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4  Ergebnisse

4.1 Sequenzanalysen der Tumorzellen des Patienten WS

4.1.1 Lymphomzellanalyse des Patienten WS

Das seit einem Jahr bestehende Keimzentrumszell-Lymphom am linken Hinterkopf des Patienten WS hatte zum Zeitpunkt der Exzision einen Durchmesser von ca. 8 cm.

Von drei entnommenen Stanzbiopsien (I, II, III) des parietal-occipital gelegenen Tumors mit definiertem räumlichen Abstand zueinander (Abbildung 9), wurden insgesamt 100 Tumorzellen mikromanipuliert und analysiert (I = 37, II = 27, III = 36 Zellen).

Die aus den histologischen Schnitten gewonnenen CD20 positiven Einzelzellen durchliefen eine seminested PCR mit Hilfe spezifischer Primer (Darstellung der verwendeten Oligonukleotide in den Tabellen 5, 6 und 7), in der die rearrangierten Immunglobulingene amplifiziert wurden.

Die Produkte der zweiten Runde der PCR, in der jeweils nur ein familienspezifischer V’-Primer zum Einsatz kam, wurden auf einem Agarose-Gel unter UV-Licht objektiviert.

Nach erfolgter Reinigung der Amplifikate mit erwarteter Länge, konnten die PCR-Produkte mit dem 373 DNA Sequencer (Applied Biosystem) direkt sequenziert werden.

Für die schwere Kette konnte kein Amplifikationsprodukt gewonnen werden. Für die variable Region der leichten Kette wurden insgesamt 24 VκJκ-Rearrangements mit Sequenzen der Vκ3-Familie gefunden und analysiert.

Tabelle 8: Ergebnisübersicht der Einzelzellanalyse des Patienten WS

Biopsie

Anzahl mikro-manipulierter Zellen

Anzahl der PCR-Amplifikate

VκJκ-
Rearrangement/

Subklon

I

37

16

12 WSVκ3C

II

27

9

3 WSVκ3A

5 WSVκ3B

III

36

9

4 WSVκ3D

Summe

100

34

24

Die Differenz zwischen Amplifikat und untersuchtem Rearrangement ist auf Verunreinigungen bzw. auf Verluste bei dem Reinigungsvorgang vor der Sequenzierung zurückzuführen.


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Von den 34 visualisierten PCR-Amplifikaten konnten 31 direkt sequenziert werden. Von den 12, als nicht zum Tumorklon zugehörig charakterisierten Sequenzen, konnte eine in der laboreigenen Sequenzdatenbank gefunden und als Verunreinigung identifiziert werden. Acht weitere erwiesen sich bei der Auswertung der Direktsequenzierung als überlagert und aufgrund fehlender Reproduzierbarkeit als nicht auswertbar. Die Ursache ist auch hier vermutlich eine auf Verunreinigungen beruhende zusätzliche Sequenzinformation. Drei Proben waren nach dem Reinigungsvorgang auf dem Agarose-Gel nicht mehr sichtbar und lieferten keine Sequenzinformationen.

Die Sequenzen des rearrangierten Vκ-Gens wurden online gegen alle bekannten Keimbahngene verglichen. Das in der internationalen ImMunoGeneTics Datenbank ermittelte am meisten homologe Keimbahngen wird nach der Nomenklatur von Barbie V und Lefranc MP IGKV3-20*1 genannt (55). Nach COX et al.(1994) ist es mit dem Vκ-Keimbahngen DPK22 identisch (56).

Die Keimbahnsequenz wurde mit den Lymphomzell-Sequenzen des Patienten WS verglichen. Die aus den Tumorzellen stammenden VκJκ Sequenzen weisen gegenüber dem Keimbahngen diverse Punktmutationen auf. Alle identischen Sequenzen wurden zu einer Konsensus-Sequenz mit den Initialen des Patienten und der amplifizierten Vκ-Familie zusammengefaßt. Es konnten, bei insgesamt 24 gefundenen VκJκ-Rearrangements, vier verschiedene Subklone für die leichte Kette identifiziert werden (gleicher Großbuchstabe hinter der Sequenzbezeichnung). Die intraklonale Diversität erscheint hier keinesfalls zufällig, sondern in Abhängigkeit von der Entnahmestelle der Biopsie. Erstaunlich ist, daß sich jeweils ein Subklon auf eine Biopsie beschränkt. So ist die Sequenz WSVκ3C nur in Biopsie I, die Sequenz WSVκ3D ausschließlich in Biopsie III und die beiden Subklone WSVκ3A und WSVκ3B nur in Biopsie II zu finden. Die Verwandtschaft der vier verschiedenen Subklone, also die Entwicklung aus einer naiven putativen B-Vorläuferzelle ist mit großer Wahrscheinlichkeit anzunehmen. Abbildung 12 zeigt die Nukleotidsequenzen der Lymphomzellen im Vergleich zum Keimbahngen. Das Verhältnis von Austauschmutationen (R = replacement) und stillen (S = silent), erstere verändern die Aminosäuresequenz, wird im nachfolgenden Kapitel dargestellt.


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4.1.2  Mutationsanalyse der V-kappa-Immunglobulingene des Patienten WS

Die gefundenen Tumorsequenzen wurden mit der Keimbahngensequenz verglichen und ausgewertet (Abbildung 12). Für den gefundenen Klon aus der Biopsie I WSVκ3C ergab sich bei einer analysierten Länge von 258 Nukleotiden eine Mutationsrate von 6,2%. Das bedeutet, daß gegenüber dem Keimbahngen 16 Nukleotide mutiert sind.

Bei der Sequenz WSVκ3A und WSVκ3D sind je 13 Nukleotide bei der Sequenz WSVκ3B 14 Nukleotide ausgetauscht, das entspricht einer Mutationsrate von 5,04% bzw. 5,43%.

Die Mutationsverteilung über das gesamte Gen wird in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle 9: Verteilung der R- (replacement) und S- (silent) Mutationen (R/S) in den Vκ-Genen der Lymphomzellen des Patienten WS.

 

FR1

R / S

CDR1

R / S

FR2

R / S

CDR2

R / S

FR3

R / S

CDR3

R / S

Insgesamt

FR1,2,3

Insgesamt

CDR1,2,3

WSVκ3A

0 / 1

3 /1

0 / 1

2 / 1

0 /1

1 / 2

0 / 3

6 / 4=1,5

WSVκ3B

0 / 1

4 / 1

0 / 1

2 / 1

0 / 1

1 / 2

0 / 3

7 / 4=1,75

WSVκ3C

0 / 1

5 / 0

0 / 3

2 / 1

0 / 1

1 / 2

0 / 5

8 / 3=2,6

WSVκ3D

0 / 1

2 / 2

0 / 1

2 / 1

0 / 1

1 / 2

0 / 3

5 / 5=1

Die entsprechenden Aminosäuresequenzen werden in Abbildung 13 dargestellt.

Ob ein Nukleotidaustausch zu einer Änderung der Aminosäuresequenz führt (Austauschmutation/R-Mutation) oder nicht (stumme/S-Mutation), wird durch den genetischen Code bestimmt. Die Wahrscheinlichkeit, daß eine Mutation eine Kodierungsänderung bewirkt, ist für jedes Triplet unterschiedlich.

Eine Häufung funktionell aktiver Austauschmutationen in den antigenbindenden Bereichen, also in den CDRs bzw. eine Anhäufung von stummen Mutationen in den FRs zur Erhaltung der Struktur, deutet auf eine antigenabhängige Entwicklung hin. Als Maßstab gilt nicht die absolute Mutationsrate, sondern das Verhältnis von R- zu S-Mutationen (R/S-Ratio) in den CDRs bzw. FRs.

Um statistische Mutationsanalysen durchführen zu können, müssen die beobachteten R/S-Ratios der Lymphomsequenzen mit der intrinsischen R/S-Ratio (R/Sint = erwartete Wahrscheinlichkeit, daß eine Mutation zur Änderung der Aminosäuresequenz führt) des rekombinierten [Seite 44↓]Keimbahngens verglichen werden. Die Abbildung 11 und Tabelle 10 zeigen die intrinsische R/S-Ratio des Keimbahngens IGKV3-20*1 getrennt für die Bereiche CDR und FR.

Die Einteilung der antigenbindenden Bereiche (CDRs) und der strukturbewahrenden Bereiche (FRs) erfolgt nach der Definition von Kabat et al. (28).

Abbildung 11: intrinsische R/S Ratio für jedes Triplet des Keimbahngens ab Position 11

Tabelle 10: Zusammenfassung: Verteilung der R/S-Ratio für die Bereiche CDR und FR

Keimbahngen

FR1

R / S

(11-23)

CDR1

R / S

(24-34)

FR2

R / S

(36-49)

CDR2

R / S

(50-56)

FR3

R / S

(57-88)

CDR3

R / S (ab89)

Insgesamt

FR1,2,3

Insgesamt

CDR1,2

IGKV3-20*1

79/34

83/20

97/28

45/18

215/65

44/13

391/127=3,08

172/51=4,61


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Abbildung 12: Vergleich der Nukleotidsequenzen der Vκ-Gene der Lymphomzellen des Patienten WS mit dem Keimbahngen IGKV3-20*1. Unter dem veröffentlichtem Keimbahngen sind die vier verschiedenen Subklone (A-D) mit Kennzeichnung der Mutationen (stumme Mutation = Kleinbuchstabe; Austauschmutation = Großbuchstabe) dargestellt. Ein „-“ deutet auf homologe Nukleotide hin.
Referenz zum angegebenen Keimbahngen IGKV3-20*1: (55)


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Abbildung 13: Abgeleitete Aminosäuresequenzen des Keimbahngens und der Vκ-Gen-Sequenzen für die variable Region der leichten Kette der Lymphomzellen des Patienten WS
Aminosäureaustausche im Vergleich zum Keimbahngen sind fett gedruckt, „-“steht für übereinstimmende Aminosäuren.


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4.2  Sequenzanalysen der Tumorzellen des Patienten LB

4.2.1 Lymphomzellanalyse des Patienten LB

Dem subscapulär gelegenen primär kutanen B-Zell-Lymphom des Patienten LB wurden insgesamt 8 Stanzbiopsien (I-VIII) entnommen, nachdem der zu diesem Zeitpunkt 6x6 cm umfassende Tumor Anfang 1997 vollständig exzidiert wurde. Die Biopsien stammen aus einem Tumorrezidiv nach einer Strahlentherapie 1995, die vorerst zur Regression führte.

Aus den Stanzbiopsien mit einem Durchmesser von jeweils 5 mm wurden insgesamt 126 CD20 positive Einzelzellen untersucht. Die in den Zellen rearrangierten Ig-Gene wurden wiederum in einer seminested-PCR analysiert. Das PCR-Produkt der ersten Runde (gepoolter Einsatz der Primer) jeder Zelle wurde als Matrize für die 2. Runde eingesetzt. Hier wurde je ein familienspezifischer Primer für die schwere und die leichte Kette des variablen Abschnittes der Immunglobulingene verwendet.

Abbildung 14 zeigt ein Beispiel von 7 PCR-Produkten erwarteter Länge. Bahn 1 und 2 stellen Amplifikate eines rearrangierten Immunglobulingens der leichten Kette (Vλ3b-Familie), die Bahnen 5-9 Amplifikate der schweren Kette (VH4-Familie) des Patienten LB dar.

Abbildung 14: Gelelektrophorese von PCR-Amplifikaten mit verwendeten Vλ3b-Jλ2,3,7int (Bahn 1,2) und VH4-JH1,4,5int Primern (Bahn 5-9)

Die nach der Reinigung folgende Direktsequenzierung bestätigte die Familienzugehörigkeit der rearrangierten Immunglobulingene für die schwere und leichte Kette.


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Die Tabellen 11 und 12 zeigen eine Übersicht der Ergebnisse der untersuchten Zellen. Gleiche Sequenzen wurden auch hier zu Konsensus-Sequenzen mit den Initialen des Patienten und der V-Familie zusammengefaßt und durch einen hinten angefügten Buchstaben einem Subklon zugeordnet. Großbuchstaben kennzeichnen Sequenzen für die schwere Kette, angefügte Kleinbuchstaben bezeichnen ein Rearrangement der leichten Kette.

Tabelle 11: Übersicht der Einzelzellanalyse des Patienten LB für die
Immunglobulingene der schweren Kette des kutanen B-Zell-Lymphoms

Biopsie

Anzahl mikro-manipulierter Zellen

Anzahl der PCR-Amplifikate

VHDJH-
Rearrangement

I

18

5 VH4

4 LBVH4A

II

18

7 VH4

7 LBVH4A

III

18

4 VH4

1 LBVH4A

IV

18

6 VH4

6 LBVH4A

V

18

16 VH4

16 LBVH4A

VI

9

7 VH4

6 LBVH4A

VII

9

2 VH4

2 LBVH4A

VIII

18

6 VH4

2 LBVH4A

Summe

126

53

44

Tabelle 12: Übersicht der Einzelzellanalyse für die Immunglobulingene
der leichten Kette

Biopsie

Anzahl mikro-manipulierter Zellen

Anzahl der PCR-Amplifikate

VλJλ-
Rearrangement/
Subklon

I

18

5 Vλ3b

4 LBVλ3ba

II

18

7 Vλ3b

7 LBVλ3ba

III

18

4 Vλ3b

-

IV

18

2 Vλ3b

-

V

18

12 Vλ3b

9 LBVλ3ba

1 LBVλ3bd

VI

9

8 Vλ3b

6 LBVλ3ba

1 LBVλ3bd

VII

9

-

-

VIII

18

5 Vλ3b

2 LBVλ3ba

1 LBVλ3bd

Summe

126

43

31


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Bei der Suche nach dem Keimbahngen wurde in der ImMunoGeneTics Datenbank für die schwere Kette das Keimbahngen IGHV4-59*3 (57) identifiziert.

Insgesamt wurden in 46 Zellen aus allen acht Biopsien VHDJH-Rekombinationen der VH4-Familie gefunden, die im Vergleich zum Keimbahngen Mutationen aufweisen.

In 44 Einzelzellen lag eine identische Immunglobulingen-Sequenz (LBVH4A) vor (s. Tabelle 11), die in allen Gewebeausschnitten wiedergefunden werden konnte.

Lediglich zwei Zellen, beide aus Biopsie III, wiesen einen Unterschied zu dieser Sequenz auf (Ergebnisse nicht dargestellt). Eine der divergierenden Sequenzenbesaß eine zusätzliche Austauschmutation an Position 72 (FR 3) (AAC⇔GAC), die andere Sequenz hingegen war im Vergleich zur Sequenz LBVH4A an Position 79 (FR 3) stumm mutiert (TCT⇔TCC). Die Sequenzen konnten in die Auswertung nicht mit einbezogen werden, da es sich um Ergebnisse handelt, die nur in einer Zelle gefunden werden konnten. Grundlage der zuverlässigen Interpretation von Punktmutationen mittels der Einzel-Zell-PCR-Technik ist das Vorliegen in zwei verschiedenen Zellen aus jeweils unterschiedlichen PCR-Reaktionen.

Von den verbleibenden 7 PCR-Amplifikaten konnten 4 nicht sequenziert (Verlust bei der Reinigung) und drei als laboreigene Gene (Verunreinigungen) identifiziert werden.

Abbildung 17 zeigt die Sequenz LBVH4A der schweren Kette des Immunglobulingens der Lymphomzellen des Patienten LB im Vergleich zum Keimbahngen.

Das Keimbahngen für die leichte Kette des Immunglobulingens wurde in der selben Datenbank ermittelt und wird als IGLV3-21*2 (58) bezeichnet. Es ist mit dem Keimbahngen LV318 (59) identisch.

In 34 Fällen wurde ein Rearrangement für die leichte Kette der Vλ3b-Familie identifiziert, wobei in 3 Biopsien kein Sequenzprodukt erhalten werden konnte. Es wurden 28 identische VλJλ-Rearrangements gefunden und mit LBVλ3ba bezeichnet werden. Sechs divergierende Sequenzen wiesen zusätzliche Mutationen im Vergleich zum Keimbahngen auf. Drei sind in sich identisch (LBVλ3bd)und bilden einen Subklon. Es handelt sich um eine zusätzliche stumme Mutation (CAC⇔CAT) im Bereich FR 1. Sie konnte in drei verschiedenen Zellen, in je einer anderen Biopsie (V,VI,VIII), gefunden werden und gilt deshalb als bestätigt. Die verbleibenden drei Sequenzen mit individuellen Unterschieden, in Form je einer zusätzlichen stummen bzw. je einer Austauschmutation, kamen jeweils nur in einer Zelle vor (jede aus einer anderen Biopsie) [Seite 50↓]und wurden deshalb nicht in die Auswertung mit einbezogen (Sequenzen nicht dargestellt).

Die Lymphomzell-Sequenzen für die leichte Kette im Vergleich zum Keimbahngen sind in Abbildung 18 dargestellt.

In insgesamt 24 Zellen konnten die Rearrangements sowohl für die leichte als auch für die schwere Kette gefunden werden. Die Kombination der Sequenzen war 20x LBVH4A/LBVλ3ba, 2x LBVH4A/LBVλ3bd (Biopsie V,VI), sowie 2x LBVH4A/LBVλ3bb (Biopsie VIII) und LBVH4A/LBVλ3be (Biopsie I). Die Sequenzen LBVλ3bb und LBVλ3be gehören zu den einmaligen Funden.

Die Kombination LBVH4A/LBVλ3ba war in allen Biopsien vorhanden, in denen für die schwere und die leichte Kette Produkte gewonnen werden konnten (Biopsie I,II,V,VI,VIII).

Es soll erwähnt werden, daß in den (elf) mitgeführten Negativkontrollen kein PCR-Produkt entdeckt wurde.

4.2.2 Mutationsanalyse der VH-Immunglobulingene des Patienten LB

Die Sequenz LBVH4A, die in allen Biopsien vorhanden war, wurde einer Mutationsanalyse unterzogen. Die einmalig vorliegenden Sequenzen fanden keine Berücksichtigung. Bei einer Länge von 216 Nukleotiden und 29 mutierten Nukleotiden gegenüber dem Keimbahngen, ergibt sich eine Mutationsrate von 13,4% bzw. eine Keimbahnidentität von 86,6%. Die Mutationsverteilung über das Tumorgen stellt sich tabellarisch wie folgt dar:

Tabelle 13: R/S-Ratios des Tumor-VH-Gens des Patienten LB

 

FR1

R / S

CDR1

R / S

FR2

R / S

CDR2

R / S

FR3

R / S

Insgesamt

FR1,2

Insgesamt

CDR1,2

LBVH4A

2 / 1

2 / 1

1 / 2

7 / 3

7 / 3

10/ 6=1,66

9 / 4=2,25

Die intrinsische R/S-Ratio für das rekombinierte Keimbahngen IGHV4-59*3 wurde ermittelt, um weitere statistische Mutationsanalysen durchführen zu können.

Die Darstellung der Keimbahnsequenz in Abbildung 15 erfolgt ab Position 25, da die Sequenzinformation der Einzelzellanalyse (in Anbetracht der verwendeten Primer) erst ab dieser Stelle verläßliche Informationen bietet.


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Abbildung 15: intrinsische R/S Ratio für jede Tripletkombination des Keimbahngens ab Position 25

Tabelle 14: Zusammengefaßte Verteilung der R/S-Ratio für das gesamte Keimbahngen der schweren Kette

Keimbahngen

FR1

R / S

(25-30)

CDR1

R / S

(31-35)

FR2

R / S

(36-49)

CDR2

R / S

(50-65)

FR3

R / S

(ab 66)

Insgesamt

FR1,2,3

Insgesamt

CDR1,2

IGHV4-59*3

39/15

35/ 4

88/30

108/27

195/73

322/118=2,73

143/31=4,61

Der Bereich der CDR 3 wurde nicht in die Analyse miteinbezogen, da er durch Rekombination (Insertion von N-Sequenzen) und einen hohen Anteil an somatischen Mutationen für statistische Mutationsanalysen nicht sicher auswertbar ist. Das zugehörige D-Gen kann häufig nicht eindeutig ermittelt werden (60). Die Aminosäuresequenz der schweren Kette mit Kennzeichnung der Austauschmutationen ist in Abbildung 19 dargestellt.

4.2.3 Mutationsanalyse der Vλ-Immunglobulingene des Patienten LB

Die Mutationsanalyse für das identifizierte Vλ3b-Gen wurde nach gleichem Schema wie für die schwere Kette durchgeführt. Die zwei gefundenen Subklone LBVλ3ba undLBVλ3bd weisen gegenüber dem mit der höchsten Wahrscheinlichkeit bei der Rekombination verwendeten Keimbahngen IGLV3-21*2 (58) 27 bzw. 28 Punktmutationen auf. Das ergibt eine Mutationsrate von 10,7% für Sequenz LBVλ3ba und 11,1% für Sequenz LBVλ3bd bei insgesamt 252 analysierten Nukleotiden. Die Verteilung der Mutationen ist in Tabelle 15 zu sehen. Die lediglich einmal vorkommenden Sequenzen wurden keiner Mutationsanalyse unterzogen.


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Tabelle 15: R/S-Ratios der Vλ-Gene der Lymphomzellen des Patienten LB

 

FR1

R / S

CDR1

R / S

FR2

R / S

CDR2

R / S

FR3

R / S

CDR3

R / S

Insgesamt

FR1,2

Insgesamt

CDR1,2

LBVλ3ba

1 / 1

3 / 0

5 / 1

2 / 1

4 / 4

5 / 0

10/ 6=1,66

10/ 1=10,0

LBVλ3bd

1 / 1

3 / 1

5 / 1

2 / 1

4 / 4

5 / 0

10/ 6=1,66

10/ 2=5,0

Der Bereich der CDR 3 wurde hier mitberücksichtigt, soweit er eindeutig dem V-Gen zuzuordnen war. Die Aminosäuresequenzen mit Kennzeichnung der produktiven Austauschmutationen sind in Abbildung 20 zu sehen.

Es folgt die Ermittlung der intrinsischen R/S-Ratio für das Keimbahngen IGLV3-21*2, getrennt für die nach Kabat et al. definierten Bereiche CDR und FR (28) (Abbildung 16; Tabelle 16). Für die leichte Kette beginnt die Analyse ab Nukleotidposition 14.

Abbildung 16: Keimbahngen IGLV3-21*2 der leichten Kette mit intrinsischer R/S-Ratio für jede
Position

Tabelle 16: Zusammenfassung der intrinsischen R/S-Ratio für das Keimbahngen

Keimbahngen

FR1

R / S

(14-23)

CDR1

R / S

(24-34)

FR2

R / S

(35-49)

CDR2

R / S (50-56)

FR3

R / S (57-88)

CDR3

R / S (ab 89)

Insgesamt

FR1,2,3

Insgesamt

CDR1,2

IGLV3-21*2

63/24

76/20

94/31

47/14

208/71

68/10

365/126=2,90

191/44=4,34


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Abbildung 17: Nukleotidsequenzen der VH-Region der Tumorzellen des Patienten LB im Vergleich zum Keimbahngen IGHV4-59*3 (57)


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Abbildung 18: Vergleich der Nukleotidsequenzen der Vλ-Region der Tumorzellen des Patienten LB mit dem Keimbahngen IGLV3-21*2 (58)

Abbildung 19: Abgeleitete Aminosäuresequenz des Keimbahngens und der VH-Gen-Sequenz für die variable Region der schweren Kette der Lymphomzellen des Patienten LB.

Abbildung 20: Abgeleitete Aminosäuresequenzen des Keimbahngens und der Vλ-Gen-Sequenzen für die variable Region der leichten Kette der Lymphomzellen des Patienten LB

Aminosäureaustausche im Vergleich zum Keimbahngen sind fett gedruckt, „-“steht für übereinstimmende Aminosäure


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22.02.2005