Jacobi, Carsten: Charakterisierung von EPB41 - Spleißformen im menschlichen Gehirn

Institut für Biologie


Dissertation
Charakterisierung von EPB41 - Spleißformen im menschlichen Gehirn

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalis

(Dr. rer. nat.)

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Dipl. Biologe Carsten Jacobi(27.11.1967)

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Ronacher

Gutachter:
Prof. Dr. P. M. Kloetzel
Prof. Dr. T. G. Ohm
Prof. Dr. A. von Deimling

eingereicht: 22.12.2000

Datum der Promotion: 22.05.2001

Zusammenfassung

In einem RT-PCR Ansatz aus neuronalen post mortem Gewebe des Menschen konnten EPB41 (Erythrozytäres Protein Bande 4.1) Spleißformen in verschiedenen Hirnregionen nachgewiesen werden. In einem weiteren RT-PCR Ansatz wurden höhermolekulare p4.1R-Spleißormen generiert, kloniert und zwei der erhaltenen Spleißformen (Klon 9 und Klon 13) charakterisiert. In einer In-situ-Hybridisierungsstudie an humanen Temporalkortex und Hippocampus konnten EPB41-Isoformen in fast allen Neuronen nachgewiesen werden. In immunhistochemischen Untersuchungen mit selbstgenerierten p4.1R spezifischen Antikörper wurden ebenfalls ausschließlich Neurone markiert. In proteinbiochemischen Untersuchungen konnte in verschiedenen humanen Hirnareale mit den p4.1R spezifischen Antikörpern eine 110 kDa und 120 kDa immunreaktive Bande nachgewiesen werden.

In Experimenten an Primärkulturen von Rattenneuronen konnte eine Herunterregulation der p4.1R Proteine sowie der mRNA von p4.1R durch Verarmung des funktionellen Pools an G-Proteinen der Rho-Familie in der Zelle gezeigt werden. Die GTPasen der Rho-Familie regulieren unter anderem die Plastizität des Dendritenbaumes von Neuronen.

Schlagwörter:
EPB41; alternative-Spleißvorgänge; Rho GTPasen; humanes Gehirngewebe

Abstract

In a RT-PCR approach using human postmortem cerebral tissue from different brain regions several EPB41 (erythrocyte protein band 4.1) spliceforms could be generated. The amplificates were cloned and two of the highmolecular EPB41 spliceforms Klon 9 and Klon 13 were characterized. Klon 9 is a new spliceform, Klon13 is identical with EPB41 (accesion number AF156225). In an in situ hybridization study the EPB41 spliceforms were detected in almost all neurons of the temporal cortex and the hippocampus. Immunhistochemical localization of the p4.1R immunreactive proteins in human temporal cortex using p4.1R specific peptide antibodies, confirmed these results. The stning pattern of soma and dendrites of the neurones was punctuated. In Western Blot experiments a 110 kDa and 120 kDa p4.1R immunreactive proteinband was detected.

A regulation of the protein 4.1R immunreactive proteins as well as the mRNA of protein 4.1 was found in experiments in which the functional pool of Rho GTPases in hippocampal primary neurones of the rat was manipulated.

Keywords:
EPB41, alternative splicing, Rho GTPases, human brain


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteCharakterisierung von EPB41 - Spleißformen im menschlichen Gehirn
Widmung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Einleitung Vorwort
1 Einleitung
1.1Das Zytoskelett des Neurons
1.2Die Protein 4.1-Superfamilie
1.3Die Protein 4.1-Familie
1.4Alternative Spleißvorgänge des EBP41-Gens
1.5Proteindomänen von Protein 4.1R
1.6Bindungspartner der Protein 4.1-Familienmitglieder
1.7Funktionen der Protein 4.1-Familie
1.8Neuronale Funktion von p4.1R - Proteinisoformen
1.9Ziel der Arbeit
2 Material und Methoden
2.1Standardprozeduren
2.2Gewebespezifikation
2.3Isolierung von Gesamt-RNA aus humanem post mortalen Gewebe
2.4Reverse Transkription
2.5Polymerasen-Ketten-Reaktion
2.5.1Primerkombinationen für RT-PCR-Experimente
2.6Sequenzierung
2.7In-situ-Hybridisierung
2.7.1Der Digoxigenin-Nachweis:
2.8Antikörperherstellung
2.8.1Herstellung von Antikörpern gegen erythrozytäres Protein 4.1
2.8.2Herstellung von Protein 4.1 - Peptidantikörpern
2.9Herstellung von Proteinhomogenaten aus post mortalem Gewebe für die Immunoblotanalyse
2.10Immunoblot und SDS-PAGE
2.11Präparation von neuronalem Rattengewebe
2.12Neuronale und gliale Zellkulturen von Ratten
2.12.1Neuronale Primärkultur
2.12.2Primäre astrogliale Kulturen
2.12.3Mikroglia Zellkulturen
2.12.4Behandlung der Neuronenkultur
2.12.5Probenaufbereitung der Zellkultur für die Immunoblotanalyse
2.13Immunhistochemie
2.13.1Immunhistochemische Analyse von humanem post mortalen Material.
2.13.2Immunzytochemie an Neuronenkulturen
2.14Konfokale Laserscanning-Mikroskopie
2.15Semiquantitative RT-PCR
3 Ergebnisse
3.1Untersuchung des EBP41 Gens auf Spleißvarianten im menschlichen Gehirn
3.2Klonierung der Gesamtsequenz
3.3In-situ-Hybridisierung mit EPB41 - Sonden
3.4Immunoblotanalyse an humanem Geweben
3.4.1Immunoblotanalyse mit einem Antikörper gegen die 1. Spleißstelle von Klon 9
3.5Immunhistochemische Untersuchung
3.6Proteinbiochemische Untersuchungen am Rattengewebe
3.6.1Lokalisation der Protein 4.1-Isoformen im Neuron
3.7Studien an neuronalen Rattenzellkulturen
3.7.1Immunoblotanalyse
3.7.2Immunzytochemische Analyse
3.7.3Semiquantitative RT-PCR
4 Diskussion
4.1Genetische Analyse von Spleißformen des EPB41-Gens
4.2Charakterisierung von Klon 9 und Klon 13
4.3Die zelluläre Verteilung der EPB41 - Spleißformen im humanen Hippokampus
4.4Proteinbiochemische Charakterisierung der p4.1R-Proteinisoformen
4.5Funktionelle Regulation von Protein 4.1R-Isoformen
4.6Die Rolle von von Protein 4.1R-Proteinisoformen in verschiedenen Krankheiten
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Anhang
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Mitglieder der p4.1-Familie
Tabelle 2: Patientendaten
Tabelle 3: Oligonukleotidsequenzen
Tabelle 4: Sequenzen der verwendeten Sonden
Tabelle 5: Peptide für die Immunisierung
Tabelle 6: Konzentration der Substanzen in den Zellkulturexperimenten

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Mitglieder der p4.1-Superfamilie
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Domänenorganisation der Proteine der p4.1-Familie. [Parra et al., 2000].
Abbildung 3 Dargestellt ist die cDNA des EBP41 - Gens mit den alternativen Exons, den konstitutiven Exons und dem nicht - kodierenden Exon. Eingezeichnet sind die jeweiligen Exons des EPB41-Gens, die für die entsprechenden Domänen kodieren. Als Beispiel sind die Peptidfragmente des erythrozytären 80 kDa p4.1R - Proteins und die Bindungspartner gezeigt, die mit den Fragmenten interagieren können.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der möglichen Rolle von p4.1R in einem tertiären Komplex. Als Beispiel ist die Beteiligung von p4.1R bei der Verknüpfung von „tight junction“ Proteine mit dem Mikrofilament-System der Zelle gewählt [aus Mattagajasingh et al., 2000].
Abbildung 5: Dargestellt ist die cDNA des EPB41-Gens mit der Position der Primer, die für die Generierung von alternativen Spleißformen der Spleißregion 1 (Exon 2-6), Spleißregion 2 (Exon 12-17) und Spleißregion 3 (Exon 17-21) verwendet wurden.
Abbildung 6: Aus den verschiedenen zerebralen Regionen wurde Gesamt-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Dargestellt sind die generierten Amplifikate über die Spleißregion 1 (Exon 2-6), 2 (Exon 12-17) und 3 (Exon 17-21), sowie das Amplifikat der Aktin-PCR
Abbildung 7: Aus den verschiedenen zerebralen Regionen wurde gesamt RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mit Primern die Gesamtlängen von Spleißformen des EPB41-Gens generiert.
Abbildung 8: Diagramm der generierten EPB41 - Spleißformen. Oben ist die EPB41 cDNA mit den alternativen Exons, den konstitutiven Exons und dem nicht kodierenden Exon dargestellt. Identifizierung der Exons von Klon 9 (EPB41 Delta 3, 4, 5 16, 17a, 17b) und Klon 13 (EPB41 Delta 3, 17a, 17b) im Vergleich zu der cDNA von EPB41
Abbildung 9: In-situ-Hybridisierung mit einer Sonde, die alle Spleißformen des EPB41-Gens detektiert. a) Dargestellt sind die verschiedenen Schichten des Isokortex, in allen Schichten wurden Neurone der grauen Substanz markiert. Die römischen Zahlen kennzeichnen die einzelnen kortikalen Schichten; weiße Substanz (WM). Ein Hybridisierungssignal wurde in der molekularen Schicht, in den Neuronen der Fascia dentata (b), den Cornu ammonis - Regionen CA1 (d), CA2 (f), CA3 (c), CA4 (e) und denen des Subikulums (g) erhalten. Die Pfeilspitzen in (g) deuten auf unspezifisch gefärbte typische Lipofuszingranula in den apikalen Dendriten der Pyramidenneurone des Subikulums. Die Pfeile in (c) und (i) deuten auf Astrozyten, die aufgrund ihrer Lipofuszingranula zu erkennen sind, aber kein Hybridisierungssignal aufweisen. Die Körnerzellen der Fascia dentata (h) zeigen ein im wesentlichen auf das Zytoplasma beschränktes Hybridisierungssignal. Bei der starken Färbung der Pyramidenzellen der CA - Regionen scheint in einigen Fällen eine Markierung des Zellkerns vorzuliegen (i). Eine In-situ-Hybridisierung mit einer Sense-Sonde zeigte keine Zellmarkierung (j, k). Ein Hybridisierungssignal konnte in keinem der untersuchten Fällen (n=4) in Gliazellen nachgewiesen werden. Der Kalibrierungsbalken repräsentiert 200 µm in (a), 100 µm in (b-g), 20 µm in (h-j) und 10 µm in (k).
Abbildung 10: Mit den Antisense-Sonden pan-EPB41 (Exon 2) und einer Klon 9 - spezifischen Sonde wurde am humanen Hippokampus eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt. Die Entwicklungszeit für beide Sonden war gleich. In der Übersicht ist die leicht unterschiedliche Expression der Antisense-Sonde pan-EPB41 in den Cornu ammonis - Regionen (CA1 > CA4 > CA3 > CA2) zu erkennen. Bei der Klon 9 - spezifischen Sonde sind hingegen keine Expressionsunterschiede zwischen den einzelnen CA-Regionen zu erkennen. Im Vergleich zu der pan-EPB41 - Sonde, die alle EPB41 - Spleißformen detektiert, ist das Signal schwächer. Der Kalibrierungsbalken repräsentiert 500 µm.
Abbildung 11: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung von Hippokampus - Proteinextrakten und präparierte Erythrozytenmembranen unter Verwendung des Antikörpers H9-85 (anti - erythrozytäres p4.1). In den zerebralen Gewebe wurden Proteinbanden mit einem Molekulargewicht von 80 kDa, 110 kDa und 120 kDa detektiert, die durch Zugabe des Antigens blockiert werden konnten. Der Antikörper detektierte im aufgetrennten Proteinhomogenat der Erythrozytenmembran nur die 78/ 80 kDa erythrozytäre p4.1 Bande.
Abbildung 12: Gleiche Mengen an Proteinhomogenat von humanem Temporalkortex, Hippokampus und Zerebellum wurden in einem 10% SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und mit dem Primärantikörper H9-85 inkubiert. In allen untersuchten Hirnregionen konnten die immunreaktiven Proteinbanden von 110 kDa und 120 kDa nachgewiesen werden
Abbildung 13: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Primärantikörper H9-85. In den nicht - zerebralen Geweben konnten keine höhermolekularen Proteinbanden von 110 kDa und 120 kDa detektiert werden. In Nierengewebe wurde eine höhermolekulare, immunreaktive Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 105 kDa detektiert. In allen Geweben wurde die 78 kDa und 80 kDa Bande nachgewiesen
Abbildung 14: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Primärantikörper H9-85. Mittels Mikrostanzen wurde aus Temporalkortex graue und weiße Substanz entnommen. Nur in der grauen Substanz konnten die 110 kDa und 120 kDa Proteinbanden detektiert werden. Der Proteinextrakt wurde in einem weiteren Schritt in ein 100.000 g Pellet „Membranfraktion“ und in den Überstand „Zytosolfraktion“ aufgetrennt. Nur im Pellet (Membranen mit den daran assoziierten Proteinen) konnten die immunreaktiven Proteine nachgewiesen werden.
Abbildung 15: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung unter Verwendung eines Klon 9 - spezifischen Peptidantikörpers. Aufgetrennt wurden gleiche Proteinmengen von humanem Temporalkortex und Gesamthirn der Ratte. Es konnten in humanen Hirn immunreaktive Proteine mit einem Molekulargewicht von 110 kDa und eine 120 kDa Proteinbande nachgewiesen werden, die mit dem Antigen blockierbar waren.
Abbildung 16: Immunhistochemische Färbung von humanem Temporalkortex (80 µm) mit dem Primärantikörper H2B6 [Antigen: Peptid 1] (1:100). In (a) ist die weiße Substanz, die unterhalb des temporalen Isokortex liegt, dargestellt. Es konnten keine gefärbten zellulären Elemente, sondern nur granuläres, im neuropil liegendes immunreaktives Material detektiert werden. Neben der Färbung dieses granulären Materials wurden in der grauen Substanz auch die Perikarya von Neuronen und deren Dendriten (siehe Pfeil) markiert (b). Die neuronale Färbung konnte nach Präabsorption des Antikörpers mit dem Antigen komplett geblockt werden, dies deutet auf eine spezifische Färbung der Neurone hin (c). Neben der zarten und homogenen Markierung der neuronalen Soma und Hauptdendriten wurden auch feinere und kleine Dendriten angefärbt. Bei einer stärkeren Vergrößerung ist eine intensive punktuierte Färbung von Soma und Dendriten zu erkennen (d, e), große Pfeile in (d) und (e). Diese punktuierte Färbung konnte auch in Regionen nachgewiesen werden, die keine Lipofuszingranula enthielten. Dies läßt darauf schließen, daß die Färbung nicht auf Lipofuszinablagerungen zurückzuführen war (e). Die Immunreaktion variierte beträchtlich, neben einer sehr starken konnte auch eine zarte Färbung von neuronalen Zellen gefunden werden z.B. in (e) die mit einem Stern markierte kleine Gruppe von sehr schwach markierten Neuronen. In (f) sind zwei immunreaktive Neurone dargestellt, die eine typisch intensive, punktuierte Färbung des Zytoplasmas (siehe Pfeile) zeigen. Die Pfeilspitze deutet auf eine typische unspezifische Färbung von wahrscheinlich extrazellulärem Material, das auch in (d), (b) und (c) zu sehen ist. Wie in (c) zu erkennen ist, wurde die unspezifische Färbung stärker und zahlreicher, als das spezifische Signal des Antikörpers durch Präabsorption mit dem Antigen blockiert wurde. Der Pfeil in (g) zeigt auf den hellen angefärbten Nukleolus im ebenfalls hellen Kern. Das Zytoplasma ist diffus hell angefärbt, wogegen die feinen intensiv gefärbten Granula hervorstehen. Der Kalibrierungsbalken repräsentiert 50 µm in (a-c) und 25 µm in (d-g).
Abbildung 17: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Antikörper H9-85. Im zerebralen Proteinextrakt der Ratte wurden, im Gegensatz zu den p4.1-immunreaktiven Banden von 110 kDa und 120 kDa im humanen zerebralen Proteinhomogenat, Proteinbanden von 115 kDa und 130 kDa detektiert. Gleich waren die Banden bei 78 kDa und 80 kDa.
Abbildung 18: Immunoblots einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Primärantikörper H9-85. Aus dem Gehirn der Ratte wurde ein Proteinhomogenat hergestellt und dieses in einem weiteren Schritt in eine Membranfraktion (100.000 g Pellet) mit den daran assoziierten Proteinen und eine Zytosolfraktion (100.000 g Überstand) aufgetrennt. Im Gegensatz zum Menschen ist in beiden Fraktionen eine 115 kDa und eine 130 kDa p4.1-immunreaktive Proteinbande nachzuweisen. In dem unten abgebildeten Immunoblot wurden aus dem Rattenhirn Temporalkortex, Thalamus und Zerebellum präpariert und von diesen Proteinhomogenate hergestellt. Die 115 kDa und 130 kDa Banden konnten in Zerebellum, Temporalkortex und Thalamus nachgewiesen werden.
Abbildung 19: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Antikörper H9-85. In diesem Versuchsansatz wurde überprüft, ob post mortale Lagerung (Autolyse) eine Auswirkung auf die Stabilität und die nachweisbare Menge der immunreaktiven Proteine hatte. Dafür wurden Rattengehirne präpariert und diese bei 4°C in einer feuchten Kammer gelagert. Zu Beginn des Versuches (0 h) und nach 12, 24 und 48 h wurden Proteinhomogenate hergestellt.
Abbildung 20: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Primärantikörper H9-85. Es wurden die p4.1-immunreaktiven Proteine nachgewiesen. Aufgetrennt wurden die Proteinhomogenate von primären Neuronen-, Astroglia- und Mikrogliakulturen.
Abbildung 21: Konfokale Laserscan-mikroskopische Darstellung von Neuronen, die mit dem Primärantikörper H2B6 und FITC-markierten Phalloidin gefärbt wurden. In der Abbildung sind die immunreaktiven p4.1 Proteine rot und das Mikrofilament-System der Zelle grün dargestellt. Die Kolokalisation der beiden Proteine stellt sich gelb dar.
Abbildung 22: Vereinfachte Darstellung der Cholesterinbiosynthese und des Isoprenoidseitenweges
Abbildung 23: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Antikörper H9-85. Eine 7 Tage alte, in cholesterinfreiem Medium gehaltene Neuronenkultur wurde in separaten Versuchsansätzen wie folgt behandelt: Mit Lovastatin; Mevalonat; Lovastatin und Mevalonat. Proteinhomogenate wurden zu Beginn des Experimentes und nach 1, 2 und 3 Tagen hergestellt. Als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Zu erkennen ist eine Herunterregulation der 115 kDa und 130 kDa Proteinbande nach 2 Tagen, ab Tag 3 sind diese Banden verschwunden. Die 80 kDa Bande wurde von dieser Behandlung nicht beeinflußt.
Abbildung 24: Neuronenkulturen, die 7 Tage auf cholesterinfreiem Medium gehalten wurden, wurden in verschiedenen Ansätzen wie folgt behandelt: mit Lovastatin; Lovastatin und Mevalonat; Lovastatin und Geranylgeranylpyrophosphat; GGT-Inhibitor. Nach 24, 48 und 72 h wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit FITC-markiertem Phalloidin eine immunfluoreszenz Untersuchung durchgeführt. Als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Der Kalibrierungsbalken entspricht 100 µm.
Abbildung 25: Analyse der mRNA von p4.1 und GAPDH in einem semiquantitativen RT-PCR Ansatz. Neuronenkulturen, die 7 Tage auf cholesterinfreiem Medium gehalten wurden, wurden mit Lovastatin, Mevalonat, Lovastatin und Mevalonat behandelt, als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Nach 2 Tagen wurde aus den Neuronen der verschiedenen Versuchsansätze Gesamt-RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mit spezifischen p4.1- und GAPDH-Primern eine RT-PCR durchgeführt. Zuerst wurden die Zyklenzahl für Protein 4.1 und GAPDH in Konzentrationsreihen so eingestellt, daß die Sättigungsphase noch nicht erreicht wurde. Anschließend wurde eine PCR mit p4.1-Primern und GAPDH-Primern durchgeführt und die Amplifikate in einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Gele wurden gefärbt und die optische Dichten der Banden bestimmt. In der Abbildung ist ein typisches Ergebnis der semiquantitativen Untersuchung dargestellt. Eine graphische Darstellung der RT-PCR Ergebnisse ist in Abbildung 26 gezeigt.
Abbildung 26: Graphische Auswertung der Ergebnisse der semiquantitativen RT-PCR. In allen Experimenten wurde die optische Dichte der PCR-Amplifikate densitometrisch bestimmt und anschließend auf GAPDH normiert. Dargestellt ist das Verhältnis der optischen Dichten der Banden: Protein 4.1 zu GADPH des jeweiligen Versuchsansatzes. In a) wurden in verschiedenen Versuchsansätzen Neuronenkulturen mit Lovastatin; Mevalonat; und Lovastatin plus Mevalonat zu Beginn des Experimentes behandelt und nach 24 h Gesamt-RNA isoliert. In weiteren Versuchsansätzen wurden Neurone mit Lovastatin behandelt und 24 h oder 48 h nach der Lovastatingabe Mevalonat zugegeben. Anschließend wurde 24 h nach der Mevalonatzugabe Gesamt RNA isoliert. 1,5 µg Gesamt-RNA wurde revers transkribiert und eine semiquantitative PCR durchgeführt. Eine statistische Auswertung der Daten (n =6) erfolgte mit einem Student´s T-Test, der Fehlerbalken stellt den „standard error of mean“ dar. Es ist eine signifikante Herunterregulation der p4.1 mRNA bei der Zugabe von Lovastatin zu erkennen, sowie eine signifikante Hochregulation nach Mevalonatzugabe. Zur Überprüfung der Ergebnisse wurde als Referenzgen Aktin verwendet und dasselbe Ergebnis erhalten (Daten werden nicht gezeigt). GAPDH wurde als Referenzgen verwendet, da in den Ansatz b) das Mikrofilament-System und in Ansatz c) das Mikrotubuli-System der Neurone destabilisiert wurden. In den Versuchsansatz b) und c) konnte zwar ein leichtes Schwanken der p4.1 mRNA nachgewiesen werden, das aber nicht signifikant war.
Abbildung 27: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit Primärantikörper H9-85. Proteinhomogenate von Neuronen, die mit einem Inhibitor der GGT-I behandelt wurden, wurden nach 1 und 2 Tagen Inkubationszeit hergestellt. Als Vergleich wurden unbehandelte Neurone verwendet. Zu Erkennen ist die Herunterregulation der 115 kDa und 130 kDa Proteinbande schon nach dem 1. Tag.
Abbildung 28: Neuronenkulturen wurden 7 Tage auf cholesterinfreiem Medium gehalten und anschließend in verschiedenen Versuchsansätzen wie folgt behandelt: Mit Lovastatin; mit Lovastatin plus Mevalonat; mit GGT-Inhibitor; und mit Lovastatin plus Geranylgeranylpyrophosphat. Die Versuchsansätze Lovastatin, sowie Lovastatin plus Mevalonat wurden nach 48 h mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Versuchsansätze GGT-Inhibitor, sowie Lovastatin plus Geranylgeranylpyrophosphat wurden nach 24 h mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurde die fixierten Neurone mit dem Antiserum H2B6 (p4.1) und FITC-markiertem Phalloidin (grün), eine immunzytochemische Untersuchung durchgeführt. In der Abbildung sind die p4.1 immunreaktiven Proteine rot und das Mikrofilament-System grün dargestellt. Eine Kolokalisation der beiden Proteine ist an der Mischfarbe gelb zu erkennen. Als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Der Kalibrierungsbalken entspricht 100 µm.
Abbildung 29: Aus den Hippokampi von neurologischen unauffälligen Patienten (n=5) und Alzheimer-Patienten (n=4) wurde Gesamt-RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und eine RT-PCR durchgeführt. Dabei wurden die Primer der Spleißregion 1 (Exon 2-6; pan-EPB41) und Klon 9 - spezifische Primer verwendet. Die Amplifikate wurden auf einem 1,5% Agarosegel aufgetrennt. Dargestellt ist ein typisches RT-PCR Ergebnis.
Abbildung 30: Aus den Hippokampi von neurologischen unauffälligen Patienten (n = 5) und Alzheimer-Patienten (n = 4) wurde gesamt-RNA isoliert, 1,5 µg der Gesamt-RNA wurde in cDNA umgeschrieben und eine RT-PCR durchgeführt. Dabei wurden pan-EPB41 Primer und Klon 9 - spezifische Primer verwendet. Die optischen Dichten der Banden wurden densitometrisch bestimmt und das Verhältnis Klon 9 zu pan-EPB41 gebildet. Der Fehlerbalken symbolisiert dem SEM der Experimente („standard error of mean“). Die Signifikant des Experimentes wurde mit einem Student´s T-Test überprüft.

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Mon Oct 1 14:07:23 2001