Jacobi, Carsten: Charakterisierung von EPB41 - Spleißformen im menschlichen Gehirn

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Das Zytoskelett des Neurons

Das Zytoskelett einer Zelle ist ein komplexes Geflecht aus Proteinfilamenten, das sich durch das Zytoplasma erstreckt. Im Neuron sind das Mikrofilament-System, das Mikrotubuli-System und das Neurofilament für die Struktur und Funktion des Zytoskeletts von Bedeutung.

Das Mikrotubuli-System besteht aus polaren Polymeren, die in 13 Protofilamente weiter unterteilt werden können. Die Mikrotubuli werden durch Mikrotubuli-assoziierte Proteine (z.B. MAP-2 und tau-Protein) reguliert und stabilisiert. Neben dem intrazellulären Transport von Membranvesikeln [Vale, 1987; Vale et al. 1985; Vallee et al., 1988] übt das Mikrotubuli-System auch eine strukturierende Funktion auf das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat aus [Allan et al., 1986; Dabora et al. 1988; Lee et al. 1988].

Die Neurofilamentbündel (Neurofibrillen) werden durch Polymerisation von Neurofilament-Protein gebildet. Das Neurofilament hat in der Zelle eine strukturelle und spannungstragende Funktion [Steinert et al., 1988; Traub, 1985].

Das Mikrofilament wird durch Polymerisation von globulären Aktin-Monomeren gebildet und ist Hauptbestandteil von allen Zellen. Der größte Teil des Mikrofilament-Systems ist mit der Plasmamembran über Proteine assoziiert. Das Mikrofilament-System hat große Bedeutung in der Zellwanderung und in der polaren Differenzierung von Zellen.

Für die Ausbildung des neuronalen Netzwerkes müssen Zell-Zell-Kontaktstellen zwischen Neuronen entstehen. 1890 veröffentlichte Ramon y Cajal die Entdeckung des Wachstumskegels als terminale Struktur einer neuronalen Zelle. Die Bewegung des Wachstumskegels ist von dem Mikrotubuli-System und dem Mikrofilament-System abhängig. Das Mikrotubuli-System ist für die Wanderung des Wachstumskegels verantwortlich. Die Richtung des Wachstumskegels wird von dem Mikrofilament-System über die Ausbildung von Lamellipodien und Mikrospikes bestimmt. Hauptvertreter neuronaler Zell-Zell-Kontakte sind axo-dendritische Synapsen.

Die polare Differenzierung von Nervenzellen in Dendriten und Axonen ist eine entscheidende Voraussetzung für eine geordnete neuronale Aktivität und damit für die Funktionsfähigkeit des gesamten Nervensystems. Für die Ausbildung und Aufrechterhaltung der Dendriten- und der Axonenstruktur, wie auch für das kompartimentspezifische Sortieren von funktionell wichtigen Membranproteinen, Rezeptoren, Transportern und Ionenkanälen, sind Proteine des Zytoskelettes von großer Bedeutung. Der Protein 4.1-Superfamilie werden regulatorische und strukturierende Funktionen bei der Organisation des Zytoskelettes zugeordnet.

1.2 Die Protein 4.1-Superfamilie

Mitglieder der Protein 4.1-Superfamilie können als periphere Membranproteine bezeichnet werden, die Transmembranproteine - in den meisten Fällen - mit dem Mikrofilament verknüpfen. Der Namensgeber dieser Familie ist das erythrozytäre Protein 4.1 (ehemalige Bezeichnung Bande 4.1, jetzt p4.1R). Gemeinsames Kennzeichen dieser Familie ist die FERM (p4.1, Ezrin, Radixin, Moesin) Domäne, die eine große Homologie zwischen allen Mitgliedern aufweist. Die FERM Domäne ist für die Interaktion mit Transmembranproteinen verantwortlich [Chishti et al., 1998]. Die Mitglieder der Superfamilie sind in Abbildung 1 dargestellt.


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Die p4.1-Superfamilie besteht aus der p4.1-Familie, der ERM-Familie [Rouleau et al., 1993; Trofatter et al., 1993], der PTPH1-Familie [Yang et al., 1991] dem Zell-Zell-Kontaktprotein Talin [Rees et al., 1990], dem Drosophila melanogaster homologen Protein DmCoracle [Fehon et al., 1994], den Proteintyrosinkinasen Fak (“focal adhesion kinase“) und PYK2 (“proline-rich tyrosine kinase 2“) [Girault et al., 1999] und den Aktin - bindenden Transportproteinen Myosin VIIa und Myosin XV [Sellers, 1999]. Die Mitglieder der Superfamilie üben in der Zelle unterschiedliche Funktionen aus, so ist eine Beteiligung an Signaltransduktionsvorgängen, Zellzyklus -Kontrolle, Differenzierungs- und Reifungsprozessen sowie an der Gedächtnisbildung nachgewiesen worden [Chishti et al., 1998; Walensky et al., 1998; Yakushijin et al., 1997].

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Mitglieder der p4.1-Superfamilie


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1.3 Die Protein 4.1-Familie

Das am längsten bekannte Mitglied der p4.1-Familie ist Protein 4.1R (auch als erythrozytäres Membranprotein Bande 4.1 bezeichnet; p4.1R).

Von dem EPB41-Gen wird durch alternatives Spleißen eine große Anzahl von Isoformen erzeugt, die entwicklungs- und/oder gewebespezifisch exprimiert werden können [Conboy 1993]. Weitere Mitglieder der p4.1-Familie sind die erst im letzten Jahr entdeckten Vertebraten paralogen Gene 4.1N (EPB41L1), 4.1G (EBP41L2) und 4.1B (EBP41L3) [Walensky et al., 1999; Walensky et al., 1998; Kim et al., 1998; Parra et al., 1998; Parra et al., 2000; Peters et al., 1998].

Die p4.1-Familie beinhaltet auch putative p4.1 - Orthologe in Drosophila melanogaster [Fehon et al., 1994], Xenopus laevis und Mus musculus. Die Identität dieser Proteine zu den Vertebraten p4.1R beträgt über die gesamte Sequenz 40% (p4.1N), 43% (p4.1G), 15% (DmCoracle) und 62% (Xenopus l. p4.1R). Die Homologie ist signifikant größer in den spezifischen Domänen: FERM Domäne (72-74%), die SABD (50-70%) (nicht in DmCoracle) und die Carboxy-terminale Domäne (CTD) (70-80%).

Die Gene, die für die humanen p4.1 Paraloge kodieren, sind auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert und zeigen ein unterschiedliches Expressionsmuster in neuronalen Geweben [Kim et al., 1998; Parra et al., 1998; Peters et al., 1998; Fehon et al., 1994].

Tabelle 1: Mitglieder der p4.1-Familie

Familien-mitglieder

Lokalisation (Chromosom)

Neuronale- Expression (in Maus und Ratte)

P4.1R

1

Expression in Neuronen des Okzipitalkortex und den Purkinjezellen, sowie in den Körnerzellen des Kleinhirns und der Fascia dentata.

P4.1G

6

Expression in beinahe allen Geweben, im Gehirn Expression in glialen Zellen.

P4.1N

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Expression in fast allen Neuronen, mit Ausnahme der Purkinjezellen sowie den thalamischen Neuronen.

P4.1B

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Expression nur in den Purkinjezellen und den thalamischen Neuronen; sowie den Neuronen der CA - Regionen des Hippokampus.

DmCoracle

Drosophila melanogaster

Expression in Geweben ektodermalen Ursprungs.


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Abbildung 2: Schematische Darstellung der Domänenorganisation der Proteine der p4.1-Familie. [Parra et al., 2000].


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1.4 Alternative Spleißvorgänge des EBP41-Gens

In Maus und Mensch umfaßt das EPB41-Gen (erythrozytäres Protein Bande 4.1) einen Bereich von 200 kb bis 300 kb und beinhaltet 24 identifizierte Exons [Baklouti et al., 1997; Huang et al., 1993], von denen über die Hälfte alternativ sind. Exon 2 und Exon 17 beinhalten noch zusätzlich interne Spleißstellen. Kombinatorische Spleißvorgänge könnten theoretisch eine große Anzahl von p4.1R Spleißformen erzeugen. Bei Untersuchungen von verschiedenen eukaryontischen Geweben konnten nur einige wenige Isoformen detektiert werden [Gascard et al., 1998]. Die exprimierten p4.1R-Isoformen können je nach Zelltypen stark variieren [Conboy et al., 1991a; Schischmanoff et al., 1997; Tang et al., 1990], was auf ein zelltypisches bzw. entwicklungsabhängiges Spleißmuster schließen läßt.

Gewebespezifische Spleißereignisse wurden für die folgenden Exons des EPB41-Gen beschrieben: Exon 17B (exprimiert während der Morphogenese von Säuger-Epithelzellen), Exon 17A (exprimiert in Muskelgewebe) sowie Exon 14 und Exon 15 (exprimiert in neuronalem Gewebe) [Baklouti et al., 1997; Schischmanoff et al., 1997; Chasis et al., 1993; Horne et al., 1993].

Es können aus dem EPB41-Gen Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten generiert werden. Dies ist davon abhängig, welche der drei Translations-Initiationsstellen benutzt und welche alternativen Exons herausgespleißt wurden. Von der ersten Translations-Initiationstelle (Exon 2´) werden Proteine mit einem Molekulargewicht von 110 kDa - 160 kDa, von der zweiten (Exon 4) Proteine von 60 kDa - 80 kDa, und von der dritten (Exon 8) p4.1R-Isoformen mit einem Molekulargewicht von 30 kDa - 60 kDa erhalten.


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Abbildung 3 Dargestellt ist die cDNA des EBP41 - Gens mit den alternativen Exons, den konstitutiven Exons und dem nicht - kodierenden Exon. Eingezeichnet sind die jeweiligen Exons des EPB41-Gens, die für die entsprechenden Domänen kodieren. Als Beispiel sind die Peptidfragmente des erythrozytären 80 kDa p4.1R - Proteins und die Bindungspartner gezeigt, die mit den Fragmenten interagieren können.


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1.5 Proteindomänen von Protein 4.1R

Die Variable Domäne 1 (V1)

Diese Region wird auch als N-terminale Domäne bezeichnet und ist nur in höher-molekularen p4.1R-Isoformen zu finden, bei denen das bereits erwähnte Exon 2´ nicht herausgespleißt wurde. Diese Domäne ist nicht in allen p4.1R-Proteinisoformen von Säugerzellen konserviert und wird von Exon 2 und zum Teil von Exon 4 gebildet (Exon 3 ist ein nicht kodierendes Exon).

Membranbindende Domäne (MBD), FERM Domäne

Die FERM Domäne wird von den Exons 4-12 kodiert. Von diesen Exons sind 4, 5 und 8 alternativ. Die erste Beschreibung der Domäne erfolgte durch eine alpha-chymotryptische Restriktion von erythrozytärem Protein 4.1. Bei diesem Verdau wurde das Protein in vier Fragmente gespalten:

30 kDa - N-terminales Fragment (MBD),

16 kDa - Fragment (Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase A und C),

10 kDa - Fragment (Spektrin / Aktin Bindungsdomäne; SABD),

22/24 kDa - C-terminales Fragment.

Die FERM Domäne beinhaltet das 30 kDa und Teile des 16 kDa - Fragmentes. Über diese Domäne erfolgt z.B. die Bindung von p4.1R an integrale Membranproteine. Eine ausführlichere Beschreibung ist unter Absatz 1.6 nachzulesen. Die FERM Domäne ist die am höchsten konservierte Domäne in der p4.1-Superfamilie, über die die Zuordnung zur p4.1-Superfamilie erfolgt [Chishti et al., 1998].

Variable Domäne 2 (V2)

Diese Domäne wird von dem konservierten Exon 13 (C-terminaler Teil der vorher beschriebenen 16 kDa Domäne) und den zusätzlichen alternativen Exons 14 und 15 kodiert. Exon 14 und 15 wurden bisher nur bei neuronalen Isoformen nachgewiesen. Die Funktion der Domäne ist zur Zeit noch nicht bekannt.

Spektrin - Aktin bindende Domäne (SABD)

Das alternative Exon 16 und das konstitutive Exon 17 kodieren diese Domäne, über die die Bindung an das Mikrofilament-System der Zelle erfolgt. Diese Domäne ist hochkonserviert, nicht nur unter der p4.1-Familie [Parra et al., 1998; Walensky et al., 1998], sondern auch unter den Orthologen p4.1R Proteinen von Amphibien und Vögeln [Winardi et al., 1995; Parra et al., 1998; Yew et al., 1987]. Das alternative Exon 16 deutet daraufhin, daß diese Domäne nicht in allen p4.1R-Isoformen funktionell gebraucht wird.


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Variable Domäne 3 (V3)

Die V3 Domäne wird von den alternativen Exons 17A und 17B exprimiert. Diese Domäne ist in den anderen p4.1-Familienmitgliedern zwischen der SABD und der CTD gelegen [Winardi et al., 1995]. Bei Untersuchungen von EPB41 - Spleißvarianten wurde bisher Exon 17B während der Morphogenese von Säuger-Epithelzellen und Exon 17A in Zellen des Muskelgewebes nachgewiesen [Baklouti et al., 1997; Schischmanoff et al., 1997].

Die C-terminale Domäne (CTD)

Auch diese Domäne ist hoch konserviert und in allen p4.1-Familienmitgliedern sowie dem Drosophila melanogaster homologen Protein DmCoracle zu finden. In dieser Domäne liegen die Bindungsstellen für das „Nuclear Mitotic Apparatus Protein“ (NuMA) [Mattagajasingh et al., 1996], das Immunophillin - bindende Protein FKBP13 [Walensky et al., 1998], eIF3-p44, einer Untereinheit des Translations-Initiationsfaktors 3 (eIF3) [Hou et al., 2000], und Bindungsstellen zu dem zur MAGUK-Familie (Membran-assoziierte Guanylatkinase Homolog) gehörenden Zonula Occludens Protein (ZO)-2 und ZO-1 [Mattagajasingh et al. 2000]. Die CTD wird von den Exons 18-21 gebildet, von denen Exon 18, 19 und 20 alternativ sind.

1.6 Bindungspartner der Protein 4.1-Familienmitglieder

Untersuchungen von eukaryontischen Zellen zeigten p4.1R-immunreaktive Proteine mit einem Molekulargewicht von 30 kDa - 210 kDa. Diese p4.1R Proteine konnten in den verschiedensten intrazellulären Bereichen, sowie im Zellkern und an den Zentrosomen nachgewiesen werden.

Über die FERM Domäne kann eine Interaktion mit den folgenden Proteinen erfolgen: Bande 3, Glycophorin C, Calmodulin, humanes „disc large“ Protein (hDlg), p55, Regulationsprotein des auswärts gleichrichtenden Chlorid-Kanals (pICln), Ca2+-Calmodulin-Kinase-II-Dlg/PSD-95-Homolog (CASK), Hyaluronat-bindendes Cluster-Differenzierungsprotein 44 (CD44), Neurexin IV, sowie den Phospholipiden Phosphatidylinositol-4-phosphat und Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat. Die Bindung an Spektrin und Aktin wird durch die SABD ermöglicht. Die CTD vermittelt, wie bereits erwähnt, die Bindung an FKPB13, NuMA, eIF3-p44, ZO-1 und ZO-2 [Walensky et al., 1998; Jöns et al., 1992; Ward et al., 1998; Lue et al., 1994; Marfatia et al., 1994; Kelly et al., 1991; Anderson et al., 1985; Tang et al., 1998; Cohen et al., 1998; Nunomura et al., 1997; Correas et al., 1986; Mattagajasingh et al., 1999].

Die Entdeckung von neuen Transmembranproteinen, die mit p4.1-Isoformen interagieren, wie dem Glykoprotein Paranodin, dem Protein Neurexin IV und Syndecan-2, haben zu einer erweiternden p4.1-Funktion mit der Plasmamembran geführt [Ward et al., 1998; Cohen et al., 1998; Menegoz et al., 1997; Baumgartner et al., 1996]. Bei dem gehirnspezifischen Neurexin-Mitglied Paranodin erfolgt die Bindung an p4.1 über die zytoplasmatische Domäne [Menegoz et al., 1997]. Paranodin ist spezifisch in der paranodalen Region zu finden, wo eine Zellverbindung zwischen Neuronen und glialen Zellen, die für die Myelinierung verantwortlich sind, stattfindet. Die Bindung von DmCoracle an Neurexin IV in Drosophila Melanogaster ist für die Bildung der Blut-Hirnschranke entscheidend [Lamb et al., 1998; Baumgartner et al. 1996]. Beide Proteine sind an Zell-Zell-Verbindungen lokalisiert worden [Fehon et al., 1994; Ward et al., 1998; Baumgartner et al., 1996].

Auch im Zellkern wurden p4.1-Isoformen nachgewiesen [Lallena et al., 1998; De Carcer et al., 1995; Krauss et al., 1997a; Krauss et al., 1997b]. Eine mögliche Funktion von p4.1-Isoformen im Zellkern ist die Beteiligung an Spleißvorgängen, da eine Interaktion mit


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Spleißfaktoren wie z.B. U2 snRNP Auxiliary Factor 35 (U2AF 35) gezeigt wurde [Lue et al., 1994; Marfatia et al., 1995; Hough et al., 1997; Lallena et al., 1998].

Eine andere Funktion von p4.1 liegt in der Beteiligung am Zusammenführen der mitotischen Spindel während der Zellteilung [Mattagajasingh et al., 1999]. Dabei interagieren die Proteine p4.1, NuMA, und Dynein miteinander. Dieser tertiäre Komplex ist notwendig für die Bildung der mitotischen Spindel [Merdes et al., 1996].

Es ist bekannt, daß MAGUK-Proteine Transmembranrezeptoren mit Ionenkanälen verknüpfen [Anderson, 1996]. Da p4.1-Isoformen einige Vertreter der MAGUK- Familie verankern können, ist eine Mitwirkung von p4.1-Isoformen an solchen Proteinkomplexen der Zell-Zell-Kommunikation möglich. Als Beispiel für diese Komplexe dient das Transmembranprotein Syndecan-2, an das p4.1 binden kann. Syndecan-2 interagiert mit der extrazellulären Matrix und dem Zytoskelett [Carey, 1997]. Man vermutet, daß die Bildung eines ternären Komplexes zwischen p4.1, Syndecan-2 und CASK die Funktion erfüllt, die Verbindung zwischen dem Zytoskelett und der extrazellulären Matrix zu stabilisieren [Hoover und Bryant, 2000].

Eine weitere Funktion von p4.1 wird bei dem Auswachsen und der Plastizität von Neuriten vermutet. Über das “GP1-anchored protein“ Contactin kann der Neuriten-Auswuchs aktiviert werden. Contactin interagiert mit dem Neurexin IV und kann so das Signal an das Zytoskelett vermitteln. Die direkte Assoziation von Neurexin IV mit p4.1 verstärkt die Verbindung mit dem darunterliegenden Zytoskelett [Peles et al., 1997].

1.7 Funktionen der Protein 4.1-Familie

Die biophysikalischen Eigenschaften der Erythrozytenmembran wie Deformierbarkeit (um Scherkräften zu widerstehen), sind abhängig von der p4.1R - Beteiligung an dem auf Spektrin basierenden zytoskeletalen Netzwerk.

P4.1R hat die Eigenschaft, durch die Interaktion mit den zytoplasmatischen Domänen von integralen Membranproteinen wie z.B. Glycophorin C und Bande 3, einen stereotypischen tertiären Komplex [p4.1R/Transmembranprotein/MAGUK] an der Plasmamembran zu bilden. Am Beispiel der Interaktion von p4.1R mit Glycophorin C und dem MAGUK-Protein p55 im Erythrozyten soll dieser Komplex erläutert werden.

Die FERM Domäne von p4.1R kann an die zytoplasmatische Domäne von Glycophorin C und an die HOOK Domäne (eine konservierte Domäne der MAGUK-Familie) von p55 binden [Marfatia et al., 1997; Hemming et al., 1994; Nunomura et al., 2000]. Die Bindung der FERM Domäne an Glycophorin C und p55 beruht auf der Interaktion von verschiedenen Aminosäure-Motiven. P55 kann auch direkt über seine PDZ Domäne mit dem C-Terminus von Glycophorin C interagieren, was zur Folge hat, daß die Affinität zur Bindung von p4.1R an Glycophorin C erhöht ist [Hemming et al., 1994]. In der Studie von Nunomura et al. (2000) wurde folgende Reihenfolge in der Bildung des tertiären Komplexes gezeigt. Zuerst kommt es zur Bildung des Heterodimers von p55 mit p4.1R, anschließend erfolgt die Bindung diese Heterodimers an Glycophorin C. In dieser Studie konnte eine mögliche Regulation des Komplexes über die Konzentration an intrazellulären Ca2+-Ionen gezeigt werden. P4.1R-Isoformen haben zwei Calmodulin Bindungsstellen eine Ca2+-abhängige und eine Ca2+-unabhängige. Bei einem Ca2+-Einstrom in die Zelle kann Calmodulin nicht mehr binden, dies beeinflußt die Struktur der FERM Domäne und somit die Bindungsaffinität der p4.1R-Isoformen in dem jeweiligen Komplex [Nunomura et al., 2000].

Mutationen im EPB41-Gen oder das Nicht-exprimieren von p4.1R-Isoformen im Erythrozyten hat eine instabile Membran zur Folge, die leicht fragmentiert. So hat die


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Abwesenheit von p4.1R zur Folge, daß zum einen der ternäre Komplex zwischen Transmembranproteinen und Proteinen der MAGUK-Familie nicht zustande kommt, und zum anderen die Transmembranproteine nicht mit dem Mikrofilament-System verknüpft werden.

Zusammengefaßt kann man sagen, daß p4.1R-Isoformen zwei wichtige Funktionen ausüben. Zum einen eine Ankerfunktion, welche die Verknüpfung von Komplexen zwischen Proteinen der MAGUK-Familie und Transmembranproteinen ermöglicht, und zum anderen das gleichzeitige Binden an das Mikrofilament-System der Zelle.

Als Beispiel für die letztgenannte Funktion ist in der nachfolgenden Abbildung die Interaktion von p4.1R mit Occludin, ZO-1 und ZO-2 dargestellt [Mattagajasingh et al., 2000]. Eine Regulation von p4.1R-Proteinisoformen könnte auch durch Phosphorylierungsvorgänge des Rho-abhängigen Signaltransduktionsweg erfolgen, da diese Regulation bei Proteine der ERM-Familie bekannt ist. Es wird vermutet, daß z.B. ERM-Proteine aufgrund einer intramolekularen Faltung inaktiv in der Zelle vorliegen. Die Phosphorylierung des Proteins bewirkt eine strukturelle Änderung des Moleküls und dadurch die Aktivierung der Bindungszentren [Pearson et al., 2000].

Abbildung 4: Schematische Darstellung der möglichen Rolle von p4.1R in einem tertiären Komplex. Als Beispiel ist die Beteiligung von p4.1R bei der Verknüpfung von „tight junction“ Proteine mit dem Mikrofilament-System der Zelle gewählt [aus Mattagajasingh et al., 2000].


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1.8 Neuronale Funktion von p4.1R - Proteinisoformen

P4.1R ist ein wichtiges Element bei der Organisation des Mikrofilament - Systems. Dabei ist die Funktion von p4.1R einerseits die eines „Ankerproteins“ zwischen Transmembranproteinen und Proteinen der MAGUK-Familie, sowie andererseits durch die Verknüpfung dieses Komplexes an das Zytoskelett definiert.

Auf- und Umbau des Zytoskelettes spielen wesentliche Rollen bei neuronaler Plastizität, wie sie bei Prozessen der Entwicklung, dem Lernen und der Gedächtnisbildung, aber auch der De- und Regeneration vorkommen. Mäuse, die gentechnisch so verändert wurden, daß keine p4.1R-Isoformen exprimiert wurden, zeigten neben Veränderungen der Erythrozyten-Morphologie auch Lern- und Verhaltensdefizite [Walensky et al., 1998]. Bei dem Lernprozeß bzw. der Gedächtnisbildung spielt die molekulare Schicht der Fascia dentata eine wichtige Rolle. In diesen Zellen konnten bei Untersuchungen von der p4.1-Familie bisher nur EPB41 - Isoformen detektiert werden [Parra et al., 2000]. Juvenile (Niemann Pick Typ C) und senile Demenzen (Alzheimer) zeigen massive Zytoskelettabnormalitäten. In beiden Erkrankungen kommt es zu einer Destabilisierung des Zytoskeletts, wobei sich das die Mikrotubuli - stabilisierende tau - Protein zu unlöslichen Filamenten verbindet. Diese meist paarig helikalen Filamente (PHF) sind lichtmikroskopisch als „tangles“ und „neurophil threads“ in Soma und Dendriten der Neurone zu erkennen. Sihag und Mitarbeiter (1994) konnten zeigen, daß p4.1R-Isoformen ein Bestandteil dieser Tangles sind.

1.9 Ziel der Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war herauszufinden, welche höhermolekularen EPB41 - Isoformen im menschlichen Gehirn exprimiert werden. Für diese Untersuchung wurde eine RNA Isolationsmethode für post mortales Gewebe etabliert. Die Gesamt-RNA wurde in cDNA umgeschrieben und mit EPB41 - spezifischen Primern eine PCR durchgeführt. Zwei der klonierten Isoformen (Klon 9 und Klon 13) wurden weiter charakterisiert. Weiterhin wurde eine In-situ-Hybridisierung etabliert und mit EPB41 - spezifischen Sonden das Verteilungsmuster der entsprechenden mRNA in humanem hippokampalen Gewebe untersucht.

Für proteinbiochemische und immunhistochemische Untersuchungen an humanem zerebralen Gewebe wurden gegen erythrozytäres p4.1-Protein, sowie EPB41 - spezifische Peptidantikörper hergestellt.

Weiterhin sollte untersucht werden, ob ein unterschiedliches Verteilungsmuster von EPB41 - Spleißformen zwischen Gesunden und Alzheimer Patienten festzustellen ist.

Experimentell sollte anhand von proteinbiochemischen, immunzytochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen festgestellt werden, ob p4.1 - Moleküle in Abhängigkeit des funktionellen Pools von Proteinen der Rho-Familie reguliert werden. Hierzu wurden dissoziierte, neuronale Kulturen des Hippokampus der Ratte als Modellsystem verwendet und p4.1R-Isoformen der Ratte analysiert.


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Mon Oct 1 14:07:23 2001