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1  Einleitung

1.1 Primär kutane B-Zell-Lymphome

Kutane maligne B-Zell-Lymphome sind autonome Proliferationen von B-Lymphozyten der Haut (1). Die Inzidenz der primär kutanen Lymphome ist mit 0,5-1/100.000 pro Jahr eher gering, dennoch stellt diese Erkrankung nach den primär gastrointestinalen Lymphomen die zweithäufigste Gruppe der extranodalen Non-Hodgkin Lymphome (NHL) dar (2). Die primär kutanen B-Zell-Lymphome (PKBZL) machen etwa 30% aller kutanen Lymphome aus. Sie unterscheiden sich bezüglich der Prognose und des klinischen Verhaltens grundlegend von den sekundär die Haut besiedelnden, beispielsweise von den Lymphknoten ausgehenden, Lymphomen (3). So ist bei primärer Manifestation in der Haut die Erkrankung oft jahrelang topographisch begrenzt und als niedrig-maligne einzustufen, während der gleiche histologische Typ bei sekundärer Besiedlung häufig einen fulminanten Verlauf zeigt und als hoch-maligne bezeichnet wird. Unterschiede findet man auch in der Präsenz von Translokationen und in der Expression von Onkogenen (4).

Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde es notwendig, die primär kutanen Lymphome als eigene Krankheitsgruppe anzusehen und als solche zu klassifizieren.

Die Kiel-Klassifikation wurde 1979 von den systemischen auf die kutanen Lymphome übertragen und 1988 überarbeitet (5). Nur 6 Jahre später folgte eine neue Formulierung, die Revised European-American Lymphoma Classification (REAL) (6), die versuchte, eine international anerkannte Basis zu schaffen. In den letzten Jahren sind große Fortschritte in der Immunhistochemie und Molekularbiologie erzielt worden (7), so daß neue Erkenntnisse gewonnen werden konnten. Die Abgrenzung echter Lymphome zu chronisch entzündlichen Dermatosen oder zu den sogenannten Pseudolymphomen war allein durch die Histologie nicht sicher zu differenzieren (7-9) und ist heute durch molekularbiologische Techniken (z.B. Southern-Blot, PCR) zumindest teilweise möglich geworden (10;11).

Dies veranlaßte die Cutaneous Lymphoma Study Group der EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer) erneut eine Klassifikation zu erarbeiten, in der weniger die histologischen Untergruppen, als gut definierte Krankheitsmerkmale beschrieben werden. Die Kombination von klinischen, immunologischen, histologischen und zytogenetischen Merkmalen wurde als Grundlage genommen, die primär kutanen B-Zell-Lymphome neu zu klassifizieren und in definierte Entitäten einzuteilen (12). Die Bestimmung der Klonalität einer lymphoidzelligen Infiltration in der Haut bzw. deren Gene, die für den Antigenrezeptor kodieren, [Seite 6↓]durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ist ein wesentliches Kriterium zur Bestimmung der Dignität (13).

Diese etablierte molekularbiologische Technik, angewendet auf die einzelne entartete B-Zelle, soll zur Aufklärung der noch unklaren Ätiologie und Pathogenese der kutanen B-Zell-Lymphome beitragen und ist die methodische Grundlage der vorliegenden Arbeit.

1.2 Klassifikation der kutanen B-Zell-Lymphome

Vom „Primär kutanen B-Zell-Lymphom“ wird definitionsgemäß nur gesprochen, wenn zum Zeitpunkt der Diagnose, nach umfassender klinischer Untersuchung und innerhalb der darauf folgenden 6 Monate, keine extrakutane Beteiligung nachweisbar ist (12). Zur klinischen Untersuchung gehören Inspektion und Palpation der Lymphknotenstationen, evtl. eine Biopsie vergrößerter Lymphknoten, Differentialblutbild, Röntgenaufnahme des Thorax, Sonographie- bzw. CT-Untersuchung des Abdomens sowie eine Knochenmarkbiopsie. Die Abwesenheit extrakutaner Manifestation bei Diagnosestellung ist entscheidend für die Prognose und damit für das weitere therapeutische Vorgehen.

Die Priorität der Klassifizierung nach der EORTC ist, eine übersichtliche Einteilung der primären Hautlymphome vom B-Zell-Typ anhand molekularbiologischer, morphologischer und klinischer Charakteristika zu erstellen, um daraus einen Fahrplan für die weitere Behandlung und Prognose ableiten zu können. Die Gruppeneinteilung der verschiedenen Entitäten bezieht neben den histologischen und immunphänotypischen, vor allem klinische Wesensmerkmale der Krankheit mit ein und verzichtet bewußt auf rein histologische Subklassifizierungen, die therapeutisch nicht relevant sind.

Tabelle 1:Einteilung der primär kutanen B-Zell-Lymphome
nach der Klassifikation der EORTC


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Es fällt auf, daß die Begriffe hoch- und niedrig-maligne Lymphome nicht mehr wie bei früheren Klassifikationen verwendet werden, da sie sich in erster Linie auf die Zellgröße beziehen, jedoch keine klinische Bedeutung im Sinne der neuen Klassifikation haben.

Die primär kutanen B-Zell-Lymphome (PKBZL) wurden aufgrund des unterschiedlichen klinischen Verhaltens in indolent oder intermediär eingeteilt.

Der Begriff provisorisch bezieht sich auf eine Gruppe von Lymphomen, die mehr nach histologischen Merkmalen erstellt wurde, da die Prävalenz sehr gering ist und bisher nicht ausreichte, um sie klinisch hinreichend zu charakterisieren. Laut einer klinischen Studie der Dutch Cutaneus Lymphoma Working Group (DCLWG), in der 626 Patienten mit primär kutanen Lymphomen untersucht wurden, ließen sich über 95% anhand dieser Klassifikation einordnen (12).

1.2.1 Kutane B-Zell-Lymphome mit indolentem klinischen Erscheinungsbild

1.2.1.1 Kutanes Keimzentrumszell-Lymphom

Das kutane Keimzentrumszell-Lymphom (KKZL) ist ein Tumor, der sich aus einer variablen Mischung von neoplastischen Zentrozyten (kleine Zellen mit gekerbten Kernen) und Zentroblasten (große Zellen mit rundlichen Kernen) zusammensetzt. In der aktualisierten Kiel-Klassifikation wurde dieser Lymphomtyp als zentrozytisch/zentroblastisch bezeichnet (5). Die histologische Zusammensetzung hängt wohl eher vom Alter und von der Wachstumsrate der Hauterscheinungen ab. Während in frühen sowie kleinen Läsionen vorwiegend Zentrozyten, wenige Zentroblasten und relativ viele reaktive T-Zellen zu finden sind, erkennt man in großen sowie schnell wachsenden Läsionen eine zunehmende Abnahme der Zentrozyten und reaktiven T-Zellen. Es steigt hingegen der Anteil der großen Zentroblasten, evtl. sind auch Immunoblasten zu finden. In den knotigen oder diffusen Infiltraten, welche die Epidermis durch eine Grenzzone aussparen (2;8), sind neoplastische Keimzentren nicht obligatorisch anzutreffen.

Das primär kutane Keimzentrumszell-Lymphom ist mit einer sehr guten Prognose vereinbar und stellt die häufigste Entität der PKBZL dar. Nach den Ergebnissen der DCLWG machen sie 65% der primär kutanen B-Zell-Lymphome aus und zeigen eine 5 Jahres-Überlebensrate (JÜR) von 97%. Klinisch präsentieren die Patienten nicht-schuppende, einzeln oder gruppiert stehende Knoten, Plaques oder Tumoren, die oft von einem ringförmigen Erythem umgeben sind und bevorzugt an Kopf, Hals oder Stamm auftreten. Ein über Jahre zu beobachtender [Seite 8↓]Krankheitsverlauf mit langsamem Wachstum ist häufig, eine extrakutane Disseminierung dagegen äußerst selten (14).

Die Immunhistochemie zeigt, daß die Tumorzellen die B-Zell-assoziierten Antigene (CD19, CD20, CD22, CD79a) exprimieren, jedoch nicht CD5 und CD10. Eine Leichtkettenrestriktion mit starkem Übergewicht einer Klasse (kappa oder lambda), die im statistischen Normalfall in der B-Lymphozyten Population im Menschen im Verhältnis 1,5:1 (κ:λ) exprimiert werden, ist ebenfalls zu finden (15). Neben dem immunhistochemischen Nachweis der Leichtkettenrestriktion läßt sich, z.B. mittels PCR, in den meisten Fällen für den Antikörper auf der Zelloberfläche, ein klonales Rearrangement der Immunglobulingene nachweisen (3).

Im Gegensatz zu den Keimzentrumszell-Lymphomen des Lymphknotens zeigen die KKZL eher selten ein Rearrangement des bcl-2-Gens (4), dessen Genprodukt Zellen gegenüber dem programmierten Zelltod (Apoptose) unempfindlich macht und eine ungehemmte Proliferation nach sich zieht (16). Grundlage der Fehlregulation ist bei den systemischen Lymphomen in der Regel eine Translokation t(14;18). Die Besonderheit ist, daß die Translokation t(14;18) bei primärer Hautmanifestation selten gefunden wird und einen Hinweis auf eine extrakutane Beteiligung geben kann (4). Aufgrund der günstigen Prognose ist die lokale Bestrahlung oder die Exzision Therapie der Wahl. Nur bei Disseminierung wird eine Chemotherapie in Betracht gezogen.

1.2.1.2 Kutanes Immunozytom/Marginalzonen-B-Zell-Lymphom

Charakteristisch für das primär kutane Immunozytom, mit ausgezeichneter Prognose (5 JÜR: 100%), ist eine Proliferation der kleinen Lymphozyten, lymphoplasmozytoiden Zellen und Plasmazellen (17). Bei dem sehr seltenen kutanen Lymphomtyp kann in Paraffinschnitten monotypisches Immunglobulin im Zytoplasma nachgewiesen werden. Klinisch sieht man einzeln oder multipel auftretende Knoten oder Plaques, vorrangig an den Extremitäten, dem Rumpf, der Lid- oder Orbitalregion lokalisiert (7). Das subkutane Fettgewebe wird oft mit infiltriert. Histologisch grenzen sich die knotigen oder diffusen Infiltrate gegen die Epidermis ab. Die monotypischen lymphoplasmozytoiden Zellen und Plasmazellen sind in den Randzonen des Infiltrates zu finden (17). Im Zentrum dagegen sind eine variable Anzahl reaktiver T-Zellen lokalisiert. Reaktive Follikelstrukturen sind nicht selten vorhanden. Einen diagnostischen Hinweis können sog. „Dutcher bodies“ (PAS-positive kugelige Einschlüsse im Kern) und [Seite 9↓]„Russel-Körperchen“ im Zytoplasma sein. Die immunhistochemische Phänotypisierung läßt die Zellen negativ für CD20, CD22, CD5 und CD10, hingegen positiv für den Marker CD79a erscheinen. Der Nachweis einer überexprimierten leichten Kette ist ein diagnostisch entscheidendes Kriterium (7). Lokal begrenzte Läsionen werden mit einer Radiotherapie behandelt oder exzidiert. Translokationen, die mit diesem Lymphomtyp in Verbindung stehen könnten, sind bisher nicht bekannt. Pathogenetisch wird eine chronische Borrelia-burgdorferi-Infektion mit diesem Tumor in Verbindung gebracht (18). Auch hier kann eine klonale Proliferation der Zellen und somit der Gene, die für die Immunglobuline im Zytoplasma kodieren, gefunden werden (19).

Das ebenfalls seltene Marginalzonen-B-Zell-Lymphom der Haut bildet mit dem Immunozytom eine gemeinsame Entität in der EORTC-Klassifikation. Abhängig von der Klassifikation und Betrachtungsweise wird der Tumor als SALT (skin-associated lymphoid tissue) (20) bzw. MALT (mucosa-associated lymhoid tissue) (21) zugehörig oder als primäres Immunozytom(17) definiert. In einigen Veröffentlichungen wird diskutiert, daß die primär kutanen Keimzentrumszell-Lymphome ebenfalls den Marginalzonen-B-Zell-Lymphomen zuzuordnen sind (22;23). Die Annahme begründet sich u.a. auf der Erkenntnis, daß primär kutane B-Zell-Lymphome, wie auch die MALT-Lymphome, im Gegensatz zu den nodalen Keimzentrumszell-Lymphomen, die Antigene CD5 und CD10 nicht exprimieren und meist keine interchromosomale Translokation t(14:18) aufweisen.

1.2.2 Kutane B-Zell-Lymphome mit intermediärem klinischen Verlauf

1.2.2.1 Großzelliges kutanes B-Zell-Lymphom der unteren Extremität

Von der Pathogenese her betrachtet, handelt es sich bei dem insbesondere die untere Extremität befallenden Lymphomtyp, um ein Keimzentrumszell-Lymphom, das sich aber vor allem klinisch von den morphologisch ähnlichen späten primär kutanen Keimzentrumszell-Lymphomen des Kopfes und des Rumpfes unterscheidet (12). Insbesondere die durchaus ungünstige Prognose (5 JÜR: 50%) rechtfertigt eine eigene Entität mit daraus folgender aggressiverer Therapie (Polychemotherapie). Histologisch dominieren Zentroblasten, Immunoblasten sowie große Zentrozyten das diffuse Infiltrat. Die Zellen sind CD19+, CD20+, CD22+ und CD79a+ und exprimieren im Gegensatz zu den KKZL des Kopfes und des Stammes das bcl-2 Protein (meist [Seite 10↓]ohne t(14;18)-Translokation) regelmäßig (24). Ein klonales Rearrangement der Immunglobulingene kann auch hier nachgewiesen werden. Bei einer Häufigkeit von ca. 10% sind bevorzugt ältere Frauen (Frauen/Männer: 3/1) betroffen.

1.2.3 Kutane B-Zell-Lymphome mit provisorischer Definition

1.2.3.1 Intravaskuläres großzelliges B-Zell-Lymphom

Dieser äußerst seltene Lymphomtyp wird als eine Akkumulation und Proliferation von großen neoplastischen B-Zellen innerhalb von Blutgefäßen definiert und wird auch heute noch häufig als maligne Angioendotheliomatose diagnostiziert.

Die Prognose ist nach den bisherigen Erfahrungen eher ungünstig, eine genaue Charakterisierung steht aufgrund der geringen Prävalenz noch aus.

1.2.3.2 Kutanes Plasmozytom

Eine klonale Proliferation von Plasmazellen in der Haut ohne Manifestation eines multiplen Myeloms läßt auf die Diagnose eines primär kutanen Plasmozytoms schließen. Sie machen lediglich 4% der extramedullären Plasmozytome aus. Histologisch eindeutig zu erkennen sind die reifen und vielkernigen Plasmazellen ohne Durchmischung mit anderen klonalen Lymphozyten wie beim Immunozytom. Auch hier ist die exakte Klassifizierung aufgrund des seltenen Auftretens noch nicht abgeschlossen.

Die Gruppe der Mantelzell-Lymphome wird charakterisiert durch das Auftreten von kleinen B-Zellen, die das CD5 Antigen und das Cyclin D1 Protein exprimieren. Diese Entität wurde nicht in die neue Klassifikation aufgenommen, weil die Haut in der Regel sekundär befallen wird. Lediglich ein Fall von primärer Hautmanifestation wurde bisher beschrieben (25).


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1.3  Struktur des Antikörpermoleküls und der Immunglobulingene

Antikörper (AK) sind antigenspezifische Produkte von B-Zellen. Sie bilden in ihrer Gesamtheit eine Familie von Plasmaproteinen, die sogenannten Immunglobuline. Ein Antikörpermolekül besitzt zwei klar unterscheidbare Funktionen. Dies ist zum einen die spezifische Erkennung des Antigens, zum anderen die Vermittlung von Wirkungs- und Effektormechanismen, die dieses Antigen unschädlich machen sollen. Die antigenbindende Region ist von AK zu AK sehr unterschiedlich, sie wird deshalb als variable Region (V-Region) bezeichnet. Die Region, die für die Vermittlung der Effektormechanismen des Immunsystems zuständig ist, wird konstante Region (C-Region) genannt. Die bemerkenswerte Vielfalt der Antikörpermoleküle ist die Folge eines hochspezialisierten Mechanismus und wird im nachfolgenden Abschnitt erläutert.

Die typische Form eines Immunglobulins (Ig) ähnelt der eines “Y“. Innerhalb der Gruppe der Immunglobuline unterscheidet man biochemisch und funktionell fünf Klassen von Antikörpern - IgM, IgG, IgD, IgA und IgE. Am Beispiel des IgG-Moleküls werden die allgemeinen strukturellen Merkmale in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Struktur eines Antikörpermoleküls
am Beispiel des IgG
Fab: antigenbindendes Fragment
Fc: Fragment crystallizable
(Fab)´2: bivalentes AG-bindendes Frag.

Die Struktur besteht aus insgesamt vier (2x2) Polypeptidketten. Die eine (mit etwa 50 kD) nennt [Seite 12↓]man schwere (heavy) oder H-Kette, die andere (mit etwa 25 kD) leichte (light) oder L-Kette.

Zwei identische schwere Ketten sind durch zwei Disulfidbrücken nahe der Hinge-Region miteinander und jede schwere Kette wiederum mit je einer leichten Kette verbunden.

Durch proteolytische Spaltung mit dem Enzym Papain nahe der beweglichen Gelenkregion (Hinge-Region) erhält man drei Fragmente. Zwei identische Fab-Fragmente mit antigenbindender Aktivität und ein Fc-Fragment mit Effektorfunktionen, wie z.B. Komplementfixierung oder Monozytenbindung.

Es existieren zwei Typen von leichten Ketten, die man als lambda- (λ-) bzw. kappa- (κ-) Ketten bezeichnet. Funktionelle Unterschiede zwischen Antikörpern, die Lambda bzw. Kappa exprimieren, konnten noch nicht gefunden werden. Das Verhältnis von κ zu λ variiert von Spezies zu Spezies und beträgt beim Menschen in etwa 1,5:1 (15;26). Ein Überschuß einer leichten Kette kann auf das Vorliegen eines B-Zell-Tumors hinweisen.

Die fünf Isotypen der schweren Ketten (IgM, IgG, IgD, IgA, IgE) bestimmen mit der carboxyterminalen Hälfte (konstante Region - CH-Region), die nicht mit der leichten Kette in Verbindung steht, die funktionelle Aktivität eines Antikörperproteins. Bei den Unterklasssen IgD, IgG und IgA weisen die H-Ketten jeweils 3 CH-Domänen, bei IgM und IgE 4 CH-Domänen auf. Die L-Ketten besitzen lediglich eine konstante Domäne (CL-Domäne). Diese liegen gegenüber der CH1-Domäne.

Die aminoterminalen Regionen (variable Region - V-Regionen) der schweren als auch der leichten Ketten sind jeweils etwa 110 Aminosäuren lang und zeigen erhebliche Sequenzvariationen. Die V-Domänen eines H-L-Ketten-Paares bilden gemeinsam eine Antigenbindungsstelle und bestimmen den Idiotyp des Antikörpers. Die Sequenzvariabilität ist nicht gleichmäßig über die V-Regionen verteilt. Einige Abschnitte, die für die Struktur der V-Domänen verantwortlich zu sein scheinen, sind relativ gleichbleibend und werden als Gerüstregionen (framework regions -FR) bezeichnet. Die dazwischen liegenden Abschnitte mit weitaus höherer Variabilität nennt man hypervariable Schleifen (HV-Regionen) (27).

Es sind vier FR-Regionen (FR1, FR2, FR3, FR4) und drei HV-Regionen (HV1, HV2, HV3) zu unterscheiden. Die Sequenzvielfalt ist auch räumlich ganz bestimmten Bereichen der Oberfläche des Moleküls zugeordnet. Sie liegen jeweils am Rand des durch die Gerüstregionen gebildeten antiparallelen β-Faltblattes (Sekundärstruktur der Ig-Domänen). Da die hypervariablen Schleifen die Bindungstelle für Antigene bilden und die Spezifität durch eine Oberflächenstruktur [Seite 13↓]festlegen, die zum Antigen komplementär ist, nennt man sie auch komplementaritätsbestimmende Regionen (complementarity determining regions, CDR1, CDR2 und CDR3). Nach Kabat et al. (28)erstreckt sich der Bereich der CDR1 für die VH-Gene von Position 31-35 und die CDR2 von Position 50-65. Der am meisten variable Teil der Domäne liegt in der CDR3 (27).

1.4 Vielfalt der humoralen Immunantwort - Antikörperdiversität

Die Vielfalt der Antikörper, die von reifen B-Zellen auf der Oberfläche exprimiert oder von Plasmazellen aktiv sezerniert werden, ist so groß, daß jede Zelle physiologischerweise einzigartig ist. Es sei denn, sie gehört zu einem Klon, z.B. im Rahmen einer malignen Entartung. Die Antwort auf ein einfaches Antigen ist vielfältig und umfaßt viele unterschiedliche Antikörpermoleküle, von denen jedes eine eigene Affinität und Spezifität besitzt. Wie kommt nun diese Vielfalt zustande?

Die variablen Regionen der Immunglobulinketten werden durch Rekombination verschiedener Gensegmente gebildet. Diese DNA-Sequenzen sind in der Keimbahn-DNA weit voneinander entfernt. In den Lymphozyten der B-Zellinie werden die Segmente der genomischen DNA umgelagert, man spricht hier von somatischer Rekombination. Die V-Region der schweren Kette wird durch drei verschiedene DNA-Abschnitte kodiert. Ein den größten Teil bildendes VH-Gensegment (95-101 AS) wird durch DNA-Umlagerungen mit einem D-Gensegment (diversity) und einem JH-Gensegment (joining) rekombiniert. Die VDJ-Verknüpfung führt zu einem durchgehenden DNA-Segment, das die gesamte variable Domäne der schweren Kette kodiert. Bei der leichten Kette besteht das DNA-Stück nur aus einer V-J-Rekombination, D-Segmente fehlen vollständig (29).


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Abbildung 2: V(D)J-Rekombination der Gene für den variablen Teil der schweren und der leichten Kette; vor dem V-Gen-Segment liegt ein Exon, das ein leader-Peptid (L) kodiert; es schleust das Protein in das endoplasmatische Retikulum (ER) ein und wird anschließend abgeschnitten dies ist für die spätere Sezernierung entscheidend.

Es sind im wesentlichen vier Mechanismen, die zur Unverwechselbarkeit eines Immunglobulins führen (30). Drei davon sind Folgen der somatischen Rekombination, die der Herstellung der vollständigen variablen Genbereiche dient. Der vierte ist ein Mutationsprozeß, der nur auf umgelagerte DNA einwirkt.

Die verschiedenen Gensegmente, welche zusammen die variablen Domänen kodieren, liegen in der Keimbahn-DNA in multiplen Kopien vor (Tabelle 2), die einen gewissen Grad an Heterogenität aufweisen. Während der meiotischen Rekombination kann es zu Insertion oder Deletion von Gensegmenten kommen, oder ein funktionstüchtiges Gen kann durch Mutationen in ein Pseudogen umgewandelt werden. Aufgrund dieses genetischen Polymorphismus stimmen die Zahlen nicht bei allen Menschen überein.

Tabelle 2: Anzahl der funktionellen Gensegmente für die
variablen Regionen der schweren und leichten
Ketten in menschlicher DNA (31)

Segment

Leichte Ketten

Schwere Kette

κ

λ

H

V-Segmente

40

29

51

D-Segmente

0

0

27

J-Segmente

5

4

6

Allein durch die unterschiedlichen Kombinationsmöglichkeiten der funktionellen Genabschnitte entsteht ein beträchtlicher Teil der Vielfalt. Die funktionellen Genloci liegen für die λ-Gene auf Chromosom 22, für die κ-Gene auf Chromosom 2. Den Locus für die schwere Kette findet man auf Chromosom 14. Sowohl die Gen-Segmente der schweren Kette als auch die der κ-Ketten kann man in sechs Familien unterteilen. Die Mitglieder einer Familie stimmen zu wenigstens 80% in ihrer Nukleotidsequenz überein. Demgegenüber lassen sich die Vλ-Gensegmente in acht Familien einteilen.

Ein zweiter Grund für die Diversität der Immunglobulingene ist die Tatsache, daß sich die variablen Regionen der schweren und der leichten Kette ebenfalls verschieden kombinieren [Seite 15↓]können. Diese Fähigkeit, durch Zusammenstellung einer relativ geringen Zahl von Segmenten viele verschiedene Spezifitäten zu erzeugen, nennt man auch kombinatorische Vielfalt (31).

Der dritte Mechanismus zur Diversifizierung des Antikörperrepertoires ist die ungenaue Verknüpfung der V-, (D-) und J-Segmente und das Einfügen von matrizenunabhängigen Nukleotiden. Während des Aneinanderfügens sind Exonukleasen aktiv, die von den einzelnen Bausteinen die Enden abspalten können. Zwei der drei hypervariablen Schleifen liegen innerhalb des V-Segmentes. Die dritte Schleife liegt in der Verknüpfungsstelle zwischen dem V- und dem J- Segment (leichte Kette) und wird bei der schweren Kette teilweise vom D-Segment kodiert. In dieser sogenannten CDR3erhöht sich die Vielfalt durch die Deletion und das Hinzufügen von P- bzw. N-Nukleotiden. P-Nukleotide umfassen palindrome (P) Sequenzen, die an den Enden der Gensegmente während der Rekombination durch die Aktivität von Endonukleasen entstehen.

Bis zu 20 N-Nukleotide, die nicht in der DNA-Matrize kodiert sind, werden durch ein Enzym, die terminale Desoxynucleotidyltransferase (TdT), in die kodierende DNA eingefügt (32). Dieser Effekt wird als junktionale Vielfalt bezeichnet und kann nur unter Inkaufnahme von Verlusten in Form von nicht lesbaren Pseudogenen („stop-Codon“, „Frame-shift“) erfolgen. Durch die zufällige Anzahl der eingefügten N-Nukleotide verschiebt sich das Leseraster der nachfolgenden Sequenz. Derartige Rasterverschiebungen führen häufig zu einem nicht-funktionellen Protein. Zwei von drei Umlagerungen sind nicht produktiv.

Die somatische Hypermutation bewirkt letztendlich eine weitere Diversifizierung der variablen Genabschnitte der Immunglobuline. Dieser Prozeß, der auch als Affinitätsreifung bezeichnet werden kann, findet nicht, wie die drei erst genannten, in den primär lymphatischen Organen, sondern antigenabhängig in den Keimzentren der sekundär lymphatischen Organe statt. Es werden nach dem Kontakt einer naiven B-Zelle (s.u.) mit dem Antigen in den variablen Regionen der rearrangierten Gene in unterschiedlichem Umfang Punktmutationen eingefügt, so daß veränderte Immunglobuline an der Oberfläche von B-Zellen erscheinen. Diejenigen mit der höchsten Affinität für das Antigen werden selektiert. Die somatische Hypermutation erreicht eine Mutationsrate von einem Basenpaar pro 103 pro Zellteilung und geschieht in den sich teilenden Zentroblasten.

Da in einer B-Zelle ungefähr 360 Basenpaare jedes der exprimierten Gene der variablen Region der schweren und leichten Kette kodieren und ungefähr drei von vier Basenaustauschvorgängen zu einer veränderten Aminosäure führen, erhält bei jeder Teilung jede zweite Zelle in ihrem Antigen-Rezeptor eine Mutation. Punktmutationen, die zu keiner veränderten [Seite 16↓]Aminosäuresequenz führen, nennt man stille oder stumme Mutationen, sie verteilen sich zufällig über die gesamte V-Gen-Region. Durch die Selektion auf verstärkte Antigenbindung werden vornehmlich in den CDR-DNA-Regionen produktive Austauschmutationen beobachtet, die zu einer Änderung der Aminosäuresequenz führen (33).

Nukleotidaustausch findet jedoch auch in rearrangierten Genen der variablen Regionen statt, die nicht produktiv sind und nicht exprimiert werden können. Hier geschieht also Mutation, ohne Selektion auf verstärkte Antigenbindung. Das Verteilungsmuster der Mutationen ist auch hier nicht rein zufällig, sondern in sogenannten „hotspots“, die auf die Bevorzugung kurzer Motive von vier oder fünf Nukleotiden hindeuten, konzentriert (34).

1.5 Die Entwicklung der B-Lymphozyten/Lymphopoese der B-Zellen

Der Begriff B-Lymphozyt wurde ursprünglich von Bursa Frabricii abgeleitet, einem lymphatischen Organ der Vögel, in dem B-Zellen gebildet werden und heranreifen. Der Mensch verfügt über kein entsprechendes Organ, bei ihm ist die Geburtsstätte der B-Lymphozyten das Knochenmark (bone marrow). Allerdings beginnt die physiologische Lymphopoese schon in der frühen Schwangerschaft in der fetalen Leber und wird erst nach der Geburt vollständig vom Knochenmark übernommen. Aus einer lymphopoetischen multipotenten Stammzelle entwickeln sich unter dem Einfluß verschiedenster Wachstums- und Transkriptionsfaktoren sogenannte Vorläufer-B-Zellen, aus denen letztendlich reife B-Lymphozyten entstehen, die auf der Oberfläche ein intaktes Immunglobulin mit einer einzigartigen Spezifität präsentieren. Jedes Entwicklungstadium der B-Zelle zeichnet sich durch spezifische Oberflächenmoleküle (CD = clusterofdifferentiation) und durch ein genau definiertes Stadium der Rekombination ihrer Immunglobulingene für die leichte und schwere Kette aus (29). Auch Subpopulationen können anhand der Oberflächenmarker (CD) unterschieden werden (z.B. CD5+/CD5-) (35). Die Erkenntnisse aus der B-Zell-Ontogenese lassen Rückschlüsse auf die Ursprungszelle einer malignen Entartung und auf die Ätiologie zu.

Tabelle 3 faßt die B-Zell-Entwicklung schematisch zusammen und beinhaltet die wichtigsten Differenzierungsmerkmale.

Tabelle 3:Entwicklung der B-Zellen im Knochenmark nach Rolink et al. (36); Erläuterung der Abkürzungen im Text

 

Stamm-

Zelle

Frühe

Pro-B-Zelle

Späte

Pro-B-Zelle

Große

Prä-B-Zelle

Kleine

Prä-B-Zelle

Unreife

B-Zelle

 

H-Ketten-Gene

Keimbahn

D-J- Umordnung

V-D-J-Umordnung

VDJ

umgeordnet

VDJ

umgeordnet

VDJ

umgeordnet

L-Ketten-Gene

Keimbahn

Keimbahn

Keimbahn

Keimbahn

V-J- Umordnung

VJ

umgeordnet

Oberflächen-Ig

fehlt

fehlt

fehlt

μ-H-Kette

Prä-B-

Rezeptor

μ-Kette im

Zytoplasma

IgM

 

Marker-Protein

CD34

CD34

CD10;19

CD40

CD10;19;20

CD40

CD19;20

CD40

CD19;20

CD40

CD19;20

IntrazelluläreProteine

 

RAG-1,-2

TdT

λ5,VpreB

TdT

λ5,VpreB

RAG-1,-2

μ

λ5,VpreB

μ

 


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1.5.1  Stadien der B-Zell-Entwicklung

Die Stadien sind durch schrittweise Umordnung und Expression der Immunglobulingene der schweren (H-) und der leichten (L-) Ketten definiert.

Die frühesten Zellen der B-Zellinie nennt man Pro-B-Zellen. Diese Vorläuferzellen können sich nur begrenzt erneuern. In den frühen Pro-B-Zellen erfolgt die Verknüpfung der DH-JH Segmente, in der späten Pro-B-Zelle die vollständige Rekombination des VDJ-Abschnittes für die schwere Kette. Voraussetzung ist die Aktivität der rekombinationsaktivierenden Gene (RAG-1, RAG-2) sowie der TdT, die in diesem Stadium intrazellulär exprimiert werden. Die Produkte von RAG-1 und –2 sind spezialisierte Endonucleasen und leiten den ersten Spaltungsschritt der DNA ein. Folge der erfolgreichen Verknüpfung ist die Expression einer intakten μ-H-Kette. Zusammen mit einer Ersatz-L-Kette (surrogate light chain - SLC), kodiert durch die Gene VpreB und λ5, wird der Prä-B-Zell-Rezeptor auf der Zelloberfläche sichtbar. Er ist das Kennzeichen der nächsten Entwicklungsstufe, der Prä-B-Zelle (35). Das Erscheinen des Prä-B-Rezeptor-Komplexes ist ein wichtiger Kontrollpunkt in der B-Zell-Entwicklung. Die großen Prä-B-Zellen werden zur Proliferation angeregt und teilen sich aktiv. Aus diesem Stadium entwickeln sich kleine Prä-B-Zellen, in denen es zur Umlagerung der V-J Segmente für die leichte Kette kommt. Mit [Seite 18↓]Abschluß der Umordnung kann ein komplettes IgM-Molekül auf der Oberfläche präsentiert werden. Die Zelle wird nun als unreife B-Zelle bezeichnet.

Alle bisher beschriebenen Stadien der Entwicklung finden antigenunabhängig im Knochenmark statt. Die überlebenden B-Zellen begeben sich in die Peripherie und differenzieren zu reifen B-Zellen, die außer IgM auch IgD exprimieren und, bis sie auf ihr spezifisches Antigen treffen, naive B-Zellen genannt werden. Spezifische Marker der frühen B-Zell-Entwicklung sind Oberflächenmoleküle (CD). Für die Erforschung der Ätiologie lymphoproliferativer Erkrankungen sind sie von Nutzen, um evtl. Rückschlüsse auf den Entartungszeitpunkt machen zu können.

T-Zell- und antigenabhängig kommt es zur erneuten Aktivierung und Proliferation in den sekundär lymphatischen Organen. Beim Eintritt aktivierter B-Zellen in die primär lymphatischen Follikel beginnen sie mit der Teilung und bilden Keimzentren aus. Dort vollzieht sich anschließend die oben beschriebene Affinitätsreifung. Welche Entwicklungsrichtung die reife B-Zelle nimmt, hängt vermutlich von der Interaktion des CD40-Antigens der B-Lymphozyten mit dem entsprechenden Liganden der T-Helfer-Zellen ab. Die Bindung an CD40 scheint verantwortlich für die Ausdifferenzierung von B-Gedächtniszellen und den Isotypenwechsel zu sein (37).

1.6 Merkmale maligner B-Zellproliferationen/Klonalität

B-Zell-Tumoren repräsentieren die klonale Expansion einer einzigen malignen transformierten Zelle, die nahezu aus jedem Entwicklungsstadium der B-Lymphozyten hervorgehen kann. Sie bewahren viele Charakteristika der Zelle, aus der sie hervorgegangen sind, z.B. die Expression bestimmter Oberflächenmoleküle oder die Möglichkeit zur somatischen Hypermutation. Alle Zellen eines Tumors weisen die gleichen Rekombinationen von Immunglobulingenen auf, was die Abstammung von einer gemeinsamen Vorläuferzelle dokumentiert. Die nachweisbar identische Immunglobulingenumlagerung, insbesondere der identische hochvariable CDR3-Abschnitt, sowie deren Analyse ist von großem Wert für die Erforschung und Diagnostik lymphoproliferativer Erkrankungen (38).


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1.7  Techniken zum Klonalitätsnachweis

Lange Zeit wurden zur Diagnosestellung von kutanen lymphoidzelligen Infiltraten lediglich morphologische und immunhistochemische Merkmale herangezogen (9;39). Die typisch histologischen Merkmale für Malignität und die immunphenotypische Leichtkettenrestriktion mit Überexpression einer leichten Kette (κ oder λ) (40) geben Hinweise auf eine maligne Entartung. Die klonale Expansion einer B-Zellpopulation, als entscheidendes Merkmal für die Malignität eines Infiltrates, kann weder anhand von Histologie noch mittels Immunhistochemie bewiesen werden.

Eine unterschiedliche VDJ-Verknüpfung in der Nukleotidsequenz von Immunglobulingenen, d.h. die Verwendung von verschiedenen V-, D- und J-Genen für die Rekombination sowie eine uneinheitliche CDR3-Region identifizieren die Herkunft von unterschiedlichen Vorläuferzellen in einer B-Zellpopulation. Man spricht von interklonaler Divergenz oder Polyklonalität. Hingegen werden in Lymphozytenpopulationen eine gleiche CDR3-Region und gemeinsam auftretende Mutationen in den Nukleotidsequenzen von Immunglobulingenen genutzt, um einen klonalen Ursprung, aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle, festzustellen. Sind innerhalb des Klones Sequenzen vorhanden, die neben den gemeinsamen, im speziellen im CDR3-Bereich, weitere Nukleotidunterschiede in der Gensequenz aufweisen, spricht man von intraklonaler Divergenz (41).

In den letzten 2 Jahrzehnten sind einige erfolgreiche Techniken etabliert worden, um normale und transformierte Lymphozyten zu studieren. Die Southern-Blot-Hybridisierung (SBH) erweist sich für den Nachweis von rearrangierten Immunglobulingenen als akkurate und reproduzierbare Methode. Die Anwendung der SBH bei der Untersuchung von Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) konnte die Zellinie, aus der die Tumorzellen abstammen, identifizieren und die klonale Natur beweisen (42). Jedoch verlangt diese Methode eine relativ reine Population von Zellen und benötigt eine beträchtliche Menge (30-50 μg) gut erhaltener DNA. So beschränkt sich der Einsatz der Methode vor allem auf Zellinien, Hybridome oder frische Biopsieproben, in denen eine homogene Population dominiert. Stellt die zu untersuchende, tumorspezifische DNA (klonale Zellpopulation) einen geringeren Anteil als 3-5% dar, gerät die SBH an ihre Sensitivitätsgrenze. Daraus resultiert eine falsch-negative Rate von 4-5% (43). Die „in situ“ Hybridisierung ist eine Technik mit dem Vorteil, die Genexpression im histologischen Kontext zu visualisieren. Die Sensitivität konnte durch Kombination mit der PCR-Technik („in situ“ PCR) erheblich erhöht werden.


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Verschiedene Methoden, die auf der PCR-Technik basieren, identifizieren klonale B-Zellpopulationen aus DNA, die aus Gewebeschnitten oder dem periphern Blut isoliert wurde (Populationsanalysen). Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) hat gegenüber der SBH den Vorteil, wesentlich weniger Anforderungen an die Qualität als auch die Quantität der zu untersuchenden DNA zu stellen. Das Verfahren, welches mit relativ geringem zeitlichen Aufwand das dominante Gen-Rearrangement herausfinden kann, benötigt zum Klonalitätsnachweis ebenfalls einen relativ großen Anteil an Tumor-DNA (mindestens 1,5% an der Gesamt-DNA). Ist diese Voraussetzung nicht erfüllt, können die polyklonalen Amplifikationsprodukte die Produkte der klonalen Population überschatten.

Die PCR-Technik ist nicht nur nützlich, um klonale Zellen zu erkennen, sondern kann auch verwendet werden, um zusätzliche Charakteristika von malignen B-Zellklonen aufzuzeigen. Sequenzanalysen der PCR-Produkte können neben der Identifikation des klonalen Immunglobulingen-Rearrangements auch somatische Mutationen aufzeigen. Der Stellenwert von Mutationsanalysen ist von besonders großem Interesse seit bekannt ist, daß aus dem Differenzierungsstadium der Tumorzellen Rückschlüsse auf die Ursprungszelle gezogen werden können (44).

Für die Interpretation von Punktmutationen in den die variablen Abschnitte kodierenden Genen ist eine Methode notwendig, die die Nukleotidsequenzen mit hoher Zuverlässigkeit darstellt. Den erwähnten Verfahren ist gemeinsam, daß die DNA aus Zellpopulationen extrahiert wird. Ein Artefakt der PCR Amplifikation von Ig-Genen aus einer Zellgruppe ist die Formation von hybriden (chimeren) Molekülen. Diese können erzeugt werden, wenn sehr ähnliche DNA-Sequenzen (wie z.B. rearrangierte Ig-Gene) in ein und demselben Reaktionsgefäß amplifiziert werden. Die hybriden Moleküle entstehen hierbei durch artifizielle Rekombination von homologen Gensegmenten aus Rearrangements verschiedener B-Zellen während des Amplifikationsprozesses. Hierbei kann es zur Hybridbildung bzw. Zusammenlagerung zwischen unterschiedlichen oder gleichen die V-Region kodierenden Genen bzw. deren Mutationsvarianten kommen, in Abhängigkeit von den in den jeweiligen Zellen rearrangierten Keimbahngenen. Da die Identifikation der verfälschten Nukleotidsequenz des Amplifikates nicht immer möglich ist und eine Veränderung der Mutationsverteilung ergeben kann, verhindern die hybriden Moleküle die zuverlässige Interpretation solcher Experimente (41). Wenn oligo- oder polyklonale Lymphozytenpopulationen analysiert werden, müssen sie vor der Sequenzierung in Plasmide kloniert werden. Der Einbau falscher Nukleotide durch die Taq-DNA-Polymerase erweist sich als erheblicher Nachteil zur Interpretation von somatischen Mutationen oder gar [Seite 21↓]intraklonaler Diversität (52).

Durch Analysen auf Einzelzellniveau lassen sich die eben erwähnten Nachteile minimieren (45). Das PCR-Produkt, das man von einer einzelnen Zelle erhält, repräsentiert ein individuelles Rearrangement und kann direkt sequenziert werden. Für die Identifikation von Punktmutationen sind hier die Sequenzartefakte der Taq-Polymerase zu vernachlässigen.

Bei diesem Verfahren wird die Mikromanipulation einer Einzelzelle aus einem histologischen Gewebeverbund kombiniert mit einer PCR-Amplifikation des variablen Ig-Abschnittes in dieser Zelle. Spezielle Fragestellungen lassen sich nur mit der Einzel-Zell-Technik untersuchen. So ist es möglich, in einer Zelle verschiedene Gene parallel zu amplifizieren, z.B. die gemeinsame Analyse der Gene für die schwere und die leichte Kette, um die B-Zell-Entwicklung weiter zu erforschen. Der Differenzierungsprozeß von B-Zellen kann außerdem in Abhängigkeit von der speziellen Umgebung des sekundär lymphatischen Gewebes examiniert werden. Und es besteht die Möglichkeit, durch Zuordnung von rearrangierten V-Gen-Sequenzen zu individuellen Zellen, den Umfang klonaler Proliferationen zu studieren und intraklonale Diversität in Abhängigkeit von der Lokalisation im Gewebeverband festzustellen (45).

Ein weiterer Einsatzbereich der Technik ist die Möglichkeit, Zellen zu studieren, die mit den konventionellen Methoden schwer zu isolieren sind. Für Reed-Sternberg Zellen beim Morbus Hodgkin, die häufig weniger als 1% der Zellen des Tumors ausmachen (46), konnte so der Klonalitätsnachweis und der Nachweis der B-Zell-Abstammung erbracht werden (47). Diese Methode kann ebenfalls als diagnostisches Werkzeug bei der Behandlung von B-Zell-Lymphomen eingesetzt werden, um nach der Therapie kleinste Residuen zu identifizieren und die Therapieeffizienz zu beobachten.

Die Einzel-Zell-PCR von rearrangierten Immunglobulingenen aus mikromanipulierten B-Zellen erlaubt es, die B-Zell-Differenzierung im histologischen Kontext zu untersuchen und durch den evtl. Nachweis somatischer Hypermutation sowie andauernder Mutationen, Entwicklungstadium und Ursprungszelle eines Tumors zu analysieren.


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22.02.2005