Aus der Dermatologischen Universitätsklinik und Poliklinik

der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Untersuchung entfernt lokalisierter Gewebeproben

kutaner B-Zell-Lymphome auf intraklonale Diversität mit der

Einzel-Zell-PCR-Technik

Zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor medicinae

(Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Frau Claudia Jacobs
aus Berlin

Dekan:Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
1. PD Dr. S. Jahn
2. PD Dr. L. Cerroni
3. PD Dr. med. J. Prinz

eingereicht:22.12.1999

Datum der Promotion:17.07.2000

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Primär kutane B-Zell-Lymphome
  • 1.2 Klassifikation der kutanen B-Zell-Lymphome
    • 1.2.1 Kutane B-Zell-Lymphome mit indolentem klinischen Erscheinungsbild
      • 1.2.1.1 Kutanes Keimzentrumszell-Lymphom
      • 1.2.1.2 Kutanes Immunozytom/Marginalzonen-B-Zell-Lymphom
    • 1.2.2 Kutane B-Zell-Lymphome mit intermediärem klinischen Verlauf
      • 1.2.2.1 Großzelliges kutanes B-Zell-Lymphom der unteren Extremität
    • 1.2.3 Kutane B-Zell-Lymphome mit provisorischer Definition
      • 1.2.3.1 Intravaskuläres großzelliges B-Zell-Lymphom
      • 1.2.3.2 Kutanes Plasmozytom
  • 1.3  Struktur des Antikörpermoleküls und der Immunglobulingene
  • 1.4 Vielfalt der humoralen Immunantwort - Antikörperdiversität
  • 1.5 Die Entwicklung der B-Lymphozyten/Lymphopoese der B-Zellen
    • 1.5.1  Stadien der B-Zell-Entwicklung
  • 1.6 Merkmale maligner B-Zellproliferationen/Klonalität
  • 1.7  Techniken zum Klonalitätsnachweis
• 2  Aufgabenstellung
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 Patientenauswahl
    • 3.1.1 Patient WS
    • 3.1.2 Patient LB
  • 3.2  Verwendete Geräte, Reagenzien und Chemikalien
    • 3.2.1 Präparatefärbung
    • 3.2.2 Mikromanipulation
    • 3.2.3 Proteinase-Verdau und Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
    • 3.2.4  Gelelektrophorese
    • 3.2.5 Reinigung der PCR-Produkte, Isolierung der DNA-Fragmente
    • 3.2.6 Sequenzierung
  • 3.3  Methoden
    • 3.3.1 Entnahmestellen des Tumormaterials
    • 3.3.2  Schnitt und Anfärbung der Biopsien
    • 3.3.3 Mikromanipulation der Einzelzellen
    • 3.3.4  Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) der Einzelzellen
    • 3.3.5  Gelelektrophorese und Reinigung der PCR-Produkte
    • 3.3.6  Direktsequenzierung der PCR-Produkte
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Sequenzanalysen der Tumorzellen des Patienten WS
    • 4.1.1 Lymphomzellanalyse des Patienten WS
    • 4.1.2  Mutationsanalyse der V-kappa-Immunglobulingene des Patienten WS
  • 4.2  Sequenzanalysen der Tumorzellen des Patienten LB
    • 4.2.1 Lymphomzellanalyse des Patienten LB
    • 4.2.2 Mutationsanalyse der VH-Immunglobulingene des Patienten LB
    • 4.2.3 Mutationsanalyse der Vλ-Immunglobulingene des Patienten LB
• 5  Diskussion
  • 5.1 Intraklonale Diversität
  • 5.2 Statistische Mutationsanalysen
  • 5.3  Methode
• 6  Zusammenfassung
• 7. Literaturverzeichnis
• 8. Abkürzungsverzeichnis
• Selbständigkeitserklärung
• Danksagung
• Lebenslauf

Tabellen

• Tabelle 1:Einteilung der primär kutanen B-Zell-Lymphome  nach der Klassifikation der EORTC
• Tabelle 2: Anzahl der funktionellen Gensegmente für die  variablen Regionen der schweren und leichten  Ketten in menschlicher DNA (31)
• Tabelle 3:Entwicklung der B-Zellen im Knochenmark nach Rolink et al. (36); Erläuterung der Abkürzungen im Text
• Tabelle 4: Reaktionsansätze für die 2. Runde der PCR
• Tabelle 5: Primer für die leichte Kette LAMBDA
• Tabelle 6: Primer für die leichte Kette KAPPA
• Tabelle 7: Primer für die schwere Kette
• Tabelle 8: Ergebnisübersicht der Einzelzellanalyse des Patienten WS
• Tabelle 9: Verteilung der R- (replacement) und S- (silent) Mutationen (R/S) in den Vκ-Genen der Lymphomzellen des Patienten WS.
• Tabelle 10: Zusammenfassung: Verteilung der R/S-Ratio für die Bereiche CDR und FR
• Tabelle 11: Übersicht der Einzelzellanalyse des Patienten LB für die Immunglobulingene der schweren Kette des kutanen B-Zell-Lymphoms
• Tabelle 12: Übersicht der Einzelzellanalyse für die Immunglobulingene  der leichten Kette
• Tabelle 13: R/S-Ratios des Tumor-VH-Gens des Patienten LB
• Tabelle 14: Zusammengefaßte Verteilung der R/S-Ratio für das gesamte Keimbahngen der schweren Kette
• Tabelle 15: R/S-Ratios der Vλ-Gene der Lymphomzellen des Patienten LB
• Tabelle 16: Zusammenfassung der intrinsischen R/S-Ratio für das Keimbahngen
• Tabelle 17: Statistische Mutationsanalysen der Tumorgensequenzen von Patient WS
• Tabelle 18: Statistische Mutationsanalysen der Tumorgensequenzen von Patient LB für die schwere und leichte Kette

Bilder

• Abbildung 1: Struktur eines Antikörpermoleküls  am Beispiel des IgG Fab: antigenbindendes Fragment Fc: Fragment crystallizable (Fab)´2: bivalentes AG-bindendes Frag.
• Abbildung 2: V(D)J-Rekombination der Gene für den variablen Teil der schweren und der leichten Kette; vor dem V-Gen-Segment liegt ein Exon, das ein leader-Peptid (L) kodiert; es schleust das Protein in das endoplasmatische Retikulum (ER) ein und wird anschließend abgeschnitten dies ist für die spätere Sezernierung entscheidend.
• Abbildung 3: histologisches Präparat der Stanzbiopsie des KKZL vom Patienten WS in HE-Färbung; 10fach vergrößert
• Abbildung 4: histologische Übersicht des Exzisates; CD20 gefärbt und ebenfalls 10fach vergrößert
• Abbildung 5: CD20-angefärbte B-Zellen wie in Abbildung 4  in 160facher Vergrößerung
• Abbildung 6: HE-Färbung eines histolo gischen Präparates des kutanen B-Zell-Lymphoms vom Patienten LB; 10fach vergrößert
• Abbildung 7: Übersicht mit Färbung des CD20 Oberflächenmarkers der B-Zellen; 15fach vergrößert;
• Abbildung 8: Darstellung der CD20 positiven B-Zellen in160facher Vergrößerung
• Abbildung 9: Entnahmestellen der untersuchten Gewebeproben (I-III) in Abhängigkeit von derLokalisation im Gesamttumorexzisat bei Patient WS
• Abbildung 10: Bindungsstellen der Oligonukleotid-Primer an den Immunglobulingenenfür die Amplifikation der variablen Bereiche der schweren und leichten Kette; seminested PCR
• Abbildung 11: intrinsische R/S Ratio für jedes Triplet des Keimbahngens ab Position 11
• Abbildung 12: Vergleich der Nukleotidsequenzen der Vκ-Gene der Lymphomzellen des Patienten WS mit dem Keimbahngen IGKV3-20*1. Unter dem veröffentlichtem Keimbahngen sind die vier verschiedenen Subklone (A-D) mit Kennzeichnung der Mutationen (stumme Mutation = Kleinbuchstabe; Austauschmutation = Großbuchstabe) dargestellt. Ein „-“ deutet auf homologe Nukleotide hin.  Referenz zum angegebenen Keimbahngen IGKV3-20*1: (55)
• Abbildung 13: Abgeleitete Aminosäuresequenzen des Keimbahngens und der Vκ-Gen-Sequenzen für die variable Region der leichten Kette der Lymphomzellen des Patienten WS Aminosäureaustausche im Vergleich zum Keimbahngen sind fett gedruckt, „-“steht für übereinstimmende Aminosäuren.
• Abbildung 14: Gelelektrophorese von PCR-Amplifikaten mit verwendeten Vλ3b-Jλ2,3,7int (Bahn 1,2) und VH4-JH1,4,5int Primern (Bahn 5-9)
• Abbildung 15: intrinsische R/S Ratio für jede Tripletkombination des Keimbahngens ab Position 25
• Abbildung 16: Keimbahngen IGLV3-21*2 der leichten Kette mit intrinsischer R/S-Ratio für jede  Position
• Abbildung 17: Nukleotidsequenzen der VH-Region der Tumorzellen des Patienten LB im Vergleich zum Keimbahngen IGHV4-59*3 (57)
• Abbildung 18: Vergleich der Nukleotidsequenzen der Vλ-Region der Tumorzellen des Patienten LB mit dem Keimbahngen IGLV3-21*2 (58)
• Abbildung 19: Abgeleitete Aminosäuresequenz des Keimbahngens und der VH-Gen-Sequenz für die variable Region der schweren Kette der Lymphomzellen des Patienten LB.
• Abbildung 20: Abgeleitete Aminosäuresequenzen des Keimbahngens und der Vλ-Gen-Sequenzen für die variable Region der leichten Kette der Lymphomzellen des Patienten LB
• Abbildung 21: Die Anzahl der gefundenen Subklone A-D in bezug auf ihre Lokalisation im Tumorexzisat. I-III kennzeichnen die Entnahmestellen der untersuchten Biopsien
• Abbildung 22: Tumorklonentwicklung in den Lymphomzellen bei Patient WS