Jacobi, Carsten: Charakterisierung von EPB41 - Spleißformen im menschlichen Gehirn

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Untersuchung des EBP41 Gens auf Spleißvarianten im menschlichen Gehirn

Nach der Etablierung der RT-PCR wurde das Expressionsmuster des EPB41-Gens im humanen Gehirn untersucht. Hierfür wurden aus den zerebralen Geweben Hippokampus, Frontal-, Okzipital-, Temporalkortex und Zerebellum RNA isoliert, revers transkribiert und mittels der PCR die drei bekannten Spleißregionen des EPB41-Gens untersucht.

Abbildung 5: Dargestellt ist die cDNA des EPB41-Gens mit der Position der Primer, die für die Generierung von alternativen Spleißformen der Spleißregion 1 (Exon 2-6), Spleißregion 2 (Exon 12-17) und Spleißregion 3 (Exon 17-21) verwendet wurden.

Mit den Primern Exon 2 und Exon 6 wurde die erste Spleißregion, mit den Primern Exon 12 und Exon 17 die mittlere und mit den Primern Exon 17 und Exon 21 die C-terminale Spleißregion untersucht. Mit allen eingesetzten Primern konnte ein reproduzierbares Bandenmuster amplifiziert werden. Mit den Primern für die erste und zweite Spleißregion konnten mehrere Banden amplifiziert werden, im Gegensatz zu der einen Bande der C-terminalen Spleißregion (siehe Abbildung 6). Vergleicht man das generierte Bandenmuster der einzelnen Hirnregionen miteinander, so sind auf die jeweilige Spleißregion bezogen keine wesentlichen Unterschiede im Bandenmuster zu erkennen.


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Abbildung 6: Aus den verschiedenen zerebralen Regionen wurde Gesamt-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Dargestellt sind die generierten Amplifikate über die Spleißregion 1 (Exon 2-6), 2 (Exon 12-17) und 3 (Exon 17-21), sowie das Amplifikat der Aktin-PCR

3.2 Klonierung der Gesamtsequenz

Für die Klonierung der Gesamtsequenz wurden die Primer Exon 2´ und Exon 21 verwendet, die die gesamte kodierende Region des EBP41-Gens umspannen. Es wurde in diesem RT-PCR Ansatz cDNA aus verschiedenen kortikalen Geweben verwendet. Für die Amplifikation der Gesamtsequenz der höhermolekularen EPB41 - Isoformen erwies sich die vorher verwendete AGS-Gold-Polymerase als nicht geeignet, da keine bzw. Amplifikate in zu geringer Menge erhalten wurden. Aus diesem Grund wurde diese Polymerase durch die cDNA-Polymerase von Promega ersetzt. Mit dieser Polymerase war es zum einen möglich, Amplifikate in ausreichender Menge für die anschließende Klonierung zu generieren, und zum anderen wurden Amplifikate bis zu einer Länge von


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2.5 kb erhalten. Die Amplifikate wurden, wie unter Absatz 2.6 beschrieben, kloniert und sequenziert.

Abbildung 7: Aus den verschiedenen zerebralen Regionen wurde gesamt RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mit Primern die Gesamtlängen von Spleißformen des EPB41-Gens generiert.

Die Sequenzen wurden mit dem Programm „Contig-Express“ aus der Software von DNAstar zusammengesetzt. Von den erhaltenen Klonen wurde Klon 13 und Klon 9 weiter charakterisiert, da es sich bei diesen um höhermolekulare Spleißformen handelte. Die vollständige Sequenz des jeweiligen Klons wurde mit dem Programm Blast in der NCBI - Gen-Datenbank analysiert. Klon 13 zeigte eine Ähnlichkeit von 97,3% und Klon 9 eine Ähnlichkeit von 98,3% auf Nukleinsäureebene mit HUMEMP41 (die Sequenz des EPB41-Gens cDNA, Genbank accession number M61733). Klon 13 war identisch zu EBP41 (Genbank accession number AF156225). Die Sequenz EPB41 wurde im Juni 1999 von Huang et al. (1999) in der Gendatenbank veröffentlicht, die Arbeitsgruppe isolierte diese Spleißform des EPB41-Gens aus der humanen Neuroblastomzellinie LAN 5. Ein Sequenzvergleich der beiden Klone mit Vertretern der p4.1-Familie zeigte, daß es sich um Spleißformen des EPB41-Gens handelte. Um festzustellen, aus welchen Exons die Spleißformen gebildet werden, wurde das Alignment-Programm der Software DNAstar verwendet. Die jeweilige DNA-Sequenz eines Exons [nach Baklouti et al., 1997] wurde mit den Sequenzen der Klone verglichen und so überprüft, welche Exons enthalten waren.

Als vereinfachte Übersicht ist in der nachfolgenden Abbildung dargestellt, aus welchen Exons der jeweilige Klon besteht. Im Vergleich ist die Gesamtsequenz des EPB41-Gens aufgetragen.


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Abbildung 8: Diagramm der generierten EPB41 - Spleißformen. Oben ist die EPB41 cDNA mit den alternativen Exons, den konstitutiven Exons und dem nicht kodierenden Exon dargestellt. Identifizierung der Exons von Klon 9 (EPB41 Delta 3, 4, 5 16, 17a, 17b) und Klon 13 (EPB41 Delta 3, 17a, 17b) im Vergleich zu der cDNA von EPB41

In beiden Klonen ist Exon 2´ enthalten. Auf diesem befindet sich die erste Translations-Initiationsstelle, die den Startpunkt für Moleküle mit einem Molekulargewicht von 110 kDa - 160 kDa darstellt. Die FERM Domäne wird durch die Exons 4-12 gebildet. Diese Domäne beinhaltet Motive, die für die Interaktion mit Proteinen wie z.B. Bande 3 (AE1), Glycophorin C, p55 und Calmodulin verantwortlich sind. Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind die Bindungsmotive von nur einigen Bindungspartnern, die sich auf der Domäne befinden, identifiziert worden. Auf Exon 5 befindet sich das LEEDY-Motiv über das die Bindung an Glycophorin C und an Bande 3 im Erythrozyten erfolgt. Bei Klon 9 wurde Exon 5 herausgespleißt, woraus resultiert, daß keine Interaktion mit Bindungspartnern über das LEEDY-Motiv erfolgen kann.

In beiden Klonen sind die Bindungsmotive für Calmodulin exprimiert, die Ca2+-abhängige Bindungsstelle auf Exon 9 und die Ca2+-unabhängige Bindungsstelle auf Exon 10. In beiden Klonen sind die Exons 14 und 15 exprimiert. Dies ist einerseits ein Hinweis, daß es sich um neuronale Isoformen des EPB41-Gens handelt, zum anderen ist damit die sogenannte V2 Domäne entstanden, deren Funktion allerdings bisher nicht bekannt ist. Bei Klon 9 wurde Exon 16 herausgespleißt. Exon 16 bildet zusammen mit Exon 17 die Spektrin-Aktin Bindungsdomäne (SABD), über die die Interaktion mit dem Spektrin/Aktin-Filament der Zelle erfolgt. Dies bedeutet, daß Klon 9 so nicht an das Spektrin/Aktin-Filament binden kann. Die C-terminale Domäne (CTD) ist in beiden Klonen vollständig vorhanden

3.3 In-situ-Hybridisierung mit EPB41 - Sonden

Das Expressionsmuster der Spleißformen des EPB41-Gens sowie die Expression von Klon 9 wurden in einer nicht-radioaktiven In-situ-Hybridisierung untersucht. Mit allen verwendeten Antisense-Sonden wurden Neurone detektiert (Abbildung 9). Im temporalen Isokortex war die Markierung in den tieferen Schichten stärker (9 a). Eine Analyse des Hippokampus zeigte ein Hybridisierungssignal in den Neuronen der Fascia dentata, der Cornu ammonis - Regionen (CA) 1-4 und des Subikulums (Abb. 9 b-g). Bei näherer Betrachtung der Körnerzellen erkennt man, daß der Zellkern nicht oder nur schwach


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angefärbt wurde (Abb. 9 h). Bei den Pyramidenneurone des Isokortex oder des Hippokampus war der Zellkern nicht abgrenzbar (Abb. 9 i). Die In-situ-Hybridisierungen mit einer Sense-Sonde zeigten keine Zellfärbung, außer einer unspezifischen Färbung von Lipofuszingranula sowie in einigen Fällen eine Anfärbung von Gefäßen (Abb. 9 j). Die Färbung der Granula waren auch bei der Verwendung von Antisense-Sonden zu erkennen. Dieses unspezifische Signal war deutlich von dem spezifischen Signal der Antisense-Sonde zu unterscheiden, da die Granula z.B. in den apikalen Dendriten des Subikulums von Neuronen lokalisiert sind. Hier wurde kein Hybridisierungsprodukt erwartet und konnte auch keines gefunden werden (Abb. 9 g, siehe Pfeilmarkierung). In keinem der untersuchten Fälle konnte das Hybridisierungssignal in Gliazellen detektiert werden.

Für die Untersuchung der Expression von allen Spleißformen des EPB41-Gens wurden Sonden aus den konservativen Exons 2 und 6 (pan-EPB41 Sonden) gewählt. Mit diesen Sonden zeigten die CA - Regionen des Hippokampus eine leicht unterschiedliche Intensität des neuronalen Signals, das in der Reihenfolge CA1 > CA4 > CA3 > CA2 abnahm. Auch Körnerzellen der Fascia dentata zeigten ein positives Signal, das in der Intensität den Pyramidenneuronen der CA3 Region entsprach. Mit den Antisense-Sonden Exon 2 und Exon 6 wurde die gleiche Färbung erhalten (Abb. 10).

Um die Expression von Klon 9 zu detektieren, wurde eine Sonde über die erste Spleißstelle gelegt (Exons 2-6, siehe Tabelle 4). Im Gegensatz zu den vorher beschriebenen In-situ-Hybridisierungen mit Sonden, die alle EPB41 - Isoformen detektierten, war bei der Verwendung der Klon 9-spezifischen Sonde kein Unterschied in der Signalintensität zwischen den einzelnen CA - Regionen und den Körnerzellen der Fascia dentata zu erkennen. Das erhaltene Signal schien bei gleicher Entwicklungszeit etwa um die Hälfte geringer als bei den verwendeten anderen Sonden, was auf eine niedrigere Expression schließen läßt. (Abb. 10).

Als Kontrolle wurden verschiedene Digoxigenin - markierte Sense-Sonden des EPB41-Gens verwendet und kein Hybridisierungssignal konnte detektiert werden.


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Abbildung 9: In-situ-Hybridisierung mit einer Sonde, die alle Spleißformen des EPB41-Gens detektiert. a) Dargestellt sind die verschiedenen Schichten des Isokortex, in allen Schichten wurden Neurone der grauen Substanz markiert. Die römischen Zahlen kennzeichnen die einzelnen kortikalen Schichten; weiße Substanz (WM). Ein Hybridisierungssignal wurde in der molekularen Schicht, in den Neuronen der Fascia dentata (b), den Cornu ammonis - Regionen CA1 (d), CA2 (f), CA3 (c), CA4 (e) und denen des Subikulums (g) erhalten. Die Pfeilspitzen in (g) deuten auf unspezifisch gefärbte typische Lipofuszingranula in den apikalen Dendriten der Pyramidenneurone des Subikulums. Die Pfeile in (c) und (i) deuten auf Astrozyten, die aufgrund ihrer Lipofuszingranula zu erkennen sind, aber kein Hybridisierungssignal aufweisen. Die Körnerzellen der Fascia dentata (h) zeigen ein im wesentlichen auf das Zytoplasma beschränktes Hybridisierungssignal. Bei der starken Färbung der Pyramidenzellen der CA - Regionen scheint in einigen Fällen eine Markierung des Zellkerns vorzuliegen (i). Eine In-situ-Hybridisierung mit einer Sense-Sonde zeigte keine Zellmarkierung (j, k). Ein Hybridisierungssignal konnte in keinem der untersuchten Fällen (n=4) in Gliazellen nachgewiesen werden. Der Kalibrierungsbalken repräsentiert 200 µm in (a), 100 µm in (b-g), 20 µm in (h-j) und 10 µm in (k).


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Abbildung 10: Mit den Antisense-Sonden pan-EPB41 (Exon 2) und einer Klon 9 - spezifischen Sonde wurde am humanen Hippokampus eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt. Die Entwicklungszeit für beide Sonden war gleich. In der Übersicht ist die leicht unterschiedliche Expression der Antisense-Sonde pan-EPB41 in den Cornu ammonis - Regionen (CA1 > CA4 > CA3 > CA2) zu erkennen. Bei der Klon 9 - spezifischen Sonde sind hingegen keine Expressionsunterschiede zwischen den einzelnen CA-Regionen zu erkennen. Im Vergleich zu der pan-EPB41 - Sonde, die alle EPB41 - Spleißformen detektiert, ist das Signal schwächer. Der Kalibrierungsbalken repräsentiert 500 µm.


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3.4 Immunoblotanalyse an humanem Geweben

Die generierten Antikörper wurden auf ihre Spezifität im Western-Blot an präparierter Erythrozytenmembran, sowie am zerebralen Gewebe von Mensch und Ratte getestet. Jeder der getesteten Antikörper zeigte ein spezifisches Signal, da es durch Präabsorption des Antikörpers mit seinem Antigen ausblieb (Abb. 11).

Für die meisten Immunoblotexperimente wurde das polyklonale Serum H9-85 verwendet. In der Abbildung wurden gleiche Proteinmengen von Hippokampus und Erythrozyten aufgetragen. In der Immunoblotanalyse konnte neben einer 80 kDa auch eine immunreaktive Proteindoppelbande bei 110 kDa und 120 kDa detektiert werden. Diese Banden waren durch Zugabe des Antigens blockierbar (Abb. 11). Auch in anderen Hirnarealen konnten diese Banden nachgewiesen werden (Abb. 12).

Abbildung 11: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung von Hippokampus - Proteinextrakten und präparierte Erythrozytenmembranen unter Verwendung des Antikörpers H9-85 (anti - erythrozytäres p4.1). In den zerebralen Gewebe wurden Proteinbanden mit einem Molekulargewicht von 80 kDa, 110 kDa und 120 kDa detektiert, die durch Zugabe des Antigens blockiert werden konnten. Der Antikörper detektierte im aufgetrennten Proteinhomogenat der Erythrozytenmembran nur die 78/ 80 kDa erythrozytäre p4.1 Bande.

Abbildung 12: Gleiche Mengen an Proteinhomogenat von humanem Temporalkortex, Hippokampus und Zerebellum wurden in einem 10% SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und mit dem Primärantikörper H9-85 inkubiert. In allen untersuchten Hirnregionen konnten die immunreaktiven Proteinbanden von 110 kDa und 120 kDa nachgewiesen werden


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Die erythrozytäre p4.1R-Isoform hat ein apparentes Molekulargewicht von 78/80 kDa, wie in der Abbildung 11 zu sehen ist. Die Detektion der 80 kDa Bande in den Hirnhomogenaten könnte entweder auf eine Kontamination durch Erythrozyten in den Hirngeweben oder auf eine neuronale p4.1 Proteinisoform zurückzuführen sein. Mit diesem Experiment konnte keine Aussage über den Ursprung dieser Bande gemacht werden. Hingegen konnte in Proteinextrakten von dissoziierten Neuronen des Hippokampus der Ratte mit den gleichen Antikörper ebenfalls eine 80 kDa Bande nachgewiesen werden (Abb. 20). Die in humanen Hirn detektierte 110 kDa und 120 kDa Proteindoppelbande konnten in Rattenhirnen nicht nachgewiesen werden, statt dessen konnten eine 115 kDa und 130 kDa immunreaktive. Proteindoppelbande detektiert werden.

Die 110 kDa und 120 kDa Proteindoppelbande konnten auch nicht in anderen humanen Geweben detektiert werden, siehe Abbildung 13.

Abbildung 13: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Primärantikörper H9-85. In den nicht - zerebralen Geweben konnten keine höhermolekularen Proteinbanden von 110 kDa und 120 kDa detektiert werden. In Nierengewebe wurde eine höhermolekulare, immunreaktive Proteinbande mit einem Molekulargewicht von 105 kDa detektiert. In allen Geweben wurde die 78 kDa und 80 kDa Bande nachgewiesen

Mittels einer Mikrostanzen wurde jeweils graue und weiße Substanz aus temporalem Hirngewebe entnommen. Die Immunoblotanalyse mit anti - p4.1 - Antiserum konnte nur in der grauen Substanz ein starkes Signal der 110 kDa und 120 kDa Proteinbande detektieren (Abb. 14). Um eine Aussage über die zelluläre Lokalisation der Proteindoppelbande zu treffen, wurde das 100.000 g Pellet und der Überstand (siehe 2.9) elektrophoretisch aufgetrennt und geblottet. Die vorher beschriebenen 110 kDa und 120 kDa immunreaktiven Banden konnten nur im 100.000 g Pellet, nicht jedoch im 100.000 g Überstand detektiert werden.

Abbildung 14: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Primärantikörper H9-85. Mittels Mikrostanzen wurde aus Temporalkortex graue und weiße Substanz entnommen. Nur in der grauen Substanz konnten die 110 kDa und 120 kDa Proteinbanden detektiert werden. Der Proteinextrakt wurde in einem weiteren Schritt in ein 100.000 g Pellet „Membranfraktion“ und in den Überstand „Zytosolfraktion“ aufgetrennt. Nur im Pellet (Membranen mit den daran assoziierten Proteinen) konnten die immunreaktiven Proteine nachgewiesen werden.


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3.4.1 Immunoblotanalyse mit einem Antikörper gegen die 1. Spleißstelle von Klon 9

Um einen Antikörper zu generieren, der die Klon 9 Spleißform detektiert, wurde ein 8 Aminosäuren langes Peptid verwendet. Die Sequenz wurde aus der Spleißstelle Exon 2,6 (siehe Tabelle 5) abgeleitet. Das Peptid wurde zur Generierung eines polyklonalen Peptidantikörperserums verwendet, das mit H96/4 bezeichnet wurde. Zum Nachweis von Klon 9 wurden gleiche Proteinmengen eines Rattenhirnhomogenats, sowie aus humanem Temporalkortex in einer SDS-PAGE aufgetrennt und geblottet. Mit dem Antikörper H96/4 konnten Proteinbanden mit einem Molekulargewicht von 110 kDa und 120 kDa detektiert werden. Die 120 kDa immunreaktive Proteinbande wies eine deutlich stärkere Färbung auf. Im Gegensatz dazu konnten keine immunreaktiven Proteine im Rattenextraktes detektiert werden, obwohl gleiche Proteinmengen aufgetrennt wurden. Bei einer Präabsorption des Antikörpers H96/4 mit dem Antigen (Peptid) konnten die 110 kDa und 120 kDa Proteinbanden geblockt werden.

Abbildung 15: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung unter Verwendung eines Klon 9 - spezifischen Peptidantikörpers. Aufgetrennt wurden gleiche Proteinmengen von humanem Temporalkortex und Gesamthirn der Ratte. Es konnten in humanen Hirn immunreaktive Proteine mit einem Molekulargewicht von 110 kDa und eine 120 kDa Proteinbande nachgewiesen werden, die mit dem Antigen blockierbar waren.

3.5 Immunhistochemische Untersuchung

Die Inkubationen mit dem Antikörper H9-85 (Antigen: erythrozytäres p4.1) und dem Peptidantikörper H2B6 zeigten eine spezifische Färbung neuronaler Somata und Dendriten (Abb. 16 b). Die immunreaktiven Neurone zeigten eine starke punktuierte Färbung von Soma und der Dendriten (Abb. 16 d-g). Auch die feinen Dendriten des Neurons waren angefärbt (Abb. 16 b, g). Mit den verwendeten Antikörpern wurden außer Neuronen keine anderen hirnspezifischen Zellen markiert. In keinem der untersuchten Fälle konnte eine Färbung des Axons, sowie eine spezifische Färbung in der weißen Substanz (Abb. 16 a) nachgewiesen werden. Die Spezifität der Färbung wurde durch Präabsorption des Antikörpers mit dem Antigen überprüft (Abb. 16 c). Die Intensität der Färbung und die Anzahl der angefärbten Neurone variierten. Trotz Präabsorption des Antikörpers mit dem Antigen (Spezifitätskontrolle) blieb die Färbung der Corpora


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amylacea, die diffuse Neuropil-Färbung, sowie die Färbung von granulärem Material bestehen (Abb. 16 c). Wurde nur der Sekundärantikörper verwendet, war auch diese Färbung nicht mehr nachzuweisen.

Abbildung 16: Immunhistochemische Färbung von humanem Temporalkortex (80 µm) mit dem Primärantikörper H2B6 [Antigen: Peptid 1] (1:100). In (a) ist die weiße Substanz, die unterhalb des temporalen Isokortex liegt, dargestellt. Es konnten keine gefärbten zellulären Elemente, sondern nur granuläres, im neuropil liegendes immunreaktives Material detektiert werden. Neben der Färbung dieses granulären Materials wurden in der grauen Substanz auch die Perikarya von Neuronen und deren Dendriten (siehe Pfeil) markiert (b). Die neuronale Färbung konnte nach Präabsorption des Antikörpers mit dem Antigen komplett geblockt werden, dies deutet auf eine spezifische Färbung der Neurone hin (c). Neben der zarten und homogenen Markierung der neuronalen Soma und Hauptdendriten wurden auch feinere und kleine Dendriten angefärbt. Bei einer stärkeren Vergrößerung ist eine intensive punktuierte Färbung von Soma und Dendriten zu erkennen (d, e), große Pfeile in (d) und (e). Diese punktuierte Färbung konnte auch in Regionen nachgewiesen werden, die keine Lipofuszingranula enthielten. Dies läßt darauf schließen, daß die Färbung nicht auf Lipofuszinablagerungen zurückzuführen war (e). Die Immunreaktion variierte beträchtlich, neben einer sehr starken konnte auch eine zarte Färbung von neuronalen Zellen gefunden werden z.B. in (e) die mit einem Stern markierte kleine Gruppe von sehr schwach markierten Neuronen. In (f) sind zwei immunreaktive Neurone dargestellt, die eine typisch intensive, punktuierte Färbung des Zytoplasmas (siehe Pfeile) zeigen. Die Pfeilspitze deutet auf eine typische unspezifische Färbung von wahrscheinlich extrazellulärem Material, das auch in (d), (b) und (c) zu sehen ist. Wie in (c) zu erkennen ist, wurde die unspezifische Färbung stärker und zahlreicher, als das spezifische Signal des Antikörpers durch Präabsorption mit dem Antigen blockiert wurde. Der Pfeil in (g) zeigt auf den hellen angefärbten Nukleolus im ebenfalls hellen Kern. Das Zytoplasma ist diffus hell angefärbt, wogegen die feinen intensiv gefärbten Granula hervorstehen. Der Kalibrierungsbalken repräsentiert 50 µm in (a-c) und 25 µm in (d-g).


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3.6 Proteinbiochemische Untersuchungen am Rattengewebe

Bei den proteinbiochemischen Untersuchungen an zerebralem Rattengewebe wurde mit den gleichen Antikörpern gearbeitet. Mit den anti p4.1-Antikörpern konnten mehrere immunreaktive Banden im zerebralen Gewebe nachgewiesen werden. Diese hatten ein apparentes Molekulargewicht von 78/80 kDa, 115 kDa und 130 kDa.

Abbildung 17: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Antikörper H9-85. Im zerebralen Proteinextrakt der Ratte wurden, im Gegensatz zu den p4.1-immunreaktiven Banden von 110 kDa und 120 kDa im humanen zerebralen Proteinhomogenat, Proteinbanden von 115 kDa und 130 kDa detektiert. Gleich waren die Banden bei 78 kDa und 80 kDa.

Wie beim Menschen die 110 kDa und 120 kDa Proteinbanden waren auch bei der Ratte die 115 kDa und 130 kDa Proteinbanden in verschiedenen zerebralen Regionen nachweisbar (Abb. 18 b). Bei der Fraktionsanalyse konnte jedoch sowohl im 100.000 g Pellet als auch im 100.000 g Überstand die p4.1-immunreaktive Doppelbande nachgewiesen werden (Abb. 18 a). Dies läßt darauf schließen, daß die bei der Ratte vorkommenden p4.1-immunreaktiven Proteine nicht nur an Membranen der Zelle lokalisierten, sondern auch im Zytosol der Zelle vorkommen.


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Die Spezien Mensch und Ratte unterscheiden sich im Bezug auf die p4.1-Isoformen somit in folgenden Punkten:

Die schwereren p4.1-Isoformen unterscheiden sich im Molekulargewicht.

In der Fraktionsanalyse wurden die p4.1-Isoformen bei der Ratte im Membranpellet sowie im Überstand (Zytoplasma der Zelle) detektiert, bei humanem Gewebe hingegen nur im 100.000 g Pellet.

Abbildung 18: Immunoblots einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Primärantikörper H9-85. Aus dem Gehirn der Ratte wurde ein Proteinhomogenat hergestellt und dieses in einem weiteren Schritt in eine Membranfraktion (100.000 g Pellet) mit den daran assoziierten Proteinen und eine Zytosolfraktion (100.000 g Überstand) aufgetrennt. Im Gegensatz zum Menschen ist in beiden Fraktionen eine 115 kDa und eine 130 kDa p4.1-immunreaktive Proteinbande nachzuweisen. In dem unten abgebildeten Immunoblot wurden aus dem Rattenhirn Temporalkortex, Thalamus und Zerebellum präpariert und von diesen Proteinhomogenate hergestellt. Die 115 kDa und 130 kDa Banden konnten in Zerebellum, Temporalkortex und Thalamus nachgewiesen werden.

Die Proteinhomogenate aus verschiedenen präparierten Rattenhirnarealen zeigten, daß die p4.1-immunreaktiven Proteine in allen untersuchten Hirnregionen vorkommen, vergleichbar zu den Ergebnissen mit humanem Hirngewebe. Um die Auswirkungen der Autolyse auf die Stabilität von p4.1-immunreaktiven Proteinen zu testen, wurden Rattenhirne entnommen und über unterschiedliche Zeiträume gegen Austrocknung geschützt in einer feuchten Kammer bei 4°C aufbewahrt. Zum Startpunkt des Experimentes (0 h) und nach 12, 24 und 48 h wurden jeweils wie bisher Proteinhomogenate hergestellt und ein Immunoblot mit anti-p4.1 - Antikörpern durchgeführt. Im Zeitraum bis 24 h konnten keine Auswirkungen auf die Menge oder die Stabilität der immunreaktiven Proteine festgestellt werden. Nach 48 h war ein Abbau festzustellen.


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Abbildung 19: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Antikörper H9-85. In diesem Versuchsansatz wurde überprüft, ob post mortale Lagerung (Autolyse) eine Auswirkung auf die Stabilität und die nachweisbare Menge der immunreaktiven Proteine hatte. Dafür wurden Rattengehirne präpariert und diese bei 4°C in einer feuchten Kammer gelagert. Zu Beginn des Versuches (0 h) und nach 12, 24 und 48 h wurden Proteinhomogenate hergestellt.

Um den Zelltyp einzugrenzen, der die 115 kDa und 130 kDa immunreaktiven p4.1 - Proteine bildet, wurden von Wistar - Rattenhirnen Zellkulturen angelegt. Es wurden drei verschiedene Kulturen hergestellt, nahezu reine Neuronen-, Mikroglia- oder Astrogliakulturen. Von allen wurden jeweils Proteinhomogenate hergestellt und ein Western Blot durchgeführt. In den Proteinhomogenaten aus Mikroglia wurden p4.1-immunreaktive Proteinbanden bei 50 kDa und 60 kDa detektiert. Bei Astrozyten konnten p4.1-immunreaktive Proteinbanden bei 80 kDa und 160 kDa und bei Neuronen Proteinbanden bei 50 kDa, 80 kDa, 115 kDa und 130 kDa nachgewiesen werden.

Abbildung 20: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Primärantikörper H9-85. Es wurden die p4.1-immunreaktiven Proteine nachgewiesen. Aufgetrennt wurden die Proteinhomogenate von primären Neuronen-, Astroglia- und Mikrogliakulturen.

3.6.1 Lokalisation der Protein 4.1-Isoformen im Neuron

Nach den proteinbiochemischen Daten wäre eine zelluläre Färbung des Zytoplasmas, sowie eine Kolokalisation von p4.1 mit dem Aktin-Mikrofilament-System der Zelle zu erwarten. Aus diesem Grund wurden an Neuronenkulturen immunzytochemische Untersuchungen unter Zuhilfenahme der konfokalen Laserscan-Mikroskopie mit anti-p4.1 - Antikörper und FITC-markiertem Phalloidin durchgeführt. In Abbildung 21 sind die p4.1-immunreaktiven Proteine rot und das Mikrofilament-System grün dargestellt. Bei Kolokalisation ergäbe sich somit das Mischbild gelb. Das Perikaryon des Neurons weist ein starkes p4.1 Signal auf. Der Zellkern ist von der Färbung nicht oder nur schwach betroffen.

Die positiv gefärbten Ausläufer der Zelle weisen feine, punktuierte Strukturen auf. In dem Bereich des Hauptdendriten und um den Zellkörper herum ist eine Kolokalisation mit dem Mikrofilament-System anhand der Gelbfärbung zu erkennen.


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Abbildung 21: Konfokale Laserscan-mikroskopische Darstellung von Neuronen, die mit dem Primärantikörper H2B6 und FITC-markierten Phalloidin gefärbt wurden. In der Abbildung sind die immunreaktiven p4.1 Proteine rot und das Mikrofilament-System der Zelle grün dargestellt. Die Kolokalisation der beiden Proteine stellt sich gelb dar.

3.7 Studien an neuronalen Rattenzellkulturen

3.7.1 Immunoblotanalyse

In der Literatur wurde eine Regulation der ERM-Familie von den Proteinen der Rho-Familie beschrieben. Dabei spielt die Isoprenylierung, das heißt die Übertragung von Geranylgeranylpyrophosphat auf Proteine der Rho-Familie durch die Geranylgeranyltransferase I eine zentrale Rolle. Geranylgeranylpyrophosphat wiederum entsteht über diverse Intermediärprodukte aus Mevalonat. Aus diesem Grund wurde überprüft, ob diese Regulation für die p4.1-immunreaktiven Proteine auch stattfindet.

Hierfür wurden Neurone kultiviert und für mehrere Tage in cholesterinfreiem Medium gehalten. Anschließend wurde die Mevalonatbiosynthese durch Zugabe von Lovastatin gehemmt. Dies hat eine Hemmung der Cholesterinsynthese und auch des Isoprenoidseitenweges der Zelle zur Folge. Um festzustellen, ob bei der Regulation der p4.1-immunreaktiven Proteine die Proteine der Rho-Familie auch tatsächlich eine zentrale Rolle spielen, wurde in einem zweiten Versuchsansatz die Geranylgeranyltransferase-I (GGT-I), die für die Isoprenylierung von Proteinen der Rho-Familie verantwortlich ist, gehemmt. Die Hemmung der GGT-I beeinflußt den endogenen Vorrat der Zelle an funktionellen GTPasen, die für die Signaltransduktionswege (Ras, Rho, Cdc42) notwendig sind.


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Abbildung 22: Vereinfachte Darstellung der Cholesterinbiosynthese und des Isoprenoidseitenweges

Als Vergleich zu den Zellen, die mit Lovastatin gehemmt wurden, dienten unbehandelte Zellen, Zellen, die mit Lovastatin und Mevalonat, sowie Zellen, die nur mit Mevalonat behandelt wurden. Da eine längere Inkubation mit Lovastatin zur Apoptose (>72 h) führte, wurden die Zellen vor jeder Probenentnahme auf apoptotische Vorgänge hin untersucht. Die Vitalität der Zellen wurde durch Färbung mit Propidiumjodid überprüft und nur vergleichbare vitale Kulturen zu den Immunoblotexperimenten herangezogen. Zu Beginn des Experimentes und nach 1, 2 und 3 Tagen wurden von den jeweiligen Ansätzen Proteinhomogenate hergestellt und im Western Blot mit anti-p4.1 - Antikörpern die Proteinbanden detektiert. Wie in Abbildung 23 dargestellt, ist ab Tag 2 eine Herunterregulation der p4.1-immunreaktiven 115 kDa und 130 kDa Proteinbanden zu erkennen. Ab Tag 3 ist diese Doppelbande verschwunden. Die 80 kDa Proteinbande wurde von dieser Behandlung nicht beeinflußt.


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Abbildung 23: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit dem Antikörper H9-85. Eine 7 Tage alte, in cholesterinfreiem Medium gehaltene Neuronenkultur wurde in separaten Versuchsansätzen wie folgt behandelt: Mit Lovastatin; Mevalonat; Lovastatin und Mevalonat. Proteinhomogenate wurden zu Beginn des Experimentes und nach 1, 2 und 3 Tagen hergestellt. Als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Zu erkennen ist eine Herunterregulation der 115 kDa und 130 kDa Proteinbande nach 2 Tagen, ab Tag 3 sind diese Banden verschwunden. Die 80 kDa Bande wurde von dieser Behandlung nicht beeinflußt.


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3.7.2 Immunzytochemische Analyse

Die Veränderung des Mikrofilamentes des Neurons bei den verschiedenen Behandlungen ist in Abbildung 24 dargestellt.

Abbildung 24: Neuronenkulturen, die 7 Tage auf cholesterinfreiem Medium gehalten wurden, wurden in verschiedenen Ansätzen wie folgt behandelt: mit Lovastatin; Lovastatin und Mevalonat; Lovastatin und Geranylgeranylpyrophosphat; GGT-Inhibitor. Nach 24, 48 und 72 h wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit FITC-markiertem Phalloidin eine immunfluoreszenz Untersuchung durchgeführt. Als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Der Kalibrierungsbalken entspricht 100 µm.


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Neurone, die in cholesterinfreiem Medium kultiviert wurden, wurden in verschiedenen Ansätzen mit Lovastatin, Lovastatin und Mevalonat, Lovastatin und GGPP, sowie mit einem Inhibitor der GGT-I behandelt. Nach 24, 48 und 72 h wurden in einem solchen Parallelansatz die unterschiedlich behandelten Neurone mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Das Mikrofilament-System der Zelle wurde mit FITC-markiertem Phalloidin sichtbar gemacht. Als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Im Vergleich zu den Kontrollen waren bei den mit Lovastatin behandelten Neuronen nach 48 h keine Wachstumskegel zu erkennen. Es fanden in den peripheren Bereichen der Neurite Degenerationsvorgänge statt. Das Perikaryon der Neurone war von diesen Vorgängen nicht betroffen. Nach 72 h waren die Zellfortsätze der mit Lovastatin behandelten Neurone im Vergleich zu denen der Kontrollen stark verkürzt und in allen Ausläufern waren Degenerationsvorgänge zu erkennen. In einigen Fällen war auch das Perikaryon von diesen Vorgängen betroffen. Wurde den Lovastatin - behandelten Neurone nach 24 h oder 48 h Mevalonat zugesetzt, so konnten die oben beschriebenen Prozesse aufgehoben werden. Die Neurone bildeten wieder ein neuritisches Netzwerk aus, was dem der unbehandelten Neuronen entsprach. Die Mevalonatzugabe nach 72 h hatte keine Auswirkungen.

Im Vergleich zu den mit Lovastatin - behandelten Zellen fanden bei Neuronen die mit einem Inhibitor der GGT-I (GGTI) behandelt wurden, die Degenerationsvorgänge wesentlich schneller statt. Nach 24 h Inkubation zeigten die Neurone ein sehr gering verzweigtes Netzwerk, und die zellulären Fortsätze waren von diesen Degenerationsvorgängen schon stark betroffen, vergleichbar zu denen nach 48 h Inkubation mit Lovastatin. Das Perikaryon der Zelle zeigte aber noch eine normale Färbung. Nach 48 h waren die Zellfortsätze der Neurone stark verkürzt. An den wenigen kurzen Ausläufern sind jedoch nun mehr kleine Verzweigungen zu erkennen. Die Degenerationsvorgänge waren in den meisten Fällen schon weit fortgeschritten und in einigen Fällen war schon das Perikaryon betroffen. Nach 72 h konnten nur wenige stark geschädigte Zellen detektiert werden. Der größte Teil der Zellen war schon tot.

3.7.3 Semiquantitative RT-PCR

Die Herunterregulation der p4.1-Proteinisoformen könnte noch zusätzlich durch eine verminderte Transkription des Gens oder durch eine Regulation bei der Translation verstärkt werden. Um zu klären, welche der beiden Möglichkeiten stattfindet, wurde eine semiquantitative RT-PCR verwendet. Als Referenzgen wurde die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) gewählt. In reproduzierbaren Versuchsansätzen konnte die signifikante Herunterregulation der p4.1 mRNA nachgewiesen werden (Abb. 26a). Ein repräsentatives PCR-Ergebnis ist in der folgenden Abbildung dargestellt.


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Abbildung 25: Analyse der mRNA von p4.1 und GAPDH in einem semiquantitativen RT-PCR Ansatz. Neuronenkulturen, die 7 Tage auf cholesterinfreiem Medium gehalten wurden, wurden mit Lovastatin, Mevalonat, Lovastatin und Mevalonat behandelt, als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Nach 2 Tagen wurde aus den Neuronen der verschiedenen Versuchsansätze Gesamt-RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mit spezifischen p4.1- und GAPDH-Primern eine RT-PCR durchgeführt. Zuerst wurden die Zyklenzahl für Protein 4.1 und GAPDH in Konzentrationsreihen so eingestellt, daß die Sättigungsphase noch nicht erreicht wurde. Anschließend wurde eine PCR mit p4.1-Primern und GAPDH-Primern durchgeführt und die Amplifikate in einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Gele wurden gefärbt und die optische Dichten der Banden bestimmt. In der Abbildung ist ein typisches Ergebnis der semiquantitativen Untersuchung dargestellt. Eine graphische Darstellung der RT-PCR Ergebnisse ist in Abbildung 26 gezeigt.

Da der Prozeß mit Mevalonat-Zugabe innerhalb von 48 h reversibel war, wurde in einem Versuchsansatz überprüft, ob die Mevalonat-Zugabe eine Auswirkung auf die Transkription des EPB41-Gens hat. In der semiquantitativen Analyse von mit Lovastatin-behandelten Neuronen, die nach 24 h und nach 48 h Mevalonat erhalten hatten, konnte eine signifikante Hochregulation von p4.1 mRNA nachgewiesen werden (Abb. 26 a).

Die Herunterregulation der p4.1 immunreaktiven Protein und der p4.1 mRNA könnten zwei verschiedene Gründe haben. Zum einen im Zuge eines präapoptotischen Vorgangs, zum anderen als Folge des Eingriffs in die Cholesterinbiosynthese. Aus diesem Grund wurde das Mikrofilament-System und das Tubulin-System des Neurons destabilisiert und so eine Apoptose eingeleitet. Das Mikrofilament-System wurde durch Inkubation mit Cytochalasin D in einer Konzentration von 10 und 20 µM inhibiert und nach 24 h RNA isoliert. Mit diesen Proben wurde eine semiquantitative RT-PCR mit GADPH- und p4.1-Primern durchgeführt. Es konnte nur ein nicht-signifikantes Schwanken des mRNA-Spiegels von p4.1 festgestellt werden (Abb. 26 b).

Durch Zugabe von Colchicin wurde die Synthese der Mikrotubuli, sowie der vesikuläre Transport entlang der Mikrotubuli gehemmt, was innerhalb von 12 h zur Apoptose führte. In dem semiquantitativen RT-Ansatz konnte ein nicht-signifikantes Schwanken in der Regulation der p4.1 mRNA detektiert werden (Abb. 26c).


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Beide Inkubationen mit Colchicin und Cytochalasin D führten zu apoptotischen Vorgängen, aber nicht zur Herunterregulation der p4.1 - mRNA, wie es durch die Hemmung mit Lovastatin erreicht wurde.

Die Hemmung der HMGCoA-Reduktase durch Lovastatin führt zu einer frühen Blockade im Cholesterinstoffwechsel, dadurch kann zum einen kein Cholesterin mehr gebildet werden, zum anderen stehen keine Isoprenoid-Einheiten zur Verfügung, um z.B. funktionelle GTPasen der Rho-Familie zu bilden. Um festzustellen, ob der Effekt der Herunterregulation der p4.1-immunreaktiven Proteine mit der Hemmung des Isoprenoidseitenweges oder mit der Hemmung der endogenen Cholesterinsynthese der Zelle im Zusammenhang steht, wurde die Geranylgeranyl-Transferase-I (GGT-I) inhibiert. Neurone wurden mit einem GGT-Inhibitor behandelt und nach 24 und 48 h wurden Proteinhomogenate hergestellt. Für die Untersuchung im semiquantitativen RT-Ansatz wurde nach 24 h RNA isoliert. Als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone.

Abbildung 26: Graphische Auswertung der Ergebnisse der semiquantitativen RT-PCR. In allen Experimenten wurde die optische Dichte der PCR-Amplifikate densitometrisch bestimmt und anschließend auf GAPDH normiert. Dargestellt ist das Verhältnis der optischen Dichten der Banden: Protein 4.1 zu GADPH des jeweiligen Versuchsansatzes. In a) wurden in verschiedenen Versuchsansätzen Neuronenkulturen mit Lovastatin; Mevalonat; und Lovastatin plus Mevalonat zu Beginn des Experimentes behandelt und nach 24 h Gesamt-RNA isoliert. In weiteren Versuchsansätzen wurden Neurone mit Lovastatin behandelt und 24 h oder 48 h nach der Lovastatingabe Mevalonat zugegeben. Anschließend wurde 24 h nach der Mevalonatzugabe Gesamt RNA isoliert. 1,5 µg Gesamt-RNA wurde revers transkribiert und eine semiquantitative PCR durchgeführt. Eine statistische Auswertung der Daten (n =6) erfolgte mit einem Student´s T-Test, der Fehlerbalken stellt den „standard error of mean“ dar. Es ist eine signifikante Herunterregulation der p4.1 mRNA bei der Zugabe von Lovastatin zu erkennen, sowie eine signifikante Hochregulation nach Mevalonatzugabe. Zur Überprüfung der Ergebnisse wurde als Referenzgen Aktin verwendet und dasselbe Ergebnis erhalten (Daten werden nicht gezeigt). GAPDH wurde als Referenzgen verwendet, da in den Ansatz b) das Mikrofilament-System und in Ansatz c) das Mikrotubuli-System der Neurone destabilisiert wurden. In den Versuchsansatz b) und c) konnte zwar ein leichtes Schwanken der p4.1 mRNA nachgewiesen werden, das aber nicht signifikant war.


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Die Immunoblotanalyse mit anti - p4.1 Antikörpern ergab eine Herunterregulation der 115 kDa und 130 kDa Proteinbande. Die GGT-I überträgt Geranylgeranyl-Isoprenoide (C20) auf die Thiolgruppe der Aminosäure Cystein am C - Terminus der Proteinsubstrate. Die Hemmung der GGT-I beeinflußt den endogenen Vorrat der Zelle an GTPasen, die für die Signaltransduktionswege (Ras, Rho, Cdc42) notwendig sind. Die Hemmung der GGT-I über einem längeren Zeitraum (48 h) führt zur Apoptose der Neurone, vergleichbar mit der Lovastatin-Behandlung.

Abbildung 27: Immunoblot einer SDS-PAGE (10%) Trennung, Inkubation mit Primärantikörper H9-85. Proteinhomogenate von Neuronen, die mit einem Inhibitor der GGT-I behandelt wurden, wurden nach 1 und 2 Tagen Inkubationszeit hergestellt. Als Vergleich wurden unbehandelte Neurone verwendet. Zu Erkennen ist die Herunterregulation der 115 kDa und 130 kDa Proteinbande schon nach dem 1. Tag.

Um die Auswirkungen der Herunterregulation der p4.1-immunreaktiven Proteine auf zellulärer Ebene zu detektieren, wurde ein immunzytochemischer Ansatz gewählt. Die Zellkulturen wurden mit einem Antikörper gegen p4.1 und FITC-markiertem Phalloidin gefärbt. In der nachfolgenden Abbildung 28 ist die gleiche Zelle in der p4.1 Färbung (rot), die Darstellung des Mikrofilament-Systems (grün) und die Kolokalisation der beiden Proteine (gelb) dargestellt. In der Kontrolle und der Lovastatin/Mevalonat Behandlung erkennt man eine deutliche Färbung der zellulären Ausläufer, sowie ein starkes Signal im Perikaryon der Zelle. In beiden Behandlungen ist ein gut ausgebildetes Mikrofilament-System der Zelle erkennbar. Das starke Aktin-Signal an einigen Zellfortsätzen deutet auf Wachstumskegel (siehe Pfeil in der Abbildung) hin. Eine Kolokalisation beider Antikörper zeigt sich am Hauptdendriten und entlang des Perikaryons. Das Zytoplasma zeigt eine starke p4.1-immunreaktive Färbung.

Bei der Inhibition der Cholesterinbiosynthese mit Lovastatin konnte nur im Perikaryon der Zelle eine deutliche p4.1-artige Färbung detektiert werden. Die Ausläufer der Zelle zeigten


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keine bzw. nur eine sehr schwache Immunreaktivität. Das Mikrofilament-System der Zelle ist im Vergleich zur Kontrolle weniger stark ausgebildet. Zum Teil sind schon Degenerationsvorgänge an den Fortsätzen der Zelle zu erkennen (Pfeilmarkierung). Eine Kolokalisation beider Proteine ist nur im Perikaryon der Zellen zu erkennen. Zu bemerken ist, daß die p4.1-immunreaktiven Proteine aber wesentlich geringer nachweisbar und eher auf das Zytoplasma der Zelle beschränkt sind.

Die Inhibition der GGT-I führt zu dem gleichen Ergebnis wie bei den mit Lovastatin behandelten Zellen. Das Mikrofilament-System der Zelle war im Vergleich zu den mit Lovastatin behandelten Neuronen noch weitgehend intakt, jedoch waren keine Wachstumskegel mehr zu detektieren.

Zusammengefaßt kann man sagen, daß die Inhibition der Geranylgeranyltransferase-I des Neurons zu einer Herunterregulation der p4.1R-immunreaktiven Proteine (110/130 kDa) führt. Weiterhin führt dieser Eingriff in die Cholesterinbiosynthese der Zelle zu einer Reduzierung des neuritischen Netzwerkes und zu Degenerationsvorgängen.

Bei der Niemann Pick Typ C Krankheit liegt eine erblich bedingte Störung des Lipidstoffwechsels vor, bei der Alzheimer´schen Erkrankung führen Mutationen in dem Cholesterintransportprotein Apolipoprotein E zu einer Prädisposition für diese Krankheit. Ein gemeinsames Kennzeichen dieser Krankheiten sind neurodegenerative Vorgänge (das Entstehen der Taupathologie führt im Endstadium zur Bildung von sogenannten Tangles).


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Abbildung 28: Neuronenkulturen wurden 7 Tage auf cholesterinfreiem Medium gehalten und anschließend in verschiedenen Versuchsansätzen wie folgt behandelt: Mit Lovastatin; mit Lovastatin plus Mevalonat; mit GGT-Inhibitor; und mit Lovastatin plus Geranylgeranylpyrophosphat. Die Versuchsansätze Lovastatin, sowie Lovastatin plus Mevalonat wurden nach 48 h mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Die Versuchsansätze GGT-Inhibitor, sowie Lovastatin plus Geranylgeranylpyrophosphat wurden nach 24 h mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurde die fixierten Neurone mit dem Antiserum H2B6 (p4.1) und FITC-markiertem Phalloidin (grün), eine immunzytochemische Untersuchung durchgeführt. In der Abbildung sind die p4.1 immunreaktiven Proteine rot und das Mikrofilament-System grün dargestellt. Eine Kolokalisation der beiden Proteine ist an der Mischfarbe gelb zu erkennen. Als Kontrolle dienten unbehandelte Neurone. Der Kalibrierungsbalken entspricht 100 µm.


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In einem RT-PCR-Ansatz mit neuronalem Gewebe von Alzheimer (n = 4) und pathologisch unauffälligen Patienten (n = 5) wurde untersucht, ob ein Unterschied in der Exprimierung von p4.1R-Isoformen zu detektieren ist. Zu diesem Zweck wurde aus Hippokampi von Kontroll- und Alzheimer-Patienten RNA isoliert und eine RT-PCR durchgeführt. Bei der Verwendung von EPB41 spezifischen Primer der Spleißregion 1 konnte kein Unterschied in der Expression zwischen Gesunden und Alzheimer Patienten gefunden werden. Bei der Verwendung von Klon 9 - spezifischen Primern konnte in den Kontroll - Geweben eine Bande generiert werden, in den pathologischen Geweben konnte hingegen keine oder nur eine sehr schwache Bande detektiert werden (siehe Abbildung 29). In der Abbildung 30 ist in einer Grafik das Verhältnis der optischen Dichte der von Klon 9 generierten zu der optischen Dichte von EPB41 generierten PCR-Amplifikat zwischen Kontrolle (n = 5) und Alzheimer (n = 4) aufgetragen. Der Fehlerbalken drückt den SEM („standard error of mean“) der Versuchsansätze aus. Die Signifikants des Experimentes wurde mit dem Student´s T-Test überprüft (Abb. 30).

Abbildung 29: Aus den Hippokampi von neurologischen unauffälligen Patienten (n=5) und Alzheimer-Patienten (n=4) wurde Gesamt-RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und eine RT-PCR durchgeführt. Dabei wurden die Primer der Spleißregion 1 (Exon 2-6; pan-EPB41) und Klon 9 - spezifische Primer verwendet. Die Amplifikate wurden auf einem 1,5% Agarosegel aufgetrennt. Dargestellt ist ein typisches RT-PCR Ergebnis.


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Abbildung 30: Aus den Hippokampi von neurologischen unauffälligen Patienten (n = 5) und Alzheimer-Patienten (n = 4) wurde gesamt-RNA isoliert, 1,5 µg der Gesamt-RNA wurde in cDNA umgeschrieben und eine RT-PCR durchgeführt. Dabei wurden pan-EPB41 Primer und Klon 9 - spezifische Primer verwendet. Die optischen Dichten der Banden wurden densitometrisch bestimmt und das Verhältnis Klon 9 zu pan-EPB41 gebildet. Der Fehlerbalken symbolisiert dem SEM der Experimente („standard error of mean“). Die Signifikant des Experimentes wurde mit einem Student´s T-Test überprüft.


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Mon Oct 1 14:07:23 2001