen, andererseits aber für die klinische Manifestation einer Autoimmunerkrankung nicht der allein ausschlaggebende Faktor sein kann. Auch Buskila et al. und Krause et al. konnten bei den von ihnen untersuchten Prolaktinompatienten keine Symptome im Sinne einer Autoimmunerkrankung feststellen.

Wider Erwarten war die ANA-Positivität in der Gruppe der Prolaktinompatienten weder vom Serumprolaktinwert noch von der Krankheitsdauer der Patienten abhängig.

3.3.4 Die Rolle des Prolaktins bei SLE-Patienten

Die Prolaktinwerte der Lupuspatienten liegen häufig über den Werten Gesunder. Die Erhöhung ist zwar oft nur unwesentlich, ihr kommt jedoch offensichtlich, ungeachtet ihrer Ursache, eine große Bedeutung hinsichtlich der Erhöhung der Krankheitsaktivität zu. Die Untersuchung hat gezeigt, daß sich PBMC Gesunder in ihrer Aktivität, die Immunglobuliproduktion betreffend, nicht von Prolaktin in physiologischer Konzentration beeinflussen lassen und auch durch eine erhöhte PRL-Konzentration nicht ansprechbar sind. Anders verhält es sich bei den SLE-


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Patienten. Die Aktivität ihrer PBMC läßt sich durch Prolaktin deutlich erhöhen. Es erscheint daher sinnvoll, bei der Therapie des SLE nicht nur hormonelle Risikofaktoren wie Östrogen-, DHEA- oder Cortisol-Serumkonzentrationen der Patienten zu berücksichtigen und zu korrigieren, sondern auch die Prolaktinkonzentration im Serum möglichst gering zu halten. Die Rolle des Prolaktins, als ein den SLE-begünstigender hormoneller Faktor, sollte nicht unterschätzt werden. So konnten z.B. Elbourne et al. am NZB/NZW F1-Maus-Modell des SLE nachweisen, daß hohe Östrogenspiegel den Krankheitsverlauf nicht akzellerieren, wenn die Prolaktin-stimulierende Eigenschaft der Östrogene durch Bromocriptin antagonisiert wird ( 214 ). Es ist nachgewiesen worden, daß Prolaktin die Glukokortikoid-induzierte Apoptose blocken kann ( 211 , 212 ). Möglicherweise begünstigt es auf diesem Wege das Überleben oder sogar die Entstehung Autoantikörper-produzierender Plasmazellen und hebt die therapeutische Wirkung der Glukokortikoide teilweise auf. Dies weist auf die Bedeutung eines niedrigen Prolaktinspiegels für den Erfolg der medikamentösen SLE-Therapie hin. In Zukunft kommt es darauf an, den therapeutischen Nutzen Prolaktinspiegel-senkender Medikamente, wie z.B. des Dopaminagonisten Bromocriptin, mittels Plazebo-kontrollierter Studien zu untersuchen. Die bisherigen Ergebnisse auf diesem Gebiet sind sehr vielversprechend ( 190 , 191 ). Auch die Nebenwirkungen einer low-dose-BRC-Therapie sind anscheinend verschwindend gering im Vergleich zu denen anderer SLE-Therapieformen. Alvarez-Nemegyei et al. kamen durch eine Plazebo-kontrollierte Studie zu dem Ergebnis, daß eine zusätzliche Therapie mit 2,5mg BRC/die eine nebenwirkungsarme und effektive Methode zur Senkung der Schubhäufigkeit bei SLE-Patienten darstellt ( 190 ).

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