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3  Material und Methoden

3.1 Patientenauswahl

Zwei Patienten der Dermatologischen Universitätsklinik der Charité Berlin mit kutanen B-Zell-Lymphomen wurden mittels molekularbiologischer Methoden untersucht. Das zu untersuchende Tumormaterial wurde durch räumlich getrennt entnommene Stanzbiopsien gewonnen. Von Patient WS wurden drei, von Patient LB acht Bioptate aus dem jeweiligen Exzisat eines Lymphomknotens analysiert.

3.1.1 Patient WS

Der damals 84 Jahre alte Patient befand sich im Frühjahr (Januar-März) 1997 in stationärer Behandlung der Dermatologischen Universitätsklinik der Charité. Seit einem Jahr fiel eine größenprogrediente, knotige Effloreszenz ohne Juckreiz am linken Hinterkopf auf. Der occipital-parietal gelegene Knoten manifestierte sich zu diesem Zeitpunkt mit einem Durchmesser von 8 cm. Das makroskopische Erscheinungsbild zeigte eine erythematöse und zerklüftete Oberfläche mit zentralen Ulcerationen sowie einer ansonsten atrophischen Epidermis. An der linken Halsseite war zudem ein ca. 1 cm auf der Unterlage verschieblicher Knoten tastbar.

Der Tumor wurde nach einer Stanzbiopsie vollständig exzidiert und mit Vollhaut gedeckt. Die histologische Untersuchung ergab ein diffus konfluierendes, vom oberen Korium beginnendes, bis tief in die Subkutis reichendes, lymphoidzelliges Infiltrat, welches neben kleinen bis mittelgroßen kompakten lymphozytären Zellen, herdförmig betont, größere, blassere Zellelemente mit unregelmäßigem Kernchromatin beinhaltete, die zytomorphologisch an Zentrozyten, Zentroblasten und teilweise an Immunoblasten erinnerten. Lymphoplasmozytoide Zellen konnten in nicht unerheblicher Menge abgegrenzt werden (Abbildung 3, 4 und 5).

Immunhistochemisch wurde die Hauptmenge der Infiltratzellen als B-Lymphozyten identifiziert (CD20 positive Lymphozyten). Neben der Betonung der B-Zellen wurde im Randbereich des Tumors ein umschriebener T-Zellanteil ausgemacht. Die Proliferationsrate betrug 10% bei diffuser Verteilung im Infiltrat. An zwei Stellen konnten stark proliferierende Keimzentren gefunden werden (hier Proliferationsrate größer als 40%), die auf eine Korrelation mit einer B-Zell-Population hinweisen.


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Abbildung 3: histologisches Präparat der
Stanzbiopsie des KKZL vom Patienten WS in HE-Färbung; 10fach vergrößert

Abbildung 4: histologische Übersicht des Exzisates; CD20 gefärbt und ebenfalls 10fach vergrößert

Abbildung 5: CD20-angefärbte B-Zellen wie in Abbildung 4
in 160facher Vergrößerung


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In geringer Menge und gleichmäßiger Verteilung waren CD68 positive Makrophagen eingestreut.

Die routinemäßig durchgeführte molekularbiologische Diagnostik zeigte in der Thermogradientengelelektrophorese (TGGE) der PCR-Produkte für die gamma-Kette des T-Zell- Rezeptors (TCRγ-Rezeptor) polyklonale, für die schwere Kette des Immunglobulins (IgH-Kette) kein Amplifikat. In einem umschriebenen Areal (lymphoplasmozytoide Zellen) fand sich eine Leichtkettenrestriktion mit Überexpression der leichten Kette kappa. Der gesamte Tumor, d.h. alle T- und B-Zellareale, stellte sich bcl-2 positiv dar. Die histologische und immunhistochemische Untersuchung führte zu der Diagnose eines primär kutanen Keimzentrumszell-Lymphoms (B-Zell-Lymphom vom Keimzentrumszelltyp).

Molekularbiologisch gelang der Nachweis einer klonalen B-Zell-Expansion für die schwere Kette nicht. Der weitere körperliche Status wurde anhand von umfassenden Untersuchungen erhoben. Blutparameter, Röntgenaufnahme des Thorax und Sonographie des Abdomens ergaben keinen Hinweis auf eine extrakutane Beteiligung. Bei weiterführender bildgebender Diagnostik (CT von Abdomen und Becken, Halsbereich) wurden verdächtige Areale in der Leber sowie Lymphknotenmanifestationen links iliakal, links inguinal und interaortokaval erkennbar. Eine Weichteilsonographie von Haut und Subkutis im linken Halsbereich ergab ein 12x9x17 mm großes echoarmes Areal mit typisch echoreichem Randwall. Die eventuell auf eine Absiedlung hinweisenden Befunde waren zum Zeitpunkt der Erstdiagnose vor ca. einem Jahr nicht beschrieben. Der Patient lehnte eine weiterführende Diagnostik ab, daher konnten die Befunde nicht eindeutig geklärt werden.

3.1.2 Patient LB

Im August 1995 bemerkte der 54 jährige Patient LB einen stark juckenden Knoten am Rücken im Bereich der linken Schulter. Nach einer Probebiopsie und Ausschluß einer extrakutanen Beteiligung wurde die Diagnose eines kutanen B-Zell-Lymphoms vom Keimzentrumszelltyp gestellt. Nach einer erfolgten Strahlentherapie (40 Gy Summendosis) kam es zur Rückbildung, jedoch manifestierten sich Neubildungen jenseits des Bestrahlungsfeldes, woraufhin die Strahlentherapie Anfang 1996 fortgesetzt wurde.

Ende 1996 bildeten sich im Schulter- und Rückenbereich (subscapulär) erneut zwei subkutane Knoten.


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Die in der Dermatologischen Universitätsklinik der Charité entnommene Probeexzision ergab folgende Befunde. In den Gewebeproben zeigte sich histologisch (Abbildung 6, 7 und 8) ein von der Epidermis abgesetztes großknotig bis diffus konfluierendes, das gesamte Korium und die angrenzende Subkutis infiltrierendes lymphohistiozytäres Zellkonglomerat. Zytomorphologisch waren die blassen Zellen mit wechselndem Kernchromatin größtenteils den Zentroblasten und teilweise den Zentrozyten zuzuordnen. Bei der immunhistochemischen Untersuchung stellten sich die großen konfluierenden Zellen als CD20 und CD79a-positive B-Zellen dar, die eine Proliferationsrate von nahezu 100% aufwiesen. Die Tumorzellen sind bcl-2 negativ, eine Expression der leichten Ketten lambda und kappa konnte hier nicht nachgewiesen werden. Ebenfalls wurde eine Follikelbildung ausgeschlossen, da die Markierung der follikulären dendritischen Zellen (FDC) negativ war. In der Biopsie konnte molekularbiologisch für die γ-Kette des T-Zell-Rezeptors ein polyklonales, für die schwere Kette des Immunglobulins ein monoklonales Amplifikationsprodukt gefunden werden.

Im Januar 1997 wurde ein erneutes Staging durchgeführt. Der mittlerweile 6x6 cm umfassende Tumor am linken Schulterblatt mit unscharf begrenztem Umgebungserythem wurde vollständig operativ entfernt. Histologisch glich der Befund der Probebiopsie. Immunhistochemisch wurde festgestellt, daß die atypischen Zellen die leichte Kette lambda exprimierten. Im Gegensatz zur Voruntersuchung fand sich jetzt eine Leicht-Kettenrestriktion mit Fehlen der kappa-Kette und Überexpression der lambda-Kette. Differentialdiagnostisch kommt ein Keimzentrumszell-Lymphom oder Marginalzonen-Lymphom in Frage.

Die extern durchgeführte Knochenmarkbiopsie zeigte keinen Anhalt für Malignität, auch die weitere bildgebende Diagnostik (CT-Thorax, -Abdomen, -Becken, sowie Sonographie-Abdomen, -Lymphknoten und -Schilddrüse) zeigte keine lymphomverdächtigen Strukturen.

Ein halbes Jahr später traten erneut erythematöse Knoten auf. Eine IL-2/INFα2a-Therapie (9 ME s.c., IL Mo.-Fr; INF Mo., Mi., Fr., 3x9 Mio. IE) wurde durchgeführt, worauf ein gutes Ansprechen festzustellen war. Vor Therapiebeginn wurden erneut zwei Knoten an der linken Schulter entfernt. Die Gesamtbeurteilung ergab die Diagnose eines nicht follikulären B-Zell-Lymphoms. Bei erneuter Vorstellung Ende 1997 war eine Vollremission am Rücken zu beobachten.


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Abbildung 6: HE-Färbung eines histolo gischen Präparates des kutanen B-Zell-Lymphoms vom Patienten LB; 10fach vergrößert

Abbildung 7: Übersicht mit Färbung des CD20 Oberflächenmarkers der B-Zellen; 15fach vergrößert;

Abbildung 8: Darstellung der CD20 positiven B-Zellen in160facher Vergrößerung


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3.2  Verwendete Geräte, Reagenzien und Chemikalien

3.2.1 Präparatefärbung

Kryostat FRIGOCUT 2800

Leica, Bensheim, GER

Primärantikörper:

 

Maus-Anti-Human-B-Cell,CD20, L2

Dako Diagnostika, Hamburg, GER

Kaninchen-Anti-Human-T Cell, CD3

Dako Diagnostika, Hamburg, GER

Sekundärantikörper:

 

Ziege-Anti-Maus IgG + IgM

Dianova, Hamburg, GER

Ziege-Anti-Kaninchen IgG

Dianova, Hamburg, GER

Tris Buffered Saline (TBS), ad 1l, pH 7,5:

 

Tris-Base 0,9 g

Merck, Darmstadt, GER

Tris-HCL 6,85 g

Merck, Darmstadt, GER

NaCl 8,78 g

Merck, Darmstadt, GER

Streptavidin-Alkalische Phosphatase

BioGenex, Mainz, GER

Neufuchsin

Sigma, Deishofen, GER

Naphtol AS-BI Phosphate

Sigma, Deishofen, GER

3.2.2 Mikromanipulation

Umkehrmikroskop DIAPHOT 300

Nikon, Düsseldorf, GER

Micropipette Puller PB-7

Narishige, Tokyo, Japan

Pipette Grinder EG-40

Narishige, Tokyo, Japan

Micropipette GD-1

Narishige, Tokyo, Japan

3.2.3 Proteinase-Verdau und Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Thermocycler

Biometra, Göttingen, GER

Multi Ultra PCR Tubes (1. Runde PCR)

Sorenson, Salt Lake City, USA

Mineral Oil

Sigma, Deishofen, GER

RNA, 5S-ribosomal

Boehringer Mannheim, Mannheim, GER

Proteinase K

Boehringer Mannheim, Mannheim, GER

Expand High Fidelity PCR System (PCR 1. Runde)

Boehringer Mannheim, Mannheim, GER

AmpliTaq®DNAPolymerase,with GeneAmp®

Roche Molecular Systems, Branchburg, USA

(PCR 2.Runde)

Perkin Elmer, Foster City, USA

JumpStart™ dNTP

BioVentures, Murfreesboro, USA

Oligonukleotid-Primer

Biotez, Berlin, GER


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3.2.4  Gelelektrophorese

Agarose Gel 2%:

 

Agarose (UltraPure™) 2g

Gibco BRL Life Technologies, Eggenstein, GER

1x TBE 100 ml

 

Ethidiumbromid (UltraPure™) 10μl

Gibco BRL Life Technologies, Eggenstein, GER

TBE 10x:

 

Tris-Base 108g

Sigma, Deishofen, GER

Borsäure 55g

Merck, Darmstadt, GER

EDTA 0,5 M, pH 8,0 40ml

Merck, Darmstadt, GER

1kb DNA-Leiter

Gibco BRL Life Technologies, Eggenstein, GER

3.2.5 Reinigung der PCR-Produkte, Isolierung der DNA-Fragmente

High Pure PCR Product Purification Kit

Boehringer Mannheim, Mannheim, GER

Agarose Gel DNA Extraction Kit

Boehringer Mannheim, Mannheim, GER

3.2.6 Sequenzierung

373 DNA Sequencer

Applied Biosystem, Weiterstadt, GER

Sequence Analysis und Sequence Navigator Software

Applied Biosystem, Weiterstadt, GER

DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit

Perkin Elmer, Foster City, USA

Natriumacetat

Merck, Darmstadt, GER

Formamid

Merck, Darmstadt, GER

Ethanol (70% und 95%)

Charité, Apotheke

EDTA

Merck, Darmstadt, GER

Dextran Blau

Sigma, Deishofen, GER

Sequenziergel :

 

Harnstoff 30 g

Gibco BRL Life Technologies, Eggenstein, GER

Acrylamid 7,125 ml

Pharmacia Diagnostics, Freiburg, GER

10x TBE 6 ml

Gibco BRL Life Technologies, Eggenstein, GER

APS 10%, 180 μl

Sigma, Deishofen, GER

TEMED 24μl

Amresco, Solon, USA


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3.3  Methoden

3.3.1 Entnahmestellen des Tumormaterials

Aus dem Tumorexzisat von WS wurden per 5x5 mm durchmessenden Stanzbiopsien Gewebeproben entnommen. Abbildung 9 zeigt die schematische Darstellung des zum Entnahmezeitpunkt ca. 8 cm umfassenden Tumors und die Entnahmestellen des Materials.

Von Patient LB wurden von dem Gesamtexzisat im Januar 1997 insgesamt acht getrennt lokalisierte Stanzbiopsien entnommen. Der Tumor war zum Zeitpunkt der Entfernung ebenfalls nahezu rund mit einem Durchmesser von ca. 6 cm (Abbildung nicht dargestellt).

Der Abstand der entnommenen Gewebeproben bei Patient LB betrug jeweils mindestens 1 cm und wurde analog der Abbildung 9 durchgeführt.

Abbildung 9: Entnahmestellen der untersuchten Gewebeproben (I-III) in Abhängigkeit von derLokalisation im Gesamttumorexzisat bei Patient WS


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3.3.2  Schnitt und Anfärbung der Biopsien

Die operativ gewonnenen Biopsien und Tumorexzisate wurden nach der Entnahme kryokonserviert. Es folgte das Schneiden der Präparate in 10 μm dicke Gewebsschichten. Diese wurden mit Aceton fixiert und mit dem Primärantikörper bei Raumtemperatur inkubiert (Dauer: 1h). Direkt im Anschluß erfolgte die Färbung der B-Zellen mit dem Maus-Anti-Human-B-Cell, CD20, L26 Antikörper. Gleichzeitig wurde zur Kontrolle der Kaninchen-Anti-Human-T-Cell, CD3 Antikörper für die T-Zell-Färbung verwendet.

Die Sekundärantikörper Ziege-Anti-Maus (IgG + IgM) und Ziege-Anti-Kaninchen (IgG) wurden im folgenden Reaktionsschritt für 30 Minuten hinzugegeben. Es folgte der nach jeder Inkubation obligatorische Waschschritt mit Tris Buffered Saline (TBS). Streptavidin-Alkalische Phosphatase wurde für weitere 30 Minuten hinzugefügt, um sich an die biotinylierten Sekundärantikörper zu binden. Der entstandene Komplex (in CD20/CD3-positiven Zellen) konnte anschließend mit Neufuchsin und Naphtol-AS-Bisphosphat, für die Mikromanipulation erkenntlich, rot angefärbt werden. Die so behandelten und gefärbten Präparate wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei 4°C in Tris-HCl (0,5 M; pH 7,6) aufbewahrt.

3.3.3 Mikromanipulation der Einzelzellen

Die Methode der Mikromanipulation ist vor allem durch den Einsatz in der Reproduktionsmedizin bekannt geworden. Die in-vitro-Fertilisation (IVF) und die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) sind etablierte Verfahren, welche sich dieser Methode bedienen.

Unsere Arbeitsgruppe verwendet die Mikromanipulation, um markierte Einzelzellen aus einem Gewebeverband zu isolieren. Ein Mikroskop (Nikon) mit bis zu 600facher Vergrößerung läßt die CD20 positiven B-Zellen in den vorliegenden 10 μm dicken histologischen Schnitten gut erkennbar werden. Glaskapillaren, die mit dem hydraulischen Mikromanipulationsgerät bewegt werden, wurden zuvor spitz gezogen (Micropipette Puller) und im Anschluß angeschliffen (Pipette Grinder). Sie dienen als Werkzeuge zur Mobilisierung der Zellen. Nach einer fotografischen Übersichtsaufnahme konnte mit Hilfe von zwei Glaskapillaren eine positiv markierte Zelle aus dem Gewebeverband gelöst und durch Erzeugung von Unterdruck in eine Glaskapillare aspiriert werden. Die so gewonnene Einzelzelle wurde als Produkt für die erste Runde der PCR in ein Reaktionsgefäß überführt, das 20 μl 1x PCR Puffer und 1ng/μ 5 SrRNA enthielt. Die anschließende Lagerung erfolgte bei -20°C. Die 5 SrRNA dient dazu, das Binden der DNA an der Gefäßwand der Reaktionsgefäße zu vermeiden.


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3.3.4  Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) der Einzelzellen

Die PCR (polymerase chain reaction) ist seit über 10 Jahren eine in der molekularbiologischen und medizinischen Wissenschaft etablierte Methode zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren (49). Die Amplifikation von DNA aus Einzelzellen gelang Li et al. Ende der achtziger Jahre (50). Um einen bestimmten Bereich der genomischen DNA zu amplifizieren, verwendet man Oligonukleotidprimer, die zu den flankierenden DNA-Sequenzen der gewünschten Region komplementär sind. Die Denaturierung der DNA und das Vorhandensein eines Primerüberschußes machen es möglich, daß sich beim erneuten Zusammenlagern die Oligonukleotide an die komplementären Stränge binden können (annealing). Eine Polymerase benutzt die genomische DNA als Matrize und verlängert die Primer um das gewünschte DNA-Stück. Durch wiederholte Zyklen kommt es zur Amplifikation des durch die Primer flankierten Fragmentes. Die sogenannte nesting Strategie beinhaltet zwei verschiedene PCR-Runden. Nach der ersten Amplifikationsrunde wird nur ein kleiner Anteil für die zweite Runde entnommen und mit zwei neuen Primern amplifiziert, die weiter intern binden als des erste Primerpaar (nesting). Seminesting bedeutet, daß nur ein Primer des Paares, welches die Ziel-DNA im zweiten Amplifikationsschritt flankiert, weiter intern ansetzt (Abbildung 10).

Die Einzelzellen enthaltenden Reaktionsgefäße wurden mit einem Tropfen Mineralöl (SIGMA) überschichtet, um das Reaktionsgemisch vor Verdampfung während des Reaktionsvorganges zu schützen und in den Thermocycler (Biometra) überführt. Nach der Zugabe von 0,6 μl Proteinase K (0,25 mg/ml) und dem anschließenden Verdau startete die 1. Runde der von uns verwendeten zweistufigen, seminested PCR zur Amplifizierung der rearrangierten Immunglobuline (VH, Vκ, Vλ). Der Verdau, eine Inkubation bei 55°C für 55 min, mit anschließender Temperaturerhöhung auf 95°C für 10 min zur Inaktivierung des Enzyms, dient dazu, die DNA in der Zelle für die PCR-Reaktion zugänglich zu machen.

Für die anschließende PCR-Reaktion wurden bei einem Ansatzvolumen von 50μl folgende Chemikalien (Boehringer Mannheim) hinzugegeben:


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1. Runde Vh/ Vκ/Vλ (Endkonzentrationen):

7 nM

jedes Primers

200 μM

dNTP

2,5 mM

MgCl2

5 μl

10x PCR-Puffer

Der Primermix beinhaltete die familienspezifischen 6 VH-, 6 Vκ- bzw. je 9 Vλ- 5´Primer und jeweils drei externe JH-, Jκ- bzw. Jλ- 3´Primer. Im Reaktionsgemisch lag jeder Primer mit einer Konzentration von 7 nM vor. Die Tabellen 5, 6 und 7 zeigen die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotidprimer und Abbildung 10 die Bindungsstellen an den Immunglobulingenen für die erste und zweite Runde der PCR.

Jeweils 3,5 U einer hitze-resistenten Taq-DNA-Polymerase, aus dem Bakterium Thermus aquaticus (51;52) wurden nach dem ersten Denaturierungsschritt durch das Öl hinzupipettiert.

Der die Amplifikation einleitende Zyklus bestand aus dem Denaturierungsschritt bei 95°C für 2 min, einem Primer annealing bei 65°C für 2 min und dem Extensionsschritt bei 72°C für 1 min. Darauf folgten 35 Runden des Drei-Schritt-Zyklus 95°C - 1 min, 59°C - 30 s, 72°C - 1 min mit Abschluß eines Extensionsschrittes bei 72°C für 5 min. Eine von 10 Proben enthielt als Negativkontrolle eine CD3 positive T-Zelle.

In der zweiten Runde der PCR wurde je ein 1 μl des Produktes der ersten Runde eingesetzt. Der Ansatz beinhaltete 50 nM je eines derfamilienspezifischen 5´-Primer. In der anderen Richtung kamen vier (JHint/Jκint) bzw. drei (Jλint) weiter intern gelegene J-3´-Primer zum Einsatz, ebenfalls aufgelistet in Tabelle 5, 6 und 7, die wie in der ersten Runde der PCR zu jeder Reaktion gepoolt hinzugefügt wurden.

Ein Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 50 μl der 2. Runde enthielt folgende Chemikalien (Perkin Elmer, für Vκ Boehringer Mannheim):


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Tabelle 4: Reaktionsansätze für die 2. Runde der PCR

2. Runde

VH

Produkt (PCR 1. Runde)

1 μl

1 μl

1 μl

familienspezifischer

5´-Primer (V)

50 nM

50 nM

50 nM

3´-Primer (Jintern)

50 nM

500 nM

50 nM

dNTP

200 μM

200 μM

200 μM

MgCl2

1,5 mM

1,0 mM

1,5 mM

10x PCR-Puffer

5 μl

5 μl

5 μl

Taq-DNA-Polymerase

1,25 U

1,25 U

1,25 U

Tabelle 5: Primer für die leichte Kette LAMBDA

Vλ 1

GGT CCT GGG CCC AGT CTG TG

20

Vλ 2

CAG TCT GCC CTG ACT CAG CCT

21

Vλ 3a

CTC AGC CAC CCT CAG TGT CCG T

22

Vλ 3b

CTC AGC CAC CCT CGG TGT CAG T

22

Vλ 4

TTT CTT CTG AGC TGA CTC AGG AC

23

Vλ 6

GAG TCT CCG GGG AAG ACG GTA

21

Vλ 7

GTG GTG ACT CAG GAG CCC TCA C

22

Vλ 8

ACT GTG GTG ACC CAG GAG CCA

21

Vλ 9

CCT GTG CTG ACT CAG CCA CCT

21

   

Jλ 1ext

GCC ACT TAC CTA GGA CGG TGA C

22

Jλ 2,3ext

GAA GAG ACT CAC CTA GGA CGG TC

23

Jλ 6,7ext

GGA GAC TYA CCG AGG ACG GTC

21

   

Jλ 1int

GGA CGG TGA CCT TGG TCC CAG T

22

Jλ 2,3,7int

GAC GGT CAG CTT GGT SCC TCC

21

Jλ 6int

GAC GGT CAC CTT GGT GCC ACT

21


[Seite innerhalb Tabelle 36↓]

Tabelle 6: Primer für die leichte Kette KAPPA

Vκ 1

GAC ATC CRG WTG ACC CAG TCT CCW TC

26

Vκ 2

CAG WCT CCA CTC TCC CTG YCC GTC A

25

Vκ 3

TTG TGW TGA CRC AGT CTC CAG SCA CC

26

Vκ 4

AGA CTC CCT GGC TGT GTC TCT GGG C

25

Vκ 5

cag tct cca gca ttc atg tca gcg a

25

Vκ 6

ttt cag tct gtg act cca aag gag aa

26

   

Jκ 1,2int

TTG ATY TCC ASC TTG GTC CCY TGG C

25

Jκ 3int

TTG ATA TCC ACT TTG GTC CCA GGG C

25

Jκ 4int

TTG ATC TCC ACC TTG GTC CCT CGG C

25

Jκ 5int

TTA ATC TCC AGT CGT GTC CCT TGG C

25

   

Jκ 1,2,4ext

ACT CAC GTT TGA TYT CCA SCT TGG TCC

27

Jκ 3ext

GTA CTT ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CC

29

Jκ 5ext

GCT TAC GTT TAA TCT CCA GTC GTG TCC

27

Tabelle 7: Primer für die schwere Kette

VH 1

CCT CAG TGA AGG TYT CCT GCA AGG C

25

VH 2

GTC CTG CGC TGG TGA AAC CCA CAC A

25

VH 3

GGG GTC CCT GAG ACT CTC CTG TGC AG

26

VH 4

GAC CCT GTC CCT CAC CTG CRC TGT C

25

VH 5

AAA AAG CCC GGG GAG TCT CTG ARG A

25

VH 6

ACC TGT GCC ATC TCC GGG GAC AGT G

25

   

JH 1,4,5int

GAC GGT GAC CAG GGT KCC CTG GCC

24

JH 2int

GAC AGT GAC CAG GGT GCC ACG GCC

24

JH 3int

GAC GGT GAC CAT TGT CCC TTG GCC

24

JH 6int

GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTK GCC

24

   

JH 1,2,4,5ext

ACC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT

24

JH 3ext

tac ctg aag aga cgg tga cca ttg t

25

JH 6ext

ACC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT

24

zu Tabelle 5, 6, 7:
Dargestellt sind die verwendeten Oligonukleotidprimer für die Einzel-Zell-PCR zur Amplifikation der variablen Abschnitte der Immunglobulingene für die schwere und die leichten Ketten nach Küppers et al. (53); angegeben in 5´-3´-Richtung; R: A/G, Y: C/T, K: G/T, S: G/C, W: A/T


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Abbildung 10: Bindungsstellen der Oligonukleotid-Primer an den Immunglobulingenenfür die Amplifikation der variablen Bereiche der schweren und leichten Kette; seminested PCR

Für das Amplifikationsprogramm der 2. Runde der seminested PCR (51) wurden folgende Temperaturen und Zeiten gewählt:

Erster Zyklus :

95°C - 2 min, 68°C - 5 min (pipettieren der DNA-Polymerase), 72°C - 1 min

45 Zyklen:

95°C - 1 min, 61°C/65°C - 30 sec, 72° - 1 min

Abschlußschritt:

72°C - 5 min

Aufgrund einer unterschiedlichen Effizienz der familienspezifischen Primer wurde beim Einsatz von VH 3- und VH 4-Primern die annealing-Temperatur in den 45 Zyklen auf 65°C erhöht. Das Amplifikationsprogramm von Vλ wurde mit 35 Zyklen (95°C - 1 min, 63°C - 30 sec, 72°C - 1 min) durchgeführt.

In der 2. Runde wurde ebenfalls eine Negativkontrolle mitpipettiert, die 1 μl der Negativkontrolle aus Runde 1. enthielt.


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3.3.5  Gelelektrophorese und Reinigung der PCR-Produkte

Um die Produkte der durchgeführten PCRs zu objektivieren, wurden 5 μl der Proben nach der zweiten Runde auf ein 2%iges Agarose-Gel, das 10 μl Ethidiumbromid enthielt, aufgetragen. Um die spezifischen Banden der amplifizierten VJ- bzw. VDJ- Rearrangements hinsichtlich der Größe zu erkennen, wurde eine 1kb DNA-Leiter mitgeführt.

Die erhaltenen PCR-Produkte wurden einer Reinigung unterzogen, um Primer, Mineralöl, Salze, freie Nukleotide und Polymerasen, die die nachfolgende Sequenzierung beeinträchtigen könnten, zu entfernen. Eindeutige, scharfe Banden in der Gelelektrophorese, die auf geringere unspezifische Amplifikate schließen lassen, wurden mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) bearbeitet. Bei diesem Reinigungsverfahren werden die Reaktionsprodukte direkt aus der PCR-Reaktion aufgereinigt. In speziellen Reaktionsgefäßen (Filter-Tube-Einheiten) wurde zu den verbleibenden 45 μl der Proben das fünffache Volumen eines Nucleinsäure-Bindungspuffers hinzugefügt und anschließend 30 sec zentrifugiert. Die Nukleinsäuren konnten so von dem in den Reaktionsgefäßen enthaltenen Glasfaservlies absorbiert werden. Nach zwei folgenden „Waschschritten“ (Zugabe von Waschpuffer versetzt mit Ethanol) folgte die Eluierung der Proben in 30 μl bidestilliertem Wasser.

Bei unreinen oder sogar Doppelbanden (Auftreten einer zweiten Bande neben der spezifischen) in der Elektrophorese erwies sich der Einsatz des Agarose Gel DNA Extraction Kits (ebenfalls Boehringer Mannheim) als effizientere Methode. Hier erfolgte die Isolierung der DNA-Fragmente mittels TBE-Agarosegelen. Der gesamte PCR-Ansatz (45 μl) wurde auf ein 1,5%iges Agarose-Gel aufgetragen. Nach einer Elektrophoreselaufzeit von ca. 90 min bei 80 V konnten die spezifischen Banden mit einem Skalpell ausgeschnitten und in Reaktionsgefäße überführt werden. Nach dem Auswiegen der einzelnen Agarosefragmente wurde das dreifache Volumen eines Agarose-Lösungspuffers und eine die Nukleinsäuren absorbierende Silica-Matrix hinzugefügt, bei 60°C 10 min inkubiert und anschließend zentrifugiert. Wie bei der zuerst beschriebenen Reinigung folgte die Zugabe des DNA-Bindungspuffers, zwei Waschvorgänge und die Elution in 30 μl bidestilliertem Wasser. Jeder Schritt zog eine Zentrifugation von 30 sec und ein Verwerfen des Überstandes nach sich. Die Trennung der Silica-Matrix von der eluierten DNA erfolgte im letzten Zentrifugationsschritt.

Abschließend wurde mit 5 μl der gereinigten Produkte eine Erfolgskontrolle durchgeführt, die der Gelelektrophorese im Anschluß an die 2. Runde der PCR entsprach.


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3.3.6  Direktsequenzierung der PCR-Produkte

Die Ausgangsmenge der DNA (1-10 μl) für die Sequenzreaktion wurde anhand der Intensität der Banden in der Erfolgskontrolle der Reinigung ermittelt. Bei einem Ansatzvolumen von 20 μl wurden, außer der DNA, 5 μl Ready Mix (AmpliTaq DNA Polymerase, dNTPs, dITP und fluoreszenzmarkierte ddNTPs) aus dem Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequenzing Kit (Perkin Elmer), sowie 2,5 μM eines familienspezifischen Primers verwendet. Während des Pipettierens standen die Proben auf Eis.

Das Programm für die Sequenzreaktion gestaltete sich wie folgt:

96°C - 2 min, 25 Zyklen 96°C - 30 sec, 50°C - 15 sec, 60°C - 4 min.

Währenddessen konnte ein 4,75%iges Polyacrylamidgel hergestellt werden. Ein Gemisch bestehend aus 30,0 g Harnstoff, 7,125 ml Acrylamid, 6,0 ml 10x TBE und 25,375 ml bidestilliertem Wasser wurde nach dem Lösen durch einen Filter (0,2 μm) gegeben und für 10 min entgast. Anschließend wurden 180 μl APS (Ammoniumpersulfatlösung) und 24 μl TEMED (Sigma) hinzugefügt und die Gellösung nach Aufnahme in eine Spritze zwischen die vorbereiteten Glasplatten gegossen. Um das Gel polymerisieren zu lassen, verweilten die Glasplatten 2 h in horizontaler Lage.

Die Produkte der Sequenzreaktion wurden für die Sequenzierung vorbereitet. Zuerst mußten sie unter dem, auch bei dieser Reaktion verwendeten, Mineralöl behutsam abpipettiert werden, um mit jeweils 2 μl Natriumacetat (3 M, pH 4,6) sowie 50 μl 95%igem Ethanol versetzt werden zu können. Nach gründlichem Vortexen, 10 minütiger Lagerung auf Eis, 30 min Zentrifugation bei 14 000 U/min und Verwerfen des Ethanolüberstandes folgte ein weiterer Waschvorgang der DNA mit 250 μl 70%igem Ethanol und erneuter Zentrifugation für 10 min. Wieder wurde der Alkohol entfernt und die Proben bei Zimmertemperatur getrocknet.

Für die nun folgende nichtradioaktive Sequenzierung (54) wurden die Pellets in 4 μl eines Ladepuffers, bestehend aus 100 μl Formamid, 20 μl EDTA und 20 μl Dextran Blau gelöst, bei 90°C für 2 min denaturiert und bis zum Auftragen auf das Gel auf Eis gelagert.

Pro Slot wurden 3,5 μl der Proben aufgetragen und der Sequenzlauf in einem 373 DNA Sequencer (Applied Biosystem) bei 1600 V, 25 mA für 10 h gestartet.

Die Auswertung der erhaltenen Sequenzen erfolgte mit der Sequence Navigator™ Software (Applied Biosystem). Jedes PCR-Produkt der 2. Runde wurde in 5´-3´ mit dem entsprechenden [Seite 40↓]V´-Primer sequenziert, bei nicht eindeutigen oder fehlenden Ergebnissen auch in 3´-5´ Richtung mit einem J´-Primer. Die Hin- und Rücksequenzen konnten gegeneinander alignent werden, um Fehlinterpretationen zu vermeiden und eindeutige Ergebnisse zu erhalten. Bei Differenzen wurde die Sequenzierung wiederholt.

Der Vergleich der analysierten Sequenzen mit den möglichen Keimbahngenen erfolgte online über die ImMunoGeneTics Datenbank (Lefranc MP, Nucleic Acids Research 1998, 26:297-303, Montpellier, France) und die V Base sequence directory Datenbank (I.M. Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engeneering, Cambridge, UK), um die am meisten homologe Keimbahn-sequenz zu ermitteln.


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22.02.2005