Jacobi, Carsten: Charakterisierung von EPB41 - Spleißformen im menschlichen Gehirn

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Genetische Analyse von Spleißformen des EPB41-Gens

In verschiedenen Arbeiten konnte gezeigt werden, daß in verschiedenen Geweben und Zellinien mehr als eine p4.1R-Isoform vorhanden ist [Conboy et al., 1988; Conboy et al., 1991; Chasis et al., 1993; Conboy et al., 1993; Krauss et al., 1997; Anderson et al., 1988; Correas, 1991; Granger et al., 1984; Granger et al., 1985]. In Arbeiten von Sihag und Kollegen (1994) und Conboy et al., (1991) wurde die Existenz von niedermolekularen p4.1R-Isoformen in neuronalen Geweben beschrieben. Die p4.1R-Isoformen werden von dem EPB41-Gen (erythrocyte protein band 4.1) exprimiert, das zu der Protein 4.1-Familie gehört.

In der vorliegenden Arbeit wurden Primer verwendet, die nur Spleißformen des EPB41-Gens amplifizieren. Mit spezifischen EBP41 Primern wurde in einem RT-PCR Ansatz die zerebralen Gewebe Hippokampus, Temporal-, Frontal-, Parietal-, Okzipitalkortex und Zerebellum beim Menschen untersucht. Die Analyse der drei bekannten Spleißregionen des EPB41-Gens ergab mehrere generierte Amplifikate, was auf das Vorkommen von verschiedenen Spleißformen schließen läßt. Die generierten Bandenmuster zwischen den einzelnen Geweben zeigten keinen wesentlichen Unterschied untereinander, mit Ausnahme des Zerebellums. In zerebellarem Gewebe konnte ein zusätzliches, höhermolekulares PCR-Amplifikat generiert werden. Dies läßt auf gewebespezifische Spleißereignisse schließen. Die Variation der optischen Dichte der generierten EPB41 - Banden im Vergleich zu dem Aktin-Amplifikat deutet auf eine unterschiedlich starke Expression der p4.1R-Isoformen zwischen den einzelnen Geweben hin.

Von den verschiedenen hirnspezifischen höhermolekularen Spleißformen des EPB41-Gens wurden Klon 9 (EPB41 Delta 3, 4, 5, 16, 17A, 17B) und Klon 13 (EPB41 Delta 3, 17A, 17B) weiter charakterisiert.

4.2 Charakterisierung von Klon 9 und Klon 13

Bei Klon 9 sind die Exons 3, 4, 5, 16, 17A und 17B herausgespleißt. Die Exons 17A und 17B sind bisher nur in Epithel- (Exon 17A) [Schischmanoff et al., 1997] und Muskelgewebe in EPB41 (Exon 17B) Spleißformen gefunden worden [Baklouti et al., 1997; Schischmanoff et al., 1997]. Exon 3 ist ein nicht kodierendes Exon und in allen höhermolekularen EPB41 - Isoformen nicht exprimiert.

Das Fehlen von Exon 16 bedeutet, daß keine Bindung an das Mikrofilament-System der Zelle erfolgen kann, weil die SABD im Protein nicht funktionell ist [Ling et al., 1988]. Gascard et al. (1998) konnten zeigen, daß p4.1R-Isoformen ohne aktive SABD auch an der Plasmamembran lokalisieren, was bedeutet, daß diese Isoformen immer noch die Eigenschaften haben, tertiäre Komplexe mit Membranproteinen zu bilden. Neuere Studien zeigen, daß verschiedene Bindungspartner wie „Nuclear Mitotic Apparatus Protein“ (NuMA) [Mattagajasingh et al., 1999], FKBP13 [Walensky et al., 1998], eIF3-p44 [Hou et al., 2000], Zonula Occludens Protein (ZO)-2 und ZO-1 [Mattagajasingh et al. 2000] an die C-terminale Domäne von p4.1 binden. Es ist zu vermuten, daß bei p4.1R-Isoformen ohne SABD eine weitere Verknüpfung von Proteinen über die C-terminale Domäne erfolgt. Die Bindung von NuMA an das Mikrotubuli-System beruht auf der Interaktion mit Tubulin [Merdes et al., 1996]. Dabei bindet NuMA an das minus-Ende der Mikrotubuli. Pasternack et al. beschrieben 1989 die Beteiligung von p4.1R an der Polymerisation des Mikrotubuli-Systems. Bei dieser Interaktion bindet p4.1R jedoch nicht direkt an die Mikrotubuli. Es wäre möglich, daß hier ein ähnliches Protein wie NuMA die Bindung von p4.1R-Isoformen an die Mikrotubuli vermittelt. Die Plastizität des neuronalen Netzwerkes beruht zum


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größten Teil auf der Interaktion zwischen den Mikrofilament- und dem Mikrotubuli-System. Die p4.1-Isoformen könnten bei der Regulation beider Systeme eine Rolle spielen.

Der in der vorliegenden Arbeit analysierte Klon 13 hat die Exons 8-13, Exon 16 und Exon 17 exprimiert. Luque und Correas (2000) konnten zeigen, daß diese Exons für die „core - Region“ kodieren, die bei den niedermolekularen p4.1R-Isoformen (30-80 kDa) für den Kerntransport essentiell sind. Die Expression von Exon 16 wurde zwar als notwendig für die „core - region“ beschrieben, aber eine komplette „core - region“ garantiert nicht automatisch den Kerntransport von niedermolekularen p4.1R-Isoformen (30-80 kDa) [Luque et al., 1998]. Weiterhin konnten Luque und Correas (2000) zeigen, daß Exon 5 und Exon 16 die Lokalisation der Isoformen in den Kern beeinflußt. Wird Exon 5 aber nicht Exon 16 exprimiert, so lokalisiert die p4.1R Isoform ins Zytoplasma der Zelle. Werden beide Exons exprimiert, so findet der Transport in den Kern statt [Gascard et al., 1998]. Interessanterweise konnte diese Arbeitsgruppe in der gleichen Studie zeigen, daß die N-terminale Extensions-Domäne negativ auf den Kerntransport wirkt (diese Domäne ist nur in den höhermolekularen Spleißformen zu detektieren) [Gascard et al., 1998]. Mattagajasingh et al. (1999) zeigten die Interaktion einer 135 kDa p4.1R-Isoform mit NuMA Protein über die N-terminale Extension und die C-terminalen Domäne. Man vermutet, daß NuMA unter anderem eine große Rolle in der Organisation des Spindelapparates am Ende der Mitose spielt. Die Internalisierung von höhermolekularen p4.1R-Isoformen in den Zellkern wird noch durch weitere Proteine beeinflußt und ist nicht nur durch die vorhandenen Domänen der Spleißform bestimmt. Theoretisch wäre bei dem in der vorliegenden Arbeit identifizierten Klon 13 ein Transport in den Kern möglich. Da Neurone postmitotisch sind, wäre statt einer Mitose - assoziierten Funktion eine Funktion bei Spleißvorgängen denkbar, da p4.1R-Isoformen mit dem Spleißfaktor U2AF35 interagieren können [Lallena et al., 1998]. P4.1R-Isoformen können in der Zelle an verschiedenen Orten wie Plasmamembran, Zytoplasma, Zentrosom, Kern, Golgi-Apparat, Streßfasern, Membran „ruffels“ lokalisieren [Krauss et al., 1997; DeCarcer et al., 1995; Krauss et al., 1997; Luque et al., 1998; Correas et al., 1991; Marchesi et al., 1990]. Die unterschiedliche Lokalisation von p4.1R beruht nicht nur auf Spleißvorgängen, sondern ist auch von der posttranslationalen Modifikation des Proteins abhängig (siehe 4.5).

Die FERM Domäne wird durch die Exons 4-12 gebildet. Bisher sind nur von einigen Bindungspartnern die Bindungsmotive auf der FERM Domäne bekannt. Das Herausspleißen von Exons der FERM Domäne hat zur Folge, daß bestimmte Bindungspartner vermutlich nicht mit p4.1 interagieren. Zum Beispiel wird auf Exon 5 das sogenannte LEEDY-Motiv exprimiert, über das die Bindung an AE1 erfolgt [Jöns et al., 1992]. Klon 9 exprimiert dieses Exon nicht und könnte somit nicht an den AE1 binden.

Zu der Gruppe der p4.1 Bindungspartner gehören auch Proteine der MAGUK-Familie, wie z.B. p55, CASK und hDlg. Ihre Bindung erfolgt über das sogenannte p4.1R Bindungs-Motiv S/TX3(K/R)4 {X: beliebige Aminosäure; der Querstrich bedeutet entweder, oder} [Lue et al., 1994; Marfatia et al., 1995; Cohen et al., 1998]. In Neuronen wurden von Kim et al. (1995) und Kornau et al. (1995) eine über die PDZ Domäne vermittelte Bindung von PSD95 und hDlg an den NMDA Rezeptor und Shaker K+ - Kanälen gezeigt. PSD95 und hDlg binden an p4.1R-Isoformen. Somit wäre eine Assoziation von p4.1R-Isoformen mit dem NMDA-Rezeptor und den Shaker K+ - Kanälen theoretisch möglich.

Die Funktion der MAGUK-Proteine ist neben der Organisation und Verankerung von Membranproteinen auch die Vermittlung des extrazellulären Signals zu den Signaltransduktionswegen und dem kortikalen Zytoskelett. Bei dieser Aufgabe könnten p4.1R-Isoformen stabilisierend wirken und die Verknüpfung an das Mikrofilament der Zelle bewerkstelligen.

In beiden Klonen ist die vollständige C-terminale Domäne enthalten, mit der eine Interaktion mit NuMA, p4.1-CAP, eIF3-p44 (Untereinheit des eukaryontischen Translationsinitiationsfaktors 3), ZO-1, ZO-2 (Organisation von tight junctions), FKBP13


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(ER Chaperone) beschrieben wurde [Mattajagasingh et al., 1999; Walensky et al., 1998; Hung et al., 2000; Mattajagasingh et al., 2000; Hou et al., 2000]. Die unterschiedlichen Bindungspartner verdeutlichen, daß p4.1R-Proteinisoformen an den verschiedenen Stellen in der Zelle lokalisiert sein können. Dabei organisieren vermutlich die p4.1R-Proteinisoformen tertiäre Komplexe wie z.B. zwischen p4.1-Cap und Dynein. In den meisten Fällen werden diese Komplexe mit dem Mikrofilament-System verknüpft. Mit welchem der möglichen Bindungspartner die Interaktion erfolgt, ist von der posttranslationalen Modifikation des Proteins abhängig.

Klon 13 und Klon 9 werden sich wahrscheinlich in ihrer zellulären Funktion unterscheiden. Da bei Klon 13 sämtliche Exons für neuronale Isoformen exprimiert sind, deutet dies auf eine ubiquitäre Rolle im Neuron hin. Mögliche bekannte Funktionen wären die Verknüpfung von Membranproteinkomplexen mit den Mikrofilament-System der Zelle oder intranukleär eine Beteiligung an Spleißvorgängen durch die Interaktion mit U2AF35. Klon 9 müßte eine spezifischere Rolle im Neuron ausüben, da die verkürzte FERM Domäne die Zahl der Interaktionspartner einschränken wird. Weiterhin ist bei Klon 9 die Bildung einer aktiven Spektrin-Aktin Bindungsdomäne nicht möglich, das heißt, Klon 9 kann nicht direkt mit dem Mikrofilament-System der Zelle interagieren. Beide Klone haben eine komplette C-terminale Domäne. Es besteht die Möglichkeit, daß die Interaktion von Proteinen mit der C-terminalen Domäne an Klon 9 eine höhere Affinität hat; da sterische Behinderungen durch eine mögliche Interaktion mit dem Mikrofilament der Zelle in diesem Fall entfällt.

Bei Untersuchungen an Erythroblasten wurde gezeigt, daß sieben p4.1R Hauptisoformen exprimiert werden, die ca. 87% aller p4.1R-Isoformen in der Zelle ausmachen. Davon hatten die von Gascard und Kollegen identifizierte Spleißform EPB41 Delta 3, 14, 15, 17A, 17B einen Anteil von 37% [Gascard et al., 1998]. Dies läßt vermuten, daß im Neuron Klon 13 (EPB41 Delta 3, 17A, 17B) wahrscheinlich zu den stark exprimierten Hauptisoformen gehört. Weiterhin konnte die Gruppe zeigen, daß die höhermolekularen p4.1R-Isoformen mit den herausgespleißten Exons 4 und 5 oder 5 und 16 nur einen Gesamtanteil von 3% aller p4.1R-Isoformen der Zelle haben. Dies läßt vermuten, daß Klon 9 wahrscheinlich eine sehr niedrig exprimierte Isoform ist.

4.3 Die zelluläre Verteilung der EPB41 - Spleißformen im humanen Hippokampus

In der In-situ-Hybridisierung mit Sonden, die sämtliche EPB41 - Spleißformen (pan-EBP41) detektieren, konnte an hippokampalem Gewebe eine Exprimierung in Zellen der granulären Schicht der Fascia dentata, sowie in fast allen Pyramidenneuronen der CA-Regionen nachgewiesen werden. Die Pyramidenneurone variierten in der Signalintensität zwischen den einzelnen Regionen. Bei gleicher Entwicklungsdauer konnte mit einer Klon 9-spezifischen Sonde nur eine schwächere Signalintensität im Vergleich zu der pan-EPB41 Sonde festgestellt werden. Dieser Befund steht im Gegensatz zu den Ergebnissen von Walensky et al. (1999), Parra et al. (2000), die in Maus für Isoformen des EPB41-Gens im Hippokampus nur eine Expression in der granulären Schicht der Fascia dentata beschrieben haben. Dies deutet auf einen möglichen speziesspezifischen Unterschied hin. Das Expressionsmuster von humanen EPB41 - Spleißformen gleicht der beschriebenen Expression von EPB41N - Spleißformen bei der Maus. Eine Kreuzreaktion mit Spleißformen des EPB41N - Gens kann jedoch ausgeschlossen werden, da die EPB41 - Sonden aus einer Region gewählt wurde, die keine Homologie zwischen den Mitgliedern der p4.1-Familie aufweist.


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4.4 Proteinbiochemische Charakterisierung der p4.1R-Proteinisoformen

Die immunhistochemischen Untersuchungen mit polyklonalen anti-p4.1R Antikörpern bestätigen die Ergebnisse der In-situ-Hybridisierung. Es wurden vorwiegend neuronale Zellen gefärbt. Die granuläre Anfärbung der Neurone markiert das Perikaryon und die Dendriten. In keinem der untersuchten Fälle konnte eine axonale Färbung nachgewiesen werden. Die granuläre Anfärbung könnte auf lokale Kluster der immunreaktiven Proteine an den Membranen der Zelle hinweisen.

Bei der Fraktionsanalyse konnten nur im 100.000 g Pellet, das sämtliche Membranen der Zelle mit den assoziierten Proteinen enthielt, die p4.1R-immunreaktiven Proteinbanden von 110 kDa und 120 kDa detektiert werden. Im Überstand wurden diese Banden nicht nachgewiesen. Beide Ergebnisse lassen auf eine Interaktion der p4.1R-Isoformen mit Membranproteinen der Zelle schließen. Bei Untersuchungen des visuellen Kortex der Ratte mit einem Antikörper gegen erythrozytären p4.1 beschrieb Tsumoto et al. (1988) eine ähnliche neuronale Färbung.

Sihag et al. (1994) beschrieb p4.1R-Isoformen in humanen, zerebralen Geweben mit einem Molekulargewicht von 50 kDa und 68 kDa. In der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Immunoblotanalyse an humanen zerebralen Geweben konnten in Hippokampus, Temporalkortex und Zerebellum p4.1R-immunreaktive Proteine mit einem Molekulargewicht von 80 kDa, 110 kDa und 120 kDa nachgewiesen werden. Hingegen konnten höhermolekularen immunreaktiven Proteinen mit einem Molekulargewicht von 110 kDa und 120 kDa bei Untersuchungen von Niere, Leber, Skelettmuskel, Herz und Blut nicht detektiert werden. Bisher wurden in keiner Studie an humanen, zerebralen Geweben die 110 kDa und 120 kDa p4.1 immunreaktiven Proteinbanden gezeigt. Die 110 kDa und 120 kDa Proteinbanden konnten mit einem Klon 9-spezifischen Antikörper detektiert werden. Ein möglicher Grund für die Detektion von zwei immunreaktiven Proteinbanden könnte an verschiedenen posttranslationalen Modifikationen des Proteins liegen. Eine andere Möglichkeit wäre, daß die unterschiedliche Proteinbanden auf „Klon 9 Isoformen“ hindeuten, die sich in den Spleißregionen 2 und/oder 3 unterscheiden, da der Antikörper gegen ein acht Aminosäuren langes Peptid der Spleißstelle 1 (Exon 2, 6; siehe Tabelle 4) generiert wurde. Da mit dem Antikörper H9-85 keine höhermolekularen immunreaktiven Proteine außer der 110 kDa und 120 kDa Proteinbande nachgewiesen werden konnte, ist zu vermuten, daß Klon 13 - Proteinisoformen ein Molekulargewicht von 110 kDa und 120 kDa haben könnten. Aus Temporalkortex wurde mittels einer Mikrostanze graue und weiße Substanz isoliert und die Proteine in einer Immunoblotanalyse untersucht. Nur in der grauen Substanz konnten die 110 kDa und 120 kDa p4.1R-immunreaktiven Proteine nachgewiesen werden. In dieser Substanz sind vor allem Neurone angesiedelt. Die weiße Substanz besteht zum größten Teil aus glialen Zellen, vereinzelten Neuronen und aus den axonalen Ausläufern der Neurone der grauen Substanz. Dieser Befund der Fraktionsanalyse bestätigt das erhaltene Bild in der immunhistochemischen Analyse. In der immunhistochemischen Färbung wurden Neurone des Iso- und Allokortex angefärbt. Die immunreaktiven Neurone zeigten eine starke punktuierte Färbung von Soma und Dendriten.

Bisher wurde ein p4.1N-immunreaktives Protein mit einem Molekulargewicht von 135 kDa nachgewiesen. Die 97 kDa und 144 kDa schweren p4.1G-Proteinisoformen wurden im Gehirn vorwiegend in Gliazellen nachgewiesen. Proteinisoformen von p4.1B mit einem Molekulargewicht von 124/130 kDa und 144/148 kDa sind nur in bestimmten Zellpopulationen wie z.B. den Pyramidenzellen der CA-Region, Purkinjezellen des Zerebellums exprimiert und lassen sich an Zell-Zell-Kontaktstellen nachweisen [Parra et al., 2000]. Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen Proteine stimmen somit nicht mit den in der Maus beschriebenen Isoformen für p4.1N, p4.1G und p4.1B überein, was für einen p4.1R spezifischen Antikörper zu erwarten ist.


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In Ratte wurden p4.1N-Proteinisoformen mit einem Molekulargewicht von 110 kDa und 125 kDa, p4.1B-Proteinisoformen mit einem Molekulargewicht von 130 kDa und p4.1R-Proteinisoformen mit einem Molekulargewicht von 120 kDa beschrieben [Yamakawa et al., 2000; Yamakawa et al., 1999; Ohara et al., 1999; Tsumoto et al., 1988]. Mit den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Antikörper wurden in Hirnhomogenaten von Ratte p4.1R-Isoformen von 80 kDa, 115 kDa und 135 kDa detektiert. Die Analyse einer Neuronenkultur zeigte p4.1R-immunreaktive Banden mit einem Molekulargewicht von 50 kDa, 80 kDa, 115 kDa und 130 kDa. Auch in diesem Fall unterscheiden sich die p4.1R-Isoformen.

Hauptunterschied zum Menschen ist zum einen das unterschiedliche Molekulargewicht der p4.1R-immunreaktiven Proteinbanden von 115 kDa und 130 kDa. Zum anderen konnte die115 kDa und 130 kDa Proteinbande sowohl im 100.000 g Pellet, als auch im Überstand nachgewiesen werden. Dies läßt auf einen speziesspezifischen Unterschied der p4.1R-Isoformen schließen.

4.5 Funktionelle Regulation von Protein 4.1R-Isoformen

P4.1R-Isoformen konnten in der Zelle an verschiedenen Orten wie Plasmamembran, Zytoplasma, Zentrosom, Kern, Golgi-Apparat, Streßfasern, Membran „ruffels“ lokalisiert werden [Krauss et al., 1997; DeCarcer et al., 1995; Krauss et al., 1997; Luque et al., 1998; Correas et al., 1991; Marchesi et al., 1990]. Die unterschiedliche Lokalisation von p4.1R beruht jedoch nicht nur auf Spleißvorgängen, sondern ist auch von der posttranslationalen Modifikation des Proteins abhängig [Gascard et al., 1998].

Eine mögliche funktionelle Regulation von p4.1 erfolgt über die intrazelluläre Ca2+-Konzentration und Calmodulin. Beide in der vorliegenden Arbeit identifizierten Klone haben Calmodulinbindungsstellen, eine Ca2+-abhängige auf Exon 9 und eine Ca2+-unabhängige auf Exon 11. In verschiedenen Studien konnte die Regulation der Bindungsaffinität von p4.1R-Isoformen durch den Einstrom von Ca2+-Ionen gezeigt werden [Lombardo and Low, 1994; Nunomura et al., 2000; Takakuwa and Mohandas, 1988]. Die Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration führte zu einer Konformationsänderung des p4.1R Moleküls, was zum Ablösen von dem Bindungspartner führt. Nunomura und Mitarbeiter erstellten folgendes Regulationsmodell für den CD44 Rezeptor: An CD44 können die Proteine Ankyrin und p4.1R an unterschiedlichen Stellen binden. Bei einer niedrigen intrazellulären Ca2+-Konzentration bindet p4.1R an den Rezeptor, Ankyrin jedoch nicht. Erhöht sich die intrazelluläre Ca2+-Konzentration durch Ca2+-Einstrom, dissoziiert p4.1R ab und Ankyrin bindet an den Rezeptor. Interessanterweise bewirkt der Wechsel der Bindungspartner eine Konformationsänderung am CD44 Rezeptor, der dadurch in die aktive Form übergeht. Eine solche Calcium - abhängige Regulation könnte auch für Klon 9 und Klon 13 möglich sein.

Eine andere Möglichkeit der Regulation von p4.1R Proteinen könnte durch Phosphorylierung erfolgen. P4.1R kann durch verschiedene Kinasen (z.B. Proteinkinasen C und A) phosphoryliert werden [Cohen et al., 1992]. Die Phosphorylierungsstelle ist an Ser-331 in der 16 kDa Domäne und Ser-467 in der SABD [Horne et al., 1990]. Eine Phosphorylierung der SABD bewirkt zum einen eine Abnahme der Bindungsaffinität von p4.1R an Spektrin und Aktin und zum anderen eine Inhibition der Bildung des tertiären Komplexes zwischen Aktin, Spektrin und p4.1R [Ling et al., 1988].

In verschiedenen Studien wurde die Regulation von Proteinen der ERM-Familie durch den Rho - abhängigen Signaltransduktionsweg beschrieben [Kotani et al., 1997; Tsukita et al., 1997a; Tsukita et al., 1997b, Hirao et al., 1996; Vaheri et al., 1997]. Die Aktivierung des Rho - Signaltransduktionsweges führt zur Aktivierung von Serin/Threonin Kinasen. Diese


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phosphorylieren inaktive ERM-Proteine im Zytoplasma. Die aktivierten ERM-Proteine können daraufhin an der Plasmamembran in tertiären Komplexen zwischen Membran-, ERM-Proteinen und Mikrofilament nachgewiesen werden [Mackay et al., 1998]. Am besten ist die Phosphorylierungs - abhängige Interaktion von Proteinen der ERM-Familie wiederum mit dem CD44 Rezeptor untersucht. Die ERM-Proteine liegen als inaktive Form im Zytoplasma der Zelle vor. Die inaktive Form beruht auf einer intramolekularen Faltung der FERM Domäne mit der C-terminalen Domäne [Gary et al., 1995]. Die Phosphorylierung des Proteins bewirkt eine Konformationsänderung in der FERM Domäne. Dies führt zum Auffalten und somit zur aktiven Form des Proteins [Gary et al., 1995; Bretscher et al., 1995; Pearson et al., 2000]. Die Bindung von ERM-Proteinen an den CD44 Rezeptor wird durch Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat und durch das GTP-bindende Protein Rho reguliert [Kotani et al., 1997; Hirao et al., 1996]. Dabei bildet sich ein tertiärer Komplex zwischen ERM-Protein, CD44 und Rho-GTPase aus. Eine analoge Aktivierung der ERM-Proteine ist auch für den Rac - Signalweg nachgewiesen worden [Mackey et al., 1998]. Die Inaktivierung dieser Komplexe erfolgt durch Dephosphorylierung der ERM-Proteine. Durch die große Homologie der FERM Domäne und der nahen Verwandtschaft der p4.1-Familie mit der ERM-Familie ist eine ähnliche Regulation der p4.1R-Proteinisoformen durch den Rho-Signaltransduktionsweg zu vermuten.

Mitglieder der Rho-Familie der „kleinen GTPasen“ sind Rac, Cdc42 und RhoA. Sie spielen eine wichtige Rolle in Signaltransduktionswegen, bei denen ein extrazelluläres Signal auf die Morphologie von Zellen wirkt [Narumiya et al., 1996; Hall, 1998; Van Aelst et al., 1997]. Bei diesen morphologischen Veränderungen wirken die Rho - GTPasen auf die Regulation des Zytoskeletts. In Studien an kultivierten Neuronen konnte eine regulierende Funktion der Rho-Familie an Wachstumsprozessen von neuronalen Zellfortsätzen nachgewiesen werden [Van Aelst et al., 1997; Leeuwen et al., 1997; Gebbink et al., 1997]. Threadgrill et al. (1997) und Li et al. (2000) konnte eine Rolle der Rho - GTPasen bei der Regulation des Dendritenbaumwachstums und der Plastizität des Dendritenbaums zeigen. Die GTPasen der Rho-Familie regulieren durch extrazelluläre Stimuli (z.B. Neurotrophine) die Wachstumsrichtung des Dendriten [Kuhn et al., 1998; McAllister et al., 1995].

Für die Synthese der funktionellen GTPasen der Ras-Superfamile ist die posttranslationale Isoprenylierung ein entscheidender Schritt. Diese Protein-Isoprenylierung erfolgt in der Zelle durch die Farnesyltransferase, die Geranylgeranyltransferase (GGT)-I und die GGT-II. Diese Haushaltsproteine übertragen Farnesyl - (C15) oder Geranylgeranyl - (C20) Isoprenoide, die aus dem Cholesterinstoffwechsel stammen, auf die Thiolgruppe des Cysteins am C-Terminus des Proteinsubstrates [Gibbs et al., 1994; Oliff, 1999]. Die posttranslationale Modifikation der Rho-Proteine erfolgt durch die GGT-I [Prendergast et al., 2000].

In der vorliegenden Arbeit wurden Neurone in cholesterinfreiem Medium gehalten und damit die endogene Cholesterinbiosynthese aktiviert. Anschließend wurde die endogene Cholesterinbiosynthese durch Inhibition der HMGCoA Reduktase mit Lovastatin unterbunden. In einem zweiten Versuchsansatz wurde die GGT-I inhibiert. Dies hatte zur Folge, daß der funktionelle Pool an GTPasen der Rho-Familie reduziert wurde. In der immunzytochemischen Untersuchung der Neurone waren nach Inhibition der HMGCoA Reduktase und der GGT-I p4.1-immunreaktive Proteine im Neuron nur noch schwach nachweisbar. In den meisten Fällen waren die Proteine nicht mehr in den Dendriten der Neurone zu detektieren, im Vergleich zu den unbehandelten Zellen war zudem die Färbung des Perikaryons deutlich schwächer. Die deutet auf eine Herunterregulation der p4.1-immunreaktiven Proteine. Das Netzwerk der neuronalen Zellfortsätze war schlechter ausgebildet, das heißt, die Ausläufer der Neurone waren im Vergleich zu den unbehandelten Zellen stark verkürzt und geringer verzweigt.


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Die Verarmung des Pools an funktionellen GTPasen der Rho-Familie führte zu einer Herunterregulation der p4.1 mRNA (Semiquantitative RT-PCR), und der 110 und 130 kDa immunreaktiven p4.1-Isoformen. Bei Neuronen, die mit Lovastatin behandelten wurden und nach 24 h oder 48 h Mevalonat erhielten (Produkt der HMGCoA Reduktase), konnte eine Hochregulation der p4.1 mRNA nachgewiesen werden. Die Destabilisierung des Mikrofilament-Systems oder des Mikrotubuli-Systems des Neurons führte jedoch nicht zu einer Herunterregulation der p4.1 mRNA. Dies deutet daraufhin, daß die Regulation der p4.1 mRNA nicht durch Zytoskelettkomponente erfolgt, sowie nicht im Zuge eines apoptotischen Vorganges erfolgte. Daraus läßt sich eine mögliche Regulation der p4.1R-Proteinisoformen durch die Proteine der Rho-Familie, sowie eine Regulation von p4.1R in den Signaltransduktionswegen der Rho-Familie postulieren. Die GTPasen der Rho-Familie spielen in der Plastizität des dendritischen Netzwerkes eine wichtige Rolle. Da p4.1R-Proteinisoformen Membranproteine mit dem Mikrofilament verknüpfen, könnte die Regulation des Mikrofilament-Systems durch die GTPasen der Rho-Familie unter anderem durch die Regulation der p4.1R-Proteinisoformen erfolgen.

4.6 Die Rolle von von Protein 4.1R-Proteinisoformen in verschiedenen Krankheiten

Mutationen oder Deletionen im EPB41-Gen haben in verschiedenen Zellen dramatische Auswirkungen. Rousseaux-Prevos und Mitarbeiter zeigten bei unfruchtbaren Männern, daß die Deformation der Spermienköpfe auf das Fehlen von niedermolekularen p4.1R-Isoformen zurückzuführen ist. Ursache dieses Defekts war eine Mutation in der zweiten Translationsinitiationsstelle in Exon 4.

Die Fehlfunktion von p4.1R bei der vererbbaren Elliptocytose führt zur Bildung von deformierten Erythrozyten mit instabilen Membranen [Tchernia et al., 1988; Agre et al., 1982; Palek and Lambert, 1990; Palek and Sahr, 1992].

Bei Psoriasis vulgaris wurde bei Untersuchungen der Keratinozyten eine zusätzliche 45 kDa p4.1-immunreaktive Proteinbande gefunden [Shimizu et al., 1995].

Das Fehlen von sämtlichen EPB41 - Isoformen im Gehirn von knock out Mäusen führt zu motorischen Störungen und Verhaltensauffälligkeiten. Die Mäuse brauchten wesentlich länger um Aufgaben zu lösen als die Wildtypkontrollen [Shi et al., 1999; Walensky et al., 1998]. Eine wichtige Rolle bei Lernprozessen spielt die granuläre Schicht der Fascia dentata. In diesen Zellen werden Isoformen von EPB41 und EPB41N exprimiert. Das Auftreten der Störung in den knock out Mäusen deutet daraufhin, daß die Proteinisoformen der beiden Gene EPB41 und EPB41N unterschiedliche Aufgaben in der Zelle haben, die nicht durch die Isoformen des anderen Gens substituiert werden können.

Peles et al. (1997) zeigten die Interaktion von Contactin mit Neurexin IV, an das p4.1R-Isoformen binden können. Contactin wird durch ein Neurotrophin aktiviert und steuert so das Auswachsen und die Plastizität von Neuriten. An den NMDA Rezeptor können die p4.1-Interaktionspartner hDlg und PSD95 binden. Die GTPase RhoA der Rho-Familie vermittelt die normale Entwicklung und die Stabilität des Dendritenbaumes bei aktivierten NMDA Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit ist ein Zusammenhang zwischen den Proteinen der Rho-Familie und p4.1R-Isoformen gezeigt worden. Daraus läßt sich eine mögliche Beteiligung von p4.1R-Isoformen an der Plastizität des Dendritenbaumes annehmen. Eine verminderte Plastizität der Neurone der granulären Schicht der Fascia dentata hätte einen Einfluß auf die Gedächtnisbildung. Ebenso würde eine geringere Verzweigung der Neurone der granulären Schicht des Zerebellums eine mögliche Erklärung für die motorischen Störungen der p4.1R knock-out Mäuse sein.

Eine Störung des Cholesterinstoffwechsel wurde auch bei der Alzheimer´schen Erkrankung sowie bei Niemann Pick Typ C nachgewiesen. Bei diesen Krankheiten kommt


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es zu Zytoskelettveränderungen im Rahmen von neurodegenerativen Vorgängen. Ein Grund für die Neurodegeneration ist das Entstehen der Tau-Pathologie, die im Endstadium zur Bildung von sogenannten Tangles führt. In proteinbiochemische Untersuchungen ist kein Unterschied zwischen einem Niemann-Pick und einen Alzheimer Tangle festzustellen. Die Tangles bestehen aus aggregierten Tau-Protein. Sihag et al. (1994) konnte p4.1-Isoformen an diesen intra-neuronalen Zytoskelettabnormalitäten, den sogenannten neurofibrillären Tangles, nachweisen.

In der vorliegenden Arbeit konnte in einer vorläufigen RT-PCR Studie an Hippokampi von Kontrollen und Alzheimer Patienten eine selektive Herunterregulation der mRNA von Klon 9 gezeigt werden. Beide Befunde könnten auf eine Beteiligung von p4.1R-Isoformen an den neuronalen Degenerationsvorgängen bei der Alzheimer´schen Erkrankung hindeuten.

Ausblick

Die Funktion der Proteinisoformen des EPB41-Gens im Neuron sind bisher noch nicht bekannt. Geplant sind Untersuchungen zur Lokalisation und Funktion der klonierten p4.1R-Isoformen in verschiedenen Zellsystemen, sowie Untersuchungen zur Rolle von p4.1R-Isoformen in neurodegenerativen Prozessen.


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Mon Oct 1 14:07:23 2001